KR102336767B1

KR102336767B1 - 골수증식성 신생물 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는, 트랜스듀신 β―유사 단백질 １（ＴＢＬ１） 활성과 관련된 질환 또는 장애의 치료 방법

Info

Publication number: KR102336767B1
Application number: KR1020147015141A
Authority: KR
Inventors: 카필 엔. 발라; 스티븐 호리건
Original assignee: 베타 캐트 파마슈티칼스, 인코포레이티드
Priority date: 2011-11-06
Filing date: 2012-11-06
Publication date: 2021-12-10
Also published as: ES2624427T3; CN103917514B; EP2773607A1; IL232452A; EA027770B1; EA201490937A1; HK1198440A1; WO2013067547A1; MX354653B; US9238030B2; SG11201402056XA; EP2773607B1; AU2012332111B2; BR112014010584A2; KR20140089418A; NZ624446A; AU2012332111A1; CA2853491C; EP2773607A4; CN103917514A

Abstract

본 발명은, 골수증식성 신생물, 만성 골수성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병을 포함하는, 암의 치료를 위한 안트라센-9,10-디온 디옥심 화합물: 2-((3R,5S)-3,5-디메틸피페리딘-1-일설포닐)-7-((3S,5R)-3,5-디메틸피페리딘-1-일설포닐)안트라센-9,10-디온 디옥심의 이용을 기술하고 있다. 상기 안트라센-9,10-디온 디옥심 화합물은, Wnt/베타-카테닌 경로를 방해하고, 베타-카테닌 경로-관련 장애의 치료, 진단 및 예방을 위한 이러한 경로의 탈조절되는 활성을 억제하고, 뿐만 아니라, 보조활성인자(coactivator) 분자 베타-카테닌과의 트랜스듀신 베타-유사 단백질 1(TBL1) 상호작용을 방해한다.

Description

골수증식성 신생물 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는, 트랜스듀신 β―유사 단백질 １（ＴＢＬ１） 활성과 관련된 질환 또는 장애의 치료 방법{METHODS FOR TREATMENT OF DISEASES AND DISORDERS RELATED TO TRANSDUCIN β-LIKE PROTEIN 1(TBL 1) ACTIVITY, INCLUDING MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASIA AND CHRONIC MYELOID LEUKEMIA}

본 발명은, 골수증식성 신생물, 만성 골수성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병을 포함하는, 트랜스듀신 β-유사 단백질 1(TBL 1) 활성과 관련된 질환 또는 장애를 조정(modulating)하는 치료학적 방법 및 이의 용도 분야에 관한 것이다.

암은 미국에서 사망을 유발하는 제2의 주요 원인이다. 이는 새로운 치료법의 개발에 대한 복합적인 도전을 제시한다. 암은 종양 덩어리의 성장 및 전이 특성을 유도하는 일련의 유전적 변화를 겪은 악성 세포의 비정상적인 성장을 특징으로 한다.

단백질의 트랜스듀신 β-유사 단백질 1(TBL1) 부류는 보조-조절인자(co-regulator) 교환 인자로서 작용함으로써 전사 활성인자에 관여하는 것으로 나타났다. TBL1 부류는 TBL1X, TBL1Y 및 TBLR1 단백질로 구성된다. 이들 단백질은 SMRT-핵 수용체/보조-억제인자(N-CoR) 복합체의 성분이며, 여기서, 이들은 복합체에 대한 보조-억제인자(co-repressor) 및 보조-활성인자(co-activator)를 교환하는 작용을 한다. SMRT 및 NCoR은 많은 상이한 핵 수용체에 의한 전사적 억제에 관여하는 큰 보조-억제인자 단백질이다. 단백질의 TBL1 부류는 핵 수용체를 위한 전사 활성인자로서 작용하는 NCoR/SMRT와의 가역적 복합체를 형성한다.

베타-카테닌(β-catenin)은 부착연접(adherens junction: AJ)을 구성하는 단백질 복합체의 일부이다. AJ는 세포 사이에 세포 성장과 부착을 조절함으로써 상피세포층의 생성 및 유지에 필요하다. β-카테닌은 또한 액틴 세포골격을 고정하고, 상피 시트가 완성될 때 세포가 분할되는 것을 멈추게 하는 접촉 억제 신호를 전달하는데 관여할 수 있다.

