KR102299751B1 - 일반화된 스토캐스틱 초-해상 시퀀싱 - Google Patents
일반화된 스토캐스틱 초-해상 시퀀싱 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102299751B1 KR102299751B1 KR1020197038832A KR20197038832A KR102299751B1 KR 102299751 B1 KR102299751 B1 KR 102299751B1 KR 1020197038832 A KR1020197038832 A KR 1020197038832A KR 20197038832 A KR20197038832 A KR 20197038832A KR 102299751 B1 KR102299751 B1 KR 102299751B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- molecule
- events
- delete delete
- event
- sequencing
- Prior art date
Links
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 86
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 110
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 58
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 10
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 67
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 47
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 47
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 24
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 description 23
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 22
- 241000894007 species Species 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 20
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 16
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 14
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 14
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 14
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 13
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 12
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 10
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108050008598 Phosphoesterases Proteins 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- -1 for example Chemical class 0.000 description 6
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 6
- 150000002972 pentoses Chemical group 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 4
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 4
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003963 dichloro group Chemical group Cl* 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006224 matting agent Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1h-indole Chemical compound C1=CC=C2NC([N+](=O)[O-])=CC2=C1 HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTBBGQKRYUTLMP-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CN1 FTBBGQKRYUTLMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000010719 DNA-(Apurinic or Apyrimidinic Site) Lyase Human genes 0.000 description 2
- 108010063362 DNA-(Apurinic or Apyrimidinic Site) Lyase Proteins 0.000 description 2
- 108010036364 Deoxyribonuclease IV (Phage T4-Induced) Proteins 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002165 resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- LFRDGHVRPSURMV-YFKPBYRVSA-N (4s)-4,5-dihydroxypentanal Chemical compound OC[C@@H](O)CCC=O LFRDGHVRPSURMV-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VIIIJFZJKFXOGG-UHFFFAOYSA-N 3-methylchromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(C)=CC2=C1 VIIIJFZJKFXOGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014722 Alkyl and Aryl Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000002226 Alkyl and Aryl Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 102000010638 Kinesin Human genes 0.000 description 1
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000754 Phosphoric Triester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004203 Phosphoric Triester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N Stilbene Natural products C=1C=CC=CC=1/C=C/C1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- NLTUCYMLOPLUHL-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-[gamma-thio]triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O NLTUCYMLOPLUHL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DAEAPNUQQAICNR-RRKCRQDMSA-K dADP(3-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 DAEAPNUQQAICNR-RRKCRQDMSA-K 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTDHDKPUHBLBTL-SHYZEUOFSA-K dCDP(3-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 FTDHDKPUHBLBTL-SHYZEUOFSA-K 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- CIKGWCTVFSRMJU-KVQBGUIXSA-N dGDP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 CIKGWCTVFSRMJU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- UJLXYODCHAELLY-XLPZGREQSA-N dTDP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 UJLXYODCHAELLY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000011157 data evaluation Methods 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N deoxyguanylic acid Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IINNWAYUJNWZRM-UHFFFAOYSA-L erythrosin B Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(I)C(=O)C(I)=C2OC2=C(I)C([O-])=C(I)C=C21 IINNWAYUJNWZRM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004174 erythrosine Substances 0.000 description 1
- 229940011411 erythrosine Drugs 0.000 description 1
- 235000012732 erythrosine Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6432—Quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
- G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
Abstract
본 발명은 샘플 용기 상에 복수의 부착 요소의 각각에 단일 DNA 주형 분자를 부착하는 단계; 스토캐스틱 포토-스위칭에 의해서 부착된 분자가 최대 4개의 다른 색상으로 온 및 오프 이벤트에서 형광을 일으키도록 스토캐스틱 포토-스위칭 화학을 모든 분자에 동시에 적용하는 단계; 및 온 및 오프 이벤트가 부착된 분자에 대해 발생함에 따라 실시간으로 각 색상에 대하 색상 채널에서 온 및 오프 이벤트를 이미징하는 단계;를 포함하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법으로서, 단일 DNA 주형 분자를 부착하는 단계에서, 인접한 요소들 사이의 평균 거리는 Abbe의 한계 미만이다.
Description
본 발명은 스토캐스틱 초-해상 시퀀싱에 관한 것이다.
