KR102317282B1 - 다알리아 발효 추출물을 포함하는 피부 장벽 강화 및 항염증용 화장료 조성물 - Google Patents

다알리아 발효 추출물을 포함하는 피부 장벽 강화 및 항염증용 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다알리아 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화 및 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 다알리아(Dahlia pinnata) 추출물에 바실러스(Bacillus) 속 균주를 접종 및 발효시켜 얻어진 다알리아 발효 추출물을 유효성분으로 포함함으로써, 피부 각질형성 단백질 및 보습인자의 발현량을 증가시키고 염증성 인자의 생성을 억제하여, 피부 장벽 강화 및 항염증 효과를 나타낼 수 있다.

Description

다알리아 발효 추출물을 포함하는 피부 장벽 강화 및 항염증용 화장료 조성물{Cosmetic Composition for Skin Barrier Enhancement and Skin Anti-inflammation Comprising Dahlia Pinnata Fermented Extract}
본 발명은 다알리아 발효 추출물을 포함하는 피부 장벽 강화 및 항염증용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 다알리아 발효 추출물을 유효성분으로 포함하여 피부 각질형성 단백질 및 보습인자의 발현량을 증가시키고 염증성 인자의 생성을 억제할 수 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 표피, 진피 및 피하지방의 3층으로 이루어져 있는데, 이 중 가장 외층인 표피는 외부 환경과 항상 접하고 있는 신체부위로 보호장벽의 역할을 하고 있다. 표피의 각질층은 죽은 각질세포로 이루어진 단백질과 각질세포 사이에 존재하는 지질로 이루어지는데, 이러한 각질층에 존재하는 피부 장벽은 기능적으로 각질세포의 분열 및 분화를 조절하여 피부를 보호하고, 체내 물질의 유출을 방지하며, 수분과 전해질의 소실을 억제하는 중요한 기능을 한다. 이에 피부 장벽 강화를 통해 수분 부족을 최소화하고 피부 항상성을 유지하는 것은 피부보호에 있어서 매우 중요하다고 할 수 있다.
한편, 피부가 외부인자나 자극원에 과도하게 노출되면 홍반, 부종, 가려움 등의 피부자극 및 면역염증반응이 유발되는데, 이러한 피부 자극 스트레스에 의한 피부 트러블은 미관상 문제가 될 뿐만 아니라, 면역염증반응 과정 및 부산물 등으로 인한 피부색소침착부터 주름증가에 이르기까지 피부 건강에 전반적으로 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Welss T, Basketter DA, Schroder KR. In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models. Toxicol In Vitro. 2004;18:231-43). 이에 면역 염증을 완화시킴으로써 피부자극을 감소시키고 피부 항상성을 유지할 수 있는 조성물의 개발이 요망되고 있다.
한편, 다알리아(Dahlia pinnata)는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀이다. 이러한, 다알리아는 덩이줄기와 초본의 특징을 지니는 식물로서 멕시코가 원산지이며, 관상용으로 각국에서 널리 재배되고 있다. 다알리아는 고구마처럼 생긴 뿌리로 번식한다. 다알리아의 줄기는 원기둥 모양이고 가지를 잘 치며 털이 없고 녹색을 띠며 높이가 1.5~2m이다. 잎은 마주나고 1~2회 깃꼴로 갈라진다. 다알리아의 작은 잎은 달걀 모양이고 가장자리에 톱니가 있으며 표면은 짙은 녹색이고 뒷면은 흰빛을 띠고 잎자루에 다소 날개가 있다.
다알리아의 덩이 뿌리는 진통 작용이 있어 충치로 인한 치통 이하선염에 약용한다. 또한, 다알리아 꽃잎은 심혈관질환, 치매, 암 등의 질병에 효능이 있다. 이러한, 다알리아 꽃잎을 추출한 다알리아 꽃 조성물을 식품의 원료로 사용하면 심혈관질환, 치매, 암 등의 질병에 약용이 가능하다.
본 발명의 발명자들은 국제 특허출원 PCT/KR2018/013754호를 통해 다알리아 추출물이 항산화 효능을 가진다는 것을 보고한 바 있는데, 이러한 다알리아 추출물을 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 이용하여 발효시킬 경우, 항균, 피부 장벽 강화, 피부 면역 증강 및 염증 완화의 효능을 나타낸다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 피부 장벽 강화 및 항염증 효능을 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다알리아 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 다알리아 발효 추출물은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 다알리아(Dahlia pinnata) 추출물에 접종 및 발효시켜 얻어진 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 바실러스 속 균은 바실러스 리체니포미스 R450403(Bacillus licheniformis R450403, 수탁번호: KCTC14348BP) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1(Bacillus amyloliquefaciens CTC 2-5-1, 수탁번호: KCTC14347BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기 다알리아 추출물은 다알리아 꽃잎의 에탄올 추출물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 장벽 강화용 화장료 조성물일 수 있다.
상기 피부 장벽 강화용 화장료 조성물에서, 상기 다알리아 발효 추출물의 농도는 1 내지 10mg/ml인 것이 바람직하다.