Wnt/β-카테닌 경로는 암에서 역할을 하는 것으로 제시되어 왔다. 최근 연구는 TBL1이 β-카테닌에 결합되고, Wnt 반응형 프로모터에 대한 복합체를 구성하여 특정 전사 프로그램을 활성화할 수 있음을 제시하였다. TBL1은 β-카테닌이 표적 유전자를 활성적으로 전사시키도록 하는데 필요한 것으로 또한 제시되어 왔다. 또한, TBL1은 유비퀴틴화(ubiquitination)(특정 효소에 의한 번역-후 개질) 및 분해로부터 β-카테닌을 보호하는 것으로 나타난다. 그러나, TBL1과 β-카테닌 사이에 상호작용의 기전은 알려져있지 않다.

일탈적인 β-카테닌 신호화는 종양형성(tumorigenesis)에서 중요한 역할을 한다. 특히, 결장직장암은 β-카테닌 경로에서 80% 초과의 돌연변이를 가짐으로써, 조절되지 않는(unregulated) 종양 신호화를 유도하는 것으로 추정된다. 일탈적인 β-카테닌 신호화는 흑색종, 유방, 폐, 간, 위, 골수종 및 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함하는, 다양한 암 형태에 관여하는 것으로 제시되어 왔다. 또한, 일탈적인 Wnt/β-카테닌 신호화는 골다공증, 골관절염, 다낭성 신장 질환, 당뇨병, 정신분열증, 혈관 질환, 심장 질환, 과증식성 장애 및 신경변성 질환을 포함하는, 다수의 다른 장애에서 발견되어 왔다. 골수증식성 신생물(MPN)은 몸의 혈액 세포를 생성하는 골수 세포가 비정상적으로 발전하여 기능하는 밀접하게 관련된 혈액학적 악성 종양 그룹이다. 세 개의 주요한 골수증식성 신생물은 진성 적혈구 증가증(PV), 본태성 혈소판 증가증(ET) 및 원발성 골수섬유증(PMF)이다. JAK2의 유전자 돌연변이는 대부분의 PV 환자 및 ET 및 PMF 환자의 50%에서 나타난다. 베타 카테닌 경로는 많은 경우에 MPN에서 활성화되며, 이들 세포의 생존을 위해 필요하다.

만성 골수성 백혈병은 골수에서 대부분의 골수성 세포의 증가되고 조절되지 않는 성장 및 "필라델피아 염색체(Philadelphia chromosome)"(여기서, 9번 염색체 단편 및 22번 염색체 단편은 분리되어, bcr-abl 융합 유전자를 형성하는 장소를 교환한다)를 함유하는 혈액에서의 이들 세포의 축적을 특징으로 하는 백혈병의 한 형태이다. CML은 CML 세포 성장에 필요한 베타 카테닌 경로를 포함한 수개의 다른 종양 경로의 활성화를 갖는다.

따라서, β-카테닌 경로-관련 장애 및 질환의 치료, 진단 및 예방을 위해 Wnt/β-카테닌 경로를 차단하여 이러한 경로의 탈조절되는 활성(deregulated activity)을 억제할 수 있는 제제(agent)에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 요지

본 발명은, 트랜스듀신 β-유사 단백질 1(TBL1)이 질환-관련 분자에 결합하는 것을 억제하는 제제를 치료학적 유효량으로 투여함으로써 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 상기 제공된 방법 및 조성물은 β-카테닌 신호화 경로 장애의 치료, 진단 및/또는 예방에 관한 것이다.

또다른 바람직한 양태에서, 상기 β-카테닌 관련 장애는 골수증식성 신생물(MPN), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함한다.

가장 바람직한 양태에서, 상기 제공된 제제는 하기의 구조식의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 갖는다:

이 제제는 본 출원 전체에서 화합물 1로서 언급된다.

바람직한 양태에서, TBL1은 트랜스듀신 (베타)-유사 1X-연결된 (TBL1X), 트랜스듀신 (베타)-유사 1Y-연결된 (TBL1Y) 및 트랜스듀신 (베타)-유사 R1-연결된 TBLR1 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

한 양태에서, 상기 활성인자는 베타-카테닌이다.

또다른 양태에서, 상기 활성인자는 베타-카테닌 관련 단백질이다.

또다른 양태에서, 상기 제공된 제제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 티로신 키나제 억제제(이에 제한되는 것은 아니지만, 닐로티닙을 포함함), 히스톤 데아세틸라제 억제제(이에 제한되는 것은 아니지만, 파노비노스타트를 포함함), 다른 항암제 및 다른 치료학적 제제를 포함하는, 다른 치료학적 제제와 병용하여 사용될 수 있다.

