KR102310000B1 - Ｈｉｆ관련 상태의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산소결핍 유도 인자(HIF)-관련 상태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 특히 트랜스페린을 포함하는 조성물의 투여를 포함하는 HIF-관련 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 치료 방법은
a. 필요로 하는 환자의 HIF 관련 병리학적 상태를 진단하는 단계, 및
b. 치료적 유효량의 트랜스페린을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

ＨＩＦ관련 상태의 치료 방법{METHOD OF TREATMENT OF HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR(HIF)-RELATED CONDITIONS}
본 발명은 산소결핍 유도 인자(HIF)-관련 상태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 특히 트랜스페린(transferrin)을 포함하는 조성물의 투여를 포함하는 HIF-관련 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
뇌줄중, 신경 퇴행성 질환, 외상성 손상 등을 포함하는 다양한 인자들에 의해 야기된 손상으로부터 세포들, 특히 신경 세포(neuron)들을 보호하는 것은, 세포 또는 신경세포의 기능을 장시간에 걸쳐 회복하는 것에 있어서 중요하다. 상처를 입은 세포들이나 신경세포들을 단일 제제로 치료하는 처우는 장점들을 가지고 있지만, 종종 완전한 기능을 되찾는데 도움을 주기 위해 필요한 분자들의 복잡성에 가동성을 부여하기에는 충분하지 않다.
신경 세포들이나 다른 세포들을 혈중 산소 감소나 허혈(ischemic)인 경우들 또는 산화로부터 보호하기 위한 생리학적 반응은 종종 세포질 손상에 반응하는 중요한 조절 경로인 HIF 신호 전달(signaling) 경로를 통해 숫자가 상향 조절되는(upregulated) 유전자들의 발현에 의해 중재되는 것으로 간주된다. 뇌에서, 신경 보호 작용 분자들의 숫자 증가는 심각한 손상으로부터 세포들을 보호하는데 있어서 중요한 인자인 것으로 여겨진다. 하지만, 신경 세포들과 다른 세포 조직들에 대한 손상을 충분히 방지, 원상 복구, 또는 감소시킬 수 있는 이용 가능한 약물은 극소수이다. 또한, 그러한 약물들은 종종 중독성이 있고, 짧은 반감기를 가지거나 두 가지 모두를 가지고 있다. 예를 들면, 국제 특허 출원 WO2006/20727호는 재관류의 유해한 효과들에 맞서는 신경세포 보호 약제로서 데프록사민의 사용을 제시하지만, 데프록사민의 투여는 그것의 플라즈마에 있어서의 반감기 감소로 인해 문제점을 제시한다.
트랜스페린은 생물학적 유체들에서 유리된 철분의 레벨을 제어하는, 철분과 결합하는 혈액의 혈장당단백질이다. 트랜스페린은 단일 철분 트랜스페린이나 이철(diferric) 홀로-트랜스페린(HoloTf)으로서 철분이 없는 아포-트랜스페린(ApoTf) 형태로 존재하는 혈액 순환에서의 철분의 주된 운반체로서 기능한다. 보통, 철분은 혈액 순환시 모든 트랜스페린 결합 자리의 30%까지 묶인다. HoloTf가 아닌 ApoTf의 뇌세포 보호 작용 기능은 Chen-Roetling 등(Chen-Roetling J., Chen L.,과 Regan R.F.Neuropharmacology, 2011; 60(2-3): 423-431.)에 의해 개시되어 있고, 이는 ApoTf가 뇌내출혈 후 헤모글로빈의 신경독성을 완화시킬 수 있다는 점을 시사한다.
본 발명의 발명자들은 다른 철분 킬레이트제들 또는, 일부 세포 조직들에서 HIF-1α 단백질 레벨들을 증가시키고 플라즈마 EPO 레벨들에 대한 영향력을 미치는 것으로 보여진 아포락토페린(Apolactoferrin)(Zakharova E.T. 등. Biometals(2012) 25:1247-1259)과 같은 또 다른 철분 결합 혈장 단백질과 결합시킴으로써 환자들에의 트랜스페린 투여의 신경보호작용 특성들을 증대시키는 것이 가능할 수 있다는 것을 발견하였다. 철분 킬레이트 능력들을 지닌 분자들은, 프로릴하이드록실아제들(prolylhydroxylases)의 활동을 차단함으로써 HIF 경로 활성물(activator)인 것으로 암시되었다.
그러므로, 본 발명은 트랜스페린을 포함하는 조성물의 투여를 포함하는 HIF(Hypoxia Inducible Factor) 관련 상태들의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 투여된 조성물이 트랜스페린과 철분 킬레이터(chelator)의 조합을 더 포함하는 HIF 관련 상태의 치료 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "트랜스페린"이라는 용어와 그것의 복수 형태는 ApoTf만을, 또는 HoloTf만을 또는 이들이 혼합된 것을 가리키는 것이다.
본 발명은 이어지는 도면들을 참조하여 추가로 설명된다.
도 1은 노목식(normoxic) 및 하이폭식(hypoxic) 상태 하에서, 6시간의 후처리(post treatment)된 대부분의 ApoTf 및 대부분의 HoloTf 유도 HIF-1α 단백질의 조성을 도시하는 도면.
도 2는 노목식 및 하이폭식 상태 하에서의 24시간의 후처리된 대부분의 ApoTf 및 대부분의 HoloTf 유도 HIF-1α 단백질의 조성을 도시하는 도면.
도 3은 6시간의 후처리된 ApoTf 및 HoloTf 유도 HIF-1α 단백질의 혼합물을 도시하는 도면.
도 4a는 HSA, 아포-트랜스페린 또는 홀로-트랜스페린이 존재하고 있는 노목식 및 하이폭식 상태 하의 Glut1의 mRNA 발현 레벨들을 도시하는 도면.
도 4b는 HSA, 아포-트랜스페린 또는 홀로-트랜스페린이 존재하고 있는 노목식 및 하이폭식 상태 하의 VGEF의 mRNA 발현 레벨들을 도시하는 도면.
