KR102331738B1 - 원형 RNA Smoc1를 포함하는 혈관 석회화의 치료 또는 진단용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 실시예는, 원형 RNA Smoc1을 포함하는 혈관 석회화 관련 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 혈관 석회화 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물, 및 진단용 조성물에 관한 것이다.
혈관 석회화는 뼈와 연조직에 인산칼슘과 같은 무기질이 침착되는 현상을 말한다. 혈관, 신장, 뇌, 심장, 폐 등 연조직에서의 석회화는 비정상부위 석회화(ectopic calcification)라 하고, 뼈나 치아와 같은 정상적으로 석회화가 되는 부위와는 다르게 병적이 질환의 특징을 나타낸다. 관상동맥을 포함한 광범위한 혈관 석회화는 만성신장병 환자에서 흔히 관찰된다. 전통적인 위험 요인인 고혈압, 당뇨, 이상지질혈증, 고령화, 그리고 흡연 등이 혈관 석회화 발생에 영향을 미친다.
혈관 석회화는 죽상경화성 석회화(atherosclerotic calcification)와 내측동맥 석회화(medial artery calcification)와 같이 두 종류로 분류한다. 만성신장병 환자의 경우 신장 기능 저하로 인하여 칼슘-인 결합체 농도가 상승되어 있다. 이러한 현상이 지속될 경우 내측동맥을 구성하는 혈관평활근 세포에 혈관 석회화가 발생하게 된다. 이러한 혈관 석회화를 조절하기 위해 인산염 결합제(phosphate binder), 활성 비타민 D 유사체(active vitamin D analog), 칼슘 유사체(calcimimetics) 등 여러 약제들이 개발되었지만, 만성신장병 환자에게서 혈관 석회화는 여전히 흔하게 발생하고 있다.
이러한 혈관 석회화의 발병기전에는 여러 요소들과 기전이 영향을 미칠 수 있다. 혈관 석회화는 심혈관 질환과 연관되어 있으며, 심혈관 질환은 현재 사망률이 높은 질환 중 하나이다. 따라서 보다 더 효과적인 혈관 석회화 치료를 위해서는 혈관 석회화 발생에 관여하는 새로운 기전을 찾을 필요가 있다.
현재 혈관 석회화에 관여하는 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)에 대하여는 연구되었지만, 아직 원형 RNA(circular RNA, circRNA)에 대한 연구는 진행되지 않았다. 원형 RNA는 비번역 RNA(noncoding RNA) 중의 하나로 주로 백스플라이싱(back-splicing)을 통해 생성된다. 원형 RNA는 주로 단백질 번역 유전자의(protein-coding gene) 엑손 부위에서 만들어지며, 뒤쪽 5' 스플라이스 부위(splice site)가 앞쪽 3' 스플라이스 부위와 결합하면서 생성된다. 원형 RNA는 5' 및 3' 말단이 없어서 핵산말단분해효소로 잘 분해되지 않는다. 이러한 원형 RNA 는 miRNA 스폰지, RNA에 부착되는 단백질 스폰지, 또는 전사인자 조절자로서 기능할 수 있다. 최근에는 번역(translation)에 관여하는 원형 RNA들도 보고가 되었다. 과거에는 원형 RNA가 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 부산물로 여겨졌지만, 다양한 조직에서 여러 RNA 염기서열분석(RNA-sequencing, RNA-seq)을 통해 원형 RNA가 많이 발현되는 것이 확인되어 주목 받기 시작했다. 원형 RNA는 신경세포에서는 활발하게 연구되었지만 혈관평활근 세포에서의 연구는 많이 이루어지지 않았다. 따라서, 혈관평활근 세포에서의 원형 RNA의 기능에 대한 연구의 필요가 있었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 일 과제는 원형 RNA, 구체적으로 circSmoc1(SPARC related modular calcium binding 1)을 포함하는 혈관 석회화 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 과제는 원형 RNA, 구체적으로 circSmoc1을 포함하는 혈관 석회화 관련 질환의 진단용 조성물 및 이를 이용하는 혈관 석회화 관련 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 혈관평활근 세포에서 발현되는 원형 RNA의 역할과 조절을 연구하였고, 혈관 석회화 유도 시 의미 있게 발현량이 변화하는 원형 RNA 중 Smoc1에서 생성되는 원형 RNA Smoc1(circSmoc1)을 발견한 것에 기초하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 혈관 석회화 유도 시 circSmoc1의 발현량이 유의미하게 감소하는 것을 발견한 것에 기초한다.