도 1a 내지 1d는 아폽토시스의 유도시 MPN 세포에 대한 화합물 1 단독 및 TG101209와 병용된 화합물 1의 활성을 도시한 바아 차트이다.
도 2는 아폽토시스의 유도시 환자로부터 분리된 원발성 MPN 세포에 대한 화합물 1 단독 및 TG101209와 병용된 화합물 1의 활성을 도시한 바아 차트이다.
도 3a 및 3b는 아폽토시스의 유도시 CML 세포에 대한 화합물 1의 활성을 예시한 표이다.
도 4a 내지 4c는 아폽토시스의 유도시 CML 세포에 대한, 다른 제제와 병용된 화합물 1의 활성을 도시한 바아 차트이다.
도 5a는 CD34+ 원발성 AML 세포, CD34+ 원발성 FLT3-ITD AML 세포; 및 CD34+ 정상 AML 세포의 일련의 사진이다.
도 5b는 대조군 조건에서 및 화합물 1을 투여한 지 16시간 후에, CD34+ FLT3-ITD 원발성 AML 세포의 일련의 사진이다.
도 5c는 AML 세포에 미치는 화합물 1의 투여 효과를 도시한 웨스턴 블롯(Western blot)의 사진이다.
도 6a는 원발성 AML 세포에서 β-카테닌의 TBL1로의 결합에 미치는 화합물 1의 투여 효과를 예시한 웨스턴 블롯의 사진이다.
도 6b는 화합물의 선행 투여 존재하에 및 부재하에 염색된 AML 세포의 일련의 사진이다.
도 6c는 AML 세포에서 β-카테닌의 TBL1로의 결합에 미치는 화합물 1의 투여 효과를 예시한 웨스턴 블롯의 사진이다.
도 7a는 상이한 양의 화합물 1에 의한 AML 세포의 처리에 대한 TOP-FLASH 및 FOP-FLASH 루시페라제 활성의 바아 차트를 도시한 것이다.
도 7b는 화합물 1에 의한 AML 세포 치료 효과의 chIP(크로마틴 면역침강법; chromatin immunoprecipitation) 분석 결과의 바아 차트를 포함한다.
도 7c는 β-카테닌, c-MYC, 사이클린 D1 및 p21(대조군)의 수준에 미치는 AML 세포에 100nM 화합물 1의 투여 효과의 바아 차트를 포함한다.
도 8a는 다양한 양의 화합물 1로 처리한 CD34+ 원발성 FLT3-WT AML 세포, CD34+ 원발성 FLT3-ITD AML 세포 및 CD34+ 정상 세포에서 비생존 세포(non-viable cell)의 %를 나타낸 바아 차트이다.
도 8b는 다양한 양의 화합물 1로 처리한 CD34+ CD38-Lin-원발성 AML 세포에서 비생존 세포의 %를 나타낸 바아 차트이다.
도 8c는 OCI-AML3으로 이식된 NSG 마우스의 생존에 미치는 화합물 1의 처리 효과를 예시한 차트이다.
도 8d는 원발성 FLT3-ITD AML3으로 이식된 NSG 마우스의 생존에 미치는 화합물 1의 처리 효과를 예시한 차트이다.

발명의 상세한 설명

정의

하기 정의가 달리 기술되지 않는 한 사용된다.

용어 "프로드러그(prodrug)"는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 생리학적 조건하에 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물의 활성 모이어티가 되는, 본 발명의 화합물의 단량체 및 이량체를 포함하는, 화합물을 의미한다.

용어 "활성 모이어티(active moieties)"는, 화합물이 본 발명의 화합물인지 아닌지의 여부에 상관없이, 생체내에서 약제학적으로 활성인 화합물을 의미한다.

용어 "대상자(subject)"는 사람을 포함하는, 포유동물을 포함한다. 용어 "환자" 및 "대상자"는 상호교환적으로 사용된다.

용어 "골수증식성 신생물(Myeloproliferative Neoplasias)" 또는 "MPN"은 신체의 혈액 세포를 생성하는 골수 세포가 비정상적으로 발생하여 기능하는 밀접하게 관련된 혈액학적 악성 종양을 의미한다. 세 개의 주요한 골수증식성 신생물은 진성 적혈구 증가증, 본태성 혈소판 증가증 및 원발성 골수섬유증이다.