상기 피부 장벽 강화용 화장료 조성물은 피부 세포에서 필라그린(filaggrin) 및 케라틴 1(keratin 1)으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질의 발현을 증가시켜 피부 장벽을 강화하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항염증용 화장료 조성물일 수 있다.
상기 항염증용 화장료 조성물에서, 상기 다알리아 발효 추출물의 농도는 1 내지 20mg/ml인 것이 바람직하다.
상기 항염증용 화장료 조성물은 산화질소(nitric oxide, NO) 및 인터류킨-1 베타(interleukin-1β, IL-1β)로부터 선택되는 1종 이상의 염증성 인자의 생성을 억제하여 항염 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 일반적인 균주로는 발효가 진행되지 않는 다알리아 추출물을 발효시킬 수 있는 균주를 사용하여 다알리아 발효 추출물을 제조하고 이를 화장료 조성물에 적용함으로써, 피부 각질형성 단백질 및 보습인자의 발현량을 증가시키고 염증성 인자의 생성을 억제하여, 피부 장벽 강화 및 항염증 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다알리아 조성물의 제조방법의 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다알리아 추출물을 준비하는 단계를 설명하기 위한 순서도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 분말 형태의 다알리아 조성물의 제조방법의 순서도이다.
도 4의 (a)는 바실러스 리체니포미스 R450403에서의 성장 곡선(growth curve)이고, 도 4의 (b)는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1에서의 성장 곡선이다.
도 5a 및 5b는 본 발명의 실시예에 따라 R450403 및 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물의 필라그린 발현양을 나타낸 그래프이다.
도 6a 및 6b는 본 발명의 실시예에 따라 R450403 및 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물의 케라틴 1 발현양을 나타낸 그래프이다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 실시예에 따라 R450403 및 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물의 일산화질소 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 8a 및 8b는 본 발명의 실시예에 따라 R450403 및 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물의 인터류킨-1 베타 생성량을 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라, 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 다알리아 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화 및 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서, '다알리아 발효 추출물'이란 다알리아 추출물에 발효 균주를 접종 및 발효시켜 얻어진 산물을 의미하며, '다알리아 추출물'이란 다알리아 꽃잎에 에탄올 등의 추출 용매를 첨가하여 추출된 산물을 의미한다.
본 발명에서, 상기 다알리아 발효 추출물은 다알리아(Dahlia pinnata) 추출물에 바실러스(Bacillus) 속 균주를 접종 및 발효시켜 얻은 산물일 수 있다.
본 발명자들은 다양한 균주에 대하여 다알리아 추출물 발효 연구를 수행하였으나, 대부분의 균주가 다알리아 추출물 배지에서 정상적으로 성장하지 못하고 발효가 진행되지 못한다는 것을 발견하였다. 이에 본 발명자들은 약 1,500개의 균주 라이브러리로부터 1차적으로 다알리아 추출물의 발효에 적합한 약 400개의 후보 균주를 선정하고, 단백질 및 당의 비율이 높은 다알리아 추출물에 적합한 아밀레이즈(amylase), 프로테이즈(protease) 등의 활성이 좋은 균주 71종을 선정하였으며, 이들 중 다알리아 배지에서 생장 가능성을 보인 36종의 바실러스 속 균주를 대상으로 추가 실험을 진행하였다. 그 결과 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)만이 다알리아 배지에서 정상적인 생육성장 곡선을 나타내었으며, 상기 2종의 균주만이 다알리아 발효 추출물을 제조할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 다알리아(Dahlia pinnata) 추출물에 접종 및 발효시켜 얻어진 다알리아 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 해결과제로 하며, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 다알리아(Dahlia pinnata) 추출물에 접종 및 발효시킬 경우, 피부 장벽 강화, 피부 면역 증강 및 염증 완화의 효능을 나타낼 수 있다는 것을 발견하였다.
바람직하게는, 본 발명에 적용 가능한 바실러스 속 균주는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) R450403, 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CTC 2-5-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 이 중 바실러스 리체니포미스 R450403은 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC14348BP(수탁일자: 2020년 10월 28일)로 기탁되어 있으며, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1은 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC14347BP(수탁일자: 2020년 10월 28일)로 기탁되어 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 다알리아 발효 추출물을 포함함으로써 피부 장벽(skin barrier)을 강화시킬 수 있다.
피부의 최외곽에 위치하는 표피는 외부로부터의 자극에 대한 방어와 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능을 수행하는데, 이러한 기능을 위해서는 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되고 유지되어야 한다. 각질형성세포는 천연보습인자(natural moisturizing factor, NMF)와 세포간 지질을 생성하면서 각질층을 형성하여, 피부에서 물리적 장벽 및 투과 장벽 역할을 하게 된다.
이러한 피부 장벽은 각질층을 형성하는 단백질의 응집을 강화하고 피부의 보습인자를 증가시킴으로써 강화될 수 있다. 구체적으로, 각질층을 형성하는 단백질이 단단하고 편평한 구조의 각질세포를 형성함으로써 피부의 물리적 장벽을 강화시킬 수 있으며, 수분을 흡수하는 성질이 뛰어난 보습인자들이 각질층에서 습윤제의 역할을 하고, 피부의 효소들이 정상적으로 활동하도록 돕는 역할을 한다.