본 발명의 일 양태는 원형 RNA Smoc1을 포함하는 혈관 석회화 관련 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 원형 RNA Smoc1은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 원형 RNA Smoc1은 miRNA 억제제로 작용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 혈관 석회화 관련 질환은 혈관 석회화, 말기신부전, 죽상동맥경화, 고혈압, 심근경색 또는 혈전증일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 원형 RNA Smoc1의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 혈관 석회화 관련 질환의 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 원형 RNA Smoc1의 발현량을 측정하는 단계는 서열번호 4 내지 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 프라이머를 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 원형 RNA Smoc1의 발현량이 감소하면 혈관 석회화 관련 질환이 발생하거나 발생할 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 4 내지 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 혈관 석회화 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 원형 RNA Smoc1(circSmoc1)을 세포 내에서 과발현 시 혈관 석회화를 감소시키므로, 혈관 석회화 관련 질환을 예방하거나 치료하는 데 활용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 원형 RNA Smoc1(circSmoc1)을 혈관 석회화 관련 질환의 진단에 사용 가능한 바이오마커로서 활용할 수 있다. 특히, 만성신부전 등 혈관 석회화 발병 가능성이 높은 임상 환자 중에, 혈관 내부에 있는 혈관석회화, X-ray 및 심장 CT 상으로도 관찰하기 힘든 스텐트 주위의 혈관 석회화 등과 같이, 기존 방법으로 혈관 석회화 진단이 어려운 환자를 확인하거나 혈관 석회화 진단을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 래트 혈관평활근 세포에 혈관 석회화 유도에 따른 circSmoc1의 발현량 변화를 나타낸다.
도 2는 인간의 심장동맥 평활근세포에서의 circSmoc1의 발현 여부를 확인하기 위한 RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 3은 circSmoc1 과발현 시 석회화가 감소하는 것을 확인하는 칼슘 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 circSmoc1를 과발현에 따른 석회화 감소 결과를 확인하기 위한 알리자린 레드의 염색 결과를 나타낸다.
도 5는 circSmoc1을 siRNA 처리하여 circSmoc1 억제 시 석회화가 촉진되는 것을 확인하는 칼슘 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 circSmoc1를 억제에 따른 석회화 촉진 결과를 확인하기 위한 알리자린 레드(alizarin red)의 염색 결과를 나타낸다.
도 7는 인간, 마우스, 래트에서 circSmoc1의 보존 여부를 UCSC 유전자 브라우저에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 인간의 심장동맥 평활근세포에서의 circSmoc1의 발현 여부를 확인하기 위한 RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 3은 circSmoc1 과발현 시 석회화가 감소하는 것을 확인하는 칼슘 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 circSmoc1를 과발현에 따른 석회화 감소 결과를 확인하기 위한 알리자린 레드의 염색 결과를 나타낸다.
도 5는 circSmoc1을 siRNA 처리하여 circSmoc1 억제 시 석회화가 촉진되는 것을 확인하는 칼슘 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 circSmoc1를 억제에 따른 석회화 촉진 결과를 확인하기 위한 알리자린 레드(alizarin red)의 염색 결과를 나타낸다.
도 7는 인간, 마우스, 래트에서 circSmoc1의 보존 여부를 UCSC 유전자 브라우저에서 확인한 결과를 나타낸다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일 양태는 원형 RNA Smoc1(circSmoc1)을 포함하는 혈관 석회화 관련 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
세포에서 상기 원형 RNA Smoc1을 침묵시키는 경우 혈관 석회화가 촉진되고, 상기 원형 RNA Smoc1가 과발현하는 경우 혈관 석회화가 감소될 수 있다.
