KR102330946B1

KR102330946B1 - 백과 추출물을 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물

Info

Publication number: KR102330946B1
Application number: KR1020170132729A
Authority: KR
Inventors: 김태종; 함영석
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2021-11-25
Also published as: KR20190041300A; KR102360859B1; KR20210137960A

Abstract

백과 추출물을 포함하는 바이오필름 형성 억제용 조성물 및 바이오필름 형성과 관련된 질환의 예방 및 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

백과 추출물을 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물{Composition for Preventing Biofilm Formation Comprising Extract of Kernel of Ginko biloba}

본 발명은 백과 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물 및 바이오필름 형성과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

바이오필름(biofilm)은 생물막이라고도 불리우며, 미생물이 세포 주위에 다당체를 생산하고 이것을 매개로 인접한 미생물과 응집하여 고체나 생체 표면에 막(film)을 형성하고 있는 상태를 의미한다. 바이오필름을 형성하는 미생물은 부유 상태의 미생물보다 항생제에 대한 저항성이 1000배 이상 높고, 바이오필름 형성은 세균성 심내막염(bacterial endocarditis), 치아 우식증(dental caries), 만성 부비동염(chronic sinusitis), 식중독, 폐렴 등과 같이 여러 질병의 발병(pathogenesis)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1).

임상에서는 카테터(catheter), 스텐트(stent)와 같은 의료기구에 대한 바이오필름 오염이 문제가 되고 있다. 의료기구 오염을 유발하는 미생물에는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 및 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 등이 있으며, 상기 미생물의 오염으로 인하여 골수염, 독소충격증후군, 식중독 및 피부 감염증 등이 유발될 수 있다.

따라서 미생물 감염에 의한 질병을 예방하기 위해서는 미생물의 바이오필름 형성을 효과적으로 억제하는 것이 필요하다. 이러한 바이오필름의 형성을 억제하기 위하여 기존에는 바이오필름을 형성하는 미생물의 생장을 저해하는 항균 활성을 이용하였다. 그러나 항균 활성을 갖는 물질로 바이오필름을 형성하는 미생물의 생장을 억제하면 내성을 갖는 미생물만 남게 되며, 결과적으로 바이오필름의 제거나 형성 억제를 어렵게 할 수 있다. 따라서, 미생물의 생장에 미치는 영향은 줄이면서 바이오필름의 형성을 억제할 수 있는 물질을 개발하는 것이 필요하다.

본 발명자들은 천연물질인 백과 추출물이 바이오필름 형성을 억제하는 능력이 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 제10-1653662호

1. http://www.intron.co.kr/sub/technologies/biofilm.php

본 발명의 일 목적은 백과 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물을 유효성분으로 함유하는 바이오필름 형성과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 백과 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, '바이오필름(biofilm, 생물막)'은 미생물에 의하여 형성된 막 모양의 구조체를 의미하며, 상호 연결된 미생물 세포층 및 미생물 분비물로 이루어진 구조적 특징을 가진다. 미생물은 다당류를 생성하는 효소를 세포 외부로 분비하여 외부 환경에 존재하는 당물질로부터 수용성 또는 불용성 다당류를 형성하며, 이러한 불용성 다당류가 지속적으로 축적되면 필름 형태의 얇은 바이오필름이 형성된다. 형성된 바이오필름은 미생물 사이의 응집에 도움을 주어 결과적으로 낭포성 섬유종(cystic fibrosis), 치아 우식증, 패혈증과 같은 난치성 감염증 등의 질환을 유발할 수 있다. 또한, 기관이나 구조물의 손상을 일으킬 수 있으며, 카테터와 같은 의료 기구를 오염시킬 수 있다.

본 발명의 바이오필름 형성 억제용 조성물의 유효성분으로 사용되는 백과는 은행나무(Gingko biloba L.) 열매의 속씨를 말하며, 만성적인 기침, 가래 및 천식 치료에 이용되어 왔다. 또한, 기관지 평활근 이완 효능, 혈관 확장 효능이 있는 것으로 알려져 있으나 미생물에 의한 바이오필름의 형성을 억제하는 효과에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 백과 추출물은 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 백과를 분쇄한 후 추출에 통상적으로 사용되는 용매를 첨가하고, 적절한 온도와 압력으로 추출하여 백과 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 용매는 정제수, 헥산, 1,3-부틸렌글리콜, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 아세톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 용매는 정제수 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있다.