DNA 시퀀싱에 사용되는 기술을 포함하여 생물학 분야의 수많은 기술은, 개선된 이미징 시스템 및 기술로부터 이익을 얻었다. DNA 시퀀싱에 대한 초기 접근법에는 디데옥시 사슬 종결 방법(즉, 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)) 및 화학적 분해 방법(즉, Maxam-Gilbert 시퀀싱)이 포함되었다. 이들 기술에 대한보다 저렴하고 빠른 대안에 대한 요구는 SBS(Sequencing by Synthesis)로 알려진 앙상블 시퀀싱 접근법의 개발로 이어졌다. 이 프로세스에서, 단일 주형 분자가 먼저 화학적으로 증폭되어 동일한 서열을 갖는 분자의 표면 결합된 "클러스터"를 생성한다. 클러스터가 생성되면, 시퀀싱이 시작되고, 이에 의해 주형의 서열에 기초하여 변형된 폴리머라제에 의해 형광 뉴클레오티드가 첨가된다. 클러스터는 광원에 의해 여기되어 기본 형광을 결정하기 위해 특성 형광 신호가 방출된다. 그런 다음 3' 사슬 종결자와 함께 염료를 제거하고, 시퀀스에서 다음 염기에 대해 주기를 반복한다.
본 명세서에 포함되어 있음.
본원에 개시된 기술의 다양한 예는 초-해상 시퀀싱을 위한 방법 및 기술을 제공한다. 일 예시에서, 복수의 폴리뉴클레어티드를 시퀀싱하는 방법 및 시스템은 다음의 단계를 포함한다: 단일 DNA 주형 분자를 부착하는 단계에서 인접한 요소들 사이의 평균 거리는 Abbe의 한계 미만 이며, 스토캐스틱 포토-스위칭에 의해서 부착된 분자가 최대 4개의 다른 색상으로 온 및 오프 이벤트에서 형광을 일으키도록 스토캐스틱 포토-스위칭 화학을 모든 분자에 동시에 적용하는 단계; 및 온 및 오프 이벤트가 부착된 분자에 대해 발생함에 따라 실시간으로 각 색상에 대하 색상 채널에서 온 및 오프 이벤트를 이미징하는 단계. 인접 요소들 간에 평균 거리는 약 20nm 미만 또는 인접 요소들 사이의 평균 거리는 약 2 nm 내지 약 20nm의 범위 내에 있을 수 있다.
다른 예에서, 인접 앵커들 사이의 평균 거리는 Abbe의 한계 미만이며, 고체 지지체에 고정된 뉴클레오티드 시퀀스의 어레이를 제공하는 단계; 뉴클레오티드를 커플링할 수 있는 효소, 탈-차단제, 고체 지지체에 고정된 뉴클레오티드 시퀀스에 상보적인 시퀀스를 가지는 뉴클레오티드 스트랜드에 커플링된 핵산, 및 라벨 모이어티 및 퀀처 모미어티가 결합된 염기를 포함하는 하나 이상의 뉴클레어티드 유사체를 포함하는 어레이에 혼합물을 제공하는 단계, 여기서 라벨 모이어티는 특정 염기 모이어티와 상관된다; 및 복수의 뉴클레어티드 유사체를 핵산에 순차적으로 첨가하여 혼합물 내의 여러 반응 사이클을 통해 진행하면서 어레이 내에 라벨 모이어티를 동시에 이미징하는 단계;를 포함하는 폴리뉴클레어티드를 시퀀싱하는 방법으로서, 각 반응 사이클은: (i) 소광제 모이어티를 절단하고 라벨 모이어티를 포함하는 일시적 핵산 종을 형성함으로써 핵산에 뉴클레오티드 유사체를 첨가하는 폴리머라제; 및 (ii) 라벨 모이어티를 제거하기 위해 일시적 핵산 종을 변항시키는 탈-차단제;를 포함할 수 있다. 일부 응용 예에서, 인접 앵커 사이의 평균 거리는 20nm미만이다. 추가 응용 예에서, 인접 앵커 사이의 평균 거리는 2nm 내지 20nm의 범위 내에 있다. 뉴클레어티드를 커플링할 수 있는 효소는 폴리머라제, 미오신, 또는 키나제를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 유사체는 3' 탄소를 갖는 펜토스모이어티를 포함할 수 있고 라벨 모이어티는 3' 탄소에서 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 다른 예에서, 뉴클레오티드 유사체는 트리포스페이트 모이어티를 포함할 수 있고 소광제 모이어티는 트리포스페이트 모이어티에 부착될 수 있다.
