KR101618124B1

KR101618124B1 - IFT46을 포함하는 다낭신 개선용 약학 조성물 및 Ift46 유전자 조건 결함 상염색체 우성 다낭신 동물모델

Info

Publication number: KR101618124B1
Application number: KR1020140150844A
Authority: KR
Inventors: 박종훈; 고제영; 박은영; 김도연; 오구택; 서인석
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2016-05-09
Also published as: WO2016072650A1

Abstract

원발성 섬모 (Primary cilia)는 편모내 운반 (intraflagellar transport)에 의해 조립되는 손가락 모양의 구조로서 기계적 및 화학적 신호에 대한 센서로서 작용한다. 섬모의 결함은 다낭신의 진행과 관련이 있으며, 섬모의 결함 기작 확인은 다낭신 이해에 매우 중요하다. 본 발명자들은 신장 상피세포와 마우스 신장에서 Ift46의 기능을 확인하였다. IFT46을 감소시키면 섬모가 짧아지고 MAPK 경로가 활성화되어 신장 상피세포에서 세포증식을 증가시킨다. 또한, Ift46 발현 감소는 흐름 센싱 (flow sensing)에 의하여 조절되는 PC2 활성에 영향을 준다. Ift46 발현 감소에 의한 비정상 상태는 3D 배양 체계에서 빠른 낭포 형성을 유도하였다. 실제로, 섬모가 결함된 인간 다낭신 조직에서 Ift46 mRNA와 단백질 수준은 정상 신장에 비하여 극적으로 감소하였다. 이러한 결과를 바탕으로 본 발명자들은 Ift46이 신장에서 특이적으로 감소된 마우스를 제작하였다. 신장에서 Ift46 유전자 결함은 섬모가 손실된 중증 다낭신 표현형과 mTOR 경로 활성을 유도하였다. 이러한 결과들은 Ift46의 결함을 통한 섬모 이상이 다낭신 진행에서 병인으로 작용하고 있음을 제시한다.

Description

IFT46을 포함하는 다낭신 개선용 약학 조성물 및 Ift46 유전자 조건 결함 상염색체 우성 다낭신 동물모델 {Pharmaceutical composition for treating autosomal dominant polycystic kidney disease containing intraflagellar transport 46 and autosomal dominant polycystic kidney disease animal model}

본 발명은 상염색체 우성 다낭신 질환 개선용 약학 조성물 및 Ift46 유전자 조건 결함 상염색체 우성 다낭신 동물모델에 관한 것으로서, 약학 조성물은 IFT46 단백질, Ift46 유전자 또는 Ift46 유전자 발현벡터를 함유하는 것을 특징으로 하며, 동물모델은 Ift46 유전자를 신장 조직의 집합관에서 특이적으로 결함 시킨 조건 결함 상염색체 우성 다낭신 동물모델이다.

다낭신 (Polycystic Kidney Disease, PKD)은 신장에 체액으로 가득 찬 낭포가 형성되어 신기능을 저해시키는 유전질환이다. 다낭신 발병에 관여하는 대표적인 원인 유전자로는 PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1)과 PKD2 (Polycystic Kidney Disease 2)가 알려져 있는데 이 두 유전자는 각 각 Polycystin-1 (PC1)과 Polycystin-2 (PC2) 단백질을 암호화 한다. PC1과 PC2 단백질은 함께 복합체를 이루어 신장 상피세포에 존재하는 섬모에 위치하여 칼슘채널로써 역할을 수행하는데, 최근 보고에 의하면 신장 상피세포의 섬모 결함 역시 다낭신 발병에 관여한다는 사실이 밝혀졌다. 하지만 아직까지 다낭신 동물모델에서 관찰되는 섬모 결함 메커니즘에 관여하는 유전자들이 명확히 밝혀져 있지 않다. 따라서 섬모 결함으로부터 유발되는 낭포 형성 기작을 규명하기 위해서, 섬모 형성 및 기능 유지에 관련되어 있는 유전자의 규명 및 메커니즘 연구는 매우 중요하다.

많은 다낭신 치료약제들이 개발되고 있지만, 부정적인 피드백 저해로 인해 실망스러운 임상결과들이 보고되었다. mTOR 저해제 라파마이신은 다낭신의 강력한 치료제로 예상되었지만, 그다지 효과가 없었다.