도 5a는 대부분의 HoloTf 또는 대부분의 ApoTf를 포함하는 조성물들의 생체 외(in vitro) 독성 또는 생체 내(in vivo) 독성을 도시하는 도면.
도 5b는 대부분의 ApoTf 또는 HoloTf를 포함하는 약물로 정맥 주사 치료된 쥐들에 관한 수정된 베델슨(Bederson) 및 일반적인 거동 스코어(behavioral score)들을 도시하는 도면.
도 6a는 ApoTf(385㎎/㎏, Ⅳ)의 경색 부피(volume) 또는 일시적인 MCAo(Middle Cerebral Artery occlusion) 쥐 모델에서의 염분 치료의 산포도를 도시하는 도면.
도 6b는 전형적인 제어 및 ApoTf 치료된 쥐로부터의 트리페닐테트라졸리움 클로라이드(TTC) 얼룩이 진 관상(Coronal) 섹션들을 도시하는 도면.
도 7은 대부분의 ApoTf 및 HoloTf를 포함하는 혼합물들에 의한 아베타(Abeta)(1-42)의 독성 작용들로부터의 뉴런 세포들의 보호를 도시하는 도면.
도 8a는 4㎎/㎖의 대부분의 ApoTf와, 대부분의 ApoTf 및 DFO 또는 IOX2의 조합을 지닌 뉴런 세포들의 치료를 도시하는 도면.
도 8b는 4㎎/㎖의 지시된(indicated) 단백질과, 지시된 단백질 및 10μM M30 플러스(plus)의 조합을 지닌 SH-SY5Y 뉴런 세포들의 치료를 도시하는 도면.
도 8c는 4㎎/㎖의 지시된 단백질과, 지시된 단백질 및 200μM DFO의 조합을 지닌 SH-SY5Y 뉴런 세포들의 치료를 도시하는 도면.
도 9a는 대부분의 아포-트랜스페린과 DFO 또는 IOX2 조합들에 대해 반응하는 Glut1의 mRNA 발현 레벨들을 도시하는 도면.
도 9b는 대부분의 아포-트랜스페린과 DFO 또는 IOX2 조합들에 대해 반응하는 VEFG의 mRNA 발현 레벨들을 도시하는 도면.
도 10a는, 정상적인 산소 레벨들 하에서 6시간 동안, 4㎎/㎖의 대부분의 아포-트랜스페린, 대부분의 홀로-트랜스페린 또는 각각의 다양한 혼합물을 지닌, 1차 사람(primary human) RPTEC(renal proximal tubule epithelial) 세포들의 치료 후의 HIF-1α 레벨들을 도시하는 도면.
도 10b는, 정상적인 산소 레벨들 하에서 6시간 동안, 4㎎/㎖의 대부분의 아포-트랜스페린, 대부분의 홀로-트랜스페린 또는 각각의 다양한 혼합물을 지닌, 1차 피질 상피(HRCE) 세포들의 치료 후의 HIF-1α 레벨들을 도시하는 도면.
도 11a는 대부분의 ApoTf 또는 DFO로 48시간 동안 치료될 때의 1차 사람 RPTEC 또는 피질 상피(HRCE) 세포들의 생존도를 도시하는 도면.
도 11b는 4㎎/㎖의 대부분의 ApoTf, 대부분의 HoloTf, 트랜스페린의 혼합물들을 가지고 72시간 동안 치료될 때의 RPTEC 또는 HRCE 세포들의 생존도를 도시하는 도면.
도 12는 대부분의 ApoTf 또는 DFO의 존재시의 사람의 1차 신장 세포들 내의 카스파제 3/7 활성화를 도시하는 도면.
도 13a는 4㎎/㎖의 대부분의 아포-트랜스페린, 대부분의 홀로-트랜스페린 또는 피디(pd)-트랜스페린으로 6시간 동안 정상 산소 레벨들 하에서 폐 세포 라인(line) NCI-H1650을 치료한 후의 HIF-1α 레벨들을 도시하는 도면.
도 13b는 4㎎/㎖의 대부분의 아포-트랜스페린, 대부분의 홀로-트랜스페린 또는 피디(pd)-트랜스페린으로 6시간 동안 정상 산소 레벨들 하에서 1차 간세포(hepatocyte)들을 치료한 후의 HIF-1α 레벨들을 도시하는 도면.
도 14a는 4㎎/㎖의 대부분의 ApoTf, 대부분의 HoloTf, 또는 pd-트랜스페린으로 72 시간 동안 치료했을 때, 사람의 폐 세포 라인, NCI-H1650의 생존도를 도시하는 도면.
도 14b는 4㎎/㎖의 대부분의 ApoTf, 대부분의 HoloTf, 또는 pd-트랜스페린으로 72 시간 동안 치료했을 때, 1차의 사람 간세포들의 생존도를 도시하는 도면.
일 양태에서, 본 발명은 트랜스페린을 포함하는 조성물의 투여를 포함하는 HIF 관련 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 트랜스페린이 재조합형의, 플라즈마에서 유래되거나 화학적으로 합성된 트랜스페린이다.
트랜스페린이 재조합체일 때에는, 단백질 발현, 생산, 및 정제의 분야에서 공지된 임의의 기술에 따라 얻어질 수 있다. 예를 들면, 트랜스페인의 핵산 염기서열은 예컨대 박테리아(Excherichia coli, Bacilus subtilis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces 및 Staphylococcus), 효모(Saccharomyces, Pichia 또는 Kuyveromyces genus), 곤충 세포(insect cell)들(Bombyx mori, Mamestrabrassicae, Spodoptera Frugiperda, Trichoplusia ni 또는 Drosophila melanogaster) 또는 포유류 세포(mammalian cell)들(HeLa cells, BHK(baby hamster kidney) cells, monkey kidney cells(COS-1), human hepatocellular carcinoma cells(예컨대, Hep G2), 사람의 아데노바이러스 변형된 293 세포들, 쥐(mouse) L-929 세포들, HaK 햄스터 세포 라인들, 스위스로부터 유래된 생쥐(murine) 3T3 세포들, Balb-c 또는 NIH 마이스(mice), CV-1 세포 라인, 1차 조직이나 1차 시료의 체외 배양으로부터 유래된 세포주(cell strain)들)과 같이 선정된 숙주 세포에서의 발현을 위해 적합한 임의의 벡터(vector)에 삽입될 수 있다.