일부 응용 예에서, 탈-차단제는 포스포에스테라제 효소(예를 들어, 포스포디에스테라제, 포스포트리 에스테라제 등)를 포함할 수 있다. 포스포에스테라제는 일시적 핵산 종으로부터 포스포디에스테르 모이어티 또는 포스포트리에스테르 모이어티를 선택적으로 제거하기 위해 포함될 수 있다. 포스 포에스테라제는 엔도뉴클레아제 IV 및 AP 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 일시적 차단 핵산 종은 탈-차단제가 라벨 모이어티를 제거하기 위해 일시적 핵산 종을 변형시키기 전에 적어도 1밀리초 동안 존재할 수 있다. 추가의 예로서, 일시적 차단 핵산 종은 탈-차단제가 라벨 모이어티를 제거하기 위해 일시적 핵산 종을 변형시키기 전에 30초 이하 동안 존재할 수 있다.
다양한 응용 예에서, 여러 반응 사이클은 100개 이상의 반응 사이클을 포함할 수 있으며, 이에 의해 핵산은 100개 이상의 뉴클레오티드 유사체의 첨가에 의해 연장된다. 다양한 응용 예에서, 뉴클레오티드를 커플링할 수 있는 효소는 폴리머라제, 미오신 또는 키나제를 포함한다.
추가 예시에서, 복수의 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법은 샘플 용기 상에 복수의 부착 요소의 각각에 단일 DNA 주형 분자를 부착하는 단계; 스토캐스틱 포토-스위칭에 의해서 부착된 분자가 최대 4개의 다른 색상으로 온 및 오프 이벤트에서 형광을 일으키도록 스토캐스틱 포토-스위칭 화학을 모든 분자에 동시에 적용하는 단계; 및 온 및 오프 이벤트가 부착된 분자에 대해 발생함에 따라 실시간으로 각 색상에 대하 색상 채널에서 온 및 오프 이벤트를 이미징하는 단계;를 포함하며, 단일 DNA 주형 분자를 부착하는 단계에서 인접한 요소들 사이의 평균 거리는 Abbe의 한계 미만이다. 포토-스위칭의 스토캐스틱 특성으로 인해, 다양한 예시에서, 포토-스위칭의 스토캐스틱 특성으로 인해, 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 동일한 염기에 대한 온 이벤트와 동시에 발생할 확률이 0.5% 미만일 것이다. 스토캐스틱 포토-스위칭을 위한 시약의 농도는 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 동일한 염기에 대한 온 이벤트가 동시에 발생할 확률이 0.5% 미만이 되도록 선택될 것이다. 다른 예에서, 다른 농도가 사용될 수 있다. 인접 요소들 사이의 평균 거리는 약 20nm 미만 또는 약 2nm 내지 20nm 사이의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 응용 예에서, 샘플 용기 상에 각각의 부착 요소는 온 및 오프 이벤트를 이미징하는데 사용되는 이미저(image)의 시야 내에 있어서, 복수의 부착 요소에서 부착된 분자에 대해 온 및 오프 이벤트의 이미징이 동시에 발생한다. 스토캐스틱 포토-스위칭 화학을 모든 분자에 동시에 적용하는 단계는 모든 분자에 동시에 스토캐스틱 광학 재구성 현미경(STORM), DNA-PAINT(DNA Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography), 또는 직접 스토캐스틱 광학 재구성 현미경 스토캐스틱 포토-스위칭 화학(direct stochastic optical reconstruction microscopy stochastic photoswitching chemistry)을 가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 방법은 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 동일한 염기에 대한 온 이벤트와 동시에 발생할 확률을 제어하기 위해 온 및 오프 이벤트가 발생하는 속도를 제어하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 응용 예에서, 온 및 오프 이벤트가 발생하는 속도를 제어하는 단계는 스토캐스틱 포토-스위칭 화학에서 뉴클레오티드 및 효소의 농도를 조정하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 응용 예에서, 온 및 오프 이벤트가 발생하는 속도를 제어하는 단계는 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 같은 염기에 대한 온 이벤트와 동시에 발생할 확률이 본 방법에 적용되는 시퀀싱 어플리케이션에서 결정된 에러율보다 