본 발명에서, 다알리아 발효 추출물이 피부 각질층 형성에 있어서 단백질 및 보습인자의 발현양을 증가시켜, 피부 장벽을 강화시킬 수 있다. 구체적으로 본 발명의 실시예에서는, 다알리아 발효 추출물을 포함하는 다알리아 조성물을 각질세포에 처리하는 경우 필라그린(filaggrin) 및 케라틴 1(keratin 1)의 발현양이 증가하는 결과를 확인하였다.
케라틴은 각질형성세포가 각질세포로 분화되어 가면서 합성되는 단백질로서, 각질층 세포의 50% 이상, 각질층 전체 단백질 중에서는 약 80%를 차지한다. 케라틴 섬유는 각질층 세포 내부 전체에 분포하여 물리적 장벽을 형성하는 역할을 하므로, 케라틴의 발현양이 증가하는 경우 피부에 단단한 장벽이 형성되어 외부의 자극으로부터 피부를 보호할 수 있다. 케라틴 단백질 중 정상적인 표피 구조 단백질로는 케라틴 1, 케라틴 10 등을 들 수 있다.
필라그린은 케라틴 결합 단백질로서, 케라틴 미세 섬유간의 결합을 촉진시켜서 장벽을 강화하는 기능을 한다. 이후, 필라그린은 각질층 상부로 올라가면서 아미노산으로 분해되어, 천연보습인자인 자유아미노산과 PCA(pyrrolidone carboxylic acid)가 생성된다. 이로써, 필라그린은 피부 장벽을 강화시킬 뿐 아니라 그 분해산물이 피부를 촉촉하게 유지하는 데 매우 중요한 역할을 한다. 뿐만 아니라, 필라그린은 분해과정을 통하여 시트룰린(citrulline), PCA, trans-UCA를 생성함으로써, 각질층의 수화, pH 정상화, 투과 장벽 형성, 항균 및 항염 작용에도 도움을 준다. 따라서 필라그린은 피부 장벽을 강화시키고, 천연보습인자로서 작용할 뿐만 아니라, 피부염의 개선과도 관련이 있다.
본 발명의 다알리아 발효 추출물은 필라그린 및 케라틴 1의 발현을 증가시킬 수 있고, 이에 따라 피부의 물리적 장벽을 강화시켜 외부 자극으로부터 피부를 보호할 수 있으며, 보습 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 피부 장벽 강화용 화장료 조성물에 있어서, 다알리아 발효 추출물의 농도가 높아질수록, 피부 장벽 강화 효과가 높아질 수 있다. 예를 들어, 상기 다알리아 발효 추출물의 농도는 1 내지 10mg/ml일 수 있다. 구체적으로, 바실러스 리체니포미스로 발효시킨 다알리아 발효 추출물의 농도는 3 내지 8mg/ml, 바람직하게는 4 내지 6mg/ml일 수 있으며, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스로 발효시킨 다알리아 발효 추출물의 농도는 2 내지 8mg/ml, 바람직하게는 4 내지 6mg/ml일 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 다알리아 발효 추출물을 포함함으로써 항염증 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서, '항염증'이라 함은 염증을 완화시키거나 억제하는 활성을 의미한다. 염증(inflammation)은 인체 내부 또는 외부에서 오는 다양한 자극에 대한 생체 조직의 방어기작으로, 활성화된 대식세포(macrophage)에서는 염증 유발 사이토카인(cytokine)이 분비되고, 염증 매개 물질을 과도하게 생성하여 염증 과정을 더욱 활성화시킨다.
염증 유발 사이토카인은 인터류킨-1 베타(interleukin-1β, IL-1β), 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등이 있다. 예를 들어 IL-1β는 대식세포를 활성화시키고, 림프구 및 호중구의 내피세포 접착을 항진시키며, 염증 부위에 염증세포의 침윤을 상승시킨다. TNF-α는 염증 반응 초기에 해당 부위로 호중구를 유도하며, 급성 염증 반응을 일으키고 악화시키는 인자이다. 또한, IL-6는 대표적인 염증성 사이토카인으로서 다양한 요인에 의해 합성되어 분비되면서 급성 혹은 만성 염증질환에 관여한다.
염증 매개 물질로는 일산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)가 대표적이다. 염증 반응에서 과발현된 NO는 혈관 투과성을 증가시켜 부종을 일으키고 염증을 심화시켜 다양한 세포 및 조직손상을 일으켜 만성염증 질환 및 자가면역질환 등을 초래하는 것으로 알려져 있다. PGE2 또한 NO와 마찬가지로 손상된 부위나 조직에서 통증과 발열의 전달에 주로 관여하는 중요한 염증 매개 물질로서 과량 생산되면 과도한 면역반응을 야기하여 각종 염증성 질환을 유발시키게 된다.