본 발명은 상염색체 우성 다낭신 질환 개선에 좀더 효과적인 약제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

IFT46을 감소시키면 섬모가 짧아지고 MAPK 경로가 활성화되어 신장 상피세포에서 세포증식을 증가시킨다. 또한, Ift46 수준 감소는 흐름 센싱 (flow sensing)에 의하여 조절되는 PC2 활성에 영향을 준다. Ift46 결함에 의한 비정상 상태는 3D 배양 체계에서 빠른 낭포 형성을 유도하였다. 실제로, 섬모가 결함된 인간 다낭신 조직에서 Ift46 mRNA와 단백질 수준은 정상 신장에 비하여 극적으로 감소하였다. 이러한 결과를 바탕으로 본 발명자들은 Ift46이 신장에서 특이적으로 감소된 마우스를 제작하였다. 동물 모델의 신장에서 Ift46 유전자 발현의 감소는 섬모가 결함된 중증 다낭신 표현형과 mTOR 경로 활성화를 유도하였다. 이러한 결과들은 Ift46이 섬모 기능의 조절을 통해 다낭신 진행과 관련 있음을 말해주며, 이로부터 Ift46 유전자 및/또는 IFT46 단백질 발현 회복이 상염색체 우성 다낭신의 치료방법이 될 수 있음을 제시한다.

본 발명은 IFT46 단백질을 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선용 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 IFT46 단백질을 코딩하는 Ift46 유전자 또는 mRNA를 포함하는 우성 다낭신 개선용 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 Ift46 유전자 또는 mRNA 발현 벡터를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물에서 IFT46 단백질이라 함은 낭포증식을 억제하는 활성을 나타내는 IFT46 단백질의 전부 또는 일부를 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 조성물에서 Ift46 '유전자'라 함은 이 유전자의 DNA 또는 mRNA를 말하며, DNA 또는 mRNA의 전부 또는 일부를 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 조성물은 상기 유전자 외에도 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 하나 또는 그 이상의 다낭신 치료제 또는 개선제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 가용화제 등이 있다.

또한 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

다낭신 개선을 위해 사용되는 본 발명의 단백질 또는 유전자는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 조성물은 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 복강 내, 흉골 내, 경피, 비측 내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 치료 방법에 있어서, "유효량"은 다낭신을 개선하거나 낭포 형성을 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유효 성분의 "유효량"은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자 또는 단백질의 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, 상기 유전자의 mRNA인 경우 0.01ng/㎏~10㎎/㎏, 화합물일 경우 0.1ng/㎏~10㎎/㎏, 상기 단백질일 경우 0.1ng/kg~10㎎/㎏의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

상기 인간 Ift46 변이체 (variant) 1의 CDS 유전자 서열은 1068bp로서, 유전자 ID는 NM_020153.3으로 알려져 있고 (서열목록 17번 서열), 인간 Ift46 변이체 (variant) 2의 CDS 유전자 서열은 915bp로서, 유전자 ID는 NM_001168618.1로 알려져 있다 (서열목록 18번 서열). 또한, 상기 인간 IFT46 변이체 (variant) 1의 단백질 서열은 서열목록 19번 (NP_064538.3)과 같고, 인간 IFT46 변이체 (variant) 2의 단백질 서열은 서열목록 20번 (NP_001162089.1)과 같다. 상기 서열에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기 위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 좀더 명확해진다.

본 발명은 Ift46 검출을 위한 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 진단용 킷트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

a) 피검체에서 분리된 시료에서 Ift46 mRNA 또는 IFT46 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및

b) 대조군에 비하여 Ift46 mRNA 발현 또는 IFT46 단백질 발현 수준이 감소하면 상염색체 우성 다낭신인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 시료가 신장 조직임을 특징으로 하는, 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 mRNA 발현 수준 측정이 인 시투 혼성화 또는 실시간 RT-PCR에 의하여 수행함을 특징으로 하는 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

a) 피검 물질을 Ift46 mRNA 발현 세포에 처리하는 단계;

b) 대조군에 비하여 Ift46 mRNA 또는 IFT46 단백질 중 1종 이상의 발현 수준을 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 상염색체 우성 다낭신 치료제 후보물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 Ift46 유전자를 신장 조직의 집합관에서 특이적으로 결함 시킨 조건 결함 상염색체 우성 다낭신 동물모델에 관한 것이다.