낮도록 온 및 오프 시간을 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 응용 예에서, 본 방법은 색상 채널에서 감지된 온 이벤트의 조명 세기가 기결정된 임계값보다 큰지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 색상 채널에서 감지된 온 이벤트의 스팟 크기가 기결정된 임계값보다 큰지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이미징 시스템은 복수의 부착 요소를 포함하는 샘플 용기; 및 스토캐스틱 포토-스위칭 화학이 동시에 모든 부착된 분자가 최대 4개의 다른 색상으로 온 및 오프 이벤트에서 형광을 일으키도록 가해질 때, 온 및 오프 이벤트가 부착된 분자에 대해 발생하는 것과 동시에 복수의 색상 채널에서 온 및 오프 이벤트를 캡처함으로써, 복수의 부착 요소에서 발생하는 포토-스위칭 이미징하도록 위치된 이미저;를 포함하며, 단일 DNA 주형 분자는 각각의 부착 요소에 부착되며, 인접한 부착 요소들 사이의 평균 거리는 Abbe의 한계 미만이다. 샘플 용기는 복수의 샘플 위치에서 복수의 부착 요소를 포함하는 플로우 셀을 포함할 수 있다. 다양한 예시에서, 인접 요소들 사이의 평균 거리는 20nm미만 또는 약 2nm 내지 20nm의 범위 내에 있일 수 있다. 다양한 예에서, 샘플 용기 상에 각각의 복수의 부착 요소는 온 및 오프 이벤트의 캡처가 복수의 부착 요소에서 부착된 분자에 대해 동시에 발생하도록 포토-스위칭을 이미징하는데 사용되는 이미저의 시야 내에 있다. 동시에 부착된 모든 분자에 가해진 스토캐스틱 포토-스위칭 화학은 스토캐스틱 광학 재구성 현미경(STORM), DNA-PAINT(DNA Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography), 또는 직접 스토캐스틱 광학 재구성 현미경 스토캐스틱 포토-스위칭 화학(a direct stochastic optical reconstruction microscopy stochastic photoswitching chemistry)을 포함할 수 있다.
이미징 시스템은 스토캐스틱 광학 재구성 현미경(STORM), DNA-PAINT(DNA Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography), 또는 확률 론적 광-스위칭 화학은 부착된 분자가 형광을 일으키도록 적용됨에 따라 광화학 반응에 의해 구동되는 직접 스위칭을 사용할 수 있다. 스토캐스틱 포토-스위칭을 위한 시약의 농도는 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 동일한 염기에 대한 온 이벤트가 동시에 발생할 확률이 0.5% 미만이 되도록 한다.
이미징 시스템은 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 같은 염기에 대한 온 이벤트와 동시에 발생할 확률이 본 방법에 적용되는 시퀀싱 어플리케이션에서 결정된 에러율보다 낮도록 온 및 오프 이벤트가 발생하는 속도를 조정하도록 구현될 수 있다. 이미징 시스템은 색상 채널에서 감지된 온 이벤트의 스팟 크기 또는 조명 세기가 기결정된 임계값보다 큰지 여부를 결정할 수 있다.
개시된 기술의 다른 특징 및 양태는 예로서 개시된 기술의 구현에 따른 특징을 예시하는 첨부 도면과 함께 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 요약서는 청구범위 및 등가물에 의해 정의되는 본원에 기재된 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
상술한 개념(이러한 개념이 서로 일치하지 않는 경우)의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 범위의 일부로 고려된다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에 포함되어 있음.
하나 이상의 예시에 따라 본 명세서에 개시된 기술은 다음 도면을 참조하여 상세하게 설명된다. 이들 도면은 개시된 기술에 대한 독자의 이해를 돕기 위해 제공된 것이며, 개시된 정확한 형태로 본 개시를 철저하거나 제한하려는 것이 아니다. 실제로, 도면은 단지 예시의 목적으로 제공되며, 개시된 기술의 전형적인 또는 예시적인 예를 도시할 뿐이다. 또한, 명확성 및 예시의 용이성을 위해, 도면의 요소는 반드시 축척대로 그려진 것은 아니라는 점에 유의해야 한다.