본 발명의 다알리아 발효 추출물은 이러한 염증성 사이토카인 및 염증 매개 물질과 같은 염증성 인자(inflammatory mediator)의 생성 및 발현을 억제함으로써, 항염증 효과를 나타낼 수 있다. 구체적으로 본 발명의 실시예에서는, 다알리아 발효 추출물을 포함하는 조성물을 염증이 유도된 세포에 처리하는 경우 IL-1β 및 NO의 농도가 감소되는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명의 다알리아 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물은 염증과 관련된 피부질환을 개선하는 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항염증 효과를 통해서 아토피 피부염, 건선, 방사선, 화학물질, 화상 등에 의해 촉발되는 홍반성 질환, 알레르기에 기한 가려움증, 지루성 습진과 같은 염증성 질환 개선 효과 또는 여드름과 같은 피부 트러블 개선 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 항염증용 화장료 조성물에 있어서, 다알리아 발효 추출물의 농도가 높아질수록, 항염 효과가 높아질 수 있다. 예를 들어, 상기 다알리아 발효 추출물의 농도는 1 내지 20mg/ml일 수 있다. 구체적으로, 바실러스 리체니포미스로 발효시킨 다알리아 발효 추출물의 농도는 4 내지 15mg/ml, 바람직하게는 6 내지 10mg/ml일 수 있으며, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스로 발효시킨 다알리아 발효 추출물의 농도는 4 내지 15mg/ml, 바람직하게는 8 내지 12mg/ml일 수 있다.
이에 따라, 다알리아 발효 추출물은 세안화장품, 기초화장품, 색조화장품, 모발 화장품, 기능성화장품 등의 다양한 화장품의 화장료에 첨가되어서 화장품에 피부 장벽 강화 및 항염증 활성을 나타내는 기능성을 부여할 수 있다. 또한, 다알리아 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 원료가 되는 다알리아 꽃잎의 색상에 따라 다양한 색상을 가지기 때문에 메이크업베이스, 파운데이션, 립스틱, 아이쉐도우, 매니큐어 등의 색조화장품의 천연 색소로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 다알리아 조성물의 제조 방법과 이에 의해 제조된 다알리아 조성물을 제공한다. 본 발명에서, '다알리아 조성물'이란 다알리아 발효 추출물을 용매에 희석한 용액을 의미한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다알리아 조성물의 제조방법의 순서도이다.
도 1을 참조하면, 다알리아 조성물의 제조 방법은 다알리아 추출물을 준비하는 단계(S100), 다알리아 추출물에 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 접종한 후, 발효시켜 다알리아 발효 추출물을 얻는 단계(S200), 및 다알리아 발효 추출물을 용매에 희석하여 피부 장벽 강화 및 항염증 효능을 가지는 다알리아 조성물을 얻는 단계(S300)를 포함할 수 있다.
다알리아 발효 추출물을 얻는 단계(S200)에서는 다알리아 추출물에 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 접종한 후, 발효시킬 수 있다.
발효란 미생물이 가지고 있는 효소가 원재료를 변화시켜 이로운 성분을 만들어내는 과정을 말하며, 발효 과정 중에는 유효 성분들이 추출되며 기능성 물질의 함량이 증가한다. 본 발명자들은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 이용하여 다알리아 추출물을 발효시키는 경우 발효 추출물이 피부 장벽을 강화하는 단백질의 발현량을 증가시키고, 염증성 인자의 농도를 감소시키는 것을 확인하였다.
일 예로서, 발효는 25 내지 45℃의 온도에서, 바람직하게는 37℃ 온도에서 72 내지 144시간 동안 수행될 수 있다.
일 예로서, 바실러스속 균주는 상기 다알리아 추출물 100 부피부에 대하여 1 내지 10부피부로 접종될 수 있다.
다알리아 조성물을 얻는 단계(S300)에서는 다알리아 발효 추출물을 용매에 희석하여 다알리아 발효 추출물의 농도를 조절하여 다알리아 조성물을 제조한다. 일 예로서, 용매로는 에탄올이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 다알리아 조성물은 액상 형태로 식품에 첨가하여 섭취가 가능하며, 화장품에 첨가하는 것도 가능할 수 있다. 다시 말해, 다알리아 조성물은 다알리아 추출물이 희석된 에탄올로 구성되고, 이 다알리아 조성물을 화장료 또는 식품에 첨가하여 화장료 조성물을 제조하는 것도 가능할 수 있다.
또 다른 예로, 용매는 화장료일 수 있다. 이 경우, 다알리아 발효 추출물을 화장료에 첨가하여 다알리아 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조가 가능하다.
여기서, 화장료 조성물은 세안화장품, 기초화장품, 색조화장품, 모발화장품, 기능성화장품 등의 화장품 종류에 따라 각각 다른 성분의 다양한 첨가물을 포함하는 화장료를 포함할 수 있다. 여기서, 화장료를 구성하는 첨가물은 화장품을 제조하기 위한 공지의 첨가물을 이용할 수 있다. 화장료의 첨가물에 대한 자세한 설명은 생략한다.