상기 원형 RNA Smoc1(circSmoc1)은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다. 상기 원형 RNA Smoc1(circSmoc1)은 역스플라이싱에 의하여 형성되고 Smoc1에서 발현되며 RNase R 소화에 내성이 있다.
상기 혈관 석회화는 만성 신장 질환의 흔한 합병증 중 하나로, 종종 심혈관 질환과 관련이 있다. 상기 혈관 석회화 관련 질환은 혈관 석회화, 말기신부전, 죽상동맥경화, 고혈압, 심근경색 또는 혈전증일 수 있다.
상기 원형 RNA Smoc1은 miRNA 억제제로 작용할 수 있으며, 이러한 원형 RNA Smoc1의 기능은 microRNA(miRNA) microarray 및/또는 luciferase reporter assay를 통해 유추할 수 있다. 상기 원형 RNA Smoc1은 miRNA 스폰지로서 기능함으로써 항-석회화 역할을 할 수 있다.
상기 원형 RNA Smoc1은 인간에서는 심장동맥 평활근세포에서 발현되며 인간, 래트 및 마우스에서 보존되므로 혈관 석회화의 문제를 해결하는 데 치료 표적으로 작용할 수 있다 (도 2 및 도 7).
본 발명의 일 실시예에 따른 원형 RNA Smoc1을 포함하는 조성물은 혈관 석회화를 억제 또는 해소하여 혈관 석회화 관련 질환에 대한 치료, 개선 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관의 석회화의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관 석회화가 의심되거나 발병된 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적 조성물은 비경구의 여러 가지 제형, 예컨대 주사의 형태로 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있고, 투여량의 조절은 당업계의 통상의 기술자에게 자명한 것이며, 의사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 유효성분으로서 circSmoc1 이외에 공지된 혈관 석회화 관련 질환 치료제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 원형 RNA Smoc1의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 혈관 석회화 관련 질환의 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 원형 RNA Smoc1의 발현량을 측정하는 단계는 서열번호 4 내지 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 프라이머를 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 4 내지 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 혈관 석회화 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
실시예
실시예 1. 세포 배양 및 석회화 유도
6주령 스프라구 돌리 래트(Sprague Dawley rat; (주)샘타코 바이오 코리아)에서 혈관평활근 세포를 분리하여 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였다. 실험군에는 혈관 석회화를 유도하기 위하여 2 mM 무기인산(inorganic phosphate; Pi)을 혈관평활근 세포에 각각 6 시간, 3 일, 6 일간 처리하였고, 배지만을 일반배지로 대체한 대조군도 같이 배양하였다. 이와 같이 배양한 혈관평활근 세포에서 RNA를 추출하였다.
혈관평활근 세포의 세포주(cell line)인 A10 세포를 10% 소태아혈청(FBS)을 포함한 둘베코수정이글배지로 배양하였고, 칼슘 분석과 알리자린 레드 염색(alizarin red staining)에 사용하였다.
인간 대동맥펑활근 세포(human coronary artery smooth muscle cells)는 평활근세포 성장 보충제(smooth muscle growth supplement) 또는 평활근세포 분화 보충제(smooth muscle differentiation supplement)가 포함된 미디엄 231(medium 231)에서 배양하였다.
실시예 2. RNA 분리 및 RNA 서열 분석
상기 실시예 1에서 배양된 세포로부터 TRIzol 시약을 이용하여 RNA를 분리하였고, 분리한 RNA에 DNase I을 처리하여 잔존하는 DNA를 RNA로부터 제거하였다.
RNA의 보존성(integrity)은 바이오애널라이저(Bioanalyzer)로 확인하였고, Ribo-Zero Gold rRNA 제거 키트를 사용하여 리보솜 RNA(ribosomal RNA)를 제거하였으며, TruSeq Stranded Total RNA Kit를 사용하여 RNA-서열 라이브러리를 만들었다. 상기 라이브러리는 Hiseq2500으로 시퀀싱하였다.