도 1은 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법이 구현될 수 있는 이미지 스캐닝 시스템의 일 예의 간략화된 블록도를 도시한다.
도 2는 복수의 부착 지점 또는 앵커를 포함하는 샘플 용기의 예를 도시한다.
도 3은 특정 스토캐스틱 포토-스위칭(stochastic photo-switching) 화학과 관련하여 도 2에 도시된 용기의 열의 측면도의 예를 도시한다.
도 4는 초-해상도 시퀀싱을 위한 예시적인 프로세스를 도시한다.
도 5는 본 명세서에 기술된 초-해상도 시퀀싱 예시에 사용될 수 있는 래칫 생화학 성분의 예를 도시한다.
도 6은 뉴클레오티드의 유입에 따른 화학 프로세스의 예를 도시한다.
도 7은 상술한 화학 프로세스를 사용한 초-해상도 이미징의 프로세스의 예를 도시한다.
개시된 기술은 수정 및 변경되어 실시될 수 있으며, 개시된 기술은 그 등가물 및 청구항에 의해서만 제한된다는 것이 이해되어야 한다.
도 1은 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법이 구현될 수 있는 이미지 스캐닝 시스템의 일 예의 간략화된 블록도를 도시한다.
도 2는 복수의 부착 지점 또는 앵커를 포함하는 샘플 용기의 예를 도시한다.
도 3은 특정 스토캐스틱 포토-스위칭(stochastic photo-switching) 화학과 관련하여 도 2에 도시된 용기의 열의 측면도의 예를 도시한다.
도 4는 초-해상도 시퀀싱을 위한 예시적인 프로세스를 도시한다.
도 5는 본 명세서에 기술된 초-해상도 시퀀싱 예시에 사용될 수 있는 래칫 생화학 성분의 예를 도시한다.
도 6은 뉴클레오티드의 유입에 따른 화학 프로세스의 예를 도시한다.
도 7은 상술한 화학 프로세스를 사용한 초-해상도 이미징의 프로세스의 예를 도시한다.
개시된 기술은 수정 및 변경되어 실시될 수 있으며, 개시된 기술은 그 등가물 및 청구항에 의해서만 제한된다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 다양한 예는, 형광단의 스토캐스틱(stochastic) 스위칭이 시퀀싱 반응 자체와 커플링되고 이미징이 혼입 시에 복수의 인접 분자에 대해 실시간으로 발생하는, 균일 단일-포트 반응을 사용하는 초-해상도 시퀀싱을 제공한다. 특히, 일부 적용에서, 샘플 용기는 복수의 웰(well) 또는 부착 요소가 구비되는데, 이는 Abbe의 제한(Abbe's limit) 하에서 개별 요소를 해설할 수 있도록 허용된 가격보다 작은 간격으로 배치된다. 단일 DNA 주형 분자는 시퀀싱을 위해 샘플 용기에 각 부착 요소에 부착된다. 이미지화 되는 분자 그룹에서 모든 분자의 스토캐스틱 포토-스위칭을 제공하는 시퀀싱 화학이 적용된다. 형광단이 그룹 내에서 스위치 온 및 오프되는 것과 동시에 모든 분자에 대한 이미지화 반응이 실시간으로 발생한다. 반응들이 스토캐스틱이고 분자간에 동기화되지 않기 때문에, 인접한 분자가 동일한 염기를 동시에 포함하지 않을 가능성이 통계적으로 존재한다.
일부 적용에서, 시퀀싱은 정확한 뉴클레오티드를 포함하는 폴리머라제(polymerase)에 의해서 발생하며, 유입 사건 동안에, 형광단은 짧은 시간 동안에 스위치 온되고 다시 스위치 오프된다. 동시에, 유입 사건은 샘플 용기에서 복수의 부착 요소에서 발생한다. 이들 다양한 분자에서 스위칭은 스토캐스틱이고 분자간에 동기화되지 않기 때문에, 반응이 발생하는 동시에 이들은 이미지화될 수 있어서, 순차적이고 더 시간 소모적인 프로세스가 필요하지 않다.