실시예에서의 용매는 에탄올 또는 화장료이지만 이에 한정되는 것은 아니며, 식품 내지 화장품에 첨가될 수 있는 용매라면 제한 없이 사용될 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다알리아 추출물을 준비하는 단계(S100)를 설명하기 위한 순서도이다.
도 2를 참조하면, 다알리아 추출물을 준비하는 단계는, 다알리아 꽃잎을 준비하는 단계(S110), 다알리아 꽃잎에 에탄올을 첨가하고 교반하여서 다알리아 추출물을 추출하는 단계(S120), 및 다알리아 추출물을 여과하는 단계(S130)를 포함할 수 있다.
다알리아 꽃잎을 준비하는 단계(S110)에서는 이물질을 제거하고 세척한 다알리아 꽃잎을 준비하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다알리아 꽃잎은 이물질이 제거되고, 세척되어 20g이 준비될 수 있다. 다만, 이는 일 예시에 불과할 뿐, 다알리아 꽃잎의 양은 제조되는 다알리아 조성물의 용량에 따라 변경이 가능하다.
다알리아 추출물을 추출하는 단계(S120)에서는 준비된 다알리아 꽃잎에 에탄올을 첨가하고 교반하여 다알리아 추출물을 추출할 수 있다. 여기서, 다알리아 꽃잎 1g당 에탄올 5 내지 20ml를 첨가하여 다알리아 추출물을 추출할 수 있다. 보다 바람직한 예로 다알리아 꽃잎 1g당 에탄올 10ml를 첨가하여 다알리아 추출물을 추출할 수 있다. 예를 들어, 다알리아 꽃잎 20g에 에탄올 20ml를 첨가하고, 상온에서 5시간 동안 30rpm의 속도로 교반하여 다알리아 추출물을 추출할 수 있다.
다알리아 꽃을 증류법 또는 압착법으로 추출하게 되면 그 구성 성분이 파괴될 수 있다. 따라서, 다알리아 추출물을 추출하는 단계에서는 다알리아 꽃잎에 에탄올을 첨가하여 추출함으로써, 보다 상세하게는 다알리아 꽃잎에 에탄올을 첨가하여 그 구성 성분을 침출시킨 후, 용매인 에탄올을 제거시켜 추출함으로써, 다알리아 꽃의 구성 성분이 파괴되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 에탄올 이외에도 석유 에테르(petroleum ether), 벤진(benzine), 클로로포름(chloroform) 등의 휘발성 유기 용매로도 다알리아 추출물의 추출이 가능하나, 잔류 유기 용매로 인한 독성으로 인해 식품 또는 화장품에 사용되는 다알리아 조성물을 제조하기에는 적합하지 않다.
다알리아 추출물을 여과하는 단계(130)에서는 다알리아 추출물을 필터로 여과하고, 약 4℃의 온도에서 보관할 수 있다. 예를 들어, 다알리아 추출물을 25mm 크기의 시린지 필터(sylinge filter, HM)로 여과하고 약 4℃의 냉장고에 보관할 수 있다.
여기서, 시린지 필터는 액체 샘플 내에 있는 부유 물질을 여과할 때 사용하는 일회용 필터이다. 시린지 필터는 특정 성분을 분리해 통과시킴으로써 혼합물을 분리할 수 있는 멤브레인 필터를 포함한다. 시린지 필터는 주사기 끝에 부착해 일정한 압력을 넣은 다음 멤브레인 필터의 미세한 구멍으로 여과할 수 있다. 다만, 시린저 필터는 일 예시에 불과할 뿐, 다알리아 추출물을 여과할 수 있는 다양한 필터로 변경이 가능하다.
이러한 다알리아 조성물은 분말 형태로도 제공될 수 있다. 이하에서는 도 3을 참조하여 분말 형태의 다알리아 조성물의 제조 방법에 대하여 상세히 설명한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 분말 형태의 다알리아 조성물의 제조방법의 순서도이다.
도 3을 참조하면, 분말 형태의 다알리아 조성물의 제조 방법은, 전술한 방법에 의해 제조된 다알리아 조성물을 동결 건조하는 단계(S400)와, 동결 건조된 다알리아 조성물을 분말 형태로 제조하는 단계(S550)을 포함할 수 있다.
다알리아 조성물을 동결 건조하는 단계(S400)에서는 다알리아 조성물을 냉매로 액체 질소를 사용하는 냉동기에 투입하여 -70℃ 이하의 온도에서 급속 동결시킬 수 있다. 다알리아 조성물을 진공 건조하여 수분 함량을 감소시킬 수 있다.
동결 건조된 다알리아 조성물을 분말 형태로 제조하는 단계(S500)에서는 동결 건조된 다알리아 조성물을 초저온 동결 분쇄기에 투입함으로써 동결 분쇄할 수 있다. 초저온 동결 분쇄기에는 액체 질소가 투입되어, 분쇄 과정 중 발생하는 열을 감쇠시키며 분쇄한다. 분쇄된 다알리아 조성물은 분말 형태를 가진다. 이러한 분말 형태의 다알리아 추출물은 식품이나 화장품에 첨가하여 사용할 수 있다.