실시예 3. 원형 RNA의 확인 및 정량
Trimmomatic을 활용하여 상기 실시예 2로부터 획득한 시퀀싱 결과 중 질이 낮은 시퀀싱 결과를 제외하고, STAR aligner와 DCC 알고리즘을 사용하여 원형 RNA의 발현을 계산하였다.
실시예 4. 상보적 DNA 합성 및 증폭
동량의 RNA를 random hexamer 및 RevertAid reverse transcriptase를 사용하여 역전사시켜 상기 실시예 2에서 수득한 RNA의 상보적 DNA를 합성하였다. 원형 RNA 발현을 확인할 수 있는 래트 프라이머(하기 표 1 참조)를 제작하여 반정량적인(semi-quantitative) PCR을 수행하였다. PCR 결과는 Image J 프로그램으로 정량하였다.
실험 결과, 유전자 smoc1에서 생성되는 원형 RNA circSmoc1이 무기인산으로 혈관 석회화를 유도함에 따라 유의미한 농도 변화를 가지며 발현되었음을 혈관평활근 세포에서 확인하였다(도 1).
| 프라이머명 | 서열(5'→3') | 산물 크기 (bp) | 서열번호 |
| circ_smoc1_rat_Fwd | CTG CAC GGA CGA GCC ACT GAT G | 155 | 4 |
| circ_smoc1_rat_Rev | CAC AGC CCC TAC CTT ATG GAT TAA GC | 5 |
또한, 인간 프라이머(하기 표 2 참조)를 제작하여 반정량적인 PCR로 발현을 확인하였다(도 2).
| 프라이머명 | 서열(5'→3') | 산물 크기 (bp) | 서열번호 |
| circ_smoc1_human_Fwd | CTG CAC AGA AGA GCC ACT GAT G | 155 | 6 |
| circ_smoc1_human_Rev | CAC AGC CCC AAC TCT ATG GAT TAA AC | 7 |
실시예 5. 원형 RNA 클로닝
circSmoc1 과발현 벡터를 제작하기 위하여, circRNA 전체 서열을 프라이머(하기 표 3 참조)로 합성하였다. 프라이머 서열은 원형 RNA 엑손 서열 일부와 제한효소, 그리고 벡터서열을 포함하였다.
클로닝을 위하여 pcDNA3.1(+) Laccase2 MCS 엑손 벡터(Addgene 플라스미드 #69893)를 원형 RNA 과발현 벡터 제작을 위한 벡터로 사용하였다. 상기 pcDNA3.1(+) Laccase2 MCS 엑손 벡터를 제한효소(PacI, SacII)로 원형 RNA를 삽입할 부위를 절단하고 해당 부위에 프라이머로 합성된 circSmoc1을 삽입하여 circSmoc1 과발현 벡터를 제작하였다.
| 프라이머명 | 서열(5'→3') | 산물 크기 (bp) | 서열번호 |
| Smoc1_lac_L_Fwd | TTTATGCAGAAATTAATTAAGTGCAGTGTCATACGTAC | 325 | 8 |
| Smoc1_lac_L_Rev | GAATACTTACGCTCCGCGGCTGAATTTCTTACATTGG | 9 |
실시예 6. siRNA의 제작
원형 RNA의 기능 연구를 위하여, 원형 RNA가 스플라이싱 되는 부위에 siRNA를 제작하였다(하기 표 4 참조). siRNA 제작을 위하여 Horizon Discovery siDesign center를 활용하였고 siRNA 서열이 내부에 2차 구조를 형성하지 않는 것을 확인 후 제작을 완료하였다.
| 프라이머명 | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| smoc1_siRNA_1_sense | AAA UUC AGG UGC AGU GUC UUU | 10 |
| smoc1_siRNA_1_antisense | UGA CAC UGC ACC UGA AUU UUU | 11 |
| smoc1_siRNA_2_sense | AGA AAU UCA GGU GCA GUU UUU | 12 |
| smoc1_siRNA_2_antisense | ACA CUG CAC CUG AAU UUC UUU | 13 |
실시예 7. 칼슘 측정 어세이
과발현 벡터 트랜스펙션(transfection)을 위하여 24-웰 플레이트에 3.5 × 104의 세포를 접종하였고, 1 일 후에 0.25 μg laccase2 벡터 또는 laccase2 벡터 내에 circSmoc1가 포함된 벡터를 트랜스펙션 하였다. 그 다음 날부터 3 일간, 실험군들인 석회화 유도시키는 세포들에는 2 mM 무기인산을 처리하였고, 대조군에는 무기인산이 없는 일반 배지를 바꿔주며 배양하였다. 그 다음 날, QuantiChrom calcium assay kit를 사용하여 칼슘량을 측정하였고 단백질 양은 Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate을 사용하여 측정하였다.