혈장 유래된 트랜스페린은 혈장의 알맞은 부분으로부터 격리된다고 예측된다. 바람직한 일 실시예에서, 트랜스페린은 Cohn 분별(fractionation) 프로세스의 부분 Ⅳ로부터 격리되고, 가장 바람직하게는 부분 Ⅳ-Ｉ 또는 Ⅳ-Ⅳ으로부터 격리된다. 또 다른 바람직한 실시예에서는, 트랜스페린이 A1PI(alpha1-proteinase inhibitor) 정제 방법의 내버려지는(waste) 부분으로부터 유래한다. 바람직하게는 상기 정제 방법은 다음과 같다:
(a) A1PI를 함유하는 정제된 용액을 얻기 위해, 침전에 의한 수용액으로부터 오염 단백질들의 부분을 제거하는 단계;
(b) A1PI가 음이온 교환 수지에 달라붙도록 음이온 교환 수지를 통해 정제된 용액을 통과시키는 단계;
(c) A1PI를 함유하는 용리된 용액을 얻기 위해 음이온 교환 수지로부터 A1PI를 용리하는 단계;
(d) 용리된 용액을 양이온 교환 수지를 통과시키는 단계;
(e) A1PI를 함유하는 양이온 교환 수지로부터 통과액을 모으는 단계; 및
(f) 단계 (c)의 용리된 용액 또는 단계 (e)의 통과액을 적어도 하나의 HIC 배지(medium)의 소수성 흡착제와 접촉시키는 단계.
가장 바람직한 실시예에서는, 위에서 언급된 정제 방법(A1PI)에서 사용된 수용액이 혈액, 혈장 또는 혈장에서 유래된 부분이다.
또 다른 실시예에서는, 트랜스페린이 적어도 하나의 전사 후 변형, 바람직하게는 페길레이션(pegylation), 글리코실레이션(glycosylation), 폴리사이알릴레이션(polysialylation) 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 처리 방법에서 사용된 트랜스페린은 SEQ ID NO:1에서 나열된 아미노산 염기서열을 지닌 전장(full length) 트랜스페린이다. 또 다른 실시예들에는, 와일드 타입(wild type) 트랜스페린의 철환제 작용의 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 유지되는 한, SEQ ID NO:1과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성(homology) 또는 유사성(similarity)을 지닌 트렌스페린 유도체의 본 발명이 처리 방법에서 사용하는 것이 포함된다. 당업자라면 트랜스페린과 아미노산 염기서열 SEQ ID NO:1 사이의 상동성에 있어서의 차이들이 철환제 기능에 영향을 미치지 않는 보존성 및/또는 비보존성 아미노산 치환체들에 기인한 것일 수 있다는 점을 바로 알게 된다.
또 다른 실시예에서는, 와일드 타입의 트랜스페린(SEQ ID NO:1)의 한 단편이 본 발명의 처리 방법에서 사용된다고 예측된다. 당업자라면 와일드 타입의 트랜스페린의 철환제 작용을 유지하도록, 와일드 타입의 트랜스페린의 알맞은 단편을 바로 선택하게 될 것이다.
추가 일 실시예에서는, 트랜스페린이 그것의 철분 결속 친화력을 증가시키도록 변형된다. 당업자라면 변형이 이루어질 구역(zone)들이나 잔기들이, 예를 들면 위치지정 돌연변이(site directed mutagenesis), 알라닌 스크리닝(alanine screening), 결정학 또는 삭제 및/또는 삽입 분석과 같이 관련 분야에 알려진 몇 가지 기술에 의해 결정될 수 있다는 점을 예상하게 된다.
본 발명의 치료 방법에서 사용된 트랜스페린은, 예를 들면 트랜스페린이 임의의 다른 단백질, 단백질 단편, 단백질 도메인(domain) 또는 펩티드에 콘쥬게이트(conjugate)되거나 융합되는, 혈액에서의 그것의 반감기(half-life)를 연장하기 위해, 단백질 콘쥬게이트나 융합(fusion) 단백질의 형태로 되어 있다는 것이 예측된다. 바람직한 일 실시예에서 트랜스페린은, 혈청 알부민들(예를 들면, 소, 토끼나 사람으로부터), 키홀 림펫 헤모시아닌, 면역글로불린 분자들(면역글로불린의 Fc 도메인을 포함하는), 티로글로불린(thyroglobulin), 오브알부민, 파상풍톡소이드나 디프테리아, 대장균, 콜레라 또는 헬리코박터 파이로리 같은 다른 병원성 세균으로부터의 톡소이드, 또는 약화된 독소 유도체, 사이토카인, 케모카인, 글루카곤 유사 펩티드-1, 엑센딘-4 또는 XTEN의 전장(full-length), 단편, 도메인 또는 펩티드에 콘쥬게이트되거나 융합된다.
본 발명의 방법에서 사용된 트랜스페린은 홀로-Tf(Holo-Tf) 단독, 아포-Tf 단독, 또는 ApoTf와 HoloTf의 혼합일 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 트랜스페린은 ApoTf와 HoloTf의 혼합일 수 있고, 바람직하게는 상기 혼합이 99:1과 70:30(ApoTf:HoloTf) 사이의 백분율을 가지고, 더 바람직하게는 상기 혼합이 생물학적 유체로부터 얻어지거나 정제된 부분과 비슷한 비율 또는 백분율을 가진다. 가장 바람직한 실시예에서는 본 발명의 방법에서 사용된 ApoTf와 HoloTf의 혼합이 사람의 혈액이나 혈장에 존재하는 ApoTf와 HoloTf의 비율 또는 백분율과 같은, ApoTf와 HoloTf의 비율 또는 백분율을 가진다.
본 발명의 방법에서, 조성물은 철환제를 더 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 철환제는 M30, 데프록사민(DFO), 데페라시록스, 디페리프론, 디페리트린, L1NAll, CP363, CP502, IOX2 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시예에서, 철환제는 데프록사민(DFO)이다.