용어 "만성 골수성 백혈병(Chronic Myeloid Leukemia)" 또는 "CML"은 백혈구의 암을 의미한다. 이는 골수에서 대부분의 골수성 세포의 증가되고 조절되지 않는 성장 및 "필라델피아 염색체"(여기서, 9번 염색체 단편 및 22번 염색체 단편은 분리되어, bcr-abl 융합 유전자를 형성하는 장소를 교환한다)를 함유하는 혈액에서의 이들 세포의 축적을 특징으로 하는 백혈병의 한 형태이다.

용어 "급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia)" 또는 "AML"은 혈액 및 골수의 암을 의미한다.

용어 "TG101209"는 수개의 티로신 키나제에 대한 ATP-경쟁적 억제제인, 경구적으로 생체이용가능한 소분자인 JAK2 억제제를 의미한다. 이 화합물은 또한 N-3급 부틸-3-[[5-메틸-2-[4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐리노]피리미딘-4-일]아미노]벤젠설폰아미드로서 공지되어 있다.

용어 "치료학적 유효량"은 질환 또는 장애를 치료하기 위하여 대상자에게 투여하는 경우, 상기 질환 또는 장애에 대한 이러한 치료를 수행하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. "치료학적 유효량"은 화합물, 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용되는 특정 화합물의 배출 속도; 치료의 지속기간; 사용된 특정 화합물과 병용되거나 동시에 사용되는 약물; 및 약제 분야에 잘 공지된 유사 인자를 포함하는, 다양한 인자에 따라 변할 수 있다. 예를 들면, 목적하는 치료학적 효과를 성취하고, 목적하는 효과가 성취될 때까지 용량을 점차적으로 증가시키는데 필요한 것보다 낮은 수준으로 화합물의 용량을 개시하는 것이 당해 기술분야의 숙련가에게는 잘 알려져있다.

한 양태에서, 용어 "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 질환 또는 장애를 개선시킴(즉, 질환이나 이의 임상적 증상 중 적어도 하나의 발병을 정지시키거나 감소시킴)을 의미한다. 또다른 양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 대상자에 의해 인식될 수 없는, 적어도 하나의 물리적 파라미터(physical parameter)를 개선함을 의미한다. 또한 또다른 양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 물리적으로 (예: 인식할 수 있는 증상의 안정화), 생리학적으로 (예: 물리적 파라미터의 안정화), 또는 이 둘 모두로 조정함을 의미한다. 또한 또다른 양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 개시를 지연시키거나, 심지어 이를 예방함을 의미한다.

어구 "약제학적으로 허용되는 염"은 건전한 의학적 판단의 범위내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 사람 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이익/위험 비에 상응하는 염을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 문헌[참조: S. M. Berge et al. J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66: 1 et seq]에 상세하게 기술되어 있다.

약제학적으로 허용되는 염은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 산 부가 염을 포함한다. 예를 들면, 질소 원자는 산과의 염을 형성할 수 있다. 대표적인 산 부가 염은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트(이소티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 팔미토에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 석시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 비카보네이트, p-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 또한, 염기성 질소-함유 그룹은 저급 알킬 할라이드(예: 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드); 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트와 같은 디알킬 설페이트; 장쇄 할라이드(예: 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드); 벤질 및 펜에틸 브로마이드와 같은 아릴알킬 할라이드 및 기타와 같은 제제로 사급화시킬 수 있다. 수용성, 수 분산성, 오일 가용성 또는 오일 분산성 생성물이 이에 의해 수득된다. 약제학적으로 허용되는 산 부가 염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기 산 및 옥살산, 말레산, 석신산 및 시트르산과 같은 유기 산을 포함한다.

약제학적으로 허용되는 염은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속을 기본으로 하는 양이온(예: 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등) 및 그 중에서도 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸암모늄, 디메틸암모늄, 트리메틸암모늄, 트리에틸암모늄, 디에틸암모늄 및 에틸암모늄을 포함한 비독성 4급화 암모니아 및 아민 양이온을 포함한다. 염기 부가 염의 형성에 유용한 다른 대표적인 유기 아민은 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘 및 피페라진 등을 포함한다.