한편, 상기 백과 추출물은 상술한 용매 추출법에 의한 추출물과 통상적인 정제 과정을 거친 추출물을 모두 포함한다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프(cut-off) 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시한 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 백과 추출물에 포함될 수 있다. 또한, 상기 백과 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 바이오필름 형성 억제용 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 상기 백과 추출물을 0.1 내지 20 중량%, 또는 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있으며, 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 바이오필름은 예르시니아 속(Yersinia sp.) 및 크산토모나스 속(Xanthomonas sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 미생물에 의하여 형성될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 미생물은 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 크산토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 예르시니아 엔테로콜리티카가 형성하는 바이오필름에 의하여 식중독, 장염 등이 유발될 수 있고, 크산토모나스 오리재가 벼의 도관에서 바이오필름을 형성하면 벼의 흰잎마름병을 유발시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 바이오필름은 식품의 표면 등과 같이 미생물의 생장 또는 증식이 가능한 곳에서 형성되기 때문에 이를 방지하기 위하여 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물을 식품 또는 화장료 조성물로 이용할 수 있다. 또한, 카테터, 스텐트와 같은 의료기구에 대한 바이오필름 형성을 방지하기 위하여 본 발명에 따른 바이오필름 형성 억제용 조성물을 코팅용 조성물로 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물을 유효성분으로 함유하는, 예르시니아 엔테로콜리티카에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 질병은 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이제 제한되지 아니한다.

예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)는 장내세균과에 속하는 그람 음성(Gram-negative) 세균이며, 위장염(gastroenteritis; 식중독 및 장염)을 유발한다. 사람에서는 급성 위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반 등 다양한 질병을 발생시키며, 바이오필름을 형성함으로써 외부의 자극이나 항생제 처리에 대해 저항성을 가지는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 백과 추출물이 예르시니아 엔테로콜리티카에 의한 바이오필름 형성을 효과적으로 억제할 수 있으므로 바이오필름 형성 억제용 조성물을 예르시니아 엔테로콜리티카에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당 업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량'이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으며, 비경구 투여의 형태일 때 1 내지 100 mg/kg/day의 유효량으로 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물을 유효성분으로 함유하는 벼의 흰잎마름병(bacterial leaf blight of rice) 방제용 조성물을 제공한다.

벼의 흰잎마름병은 쌀 생산에 가장 많은 경제적 손실을 야기하는 질병으로 세계적으로 광범위하게 발생한다. 벼의 도관에 크산토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae)가 흡착하여 바이오 필름을 형성하면 도관의 통로를 막게 되고, 이를 통해 영양분이나 물의 전달이 원활하지 않게 된다. 이에 따라 잎이 죽기 시작하며, 벼가 죽거나 살아남더라도 쌀을 정상적으로 생산할 수 없게 된다. 따라서 크산토모나스 오리재에 의한 바이오필름의 형성을 억제하면 벼 도관의 막힘 현상을 감소시킬 수 있으며, 크산토모나스 오리재에 감염되어도 벼가 정상적으로 자랄 수 있어 벼의 수확량을 정상적으로 유지할 수 있다.

상기 벼의 흰잎마름병 방제용 조성물은 직접 분사 가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다. 또한, 상기 방제용 조성물은 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다.

또한, 상기 흰잎마름병 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화될 수 있으며, 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로서 제조될 수 있다. 적절한 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 벼의 흰잎마름병 방제용 조성물은 백과 메탄올 추출물, 백과 물 추출물, 백과 50% 에탄올 추출물 또는 백과 95% 에탄올 추출물을 포함하는 바이오필름 형성 억제용 조성물을 포함할 수 있다.

백과 추출물은 미생물이 생성하는 바이오필름의 형성을 효과적으로 억제할 수 있으므로 바이오필름 형성 억제용 조성물 및 바이오필름 형성과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 백과 추출물이 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)의 바이오필름 형성에 미치는 효과를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다: A는 백과 메탄올 추출물, B는 백과 50% 에탄올 추출물, C는 백과 95% 에탄올 추출물 결과이며, X축의 '희석 비율'은 백과 추출물의 희석 비율을 의미한다.
도 2는 백과 추출물이 예르시니아 엔테로콜리티카의 생장에 미치는 효과를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다: A는 백과 메탄올 추출물, B는 백과 50% 에탄올 추출물, C는 백과 95% 에탄올 추출물 결과이며, X축의 '희석 비율'은 백과 추출물의 희석 비율을 의미한다.
도 3은 크산토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae)에 대한 백과 추출물의 바이오필름 형성 억제 효과를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다: A는 백과 메탄올 추출물, B는 백과 물 추출물, C는 백과 50% 에탄올 추출물 및 D는 백과 95% 에탄올 추출물 결과이며, X축의 '희석 비율'은 백과 추출물의 희석 비율을 의미한다.
도 4는 백과 추출물이 크산토모나스 오리재의 생장에 미치는 효과를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다: A는 백과 메탄올 추출물, B는 백과 물 추출물, C는 백과 50% 에탄올 추출물 및 D는 백과 95% 에탄올 추출물 결과이며, X축의 '희석 비율'은 백과 추출물의 희석 비율을 의미한다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 백과 추출물 제조

백과 10g에 물, 메탄올, 50% 에탄올 및 95% 에탄올 각각을 100㎖를 첨가하고, 50℃ 항온 수조에서 3시간 동안 추출하였다. 이후 여과지(filter paper)를 사용하여 추출물을 1차 여과하고, 여과된 1차 추출물의 부피를 측정하였다.