본 발명의 방법에서, HIF 관련 상태의 처리는 사람에 대한 이식의 준비로 트랜스페린을 포함하는 조성물로 장기들을 처리하는 것을 포함한다. 바람직한 일 실시예에서, 장기들은 신장, 간, 폐, 및 심장을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
또한, 본 발명의 방법에서, HIF 관련된 상태의 처리는 이식 전후에 트랜스페린을 포함하는 조성물을 장기 이식 수용체들에 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 이식 전 또는 후에 트랜스페린을 포함하는 조성물을 장기 이식 수용체들에 투여하는 것을 포함하고, 이식 장기들은 인체내로의 이식을 위한 준비로 트랜스페린을 포함하는 조성물로 이전에 처리되었다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HIF 관련된 상태를 치료하는 방법에 관한 것이고, 이 경우 상기 상태는 트랜스페린을 포함하는 조성물의 상기 인체로의 투여를 포함하는 인체에서의 허혈(ischemia)의 처리를 포함한다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 허혈은 심장 정지, 혈전 응고, 외상성 손상이나 뇌졸증에 기인한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HIF 관련된 상태의 처리 방법에 관한 것으로, 상기 처리는 조직/장기들의 허혈 또는 산소 부족이 관찰되거나 예상되는 경우들에서 환자로의 수술 전에 투여하는 것이다.
이제, 본 발명의 양태들이 더 완전히 이해 및 평가될 수 있도록, 다음 예들에서의 몇몇 바람직한 실시예들에 관련되어 설명되지만, 본 발명을 이들 특정 실시예들에 국한하려는 의도는 아니다. 반대로, 첨부된 청구항들에 의해 정의된 것처럼 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있는 모든 대안예, 수정예, 및 동등예를 포괄하는 것으로 의도된다. 그러므로, 바람직한 실시예들을 포함하는 다음 예들은 본 발명의 실시를 예시하는 역할을 하게 되고, 도시된 개별적인 항목들은 예로서 주어진 것이며 오직 본 발명의 바람직한 실시예들의 실례가 되는 논의 목적을 위한 것이고, 본 발명의 원리들과 개념 양태들뿐만 아니라 공식화 절차들의 가장 유용하고 바로 이해되는 서술인 것으로 믿어지는 것을 제공할 목적으로 제시되고 있음이 이해된다.
예들(EXAMPLES)
다음 예들에서 수행된 실험들은 아포(Apo)-형태 또는 홀로(Holo)-형태를 포함하는 트랜스페린으로 처리되었다. 광범위한 트랜스페린 혼합물이 테스트되었는데, 대부분의 ApoTf, 대부분의 HoloTf, pdTf 및 특별힌 정의된 트랜스페린 혼합물을 포함하는 ApoTf와 HoloTf의 상대적인 백분율이 아래 표 1에서 강조된다.
과반수 과반수
Apo Holo Mix 1 Mix 2 Mix 3 pdTf
%ApoTf 98 30 95 64 33 68
%HoloTf 2 70 5 36 67 32
예 1. 대부분의 ApoTf와 대부분의 HoloTf를 포함하는 조성물은 6시간의 처리 후 노목식 상태와 하이폭식 상태 하에서 HIF-1α단백질을 유도한다.무혈청 배지에서 배향된, 사람의 신경모세포종 SH-SY5Y 세포 라인 세포는 노목시아(21%의 산소) 상태와 하이폭시아 상태(1%의 산소) 하에서 6시간 동안 혈장 유래된 ApoTf와 HoloTf(두 가지 경우 모두 1㎎/㎖와 4㎎/㎖의 농도로)로 처리되었다. 대조군(control)들로서, 1㎎/㎖ 또는 4㎎/㎖의 농도로 HSA(human serum albumin)로 처리되지 않은 세포들 또는 처리된 세포들이 사용된다. 6시간 후, ELISA에 의해 HIF-1α단백질 레벨들에 관한 세포 사이에 있는 단백질들이 수확되고 테스트되었다.
도 1에 도시된 바와 같이, 노목식 상태와 하이폭식 상태 모두 하에서, 그리고 ApoTf에 관한 테스트된 2개의 농도에 관해, HIF-1α세포성 단백질 레벨들에 있어서의 상당한 증가가 일어났다. HoloTf에 관해서는, 세포들이 1㎎/㎖의 농도로 처리될 때에는 노목식 상태와 하이폭식 상태 모두에서 HIF-1α의 세포성 단백질 레벨들에 있어서의 상당한 증가가 관찰되었고, 세포들이 4㎎/㎖의 농도로 처리될 때에는 노목식 상태에서 HIF-1α의 세포 내의 단백질 레벨들에 있어서의 상당한 증가가 관찰되었다. 세포들이 4㎎/㎖의 농도를 가진 HoloTf로 처리되었을 때에는, HIF-1α의 세포성 단백질 레벨들에 있어서 증가되는 경향이 보여졌다.
예 2. 대부분의 ApoTf와 대부분의 HoloTf를 포함하는 조성물은 24시간의 처리 후 노목식 상태 하에서 HIF-1α단백질을 유도한다.
예 1에서 수행된 실험은 반복되었지만 24시간 동안 처리를 수행하였고, 노목식 상태 하에서만 행해졌다. 24시간 후, ELISA에 의해 HIF-1α단백질 레벨들에 관한 세포 사이에 있는 단백질들이 수확되고 테스트되었다. 상기 도면에서 볼 수 있는 것처럼, 테스트된 농도들 모두에서 HIF-1α의 세포성 단백질 레벨들의 ApoTf가 증가하였다. HoloTf에 관해서는 4㎎/㎖의 농도를 사용하여 처리가 수행되었을 때에는 HIF-1α의 세포성 단백질 레벨들의 상당한 증가가 관찰되었고, 1㎎/㎖의 농도를 사용할 때에는 상기 단백질이 증가하는 경향이 보여졌다.
예 3. 6시간의 처리 후, ApoTf와 HoloTf의 혼합물은 HIF-1α단백질을 유도한다.