한편, siRNA 트랜스펙션을 위해서 24-웰 플레이트에 2.0 × 104의 세포를 접종하였고, 1 일 후에 리포펙타민™ 3000을 이용하여 트랜스펙션하였고, siRNA의 최종 농도가 30 nM가 되게끔 하였다. 이후 실험군에는 무기인산을 3 일간 처리하였고 위와 같이 칼슘과 단백질량을 측정하였다.
실험 결과, circSmoc1가 포함된 벡터를 트랜스펙션하여 과발현시킨 경우, 공벡터(EV)를 트랜스펙션 시킨 경우보다 칼슘 이온의 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
또한, sicircSmoc1_1, sicircSmoc1_2를 주입하여 circSmoc1을 넉다운(knockdown)시킨 경우 대조군에 비해 칼슘 이온의 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 5).
실시예 8. 알리자린 레드 염색 및 정량
세포 내에서 circSmoc1를 과발현시키거나 siRNA로 억제할 때 혈관 석회화에 미치는 영향을 보기 위하여, 24-웰 플레이트에 혈관평활근세포주를 접종하였다. 1일 후에 세포에 circSmoc1 과발현 벡터 또는 siRNA를 처리하였다. 그 다음 날부터 3 간 4 mM 무기인산을 처리하였다.
그 이후, 알리자린 레드 염색을 위하여 세포를 PBS 및 1차 증류수로 세척하고, 10% 포르말린으로 상온에서 1시간 동안 고정시켰다. 그 후 포르말린을 제거하고 다시 1차 증류수로 세포를 세척한 후 물기가 없을 때 40 mM 알리자린 레드 용액(pH 4.2)을 처리하여 상온에서 하룻밤 동안 방치하였다. 알리자린 레드 염색을 정량하기 위해서 300 μL의 10% 세틸피리디늄클로라이드를 각 웰에 넣었고 30분간 방치하였다.
그 후, 세포액 중 200 μL를 분리하고, 562 nM에서 마이크로플레이트 흡광도를 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
실험 결과, circSmoc1을 과발현시킨 경우 세포 내에서 칼슘 침전이 현저히 감소하고(도 4), circSmoc1을 넉다운시킨 경우 세포 내에서 칼슘 축적이 현저하게 증가하는 것(도 6)을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Composition comprising circular RNA for treating or diagnosing
vascular calcification
<130> P-190257
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 286
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human circSmoc1 (hg19)
<400> 1
gtgcagtgcc atacttacac tgggtactgc tggtgtgtca ccccggatgg gaagcccatc 60
agtggctctt ctgtgcagaa taaaactcct gtatgttcag gttcagtcac cgacaagccc 120
ttgagccagg gtaactcagg aaggaaagat gacgggtcta agccgacacc cacgatggag 180
acccagccgg tgttcgatgg agatgaaatc acagccccaa ctctatggat taaacacttg 240
gtgatcaagg actccaaact gaacaacacc aacataagaa attcag 286
<210> 2
<211> 286
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rat circSmoc1 (rn6)
<400> 2
gtgcagtgtc atacgtacac agggtactgc tggtgtgtca ccccagacgg gaagcccatc 60
agtggctcgt ccgtgcagaa taaaactcct gtatgttcag gtccagtcac tgacaagccc 120
ttgagccagg gtaactcagg aaggaaagat gatggctcta aacccacgcc cacgatggag 180
acccagcctg tgttcgatgg agatgaaatc acagccccta ccttatggat taagcacttg 240
gtaatcaaag actccaaatt gaataacacc aatgtaagaa attcag 286
<210> 3
<211> 319
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse circSmoc1 (mm9)
<400> 3
gtgcagtgcc atacgtacac agggtactgc tggtgtgtca ccccagatgg caagcccatc 60
agtggttctt ccgtgcagaa taaaactcct gtatgttcag gtccagttac cgacaagccc 120
ttgagccagg gtaattcagg aagaaaagtc tcctttcgtt tctttttaac cctcaattca 180
gatgatggct ctaaacccac gcccacgatg gagacccaac ctgtgttcga tggagatgaa 240
atcacagccc ccaccttatg gattaagcac ttggtaatca aagactccaa gttgaataac 300
accaacgtaa gaaattcag 319
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (circ_smoc1_rat_Fwd)
<400> 4
ctgcacggac gagccactga tg 22
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (circ_smoc1_rat_Rev)
<400> 5
cacagcccct accttatgga ttaagc 26
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (circ_smoc1_human_Fwd)
<400> 6