다양한 초-해상도 프로세스를 상세히 설명하기 전에, 이러한 프로세스가 구현될 수 있는 예시 환경을 설명하는 것이 유용한다. 이러한 예시적인 환경 중 하나는 도 1에 도시된 것과 같은 이미지 스캐닝 시스템의 환경이다. 예시적인 이미지 스캐닝 시스템은 영역의 이미지를 획득 또는 생성하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 도 1의 개략적인 예시는 백 라이트 디자인의 이미징 구성 예를 도시한다.
도 1의 예에서 알 수 있는 바와 같이, 대상 샘플은 샘플 용기(110) 상에 위치하며, 샘플 용기(110)는 대물 렌즈(142) 아래의 샘플 스테이지(170)에 위치된다. 광원(160) 및 관련 광학장치(optics)는 레이저 광과 같은 광빔을 샘플 용기(110) 상의 선택된 샘플 위치로 지향시킨다. 샘플은 형광을 내고, 합성 광(resultant light)은 대물 렌즈(142)에 의해 수집되고 형광을 검출하기 위해 광-검출 카메라 시스템 (140)으로 보내진다. 샘플 스테이지(170)는 대물 렌즈(142)의 초점에서 샘플 용기(110)상의 다음 샘플 위치를 위치시키기 위해 대물 렌즈(142)에 대해 이동된다. 대물 렌즈(142)에 대한 샘플 용기 (110)의 이동은 샘플 스테이지 자체, 대물 렌즈, 전체 광학 스테이지 또는 전술한 것의 임의의 조합을 이동시킴으로써 달성될 수 있다. 추가적인 예는 또한 전체 이미징 시스템을 고정 샘플 위로 이동시키는 것을 포함할 수 있다.
유체 전달 모듈 또는 장치(100)는 시약(예: 형광 뉴클레오티드, 완충액(buffers), 효소(enzymes), 절단 시약(cleavage reagents) 등)의 흐름을 샘플 용기 (110) 및 폐기물 밸브(120)로 향하게 한다. 일부 응용 예에서, 샘플 용기(110)는 샘플 용기(110)의 복수의 샘플 위치에서 핵산 서열의 클러스터를 포함하는 플로우셀(flowcell)로서 구현될 수 있다. 시퀀싱될 샘플은 다른 선택적인 구성요소와 함께 플로우셀의 기판에 부착될 수 있다.
시스템은 또한 샘플 용기(110) 내의 유체의 온도 조건을 선택적으로 조절할 수 있는 온도 스테이션 액추에이터(130) 및 가열기/냉각기(135)를 포함한다. 카메라 시스템(140)은 샘플 용기(110)의 시퀀싱을 모니터링하고 추적하기 위해 포함될 수 있다. 카메라 시스템(140)은, 예를 들어, 필터 스위칭 어셈블리(145), 대물 렌즈 (142) 및 포커싱 레이저(150) 내의 다양한 필터들과 상호 작용할 수 있는 CCD 카메라로서 구현될 수 있다. 카메라 시스템(140)은 CCD 카메라로 제한되지 않으며, 다른 카메라 및 이미지 센서 기술이 사용될 수 있다.
광원(160)(예를 들어, 선택적으로 다수의 레이저를 포함하는 어셈블리 내의 여기 레이저) 또는 다른 광원이 광섬유 인터페이스(161)(이는 하나 이상의 재-이미징 렌즈, 광섬유 마운트, 등을 선택적으로 포함한다)를 통한 조명을 통해 샘플 내에서 형광 시퀀싱 반응을 조명하기 위해 포함될 수 있다. 저 와트 램프(165), 포커싱 레이저(150), 포커싱 검출기(141) 및 역 다이크로익(reverse dichroic)(185) 또한 도시된 예에 제시되어있다. 포커싱 레이저(150)는, 즉, 대물 렌즈(142)와 샘플 (110) 사이의 거리를 조정함으로써, 또는 당업계에 공지된 다른 포커싱 기술을 사용하여, 시스템을 자동-포커싱하기 위해서 포커싱 검출기(141)와 함께 사용될 수 있다. 일부 응용 예에서, 포커싱 레이저(150)는 이미징 동안 꺼질 수 있다. 다른 응용 예에서, 대안의 포커싱 구성은 제2 포커싱 카메라(도시되지 않음)를 포함 할 수 있으며, 제2 포커싱 카메라는 데이터 수집과 동시에 표면에서 반사된 산란 빔의 위치를 측정하기 위해서 제2 사분면 검출기, 위치 감지 검출기(PSD) 또는 유사한 검출기일 수 있다.