6시간 후, ELISA에 의해 HIF-1α단백질 레벨들에 관한 세포 사이에 있는 단백질들이 수확되었고 테스트되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 혈장 유래된 대부분의 ApoTf, 대부분의 HoloTf 또는 그것들의 혼합물로 노목식 상태 하에서 6시간 처리한 후, HIF-1α 세포성 단백질 레벨들의 증가가 관찰되었다. 또한 상기 도면에서 볼 수 있는 것처럼, ApoTf와 HoloTf의 모든 혼합물들이 SH-SY5Y 뉴런 세포들에서 HIF-1α 단백질의 숫자를 증가시킨다.
예 4. HSA, Apo-트랜스페린 또는 Holo-트랜스페린의 존재시, 노목식(normoxic) 상태와 하이폭식(hypoxic) 상태 하에서 Glut1과 VEFG의 mRNA 발현 수준.
HIF-1α 단백질의 안정화 및 증가는 보통 HIF 관련된 유전자, 즉 그것들의 전사 조절 요소들에서의 HIF 결합 자리들을 가지는 유전자의 숫자 증가(HIF에 의해 목표로 정해진 유전자들의 전사에 있어서의 증가)를 가져온다. HIF-1α 단백질에 의해 활성화되는 2가지 잘 특징지어진(characterized) 유전자는 Glut1 수용체와 VEGF이다. 그러므로, 이들 HIF 목표 유전자들 각각에서의 mRNA 발현 변화들을 분석하기 위해서, SH-SY5Y 세포 라인 세포들이 배양되었고 노목식(21% 산소) 상태 또는 하이폭식(1% 산소) 상태 하에서 6시간 동안 1㎎/㎖와 4㎎/㎖의 농도로 대부분의 ApoTf 또는 대부분의 HoloTf로 처리되었다. 음성 대조군들로서, 세포들이 HSA(1㎎/㎖ 또는 4㎎/㎖)로 처리되었거나 처리되지 않은 채로 남겨졌다. 6시간 후, 에 qPCR의해 Glut1과 VEGF 발현 레벨들에 관한 세포 사이에 있는 mRNA가 수확되고 테스트되었다. 발현 결과들은 처리되지 않은 세포들에서 보이는 대응하는 전사물(transcript)의 발현에 대해 계산되었다. 도 4a 및 도 4b는 Glut1 수용체와 VEGF 각각에 관해 얻어진 발현 결과들을 보여준다. 이러한 도면들에서의 값들은 하우스키퍼(housekeeper)(beta-action) 발현에 관해 정규화된 목표 유전자(Glut1 또는 VEGF)를 지닌 상대적 유전자 발현으로서 도시되어 있다. 상기 숫자들로부터 직접 유래될 수 있는 것처럼, 하이폭식 상태 하에서 Glut1(도 4a)과 VEGF(도 4b) 모두의 발현은 HSA 대조군들에 대한 아포-트랜스페린으로 처리될 때 상당히 증가되었다. 흥미롭게도, 노목식 상태 하에서는 아포-트랜스페린이 아닌 홀로-트랜스페린이 Glut1만 발현을 증가시켰다.
예 5. ApoTf와 HoloTf의 혼합물은 생체 외 또는 생체 내의 유독성을 나타내지 않는다.
HoloTf는 생체 내와 생체 외의 세포들에 독성이 있다고 보고되었기 때문에, 대부분의 ApoTf, 대부분의 HoloTf 또는 ApoTf+HoloTf의 혼합물들을 함유하는 다양한 조성물들의 유독성이 SH-SY5Y 세포들에서 테스트되었다. SH-SY5Y 세포들은 72시간 동안 4㎎/㎖ Tf(도 5a에 표시된 것과 같은), M30 또는 DFO의 표시된 농도들을 가지고 처리되었다. 72 시간 후, 세포들은 셀 티터 글로우 생존 능력 분석 평가(Cell Titer Glow viability assay)를 거쳤다. 대조군 세포들, 처리되지 않은 세포들이 100% 생존 가능 값으로 설정되었다. 평균 생존 능력과 표준 편차들이 각각의 처리 상태에 관해 도시된다. 대부분의 ApoTf를 함유하는 임의의 조성물에서는 어떠한 독성 효과도 보여지지 않았고, 놀랍게도 대부분의 HoloTf의 유독성 또는 유해한 어떠한 효과들도 관찰되지 않았다.
흥미롭게도, 대부분의 ApoTf나 대부분의 HoloTf 조성물 어느 것도 이들 행동 기준에 있어서의 상당한 차이점들을 보여주지 않았고, 이는 생체 내에서의 HoloTf의 어떠한 유해한 효과들도 존재하지 않음을 암시한다. 도 5b는 대부분의 ApoTf 또는 HoloTf를 포함하는 약물로 정맥 주사 치료를 받은 쥐들에 관한 수정된 베더슨(Bederson) 및 일반적인(General) 거동 스코어(score)들을 보여준다. 생체 내 신경에 관계된 기능이 다음 정의(definition)들을 사용하여 수정된 베더슨 스코어(Bederson 등.,1986b; Crumrine 등.,2011)에 의해 평가되었다.
스코어 0: 어떠한 명백한 신경학적 후유증들도 존재하지 않음;
스코어 1: 신체 비틀림 존재;
스코어 2: 우측 편마비(right side weakness)를 동반한 신체 비틀림;
스코어 3: 신체 비틀림과, 선회 거동이 있는 우측 편마비;
스코어 4: 발작 행동
쥐들의 일반적인 거동 스코어들이, 수술 절차들 다음에 오는 동물들의 회복 감시 목적을 위해 CALS 요원에 의해 전개되었다(표준 CALS 수술 후의 조리). 예정된 행동 관찰들에 수치가 설정되었다.