본 발명에 대한 개시

본 발명은, 트랜스듀신 β-유사 단백질 1(TBL1)이 질환-관련 분자에 결합하는 것을 억제하는 제제를 치료학적 유효량으로 투여함으로써 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 상기 제공된 방법 및 조성물은 골수증식성 신생물(MPN), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 골수성 백혈병(AML)에서 β-카테닌 신호화 경로 장애의 치료, 진단 및/또는 예방에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은, 트랜스듀신 β-유사 단백질 1(TBL1) 단백질에 결합하는 제제의 치료학적 유효량을 β-카테닌 관련 장애의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 β-카테닌의 결합을 방지함을 포함하는, β-카테닌 관련 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.

이 화합물은 본 출원 전체에서 "화합물 1"로서 언급된다.

또다른 바람직한 양태에서, β-카테닌 관련 장애는, 이에 제한되는 것은 아니지만, MPN, CML 및 AML을 포함하는, 암을 포함한다.

화합물 1은 원래, 전사 활성화 또는 β-카테닌 유전자를 억제하는 이의 능력에 대해 세포 기반 스크린(cell based screen)으로 확인되었었다. 이 화합물의 특성 분석은, 상기 화합물이 β-카테닌의 분해를 유도하고, 전사 활성화 복합체에 대해 간섭할 수 있으며, 핵 수용체 신호화 경로 조절인자의 특징을 갖는다는 발견을 유도하였다. 화합물 1은 TBL1과 상호작용하여, β-카테닌이 TBL1과 회합되는 것을 방지하고, 베타 카테닌 분해를 유도한다.

화합물 1의 이러한 활성은, 암세포들에서 베타 카테닌 경로를 억제하고, 이들 세포들이 아폽토시스를 겪도록 유도하는 것으로 밝혀졌다. 특히, CML 환자로부터 유래된 세포주 및 MPN 환자로부터 유래된 세포주와 원발성 세포(primary cell)는 화합물 1의 존재하에 아폽토시스 및 성장 억제를 겪는다. 또한, 화합물 1의 활성은, 이들 질환에서 치료학적으로 중요한 신호화 경로에 영향을 주는 화합물(예: JAK2, BCR-ABL, 및 HDAC)과 상승작용하고, 상기 질환을 겪는 개체에서 이들 질환을 개선하기 위하여 이들 제제와 병용하여 사용될 수 있다.

따라서, 일부 양태에서, 상기 제공된 제제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 티로신 키나제 억제제(이에 제한되는 것은 아니지만, 닐로티닙을 포함함), 히스톤 데아세틸라제 억제제(이에 제한되는 것은 아니지만, 파노비노스타트를 포함함), 다른 항암제 및 다른 치료학적 제제를 포함하는, 다른 치료학적 제제와 병용하여 사용될 수 있다.

상기 치료 또는 다른 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 화합물들 중 하나의 치료학적 유효량은 순수한 형태로, 또는 하기 형태가 존재하는 경우, 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 프로드러그 형태로 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 관심있는 화합물을 함유하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.

사람 또는 하등 동물에게 투여되는 본 발명의 화합물의 총 1일 용량은 약 0.0001 내지 약 1000mg/kg/일의 범위일 수 있다. 목적하는 경우, 효과적인 1일 용량은 투여의 목적으로 다중 용량으로 나눌 수 있고; 결과적으로 일회 용량 조성물은 1일 용량을 채우기 위해 이러한 양 또는 이의 약수를 함유할 수 있다.

본 발명의 보다 명확한 이해를 위해, 상세한 설명이 하기에 제공된다. 이들은 단순히 예시이고, 어떠한 방법으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 실제로, 본원에 제시되고 기술된 것들 이외에, 본 발명의 다양한 변형이 하기 실시예 및 전술한 기술로부터 당해 기술분야의 숙련가에게는 명확해질 것이다. 이러한 변형도 또한 첨부된 특허청구범위 내에 포함시키고자 한다.

실시예

실시예 1

아폽토시스의 유도시 MPN 세포에 대한 화합물 1의 활성

간단히, 세포주 HEL 92.1.7(도 1a 및 1c) 및 UKE1(도 1b 및 1d)을 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배지에 씨딩하였다. 24시간 후, 세포를 1) 화합물 1 ; 또는 2) TG101209와 병용된 화합물 1 중 하나로 48시간 동안 처리하였다. 처리가 끝날 무렵, 세포를 1X PBS로 세척하고, 안넥신 V 및 TOPR03 요오다이드로 염색하였다. 아폽토시스 세포의 %는 유세포 분석기로 측정하였다.

도 1a 내지 1d에 예시한 바와 같이, 화합물 1(도면 범례에서 BC2059로서 언급됨)은 HEL 92.1.7 및 UKE1 세포 모두의 아폽토시스를 유도하였다. 이들 아폽토시스-유도 효과는 TG101209에 의해 개선되었다.