본 발명자들이 제작한 Ift46이 신장에서 특이적으로 감소된 마우스는 다낭신 연구에 유용하다.

도 1은 Ift46 발현 감소로 인한 섬모의 비정상적인 표현형을 나타낸다. (A, D) 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 Ift46 mRNA 발현을 비교한 것이다. 그래프는 세 번 반복실험한 후의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (B) 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포를 항-아세틸화된 α-튜블린 (녹색)으로 염색한 사진이다. (C) 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 섬모를 가지고 있는 세포를 정량한 것이다. (E) 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포의 주사전자현미경 사진이다. (F) 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 섬모의 길이를 정량한 것이다. 그래프는 세 번 반복실험한 후의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ns, 유의성 없음.
도 2는 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 Ift46/25/52/88/172의 발현 수준을 나타낸다. (A) 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 Ift46/25/52/88/172의 mRNA 발현을 정량적 PCR로 분석한 결과이다. 그래프는 세 번 반복실험한 후의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (B) 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 Ift46/25/52/88/172 단백질 발현과 β-액틴 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.
도 3은 Ift46 siRNA를 처리한 mIMCD-3 세포에서 MAPK 경로의 활성화와 세포 증식의 증가를 나타낸다. (A) Ift46, pMek, Mek, pErk, Erk 및 β-액틴 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다. (B) 시간 의존적으로 XTT 분석으로 세포 생존율을 분석하였다. 그래프는 세 번 반복실험한 후의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *p<0.05는 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포를 비교하여 유의한 값. (C) BrdU가 삽입된 세포를 측정한 것이다. 그래프는 세 번 반복실험한 후의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. **p<0.005는 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포를 비교하여 유의한 값.
도 4는 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 흐름 센싱이 교란됨을 나타낸다. (A)는 Ift46, PC2 및 β-액틴 단백질 발현의 웨스턴 블랏 분석결과이다. (B)는 항-아세틸화된 α-튜블린 (녹색) 및 폴리시스틴-2 (polycystin-2) (적색)으로 염색한 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포 사진이다. (C)는 흐름 자극 하에서 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포의 세포 내 칼슘 수준 변화에 대한 대표적인 사진이다. 색상 막대는 낮은 칼슘 농도는 청색과 녹색으로, 그리고 높은 칼슘 농도는 황색과 적색으로 세포 내 칼슘 농도를 나타낸다. (D)는 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 흐름 자극에 대한 칼슘 반응을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 세포 수준에서의 낭포 형성 과정에 있어서 Ift46 녹다운의 효과를 나타낸다. (A)는 Ift46, pMek, Mek, pErk, Erk 및 β-액틴의 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 분석한 것이다. (B)는 각 대조군 siRNA가 처리된 MDCK 세포와 Ift46 siRNA가 처리 된 MDCK 세포로부터 형성된 낭포 사진이다. (C)는 ISCapture 프로그램으로 측정한 낭포 면적을 나타낸다. 그래프는 세 번 반복실험한 후의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. **p<0.01는 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 MDCK 세포를 비교하여 유의한 값.
도 6은 인간 다낭신 환자에서 Ift46 발현 수준을 나타낸다. (A)는 정상 신장과 다낭신 신장에서 항-아세틸화된 α-튜블린으로 염색한 원발성 섬모 사진이다. (B)는 HRCE, WT9-7 및 WT9-12에서 IFT46과 β-액틴의 단백질 발현을 웨스턴 블랏 분석한 것이다. (C)는 3인의 정상인 신장과 4인의 다낭신 환자에서 IFT46 발현을 정량적 PCR로 분석한 것이다. *p<0.05는 정상인과 다낭신 환자를 비교하여 유의한 값을 나타낸다. (D, E)는 정상인과 다낭신 환자에서 IFT46 단백질 발현 차이를 나타내는 웨스턴 블랏 분석 결과와 띠 밀도 그래프이다. ***p<0.005는 정상과 다낭신 비교.
도 7은 마우스 신장 집합관에서 Ift46 결함이 다낭신을 유도함을 나타낸다. (A)는 Ift46 야생형 gDNA, tm1a gDNA 및 flox gDNA를 나타내는 개요도이다. (B)는 3주째에 H&E로 염색한 대조군 (Ctrl) 및 실험군 (Exp) 신장이다. (C)는 3주째에 실험군 신장에서 형성된 낭포의 기원을 규명한 것이다. 집합관 (Collecting ducts)은 TRITC가 접합된 DBA (적색)로 염색되었다. 핵은 DAPI (청색)로 염색되었다. (D)는 3주째에 대조군 신장과 실험군 신장에서 2개의 신장 중량/체중 데이타를 평균 ± 표준편차로 나타낸 것이다.
도 8은 섬모 표현형과 mTOR 신호전달에 대한 Ift46 결함의 효과를 나타낸다. (A)는 P5와 P21에서 핵 (청색), 집합관 (적색) 및 섬모 (녹색)에 대해 염색한 사진이다. (B)는 P5에서 대조군과 실험군 신장에서 mTOR 경로에 대해 웨스턴 블랏 분석한 것이다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