백라이트 장치로서 예시되었지만, 다른 예에서는 레이저 또는 샘플 용기(110) 상에 대물 렌즈(142)를 통하여 지향되는 레이저 또는 다른 광원(미도시)을 포함할 수 있다. 샘플 용기(110)는 대물 렌즈(142)에 대한 샘플 용기(110)의 이동 및 정렬을 제공하기 위해 궁극적으로 샘플 스테이지(170) 상에 장착될 수 있다. 샘플 스테이지는 임의의 3개 방향으로 움직일 수 있도록 하나 이상의 액추에이터를 가질 수 있다. 예를 들어, 직교좌표의 관점에서, 스테이지가 대물 렌즈에 대해 X, Y 및 Z 방향으로 이동하도록 액추에이터가 제공될 수 있다. 이는 샘플 용기(110) 상의 하나 이상의 샘플 위치가 대물 렌즈(142)와 광학적으로 정렬되게 할 수 있다.
포커싱(z축) 구성 요소(175)는 이 예에서 샘플 용기(110)에 대한 광학 구성 요소의 포커싱 방향(일반적으로 z축 또는 z방향으로 지칭됨)에서의 위치를 제어하기 위해 포함되는 것으로 도시되어있다. 포커스 구성 요소(175)는, 이미징 작업을 위해 적절한 포커싱을 제공하기 위해서 광학 구성 요소(예: 광학 렌즈(142))에 대하여 샘플 스테이지(170) 상의 샘플 용기를 이동시키도록, 광학 스테이지, 샘플 스테이지, 또는 두 스테이지 모두에 물리적으로 커플링된 하나 이상의 액츄에이터를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 액추에이터는 예를 들어 기계적, 자기적, 유체적 또는 다른 부착에 의해 또는 스테이지에 직접 또는 간접적 접촉에 의해 각각의 스테이지에 물리적으로 결합될 수 있다. 하나 이상의 액추에이터는 동일한 평면에서 샘플 스테이지를 유지하면서(예를 들어, 광축에 수직인 수평 또는 수평 자세를 유지하면서) z방향으로 스테이지를 이동 시키도록 구성될 수 있다. 하나 이상의 액추에이터는 또한 스테이지를 기울이도록 구성될 수 있다. 이는 예를 들어 샘플 용기(110)가 표면의 임의의 경사를 고려하도록 동적으로 레벨링될(leveled) 수 있도록 수행될 수 있다.
시스템의 포커싱은 일반적으로 대물 렌즈의 초점 평면을 선택된 샘플 위치에서 이미지화될 샘플과 정렬시키는 것을 지칭할 수 있다. 그러나, 포커싱은 또한 예를 들어 테스트 샘플의 이미지에 대한 원하는 레벨의 선명도 또는 콘트라스트와 같은 샘플의 표현을 위한 원하는 특성을 얻기 위해 시스템에 대한 조정을 지칭할 수 있다. 대물 렌즈의 초점 평면의 사용 가능한 피사계 심도가 매우 작을 수 있기 때문에(때로는 1㎛이하), 초점 구성 요소(175)는 이미징되는 표면을 밀접하게 따라 간다. 샘플 용기가 기기에 고정된 것처럼 완벽하게 평평하지 않기 때문에, 포커싱 구성 요소 (175)는 스캐닝 방향(일반적으로 본 명세서에서 y축으로 지칭 됨)을 따라 이동하면서 이러한 프로파일을 따르도록 설정될 수 있다.
이미징되는 샘플 위치에서 테스트 샘플로부터 나오는 광은, 예를 들어 카메라 시스템(140)을 포함하는 하나 이상의 검출기로 향할 수 있다. 검출기는 예를 들어 CCD 카메라를 포함할 수 있다. 포커싱 영역으로부터 나오는 광만이 검출기로 통과할 수 있도록 조리개(aperture)가 포함되고 위치될 수 있다. 조리개는 포커싱 영역의 밖에 있는 영역에서 나오는 광의 구성 요소를 필터링하여 이미지 품질을 향상시키기 위해 포함될 수 있다. 방출 필터는 필터 스위칭 어셈블리(145)에 포함될 수 있으며, 이는 결정된 방출 파장을 기록하고 임의의 미광 레이저 광(stray laser light)을 차단하도록 선택될 수 있다.