실시예 2

아폽토시스의 유도시 환자로부터 분리된 원발성 MPN 세포에 대한 화합물 1 및 다른 제제와 병용된 화합물 1의 활성

간단히, MPN 환자의 골수로부터 분리된 CD34+ 세포를 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배지에 씨딩하였다. 24시간 후, 세포를 48시간 동안 화합물 1로 또는 TG101209와 병용된 화합물 1로 처리하였다. 처리가 끝날 무렵, 세포를 1X PBS로 세척하고, 안넥신 V 및 TOPR03 요오다이드로 염색하였다. 아폽토시스 세포의 %는 유세포 분석기로 측정하였다. 컴비네이션 지수(Combination index)(CI)는 슈-탈라레이(Chou-Talalay) 방법을 사용하여 결정하였다[참조: Adv. Enzyme Regul. 22, 27-55].

도 2는 이 실험의 결과를 도시한 바아 차트이다. 알 수 있는 바와 같이, 100nM 이상에서 화합물 1(도면 범례에서 BC2059로서 언급됨)은 CD34+ MPN 세포의 아폽토시스를 유도하였다. TG101209의 부가는 이러한 효과를 개선시켰다.

실시예 3

아폽토시스의 유도시 CML 세포에 대한 화합물 1의 활성

간단히, 세포주 K562(사람 불멸화 골수성 백혈병 세포주) 및 LAMA-84(사람 백혈병 세포주)를 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배지에 씨딩하였다. 24시간 후, 세포를 48시간 동안 화합물 1로 처리하였다. 처리가 끝날 무렵, 세포를 1X PBS로 세척하고, 안넥신 V 및 TOPR03 요오다이드로 염색하였다. 아폽토시스 세포의 %는 유세포 분석기로 측정하였다.

도 3a 및 3b는 이 실험의 결과를 예시한 표이다. 알 수 있는 바와 같이, 화합물 1에 의한 처리는 세포 주기의 G0/G1 단계에서 아폽토시스 세포의 수를 증가시켰지만, 세포 주기의 S 또는 G2/M 단계에서는 유의한 효과를 갖지 못하였다.

실시예 4

아폽토시스의 유도시 CML 세포에 대한 다른 제제와 병용된 화합물 1의 활성

간단히, 세포주 K562 및 LAMA-84를 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배지에 씨딩하였다. 24시간 후, 세포를 1) 화합물 1 단독으로; 또는 2) 파노비노스타트 및 닐로티닙과 병용하여 48시간 동안 처리하였다. 처리가 끝날 무렵, 세포를 1X PBS로 세척하고, 안넥신 V 및 TOPR03 요오다이드로 염색하였다. 아폽토시스 세포의 %는 유세포 분석기로 측정하였다.

도 4a 내지 4c는 이 실험의 결과를 바아 차트이다. 이들 도면이 제시한 바와 같이, 화합물 1에 의한 처리는 K562 및 LAMA-84 세포주 모두에서 아폽토시스 세포의 수를 증가시켰다. 파노비노스타트 및 닐로티닙은 화합물 1의 효과를 개선시켰다.

실시예 5

사람 MPN의 마우스 모델에서 화합물 1의 활성. 본 발명자들은 화합물 1의 생체내 항-MPN 활성을 측정하였다

간단히, NOD-SCID 마우스를 반-치사적(sub-lethally)으로 방사선 조사하고, HEL 92.1.7 세포를 꼬리 정맥으로 주입시켜, MPN을 확립하였다. 마우스를 꼬리 정맥을 통해 3주 동안 b.i.w. 투여된 15 또는 20mg/Kg의 화합물 1로 처리하였다. 동물은 투약을 멈춘 후 생존을 이어갔다. 대조군과 비교시, 화합물 1-처리된 마우스는 상당히 개선된 생존을 나타내었다(p < 0.01).

실시예 6

AML 세포에서 β-카테닌 발현 및 핵 국부화에 미치는 화합물 1의 효과

본 실험의 목적은 AML 세포에서 β-카테닌 발현 및 핵 국부화(nuclear localization)에 미치는 화합물 1의 효과를 분석하는 것이었다.