다알리아 발효 추출물을 포함하는 다알리아 조성물은 피부 각질형성 단백질 및 보습인자의 발현량을 증가시키고 염증성 인자의 생성을 억제하여, 피부 장벽 강화 및 항염증 효과를 나타낼 수 있다.
실시예
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 조성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 다알리아 발효 추출물의 제조
다알리아 추출물 준비 및 발효 균주의 선정
다알리아 꽃잎 20g에 에탄올 200ml를 첨가하여 상온에서 5시간 동안 30rpm의 속도로 교반하여, 다알리아 추출물을 추출하고, 여액을 25mm 시린저 필터로 여과하여 다알리아 추출물을 준비하였다.
다알리아 추출물을 발효하기에 적합한 균주를 발굴하기 위하여 각종 출처로부터 1,501종의 미생물 균주를 수집하고, 이들로부터 아밀레이즈(amylase), 프로테이즈(protease) 활성이 높은 바실러스 속 균주 36종을 선정하였다. 선정된 36종의 바실러스 속 균주의 종류와 출처를 표 1에 나타내었다.
시료 번호 균주 종류 출처 시료 번호 균주 종류 출처
1 MSP-7 모슬포항 19 NWFO-14-2 녹원목장
2 CTC 1-4-1 조개발효식품 20 NWFY-11-2 녹원목장
3 CTC 2-5-1 조개발효식품 21 NWFY-36 녹원목장
4 DJ-3-61 대저생태공원 22 NWFY-41 녹원목장
5 DPP-15 대포포구 23 OGH-18 올레시장갈치속젓
6 DPS-3-1 대포포구 인근 흙 24 OGH-19 올레시장갈치속젓
7 EF45011 황토참나무 목초 25 OGH-24 올레시장갈치속젓
8 GC-3-13 부산 감천항 인근 암남공원일대 26 OGH-8 올레시장갈치속젓
9 GIPS-2-2-3 금일해수욕장 27 YS-DS 3C 여수돌산공원
10 JSP-1-11-1 된장발효식품 28 YS-DS 4C 여수돌산공원
11 JSP-1-4-1 된장발효식품 29 YS-YR 5A 여수연등천남산교
12 JSP-1-6-1 된장발효식품 30 R450301 Rock salt
13 JSP-2-9-2 된장발효식품 31 EF45023 강원참숯
14 KOS-3-1-1 한국인전망대 흙 32 NWFY-19 녹원목장
15 KOS-3-2-2 한국인전망대 흙 33 R450403 Rock salt
16 MSW-3-1-1 모기하마해변 34 OGH-20 올레시장갈치속젓
17 MY-DS 3C 한국인전망대 흙 35 GS-BC 3A 벤뎅이 젓무침
18 NWFO-14-1 녹원목장 36 R450401 Rock salt
이들 균주에 대하여 다알리아 추출물 함유 배지에서의 생육 성장을 관찰하였다. 그 결과 36종의 균주 중 오직 바실러스 리체니포미스 R450403 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1 2종의 균주만 다알리아 추출물 배지에서 생육 성장이 가능하였으며, 나머지 34종의 균주는 모두 생육이 되지 않는 것을 확인하였다.
도 4의 (a)는 바실러스 리체니포미스 R450403에서의 성장 곡선(growth curve)이고, 도 4의 (b)는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1에서의 성장 곡선으로, 양자 모두 시그모이드 곡선(sigmoidal curve)의 형태를 나타내고 있다.
다알리아 발효 추출물의 제조
다알리아 추출물을 선정된 균주로 발효시켜 다알리아 발효 추출물을 제조하였다.
발효시 사용된 배지(0.4% nutrient broth)는 다알리아 추출물 10중량%로 구성하였으며, 상기 배지에 바실러스 리체니포미스 R450403 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1를 접종하여 37℃에서 5일 간 배양하여 발효를 진행한 후 상등액을 수거하여 표 2와 같이 다알리아 발효 추출물을 제조하였다.
발효 추출물 샘플명 발효 균주의 종류
R450403 FE 바실러스 리체니포미스 DSM 13 (R450403)
CTC 2-5-1 FE 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NBRC 15535 (CTC 2-5-1)
이후, 다알리아 발효 추출물에 용매로서 에탄올을 첨가한 다음 건조 오븐에서 건조시키고, 건조된 다알리아 조성물을 재분산한 후 여과하여 실험에 사용하였다.
실험예 1: 피부 장벽 강화 효능 분석
실험 방법
제조예 1에서 얻어진 발효 추출물을 대상으로, 실시간 유전자 발현조사(Real time quantitative polymeric chain reaction, RT-qPCR)를 이용한 관련 유전자 수준을 측정하여 피부 장벽 강화 효능을 시험하였다.
인간각질형성세포주(HaCaT)를 CO2 배양기로 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 이 때, 배양액으로는 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, P/S) 항생제를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium) 배지를 사용하였다. 세포배양 시 최대 80%의 컨플루언시(confluency)를 유지하였으며, 그 후 계대배양(subcultivation)을 수행함으로써 세포를 유지하였고, 4.5Х105 세포수/웰(cells/well)의 조건으로 배양하였다.