물 추출물은 셀룰로스 아세테이트 필터(cellulose acetate filter; 0.2 ㎛ pore size)로 추가로 여과한 후 실험에 이용하였다. 메탄올 추출물, 50% 에탄올 추출물 및 95% 에탄올 추출물은 감압 농축기(rotary evaporator)로 추출물 전체 부피의 10%까지 농축한 후 다시 여과하였다. 여과액에 1차 추출물의 부피만큼 물을 첨가하고, 셀룰로스 아세테이트 필터로 추가로 여과한 후 실험에 이용하였다.

실시예 2: 백과 추출물의 바이오필름 형성 억제 효과

2-1. 예르시니아 엔테로콜리티카에 대한 바이오필름 형성 억제 효과

예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica; 이하, Y. enterocolitica로 기재함)는 TYE 한천 플레이트(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1.5% agar)에 도말(streaking)한 후, 26℃에서 2일 동안 배양하였다. 플레이트에서 단일 군집(single colony)을 하나 취하여 TYE 액체배지 5㎖에 접종하고, 26℃에서 1일 동안 250rpm으로 진탕배양하였다.

96-웰 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride, PVC) 마이크로플레이트에 M63 액체배지(3g/L KH₂PO₄, 7g/L K₂HPO₄, 2g/L (NH₄)₂SO₄, 0.5 mg/L FeSO₄, 0.2% glucose, 0.02% MgSO₄)를 100 ㎕씩 분주하였다. 여기에 실시예 1에서 제조한 메탄올 추출물을 1㎕ 분주하고, 50% 에탄올 및 95% 에탄올 추출물은 5㎕를 분주하였다. 다음으로 각각의 웰에 상기 배양한 Y. enterocolitica를 OD₆₀₀이 0.05가 되도록 접종하여 26℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 OD₅₉₅에서 흡광도(optical density, OD; absorbance)를 측정하여 Y. enterocolitica의 세포 밀도를 확인하고, 플레이트에서 배양액을 제거한 후 증류수로 3번 부드럽게 세척하였다. 각각의 웰에 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액 100㎕를 분주하여 15분 동안 상온에서 바이오필름을 염색하였다. 15분 후 증류수로 3번 세척하고, 크리스탈 바이올렛을 용출시키기 위하여 95% 에탄올 100㎕를 첨가하여 15분 동안 방치하였다. 이후 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)로 OD₅₉₅에서 흡광도를 측정하여 형성된 바이오필름의 양을 정량하였다.

확인 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 백과 메탄올 추출물, 50% 에탄올 추출물 및 95% 에탄올 추출물에 의하여 바이오필름 형성이 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

2-2. 크산토모나스 오리재에 대한 바이오필름 형성 억제 효과

크산토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae; 이하, X. oryzae로 기재함)는 YGC 한천 플레이트(5% glucose, 0.5% yeast extracts, 1.25% CaCO₃ _,1.5% agar)에 도말한 후, 28℃에서 2일 동안 배양하였다. 플레이트에서 단일 군집을 하나 취하여 210 액체배지(0.5% sucrose, 0.8% casein enzymatic hydrolysate, 0.4% yeast extract, 0.3% K₂HPO₄, 0.03% MgSO₄7H₂O) 5㎖에 접종하고, 28℃에서 2일 동안 250rpm으로 진탕배양하였다.

96-웰 폴리비닐 클로라이드 마이크로플레이트에 XOM2 액체배지(670μM L-methionine, 10 mM sodium L-(+)-glutamate monohydrate, 14.7mM KH₂PO₄, 40μM MnSO₄, 240μ Fe(III)-EDTA, 5 mM MgCl₂, 0.18% D-xylose, pH6.5)를 사용한 것을 제외하고, 상기 2-1과 동일한 방법으로 백과 추출물(메탄올 추출물 1㎕, 물 추출물과 50% 에탄올 추출물 및 95% 에탄올 추출물은 각각 5㎕ 이용)의 바이오필름 형성 억제 효과를 확인하였다.

확인 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 백과 메탄올 추출물, 백과 물 추출물, 백과 50% 에탄올 추출물 및 백과 95% 에탄올 추출물에 의하여 바이오필름 형성이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있었다.

본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 구체예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

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백과 추출물을 유효성분으로 함유하는, 예르시니아 엔테로콜리티카에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 질병은 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
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