스코어 0: 정상적인 투약 사실이 없는 쥐와 일치하는 거동(즉, 동측성 결손이 없음);
스코어 1: 밝고/활발하고/즉각적으로 반응하는; 쥐는 자발적으로 움직이고 자신의 우리를 찾아내며, 외부 자극들에 반응하고 우리의 상부를 탐색;
스코어 2: 조용하고/민접하며/즉각적으로 반응하는; 보류된 거동 하지만 외부 자극에 반응하게 되며, 뒷다리로 서거나 우리의 상부를 탐색하는데 전념하지 않음;
스코어 3: 활기가 없는 거동: 자극되지 않는 한 움직이는 경향이 없고, 졸린 상태로 재빨리 되돌아가며, 외부 자극들에 거의 흥미를 보이지 않음;
스코어 4: 반응이 느린: 자극을 받을 때조차도 엎드려 있는 위치에 남아 있음; 및
스코어 5: 안락사를 요하는 발작 행동.
예 6. 트랜스페린에 의한 생체내 세포질 보호.
뇌졸중(brain stroke)의 MCAo(Middle Cerebral Artery occlusion) 쥐 모델이, 트랜스페린에 의한 세포질 보호를 평가하기 위해 사용되었다. 스트로크(stroke)는 MCAo 기술을 사용함으로써, 16마리의 쥐에게 수술 방식으로(surgically) 도입되었다. 8마리의 쥐가 뇌에 식염수를 주입함으로써 처리되었고, 나머지 8마리는 죄에 ApoTf를 주입함으로써 처리되었다. 도 6a 및 도 6b는 제어 쥐들(식염수로 처리된)과 비교시, 대부분의 ApoTf를 포함하는 혼합물로 처리된 쥐들에서 위반된 영역의 체적에 있어서의 상당한 감소가 관찰되었음을 보여준다. 도 6a는 ApoTf(385㎎/㎏, Ⅳ) 또는 일시적인 MCAo에 있어서의 염수 처리의 경색(infarct) 부피의 산포도를 보여주고, 도 6b는 대표적인 대조군 및 ApoTf 처리된 쥐로부터의 TTC 얼룩진(stained) 관상 단면들을 보여준다.
예 7. ApoTf 및 HoloTf가 Abeta 1-42 유독성(toxicity)으로부터의 SH-SY5Y를 보호한다.
HIF 경로의 상향조절(upregulation)은 신경 세포들과 뉴런들의 파괴를 가져오는 병리학을 포함하는, 다수의 신경퇴행성 질병에 있어서의 보호하는 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. SH-SY5Y의 처리가 HIF를 상향조절하기 때문에, Apo- 또는 Holo-트랜스페린으로 세포들을 치료하는 것은 신경퇴화를 유도하는 것으로 알려진 물질들을 겪는 세포들에 대한 보호 효과를 제공해야 한다. 도 7은 공지된 신경퇴행성 톡신 올리고머라이즈드 아베타 1-42 펩티드(도 7)의 독성 효과들로부터 대부분의 Apo-트랜스페인과 Holo-트랜스페린이 SH-SY5Y 세포들을 보호하는지를 평가하는 데이터를 강조한다. 증식배지에서 배양된 SH-SY5Y 신경 세포들은 정상적인 산소 레벨들 하에서 24시간 동안 4㎎/㎖의 아포-트랜스페린 또는 홀로-트랜스페린으로 처리되었다. 24시간 후, 세포들은 72시간 동안 추가로 올리고머라이즈드 아베타 1-42 펩티드로 처리되었다. 올리고머라이즈드 아베타-42로 처리한 후, 세포들은 ApoGlo 카스파제(caspase) 3/7 활성화 시금물(assay)을 거쳤다. 대조군 세포들, 처리되지 않은 세포들은 1인 정규화된 값으로 설정되었다. 대조군 세포들에 대한 평균 카스파제 유도와, 표준편차들이 각각의 처리 조건에 관해 도시되어 있다. 흥미 있게, 이들 데이터는 대부분의 ApoTf와 HoloTf 모두 아베타 유도된 독성으로부터 SH-SY5Y를 보호함을 보여준다. 이들 데이터는 또한 ApoTf 또는 HoloTf를 지닌 내제된 독성이 없음을 더 분명히 해준다.
예 8. 소분자 HIF 활성물들과 ApoTf/HoloTf 혼합물들로 인한 상승 작용 효과
트렌스페린은 다른 철환제들이나 효소 억제제들과 같은, 다른 HIF 활성화 소분자들과 상승 작용이 있게 작용할 수 있다. 이는 더 낮은 레벨들의 이들 소분자들이 투여되는 것을 허용할 수 있어, 더 적은 수의 부작용을 이끌어내지만 높은 치료상 레벨들을 유지한다. 아포-트랜스페린이 철환제, DFO, 및 phd2 억제제 IOX2의 효능을 증가시키는지 여부를 결정하기 위해, 혈청이 없는 배지에서 배향된 SH-SY5Y 신경 세포들이 정상적인 산소 레벨들 하에서 소분자 약물(drug)이 존재할 때 또는 존재하지 않을 때 4㎎/㎖의 지시된 단백질들로 처리되었다. 실험 결과들은 도 8a,도 8b, 및 도 8c에 도시되어 있다. 도 8a에 도시된 데이터는 지시된 농도에서 4㎎/㎖의 단백질을 더한, DFO 또는 IOX2의 조합으로 세포들을 처리하는 것에 관련된다. 실험상 양성 대조군(positive control)으로서 CoCl2가 사용되었다. 도 8b에 도시된 데이터는 10μM M30 플러스/마이너스 4㎎/㎖의 단백질의 조합으로 세포들을 처리하는 것에 관련된다. 도 8c에 도시된 데이터는 200μM DFO 플러스/마이너스 4㎎/㎖의 단백질의 조합으로 세포들을 처리하는 것에 관련된다. 6시간 후, ELISA에 의해 HIF-1α단백질에 관해, 세포 내 단백질들이 수확되었고 테스트되었다. 데이터는 표준 편차를 가지고 pg/㎖로 도시되어 있다.