간단히, CD34+ 원발성 AML 세포, CD34+ 원발성 FLT3-ITD AML 세포 및 CD34+ 정상 세포를 항-3-카테닌 항체 및 DAPI 핵산 착색제로 염색하였다. 이들 착색물의 사진은 또한 합쳐졌다(merged). 염색된 세포의 사진이 도 5a에 포함되어 있다. 이들 사진에서 제시하는 바와 같이, 두 형태의 AML 세포에서 발현된 많은 β-카테닌이 존재하며, β-카테닌은 이들 세포의 핵에 집중되어 있다.

도 5b는 16시간 동안 100 nM의 화합물 1로 CD34+ 원발성 FLT3-ITD AML 세포를 처리한 결과를 예시하고 있다. 알 수 있는 바와 같이, 대조군 세포(즉, 화합물 1로 처리되지 않은 세포)와 비교시, 이 처리는 AML 세포에서 β-카테닌 발현 및 핵 국부화의 고갈을 유도한다.

도 5c는 화합물 1에 의한 처리가 AML 세포에서 β-카테닌 발현 및 핵 국부화의 고갈을 유도함을 추가로 예시하는 웨스턴 블롯의 사진이다. 알 수 있는 바와 같이, 100 nM의 화합물 1로 처리된 AML 세포는 β-카테닌을 덜 발현하지만, TBL1, c-MYC, 서바이빈 및 β-액틴에 대해서는 동일한 수준이었다.

실시예 7

AML 세포에서 β-카테닌의 TBL1로의 결합에 미치는 화합물 1의 효과

본 실험의 목적은 AML 세포에서 β-카테닌의 TBL1로의 결합에 미치는 화합물 1의 효과를 분석하는 것이었다.

도 6a는 원발성 AML 세포를 8시간 동안 100 nM의 화합물 1로 처리한 후 원발성 AML 세포에서 β-카테닌이 더 적게 존재함을 예시하는 웨스턴 블롯의 사진이다.

도 6b는 화합물 1의 선행 투여의 존재 및 부재하에 염색된 AML 세포의 일련의 사진이다. 상부 패널은 대조군 세포(화합물 1의 선행 투여 부재하)를 도시하고 있고, 하부 패널은 16시간 동안 100 nM의 화합물 1의 투여한 다음의 AML 세포를 도시하고 있다. 세포를 항-β-카테닌 항체, 항-TBL1 항체 및 DAPI 핵산 착색제로 염색하였다. TBL1 및 항-베타-카테닌 착색물의 사진은 또한 합쳐졌다. 알 수 있는 바와 같이, 화합물 1의 투여는 β-카테닌의 수준을 고갈시켰고, TBL1로의 β-카테닌의 결합을 심하게 파괴하였다. 특히 상부 우측 사진과 하부 우측 사진이 비교가 된다.

도 6c는 AML 세포에 화합물 1의 투여가 β-카테닌의 프로테아좀 분해(proteasomal degradation)를 유도함을 예시하는 웨스턴 블롯의 사진이다. 알 수 있는 바와 같이, 비-처리된 AML 세포에 비하여, 8시간 동안 100 nM의 화합물 1로 처리한 AML 세포에서 β-카테닌이 더 적게 존재한다. 그러나, 10 nM의 카르필조밉(CZ)(프로테아좀 억제제)을 동일한 AML 세포에 투여한 경우, β-카테닌의 양은 증가하였다.

실시예 8

AML 세포에서 표적 유전자 프로모터 및 전사시 β-카테닌에 미치는 화합물 1의 효과

본 실험의 목적은 AML 세포에서 표적 유전자 프로모터 및 전사시 β-카테닌에 미치는 화합물 1의 효과를 분석하는 것이었다.

도 7a는 상이한 양의 화합물 1에 의한 AML 세포의 처리에 대한 TOP-FLASH 및 FOP-FLASH 루시페라제 활성의 바아 차트를 도시하고 있다.

TOP-FLASH는 티미딘 키나제(TK) 최소 프로모터 및 루시페라제 개방 판독 프레임(open reading frame)의 상류 TCF 결합부위 (야생형) 세 카피(copy)의 두 세트(역 배향으로 제2 세트가 있음)를 함유하는 형질감염 등급 T-세포 인자(TCF) 리포터 플라스미드이다.

FOP-FLASH는 돌연변이된 TCF 결합부위를 함유하는 리포터 플라스미드로, 네가티브 대조군이다.