시료 제조

주사전자현미경 (SEM) 시료를 제조하기 위하여 섬모가 있는 mIMCD-3 세포를 1X PBS로 두 번 세척하고 2.5% 글루타르알데하이드 용액에 저장하였다.

세포 배양

mIMCD-3 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM과 HAM's F12 배지에서 배양하였다. 세포는 5% CO₂가 포함된 습한 환경에서 37 ℃로 배양하였다. 섬모형성을 유도하기 위하여 mIMCD-3 세포를 5일간 포화상태로 유지하였다.

siRNA 처리

세포는 Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen)를 이용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 대조군 siRNA와 Ift46 siRNA (small interfering RNA; Santa Cruz Biotechnology)를 세포에 트랜스펙션시켰다.

면역형광현미경

5~10 ㎛ 두께의 신장 시료 파라핀 절편을 면역형광 현미경 관찰에 사용하였고, 4 ℃에서 1차 항체와 함께 배양하였다. 세포 실험의 경우에는, 세포를 산으로 세척한 유리 커버슬립에서 배양하였다. 세포는 4% 파라포름알데하이드 함유 PBS에서 10분간 고정시켰고, 1차 항체와 함께 4 ℃로 밤새 배양하였다. 사용한 1차 항체는 아세틸화된 항-튜블린 (Sigma-Aldrich), 로다민-DBA (VECTOR LABs) 및 PC-2 (Santa Cruz Biotechnology)였다. 세포는 세 번 세척한 후 FITC와 로다민 형광이 각 각 결합된 항-IgG (Vector Lab.) 이차 항체 1:5000 희석액으로 한 시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후 세포는 Vectashield (Vector Lab.)에 올리고 형광현미경으로 관찰하였다. 핵염색은 DAPI로 수행하였다.

정량적 PCR

총 RNA는 Nucleospin® kit (Macherey-Nagel)를 이용하여 제조자의 지시대로 추출하였고, cDNA는 제조자의 지시에 따라 Moloney 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 (Promega)를 이용하여 제조하였다. 정량적 pPCR은 qPCR SYBR Green kit (Qiagen)를 이용하여 수행하였다. 사용한 마우스 프라이머는 다음과 같다: β-액틴, 정방향 5'-GACGATGCTCCCCGGGCTGTATTC-3', 역방향 5'-TCTCTTGCTCTGGGCCTCGTCACC-3'; Ift25, 정방향 5'-TGAAAAGCACCCACCTGAAAACATC-3', 역방향 5'-TCAATCCTCAAAGTCCGCACCAAGTAA-3'; Ift46, 정방향 5'-CCTACCGTGCTTTCGCTGTGG-3', 역방향 5'-ATGGCTTTGGGATTCTTCTCTGC-3'; Ift52, 정방향 5'-GCGATGAGAACCCCCGTGAC-3', 역방향 5'-AGTTCCTCGTGAGCCTTGATGACC-3'; Ift88, 정방향 5'-TGTTTGCGTTTCTTGGTTCGTCTC-3', 역방향 5'-TGCGCTGTTCCCTCATTTCTTTC-3'; Ift172, 정방향 5'-GGGAAGGCTGCTAACAAAGACAAC-3', 역방향 5'-CTAGGGAGACCACCGCACCACT-3'. 사용한 인간 프라이머는 다음과 같다: β-액틴, 정방향 5'-AAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3', 역방향 5'-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3'; Ift46, 정방향 5'-CGTTCTAAGCCCCCTGCGACTG-3', 역방향 5'-TGCCCAAAAGCTCTTCAAACTCC-3'.