예 9. 대부분의 아포-트랜스페린과 DFO 또는 IOX2 조합들에 대응하는 Glut1 및 VEGF의 mRNA 발현 수준
또한, 대부분의 아포-트랜스페린과 DFO 또는 IOX2 조합들에 대응하는 Glut1 및 VEGF의 mRNA 발현 레벨들이 결정되었다. 혈청이 없는 배지에서 배향된 SH-SY5Y 신경 세포들이, 정상적인 산소 레벨들 하에서 4㎎/㎖의 사람 혈청 알부민 또는 대부분의 아포-트랜스페린을 가지고 처리되었다. 지시된 것처럼, 200μM DFO 또는 1μM IOX2이 HSA 및 대부분의 아포-트랜스페린으로 함께 처리되었다(co-treated). 6시간의 처리 후, qPCR에 의해 Glut1 및 VEGF 발현 레벨들에 관해 세포 내 mRNA가 수확되고 테스트되었다. 하우스피커(베타-액션) 발현에 관해 정규화된 목표 유전자(Glut1 또는 VEGF)를 가지고 상대적 유전자 발현으로서의 값들이 도시된다. 표준 편차들이 도시되어 있다. 도 9a 및 도 9b는 HIF 경로의 소분자 활성물들과 아포-트랜스페린 모두를 추가하여, Glut1 및 VEGF mRNA 레벨들이 상승 작용하는 식으로 그리고 추가적으로 증가하는 것을 보여준다.
예 10. 인간의 주요(primary) 신장 세포에 있어서의 다수 ApoTf 및 다수 HoloTf 유도 HIF-1α 단백질 조성물.
관련 분야에서는 저산소증에 관련되거나 저산소증에 의해 유발된 상태를 치료하기 위해 사용된 많은 소 분자들이 독성이 있고, DFO와 같은 다수의 부작용을 가진다는 것이 공지되어 있다. 상기 소 분자들의 가장 명백한 부작용들 중 하나는 신장 독성이다. 그러므로, 트랜스페린 및/또는 혼합물들이 주요 신장 세포들, 즉 사람의 주요 신장 세포들에서 HIF-1α 레벨들을 증가시키는지를 평가하기 위해, 주요 사람의 RPTEC(renal proximal tubule epithelial cell) 또는 피층(cortical) 상피 세포(HRCE) 모두가 얻어졌다. 혈청이 없는 배지에서 배양된 주요 사람의 RPTEC 또는 주요 피층 상피(HRCE) 세포가, 정상적인 산소 레벨들 하에서 6시간 동안 4㎎/㎖의 대부분의 아포-트랜스페린, 대부분의 홀로-트랜스페린 또는 각각의 다양한 혼합물로 처리되었다. 6시간 후, ELISA에 의해 HIF-1α단백질 레벨들에 관해 세포 내 단백질이 수확되었고 테스트되었다. 도 10a 및 도 10b는 각각 RPTEC 및 HRCE에서 아포-트랜스페린과 홀로-트랜스페린의 혼합물로 이루어진 트랜스페린으로 HIF-1α레벨들이 유도되는 것을 드러내고 있다.
예 11. 다수 ApoTf 또는 DFO의 존재시, 사람의 주요 신장 세포들(primary kidney cells) 내의 카스파제 3/7 활성화를 포함하는, 트랜스페린 또는 DFO의 존재시 사람의 주요 신장 세포들의 생존 능력.
사람의 혈장 단백질의 예상된 안전성 프로필을 고려하면, DFO와 트랜스페린들(대부분의 Apo, 대부분의 Holo 및 혼합물)의 독성 효과가 주요 사람 신장 세포들에서 평가되었다. RPTEC 또는 피층 상피 세포(HRCE)가 48시간 동안 대부분의 ApoTf 또는 DFO의 지시된 농도들을 가지고 처리되었고(도 11a); RPTEC 또는 HRCE 세포가 72시간 동안 4㎎/㎖의 대부분의 ApoTf, 대부분의 HoloTf, 트랜스페린의 혼합물들로 처리되었다(도 11b). 48시간 또는 72시간 후, 세포들은 셀 티터 글로우 생존 능력 분석 평가를 거쳤다. 대조군 세포들, 처리되지 않은 세포들이 100%의 생존 가능 값으로 설정되었다. 평균 생존 능력 및 표준 편차들이 각각의 처리 상태에 관해 도시되어 있다. 도 11a 및 도 11b는 DFO가 상당한 독성 효과를 가지는데 반해, 트랜스페린 분자들 중 어느 것도 이들 주요 신장 세포들에 대해 어떠한 해로운 효과도 보여주지 않는다는 것을 보여준다.
ApoTf 또는 DFO의 존재시 사람의 주요 신장 세포들 내에서의 카스파제 3/7 활성화를 평가하기 위해, RPTE 또는 HRC 세포들이 48시간 동안, ApoTf 또는 DFO의 지시된 농도들로 처리되었다. 48 시간 후, 세포들은 ApoGlo 카스파제 3/7 활성화 시금을 거쳤다. 대조군 세포들, 처리되지 않은 세포들이 정규화된 값 1로 설정되었다. 대조군 세포들에 대한 평균 카스파제 활동과, 표준 편차들이 각각의 처리 상태에 관해 도 12에 도시되어 있다.
예 12. 주요 사람의 간세포들이나 NCI-H1650, 폐 세포 라인에서는 HIFDML 어떠한 상향 조절도 관찰되지 않았다.
위에서 상세히 설명된 바와 같이, 플라즈마 유래된 아포-트랜스페린과 홀로-트랜스페린 모두 사람의 신경 세포 라인인 SH-SY5Y에서 HIF-1α의 세포의 레벨들을 증가시킨다. 신경 세포들 외에, 간과 폐 장기 이식들이 또한 HIF 시그널링(signaling)의 유도로부터 이익을 얻을 수 있다. 따라서, 동일하게 평가하기 위해 주요 간세포들과 폐 세포 라인(NCI-H1650)에서의 HIF-1α 레벨들에서의 트랜스페린들의 효과가 결정되었다. 폐 세포 라인인 NCI-H1650 또는 혈청이 없는 배지에서 배양된 주요 간 세포들이 정상적인 산소 레벨들 하에서 6시간 동안, 4㎎/㎖의 대부분의 아포-트랜스페린, 대부분의 홀로-트랜스페린 또는 pd-트랜스페린으로 처리되었다. 6시간 후, ELISA에 의해 HIF-1α 단백질 레벨들에 관해 세포 내 단백질들이 수확되었고 테스트되었다. 도 13a와 도 13b에서 강조된 바와 같이, 데이터는 HIF-1α 레벨들이 트랜스페린 또는 NCIH1650 또는 주요 간세포들에서의 아포-트랜스페린과 홀로-트랜스페린의 혼합물들로 유도되지 않음을 부여준다.