도 7a에 예시한 바와 같이, 20 nM, 50 nM, 및 100 nM의 화합물 1에 의한 처리는 이러한 루시페라제 검정에 의해 측정된 바와 같이 β-카테닌의 훨씬 더 적은 발현을 유발하였다. FOP-FLASH(네가티브 대조군)에서는 감소가 없었다. 이들 결과는 화합물 1에 의한 AMC 세포의 처리가 β-카테닌의 발현을 감소시켰음을 나타내고 있다.

도 7b는 화합물 1에 의한 AML 세포 치료 효과의 chIP(크로마틴 면역침강법) 분석 결과의 바아 차트를 포함한다. 도 7b에 제시된 바와 같이, 8시간 동안 200 nM의 화합물 1에 의한 AML 세포의 처리는 서바이빈, CCND1 및 c-MYC의 프로모터 DNA의 양을 감소시켰다.

도 7c는 β-카테닌, c-MYC, 사이클린 D1 및 p21(대조군)의 수준에 미치는 AML 세포에 100 nM의 화합물 1의 투여 효과의 바아 차트를 포함한다.

도 7에 예시된 바와 같이, 100 nM의 화합물 1에 의한 처리는 β-카테닌, c-MYC, 및 Cyclin D1의 더 적은 발현 및 p21의 훨씬 더 큰 발현을 유발하였다.

실시예 9

원발성 AML 세포가 이식된 NSG 마우스의 시험관내 아폽토시스 및 생존에 미치는 화합물 1의 효과

본 실험의 목적은 원발성 AML 세포가 이식된 NSG 마우스의 시험관내 아폽토시스 및 생존에 미치는 화합물 1의 효과를 분석하는 것이었다.

도 8a는 다양한 양의 화합물 1로 처리한 CD34+ 원발성 FLT3-WT AML 세포, CD34+ 원발성 FLT3-ITD AML 세포 및 CD34+ 정상 세포에서 비생존 세포의 %를 나타낸 바아 차트이다. 도 8a에 예시된 바와 같이, 화합물 1은 두 형태의 AML 세포에서 시험관내 아폽토시스를 유의하게 유도하였다.

도 8b는 다양한 양의 화합물 1로 처리한 CD34+ CD38-Lin-원발성 AML 세포에서 비생존 세포의 %를 나타낸 바아 차트이다. 도 8b에 예시된 바와 같이, 화합물 1은 AML 세포에서 시험관내 아폽토시스를 유의하게 유도하였다.

OCI-AML3 이종이식(xenograft) 세포에 의해 확립된 AML이 있는 NOD-SCID-IL2γ 수용체 결핍(NSG) 마우스에서 3주 동안, 주 2회 꼬리 정맥 주입을 위해 화합물 1에 의한 처리는 대조군 마우스에 비하여, 생존을 개선시켰다. 도 8c는 이 실험 결과를 예시하는 차트를 포함한다. 5mg/kg의 화합물 1 및 10mg/kg의 화합물 1에 의한 처리는 모두 생존을 개선시켰고, 10mg/kg 용량이 보다 더 효과적이다.

매우 유사한 결과가 원발성 FLT3-ITD AML 이종이식된 NSG 마우스에서 수득되었다. 도 8d에 제시된 바와 같이, 10mg/kg의 화합물 1에 의한 처리(3주, 주 2회 정맥내 주입)는 대조군 마우스에 비하여 생존 %의 극적인 증가를 야기하였다.

이들 결과는 화합물 1이 원발성 AML 세포가 이식된 NSG 마우스의 생존을 유의적으로 개선함을 강력히 제시하고 있다.

Claims

보조활성인자(coactivator) 분자와의 TBL1 상호작용을 방해하는 치료학적 유효량의 제제(agent)를 포함하는, 골수증식성 신생물(MPN), 만성 골수성 백혈병(CML), 및 급성 골수성 백혈병(AML)으로부터 선택되는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 제제가 하기 구조식:

을 갖거나 약제학적으로 허용되는 이의 염인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 장애가 골수증식성 신생물인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 장애가 만성 골수성 백혈병인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 장애가 급성 골수성 백혈병인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 보조활성인자 분자가 베타-카테닌인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 JAK2 키나제, BCR-ABL 키나제, 또는 히스톤 데아세틸라제를 억제하는 제제와 추가로 병용되어 제공되는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TBL1이 트랜스듀신 (베타)-유사 1X-연결된 TBL1X 단백질, 트랜스듀신 (베타)-유사 1Y-연결된 TBL1Y 단백질 및 트랜스듀신 (베타)-유사 R1-연결된 TBLR1 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
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