웨스턴 블롯팅

단백질은 폴리아크릴아마이드 젤 상에서 분리한 다음 PVDF 막 (Amersham Pharmacia Biotech)으로 옮겼다. 사용된 일차 항체는 세포골격 액틴 (Bethyl Laboratories), pMek, Mek, Erk, pErk, pS6, S6, pS6K (T389), pS6K, pAMPK (T172), AMPK (Cell Signaling Technology), Ift46 (Abcam), Ift25/52 (Protein tech) 및 Ift88/172 (Santa Cruz Biotechnology)이었다. 블롯들은 4 ℃에서 1차 항체와 함께 밤새 배양하였다. 블롯들은 상온에서 한 시간 동안 이차 항체 (Upstate Biotechnology, 1:5000)와 함께 배양하였다. 면역활성 복합체는 ECL 제제 (Atto)로 시각화하였다.

증식 분석

세포증식 킷트 Ⅱ (XTT) 발색 분석 킷트 (Roche)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 세포 증식을 수행하였다. 세포증식 ELIAS, BrdU (colorimetric) kit (Roche)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 세포 증식을 측정하였다.

3차원 세포배양

MDCK 세포를 이용하여 세포 수준에서 인 비트로 낭포 형성 분석 (3차원 세포 배양)을 수행하였다. 세포는 10X DMEM (Gibco) 및 10X 재구성 완충액 (reconstitution buffer)에 현탁한 후 콜라겐 랫트 꼬리 타입 I (BD)을 가하였다. 포스콜린 (Foskolin)을 배지에 처리하여 낭포 형성을 유도하였다. 낭포 형성 세포의 상 대비 사진은 Olympus IX70 현미경으로 찍었다.

체액 자극에 의한 반응 실험 ( Fluid shear stress experiments )

세포에 5 μM Fura 2-AM (Molecular Probes, Eugene, OR)과 0.01 % 플루론산 (pluronic acid)을 함유한 NT 용액을 37 ℃에서 45분간 로딩하고, 그 후 15분간 NT 용액에서 언로딩하였다. 세포에 Ca² ⁺-결합 안료인 Fura-2로 로딩하고, 유체 전단력 (0.75 dyne/㎠) 교란에 노출시켰다. NT 용액은 145 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.3 mM, CaCl₂, 5 mM 포도당 및 10 mM HEPES (pH 7.4)로 이루어졌다. Fura-2는 파장 340 ㎚ 및 380 ㎚에서 고속 파장 전환장치 (Sutter, Lambda DG-4)로 여기되었다. [Ca² ⁺]c를 측정하여, 파장 340 ㎚ 및 380 ㎚ 여기 (R340/380)에서 형광 발광 비율을 나타내었다. 영상분석 소프트웨어 (MetaFluor, Molecular Devices, USA)로 영역 내의 관심 부분 몇 군데를 선택하고 측정값을 취하였다. 비디오 영상은 Nikon Eclipse Ti 역상 현미경에 부착된 냉각한 CCD 카메라 (CoolSNAP HQ2, Photometrics, USA)를 이용하여 얻었고, 형광을 측정하였다. 형광값은 MetaFlour에서 Origin 8.0으로 보내어 부가적인 분석 및 그래프 그리기에 이용하였다.

통계분석

데이타는 평균 ± 표준편차로 표기하였으며, 대응표본 t-test (paired t-test)로 분석하였다. 대응표본 t-test는 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad software, San Diego, CA)으로 수행하였다. 분석에서 p-값 < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 여겨진다.

결과 1: mIMCD -3 세포에서 Ift46 발현은 섬모 길이 조절과 관련 있다.

신장 상피세포에서 섬모 표현형에 미치는 Ift46 감소의 영향을 확인하기 위하여 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포와 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 섬모가 있는 세포를 관찰하였다. Ift46 siRNA가 mIMCD-3 세포로 트랜스펙션되었을 때 아세틸화된 α-튜블린 (녹색)으로 염색된 원발성 섬모 (primary cilia)는 정상적으로 관찰되었고 (도 1A, 1B), 섬모가 있는 세포의 백분율에서 유의한 차이가 없었다 (도 1C). 그러나, Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서는 대조군과 비교하여 짧은 섬모가 관찰되었다 (도 1D, E, F). 이러한 결과들은 신장 상피세포에서 Ift46 발현 감소가 원발성 섬모의 길이를 짧게 하는 것으로 보인다.