예 13. 트랜스페린들의 존재시의 NCI-H1650과 사람의 주요 간세포들의 생존 능력.
사람의 혈장 단백질의 예상된 안전성 프로필이 주어지면, NCI-H1650과 사람의 주요 간세포들에서의 트랜스페린들(대부분의 아포, 대부분의 홀로, 및 pd-트랜스페린)의 독성 효과가 평가되었다. 사람의 폐 세포 라인, NCI-H1650, 및 주요 사람의 간 세포들이 4㎎/㎖의 대부분의 ApoTf, 대부분의 HoloTf, 또는 pd-트랜스페린으로 72시간 동안 처리되었다. 72시간 후, 세포들은 셀 티터 글로우 생존 능력 분석 평가를 거쳤다. 대조군 세포들, 처리되지 않은 세포들이 100%의 생존 가능 값으로 설정되었다. 평균 생존 능력 및 표준 편차들이 각각의 처리 상태에 관해 도 14a 및 도 14b에 도시되어 있다. 데이터는 폐 세포들, NCI-H1650, 또는 주요 간 세포들에서 대부분의 HoloTf 또는 대부분의 ApoTf를 함유하는 조성물들에 있어서 어떠한 독성 효과도 관찰되지 않았음을 보여준다.
결론:
사람의 신경 세포 라인인 SH-SY5Y에서 수행된 실험들은 혈장 유래된 아포트랜스페인과 홀로-트랜스페린 모두가 HIF-1α의 세포 레벨들을 증가시켰음을 보여준다. HIF-1α 레벨들에 있어서의 증가는 노목식 상태와 하이폭식 상태 모두 하에서 발생한다. 정상적인 산소 상태 하에서 세포들에 아포-트랜스페린을 투여하는 것은, 세포들이 하이폭식 환경에 노출되었을 때 보여지는 유사한 레벨까지 HIF-1α의 레벨들을 올렸다. 오랜 기간 동안 노목식 상태에서 아포-트랜스페린에 SH-SY5Y 세포들을 노출시키는 것은, 더 짧은 시간 보다는 더 많이 HIF-1α의 레벨을 증가시켰다. 사람의 혈청 알부민 음성 대조군들은 HIF-1α 레벨들에 어떠한 효과도 미치지 않았다.
ApoTf와 HoloTf의 다양한 혼합물들은 모두 SH-SY5Y 신경 세포들과 주요 신장 세포들에서 HIF-1α 단백질을 상향 조절하였다.
주요 사람의 간 세포들, 또는 NCI-H1650, 폐 세포 라인에서는 HIF-1α의 어떠한 상향 조절도 관찰되지 않았다.
ApoTf와 HoloTf의 다양한 혼합물들은 모두 SH-SY5Y 신경 세포들에서 HIF-1α 목표 유전자들을 상향 조절하였다.
임의의 세포 타입(신경, 폐, 신장 또는 간세포)이나 생체내에서 대부분의 HoloTf 또는 대부분의 ApoTf를 함유하는 조성물에서는 어떠한 독성 효과도 관찰되지 않았다.
허혈재관류(ischemia-reperfusion)의 신경 스트레스 모델에서의 쥐들의 생체 내 처리는 트랜스페린이 경색부로부터 쥐 세포들을 보호한다는 점을 보여주었다.
대부분의 ApoTf 또는 HoloTf를 포함하는 혼합물들은 아베타(1-42) 올리고머의 독성 효과들로부터 신경 세포들을 보호하였다.
대부분의 ApoTf로 구성된 혼합물들만이 M30 또는 DFO로 상승 작용 효과들을 가졌고, 이들 상승 작용 활동들은 오직 SH-SY5Y 신경 세포들에서 일어난다.
Figure 112019120461963-pat00001
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Claims (9)

  1. HIF 관련 병리학적 상태의 치료시 사용하기 위해 아포-트랜스페린(apo-transferrin: ApoTf)과 홀로-트랜스페린(holo-transferrin: HoloTf)의 혼합물을 포함하는 조성물로서,
    상기 병리학적 상태는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 및 근위축성 측삭 경화증으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 신경퇴행성 질환이며,
    상기 조성물은 98%의 Apo-Tf:2%의 Holo-Tf 내지 30%의 Apo-Tf:70%의 Holo-Tf의 비율의 아포-트랜스페린(Apo-Tf)과 홀로-트랜스페린(Holo-Tf)의 혼합물인, 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 철환제(iron chelator) 또는 PHD2 효소 억제제 중 어느 하나를 더 포함하는, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 아포-트랜스페린 및 상기 홀로-트랜스페린은 재조합체인, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 아포-트랜스페린 및 상기 홀로-트랜스페린은 혈액에서의 반감기를 연장하는 도메인들에 대한 공유 융합을 포함하여, 단백질의 혈장(plasma) 반감기를 연장하기 위해, 페길레이션(pegylation), 당화(glycosylation), 폴리시알리레이션(polysialylation), 또는 다른 물리적 변형들에 의해 변형되는, 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 도메인들은 면역글로불린, 알부민, 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1), 엑센딘-4(exendin-4) 또는 XTEN의 Fc 도메인, 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 아포-트랜스페린 및 상기 홀로-트랜스페린은, SEQ ID NO:1과 50%를 초과하는 유사도를 포함하는 트랜스페린의 유도체들인, 조성물.
  8. 제 2 항에 있어서,
    상기 철환제는 M30, 데페록사민(DFO), 데페라시록스(Deferasirox), 디페리프론(deferiprone), 디페리트린(deferitrin), L1NAll, CP363, CP502 또는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)인, 조성물.
  9. 제 2 항에 있어서,
    상기 PHD2 효소 억제제는 IOX2, IOX3, 디메틸록살릴 글리신 또는 다른 2-옥소글루타르산 결합 자리 분자들인, 조성물.
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