ctgcacagaa gagccactga tg 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (circ_smoc1_human_Rev)
<400> 7
cacagcccca actctatgga ttaaac 26
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (Smoc1_lac_L_Fwd)
<400> 8
tttatgcaga aattaattaa gtgcagtgtc atacgtac 38
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (Smoc1_lac_L_Rev)
<400> 9
gaatacttac gctccgcggc tgaatttctt acattgg 37
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (smoc1_siRNA_1_sense)
<400> 10
aaauucaggu gcagugucuu u 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (smoc1_siRNA_1_antisense)
<400> 11
ugacacugca ccugaauuuu u 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (smoc1_siRNA_2_sense)
<400> 12
agaaauucag gugcaguuuu u 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (smoc1_siRNA_2_antisense)
<400> 13
acacugcacc ugaauuucuu u 21
Claims (8)
- 원형 RNA Smoc1을 포함하고, 상기 원형 RNA Smoc1은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 말기신부전, 죽상동맥경화, 고혈압, 심근경색 또는 혈전증으로 구성되는 군에서 선택되는 혈관 석회화 관련 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 원형 RNA Smoc1은 miRNA 억제제로 작용하는 것을 기술적 특징으로 하는 혈관 석회화 관련 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물. - 삭제
- 원형 RNA Smoc1의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 원형 RNA Smoc1의 발현량을 측정하는 단계는 서열번호 4 내지 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 갖는 프라이머를 이용하는, 말기신부전, 죽상동맥경화, 고혈압, 심근경색 또는 혈전증으로 구성되는 군에서 선택되는 혈관 석회화 관련 질환의 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- 삭제
- 제5항에 있어서,
원형 RNA Smoc1의 발현량이 감소하면 혈관 석회화 관련 질환이 발생하거나 발생할 가능성이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 혈관 석회화 관련 질환의 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 원형 RNA Smoc1의 발현량 측정을 위한 서열번호 4 내지 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 갖는 프라이머를 포함하고, 말기신부전, 죽상동맥경화, 고혈압, 심근경색 또는 혈전증으로 구성되는 군에서 선택되는 혈관 석회화 관련 질환의 진단용 조성물.
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| US20170240964A1 (en) | 2016-02-19 | 2017-08-24 | Chuen Yan LEUNG | Genetic markers for engraftment of human cardiac ventricular progenitor cells |
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| KR101775385B1 (ko) | 2016-09-22 | 2017-09-06 | 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 | 망고스틴 크산톤 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관 석회화 억제용 조성물 |
-
2019
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US20170240964A1 (en) | 2016-02-19 | 2017-08-24 | Chuen Yan LEUNG | Genetic markers for engraftment of human cardiac ventricular progenitor cells |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Chinese Medical Journal. 2019. Vol.132, No.20. pp.2476-2484. |
| Circulation Research. 2019. Vol.125, Supplement 1. Abstract 325.* |
| Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2020. Vol.19, pp.31-41.* |
| PLOS ONE. 2018. Vol.13, No.6, Article e0198104.* |
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| KR20210074722A (ko) | 2021-06-22 |
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