결과 2: IFT 복합체 B 코어의 수준에 미치는 Ift46 감소의 효과

IFT B 복합체는 코어 복합체와 IFT20/57/80/172와 같은 수 개의 주변 단백질로 이루어져 있고, Ift46은 복합체 B 코어의 일원이다. 복합체 B 코어에는 IFT81/74/27/25/88/70/52/46 단백질들이 있고, Ift52와 Ift88은 Ift46과 직접적으로 상호작용하는 파트너들로 알려져 있다. 복합체 B 코어와 주변 단백질들의 발현에 대한 Ift46의 효과를 확인하기 위하여 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 Ift25/52/88/172를 확인하였다. 단백질 수준 확인 전 mRNA 수준을 확인하였다. 비록 Ift46 유전자 발현이 감소했더라도 Ift25/52/88/172의 mRNA 수준은 현저한 변화가 없었다 (도 2A). 그러나, 단백질 수준의 경우 복합체 B 코어로 알려진 Ift25/52/88은 대조군과 비교할 때 Ift46 siRNA 처리한 mIMCD-3 세포에서 감소하였다 (도 2B). 이와 대조적으로, 주변 단백질로 알려진 Ift172의 수준은 Ift46 siRNA 처리한 mIMCD-3 세포에서 변화가 없었다. 이러한 결과들은 Ift46 단백질의 감소가 주변 단백질에 대해서가 아니라 복합체 B 코어인 Ift25/52/88 단백질에 영향을 미친다는 것을 말해준다.

결과 3: Ift46 siRNA 로 처리한 mIMCD -3 세포에서 세포 증식의 증대

정상 섬모 표현형과 IFT 구성요소의 정상적 발현은 mTOR, Hh 및 MAPK 경로와 같은 세포 내 신호전달 조절에 중요하고, 따라서 섬모 또는 섬모 단백질의 결함은 비정상적 신호전달과 관련이 있다. Ift46 감소에 의해 유도되는 섬모의 결함이 섬모에 의한 신호전달에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 웨스턴 블롯으로 MAPK 경로를 확인하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 pMek 및 pErk 수준은 극적으로 증가하였다 (도 3A). 이러한 결과들은 Ift46 녹다운에 의해 유도되는 섬모 결함이 MAPK 경로 활성을 유도함을 나타낸다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 MAPK 경로 활성화가 세포 증식 증대와 관련되어 있기 때문에 세포 생존율을 확인하였다. Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포의 세포 생존율은 대조군 세포에 비하여 높았다 (도 3B). 또한, 대조군 세포와 비교할 때 Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 BrdU 혼입이 증가하였다 (도 3C). 이러한 결과들은 Ift46 발현 감소가 MAPK 경로 활성화 및 세포 증식을 유도함을 말해준다.

결과 4: Ift46 은 PC2 발현/위치에 대해서가 아니라 흐름 센싱에 영향을 미친다.

Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 MAPK 경로 활성화가 세포 증식을 증대시키는 이유를 확인하기 위하여 PC2에 초점을 맞추었다. 원발성 섬모에 위치한 PC2가 세포 내 칼슘 농도 조절을 통해 MAPK 경로를 조절하는 칼슘 채널로 기능하기 때문이다. 그러므로, PC2의 발현과 위치의 변화를 관찰하였다. Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포에서 PC2의 발현 (도 4A) 및 위치 (도 4B)에는 아무런 변화가 없었다. PC2의 발현 및 배치에 아무런 변화가 없었기 때문에 본 발명자들은 PC2 활성에서의 변화를 확인하기 위하여 흐름 자극 (flow stimulation) 하에서 세포 내 칼슘 수준을 측정하였다. 대조군 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포의 경우, 세포 내 칼슘 수준은 흐름 자극 후 극적으로 증가하였다 (도 4C, D). 그러나, Ift46 siRNA로 처리한 mIMCD-3 세포는 흐름 자극에 대하여 반응이 감소하였다 (도 4C, D). 이는 Ift46 발현 감소가 흐름 자극에 의한 PC2 활성을 감소함을 말해준다.

결과 5: Ift46 발현 감소는 인 비트로 낭포 형성을 증가시킨다.