배양된 인간각질형성세포주에, 제조예 1의 다알리아 발효 추출물 샘플을 각각 0mg/ml, 2mg/ml, 4mg/ml 및 6mg/ml의 양으로 처리하여 3시간 동안 배양하였다.
배양된 세포를 회수하고, RNAiso Plus(Takara Biochemical Inc., Japan)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 이용하여 SuPrimeScript RT premix(GeNet Bio, Daejeon, Korea)로 cDNA를 합성하고 TaqMan probe를 이용하여 RT-qPCR을 수행함으로써, 피부 장벽 강화 인자의 상대적 발현 양상을 분석하였다. 피부 장벽 강화 인자로는 각질세포형성에 관여하는 보습인자인 필라그린(filaggrin)과 케라틴 1(keratin 1)을 이용하였다. 발현양은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA 발현양을 기준으로 보정하였다.
1-1. 필라그린의 발현양 분석
도 5a 및 5b는 각각 R450403 및 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 후 필라그린의 발현양을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 5a 및 5b를 참조하면, 인간각질형성세포주에 본 발명의 다알리아 발효 추출물을 처리하는 경우 대조군(0mg/ml)에 비하여 필라그린의 유전자 발현양이 증가하는 경향을 나타내는 결과가 나타났다.
구체적으로 도 5a를 참조하면, 인간각질형성세포주에 바실러스 리체니포미스 R450403으로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 경우, 4 및 6mg/ml 농도 조건에서 필라그린의 발현양이 대조군(0mg/ml)에 비해 각각 1.41배(±0.06) 및 2.45배(±0.22)로 증가된 결과를 확인하였다.
또한, 도 5b를 참조하면, 인간각질형성세포주에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 경우, 다알리아 발효 추출물의 농도가 2, 4 및 6mg/ml로 증가할수록 필라그린의 발현양이 대조군(0mg/ml)에 비해 각각 1.17배(±0.04), 2.49배(±0.11), 3.20배(±0.23) 증가된 결과를 확인하였다.
1-2. 케라틴 1의 발현양 분석
도 6a 및 6b는 각각 R450403 및 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 후 케라틴 1의 발현양을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 6a 및 6b를 참조하면, 인간각질형성세포주에 본 발명의 다알리아 발효 추출물을 처리하는 경우, 대조군(0mg/ml)에 비하여 케라틴 1의 유전자 발현양이 증가하는 결과를 확인할 수 있었다.
구체적으로 도 6a를 참조하면, 인간각질형성세포주에 바실러스 리체니포미스 R450403으로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 경우 다알리아 발효 추출물의 농도가 각각 2, 4 및 6mg/ml로 증가할수록 케라틴 1의 발현양이 대조군(0mg/ml)에 비해 각각 1.11배(±0.19), 1.50배(±0.12), 2.38배(±0.22) 증가된 결과를 확인하였다.
또한, 도 6b를 참조하면, 인간각질형성세포주에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 경우, 다알리아 발효 추출물의 농도가 2, 4 및 6mg/ml로 증가할수록 케라틴 1의 발현양이 대조군(0mg/ml)에 비해 각각 1.07배(±0.02), 1.23배(±0.21), 2.42배(±0.23) 증가된 결과를 확인하였다.
피부 장벽 강화 효능 실험 결과, 인간각질형성세포주에 본 발명의 다알리아 발효 추출물을 처리하는 경우 각질층 형성 단백질로서 보습인자로 작용하는 필라그린과 케라틴 1의 유전자 발현양이 증가되는 결과가 나타났고, 이로부터 피부 장벽 강화에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 항염 효능 분석
실험 방법
제조예 1에서 얻어진 발효 추출물을 대상으로, 항염 관련 인자 저해 효과를 측정하여 피부 진정 효능을 시험하였다.
염증면역세포인 RAW 264.7 세포를 CO2 배양기로 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 이 때, 배양액으로는 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, P/S) 항생제를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium) 배지를 사용하였으며, RAW 264.7 세포를 24-웰 플레이트(24-well plate)에 2.5 x 105cells/well로 분주하고 24시간 배양시켰다.
배양된 세포에 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)를 500ng/ml의 농도로 처리하여 염증을 유도하였다. 16시간 후, 제조예 1의 다알리아 발효 추출물 샘플을 각각 0mg/ml, 4mg/ml, 6mg/ml 및 8mg/ml의 양으로 처리하고 배양기에서 24시간 배양하였다.
배양 후 상등액을 수거하여 12,000rpm으로 2분 동안 원심분리한 후, 염증성 인자인 일산화질소(NO) 및 인터류킨-1 베타(IL-1β)의 생성량을 측정하였다.
2-1. 일산화질소 분석 (NO assay)
염증 산물 중 하나인 일산화질소의 생성량을 측정하여 항염 효과를 분석하였다.