이러한 결과들을 바탕으로 본 발명자들은 IFt46 발현 감소가 다낭신과 관련이 있다는 가설을 세웠는데, 이는 대부분의 IFT 유전자를 목표로 하는 마우스 모델들이 다낭신 표현형을 나타내기 때문이다. 또한, pMek/pErk 활성화를 통한 신장 상피세포 증식의 증대가 다낭신의 주요 특징이기 때문이다. 이러한 이유로부터, 본 발명자들은 MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) 세포를 이용하여 세포 수준 낭포 형성 분석을 수행하였다. 먼저, 본 발명자들은 대조군 siRNA로 처리한 MDCK 세포와 Ift46 siRNA 처리한 MDCK 세포에서 pMek/pErk 수준을 확인하였다. Ift46 siRNA 처리한 MDCK 세포에서는 pMek/pErk가 활성화됨을 확인하였다 (도 5A). 다음으로, 본 발명자들은 세포 수준 낭포 형성분석을 수행하고 낭포 표현형을 관찰하였다. Ift46 siRNA 처리한 MDCK 세포에서는 대조군 세포와 비교하여 수많은 큰 낭포들을 관찰할 수 있었다 (도 5B, 5C). 이러한 결과들은 Ift46 발현 감소가 신장세포에서 빠른 낭포 형성을 유도함을 나타낸다.

결과 6: 인간 다낭신 환자에서 Ift46 발현의 감소

인간 다낭신에서 Ift46 발현이 감소하는지를 확인하기 위하여 다낭신 세포주와 조직에서 Ift46 발현 정도를 확인하였다. Ift46 수준을 확인하기에 앞서, 인간 정상 신장과 인간 다낭신 신장에서 원발성 섬모의 표현형을 관찰하였다. 정상 신장의 신장 상피세포에서 돌출한 원발성 섬모는 정상적이었으나, 다낭신 신장에서는 그렇지 않았다 (도 6A). 다음으로, HRCE (normal human renal cortical epithelial cells) 세포와 두 사람의 다낭신 환자 세포, WT9-7과 WT9-12에서 IFT46 단백질 수준을 조사하였다. 정상 신장세포와 비교하여 다낭신 환자 세포주에서는 IFT46 발현이 감소하였다 (도 6B). 뿐만 아니라, 본 발명자들은 세 사람의 정상 신장과 네 사람의 다낭신 신장에서 IFT46 발현을 살펴보았다. 정상 신장과 비교할 때 다낭신 신장에서는 IFT46 mRNA 및 단백질 수준이 극적으로 감소하였다 (도 6C, D, E). 이러한 결과들은 IFT46 수준 감소가 다낭신 발병과 밀접하게 관련 있음을 제시한다.

결과 7: 신장에서 Ift46 결함은 심각한 다낭신 표현형을 촉진한다.

동물 모델에서 Ift46 유전자의 기능을 규명하기 위하여 EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis)으로부터 Ift46을 조건적으로 목표하는 ES 세포 클론 (HEPD0687_1_H04)을 입수하였다.마우스 Ift46 게놈 DNA는 12개의 엑손으로 구성된다. 이 12개의 엑손 중 엑손 5, 6 및 7은 양 측면에 loxP 서열이 존재하고 있고 (mIft46 flox gDNA) (도 7A), 그리하여 모든 단백질을 코딩하는 전사체들은 끝을 자른 단백질 또는 논센스 매개 mRNA 붕괴 (non-sense mediated decay)를 생성할 것으로 예상된다. 집합관에서 Ift46 유전자를 결함시키기 위해, HoxB7-Cre 마우스를 이용하였다. HoxB7-Cre는 E9.5 상의 중신관 (mesonephric duct)으로부터 E12.5에 모든 요관 싹 (ureteric bud)까지 발현된다. 대조군 마우스 (Ctrl)는 Ick^f ^/+: HoxB7-Cre 유전자형을 가지며, 실험군 (Exp)은 Ick^f ^/f: HoxB7-Cre 유전자형을 가진다. 그 결과, 신장 집합관 세포에서 Ift46 결함은 실험군에서 심각한 다낭신을 유발한다 (도 7B). 실험군에서 대부분의 낭포는 집합관으로부터 유래하였다 (도 7C). 뿐만 아니라, 두 개의 신장 중량/체중 비 (2KW/BW)는 대조군에 비하여 실험군에서 증가하였다 (도 7D). 이러한 결과들은 Ift46 발현 감소가 다낭신 발병과 관련이 있음을 제시한다.

결과 8: Ift46 결함은 섬모 손상 및 mTOR 경로 활성화를 유도한다.

최근의 연구결과들은 섬모 결함이 다낭신 병세 진행과 밀접하게 관련이 있음을 보여준다. 그리하여 본 발명자들은 실험군 마우스의 섬모 표현형을 관찰하였다. P5 및 P21에서, 대조군 신장의 집합관에서는 정상 섬모가 관찰되었으나, 실험군 신장에서는 집합관에 섬모가 없었다 (도 8A). 또한, 섬모 신호전달 조절에 대한 Ift46 결함의 효과를 알아보기 위하여 mTOR 신호전달을 확인하였다. 그 결과, 실험군 신장에서는 pAMPK 감소를 통하여 mTOR 신호전달이 활성화되었다 (도 8B). 이러한 결과들은 Ift46이 섬모형성과 mTOR 신호전달 조절에 필수적임을 말해준다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Sookmyung Women's University <120> Pharmaceutical composition for treating autosomal dominant polycystic kidney disease containing intraflagellar transport 46 and autosomal dominant polycystic kidney disease animal model <130> SookmyungU-JHPark-Ift46 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gacgatgctc cccgggctgt attc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tctcttgctc tgggcctcgt cacc 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgaaaagcac ccacctgaaa acatc 25 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcaatcctca aagtccgcac caagtaa 27 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cctaccgtgc tttcgctgtg g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atggctttgg gattcttctc tgc 23 <210> 7 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Val Leu Ser Leu Trp Leu Thr Glu Asn Ser Lys Gln His Asn Ile 145 150 155 160 Thr Gln His Met Lys Val Lys Ser Leu Glu Asp Ala Glu Lys Asn Pro 165 170 175 Lys Ala Ile Asp Thr Trp Ile Glu Ser Ile Ser Glu Leu His Arg Ser 180 185 190 Lys Pro Pro Ala Thr Val His Tyr Thr Arg Pro Met Pro Asp Ile Asp 195 200 205 Thr Leu Met Gln Glu Trp Ser Pro Glu Phe Glu Glu Leu Leu Gly Lys 210 215 220 Val Ser Leu Pro Thr Ala Glu Ile Asp Cys Ser Leu Ala Glu Tyr Ile 225 230 235 240 Asp Met Ile Cys Ala Ile Leu Asp Ile Pro Val Tyr Lys Ser Arg Ile 245 250 255 Gln Ser Leu His Leu Leu Phe Ser Leu Tyr Ser Glu Phe Lys Asn Ser 260 265 270 Gln His Phe Lys Ala Leu Ala Glu Gly Lys Lys Ala Phe Thr Pro Ser 275 280 285 Ser Asn Ser Thr Ser Gln Ala Gly Asp Met Glu Thr Leu Thr Phe Ser 290 295 300

Claims

IFT46 (intraflagellar transport 46) 단백질을 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선용 약학 조성물.
Ift46 (intraflagellar transport 46) 유전자를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선용 약학 조성물.
Ift46 (intraflagellar transport 46) 유전자 발현 벡터를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선용 약학 조성물.
Ift46 (intraflagellar transport 46) 유전자 검출을 위한 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 진단용 킷트.
a) 피검체에서 분리된 시료에서 Ift46 mRNA 또는 IFT46 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 대조군에 비하여 Ift46 mRNA 발현 또는 IFT46 단백질 발현 수준이 감소하면 상염색체 우성 다낭신인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 시료는 신장 조직임을 특징으로 하는, 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 mRNA 발현 수준 측정은 인 시투 혼성화 또는 실시간 RT-PCR에 의하여 수행함을 특징으로 하는 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법.
a) 피검 물질을 Ift46 mRNA 발현 세포에 처리하는 단계;
b) 대조군에 비하여 Ift46 mRNA 또는 IFT46 단백질 중 1종 이상의 발현 수준을 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 상염색체 우성 다낭신 치료제 후보물질 스크리닝 방법.
인체를 제외한, Ift46 유전자를 신장 조직의 집합관에서 특이적으로 결함 시킨 조건 결함 상염색체 우성 다낭신 동물모델.