구체적으로, 2.5%(v/v) 인산 용액에 1%(w/v) 설파닐아마이드(sulfanilamide) 및 0.1%(w/v) 나프틸에틸렌디아민(naphthylethylene diamine)을 포함하는 그리스 시약(Griess reagent) 100μL를 원심분리한 상등액 100μL와 혼합하고, 96-웰 플레이트(96-well plate)에서 10분간 반응시켰다.
반응 후 540nm에서 흡광광도계(Synergy™ HTX Multi-Mode Microplate Reader, Biotek)를 사용하여 흡광도를 측정하고, 생성된 아질산염(nitrite)의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite)을 이용하여 정량분석하였다. 비교를 위하여, 염증 유도 및 다알리아 발효 추출물 처리를 모두 수행하지 않은 미처리군에 대해서도 아질산염의 농도를 정량분석하였다.
도 7a 및 7b는 각각 R450403 및 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 후 아질산염 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 7a 및 7b를 참조하면, 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에 본 발명의 다알리아 발효 추출물을 처리하는 경우 아질산염 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 추출물의 농도가 높아질수록 아질산염의 생성량이 더 낮아지는 것을 확인하였다.
구체적으로 도 7a를 참조하면, 바실러스 리체니포미스 R450403으로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 경우 추출물 농도 6mg/ml 이상에서 아질산염의 농도가 현저히 저하되고, 8mg/ml 조건에서 미처리군 수준에 거의 근접할 정도로 아질산염 농도가 감소함을 확인하였다.
또한, 도 7b를 참조하면, 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 경우, 추출물 농도 8mg/ml 조건에서 미처리군 수준에 근접할 정도로 아질산염 농도가 감소함을 확인하였다.
2-2. 인터류킨-1 베타(Interleukin-1 beta, IL-1β) 분석
염증성 질환과 관련된 사이토카인(cytokine)으로서 인터류킨-1 베타의 농도를 측정하여 항염 효과를 분석하였다.
원심분리한 상등액에 대하여, IL-1β ELISA Kit(Duoset, R&D systems)를 이용하여 효소면역측정법(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)을 수행하고, 450nm에서 흡광광도계(Synergy™ HTX Multi-Mode Microplate Reader, Biotek)를 사용하여 인터류킨-1 베타의 양을 정량분석하였다. 비교를 위하여, 염증 유도 및 다알리아 발효 추출물 처리를 모두 수행하지 않은 미처리군에 대해서도 동일한 실험을 수행하였다.
도 8a 및 8b는 각각 R450403 및 CTC 2-5-1로 발효시킨 다알리아 발효 추출물을 처리한 후 인터류킨-1 베타의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 및 8b를 참조하면, RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하면 염증이 유도되어 인터류킨-1 베타의 농도가 급격하게 증가하는데, 본 발명의 다알리아 발효 추출물을 처리하는 경우 인터류킨-1 베타의 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 추출물의 농도가 높아질수록 인터류킨-1 베타의 생성량이 더 낮아지는 것을 확인하였으며, CTC 2-5-1로 발효시킨 샘플에 비해 R450403로 발효시킨 샘플의 인터류킨-1 베타 생성량이 더 낮은 경향을 확인하였다.
항염 효능 실험 결과, 염증이 유도된 세포에 본 발명의 다알리아 발효 추출물을 처리하는 경우 염증성 인자의 생성이 억제되는 결과가 나타났다. 이로부터, 본 발명의 다알리아 발효 추출물은 우수한 피부 면역 강화 및 염증 완화 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 바실러스 리체니포미스 R450403(Bacillus licheniformis R450403, 수탁번호: KCTC14348BP) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1(Bacillus amyloliquefaciens CTC 2-5-1, 수탁번호: KCTC14347BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 다알리아(Dahlia pinnata) 추출물에 접종 및 발효시켜 얻어진 다알리아 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 장벽 강화용 화장료 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 다알리아 발효 추출물의 농도가 1 내지 10mg/ml인, 피부 장벽 강화용 화장료 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 다알리아 추출물이 다알리아 꽃잎의 에탄올 추출물인, 피부 장벽 강화용 화장료 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물이 피부 세포에서 필라그린(filaggrin) 및 케라틴 1(keratin 1)으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질의 발현을 증가시켜 피부 장벽을 강화하는, 피부 장벽 강화용 화장료 조성물.
  5. 바실러스 리체니포미스 R450403(Bacillus licheniformis R450403, 수탁번호: KCTC14348BP) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CTC 2-5-1(Bacillus amyloliquefaciens CTC 2-5-1, 수탁번호: KCTC14347BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 다알리아(Dahlia pinnata) 추출물에 접종 및 발효시켜 얻어진 다알리아 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 화장료 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 다알리아 발효 추출물의 농도가 1 내지 20mg/ml인, 항염증용 화장료 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 다알리아 추출물이 다알리아 꽃잎의 에탄올 추출물인, 항염증용 화장료 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 조성물이 산화질소(nitric oxide, NO) 및 인터류킨-1 베타(interleukin-1β, IL-1β)로부터 선택되는 1종 이상의 염증성 인자의 생성을 억제하여 항염 효과를 나타내는, 항염증용 화장료 조성물.
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