다양한 예에서, 샘플 용기(110)는 샘플이 구비되는 하나 이상의 기판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 복수의 상이한 핵산 시퀀싱을 분석하기 위한 시스템의 경우, 샘플 용기(110)는 시퀀싱될 핵산이 결합, 부착 또는 연관되는 하나 이상의 기판을 포함할 수 있다. 다양한 예에서, 기판은, 예를 들어 유리 표면, 플라스틱 표면, 라텍스, 덱스트란(dextran), 폴리스티렌 표면, 폴리프로필렌 표면, 폴리아크릴아미드 겔, 금 표면 및 실리콘 웨이퍼와 같은, 핵산이 부착될 수 있는 임의의 불활성 기판 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 일부 응용 예에서, 기판은 샘플 용기(110)를 가로 질러 매트릭스 또는 어레이로 형성된 복수의 위치에서 채널 또는 다른 영역 내에 있다.
도 1을 참조하여 전술한 예시적인 스캐닝 시스템과 같은 스캐닝 시스템의 동작을 제어하기 위해 하나 이상의 제어기(미도시)가 제공될 수 있다. 제어기는 예를 들어 포커싱, 스테이지 이동, 및 이미징 동작과 같은 시스템 동작의 양태들을 제어하도록 구현될 수 있다. 다양한 응용 예에서, 제어기는 하드웨어, 소프트웨어 또는 전술한 것의 조합을 사용하여 구현될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현들에서, 제어기는 연관된 메모리를 갖는 하나 이상의 CPU 또는 프로세서를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 제어기는 동작을 제어하기 위해 하드웨어 또는 다른 회로를 포함할 수 있다. 예를 들어, 회로에는 다음 중 하나 이상이 포함될 수 있다: FPGA(Field Programmable Gate Array), ASIC(application specific integrated circuit), PLC(programmable logic device), CPLD(complex programable logic device), PLA(programmable logic array), PAL(programmable array logic) 또는 기타 유사한 처리 장치 또는 회로. 또 다른 예로서, 제어기는 이러한 회로와 하나 이상의 프로세서의 조합을 포함할 수 있다.
도 1을 참조하여 설명된 것과 같은 시스템과 함께 사용될 수 있는 시퀀싱 기술은 차세대 시퀀싱(NGS) 기술을 포함한다. SBS(Sequencing by Synthesis)는 추가 중합반응(polymerization)을 차단하는 터미네이터(terminator)를 포함하는 변형된 dNTP들을 사용하는 널리 채택된 NGS 기술이다. 시퀀싱 반응은 다수의 주형 분자에서 동시에 수행될 수 있다. SBS로, 각각의 dNTP가 첨가 될 때 형광 라벨된 가역적 터미네이터가 이미징되고, 다음 염기의 혼입을 위해 절단된다. 각 시퀀싱 주기 동안 4개의 가역적 터미네이터-결합 dNTP가 모두 존재하기 때문에, 자연 경쟁은 혼입 편향을 최소화한다. 이는 결과적으로 광범위한 응용 분야에서 정확한 데이터를 얻을 수 있는 염기-대-염기 시퀀싱(base-by-base sequencing)으로 이어진다.
NGS에서, DNA 중합효소는 DNA 합성의 순차적인 주기 동안 형광 라벨된 dNTP(deoxyribonucleotide triphosphates)의 DNA 주형 스트랜드로의 혼입을 촉진시킨다. 각각의 사이클 동안, 혼입 시점에서, 뉴클레오티드는 형광단 여기에 의해 식별된다. 한 가지 차이점은, 단일 DNA 단편을 시퀀싱하는 대신에, NGS가 이 프로세스를 수백만 개의 단편에 걸쳐 대규모 병렬 방식으로 확장한다는 것이다.
NGS에 대한 하나의 접근법은 다음의 4가지 기본 단계를 포함한다: 라이브러리 준비, 클러스터 생성, 시퀀싱, 및 데이터 분석. 라이브러리 준비와 함께, 시퀀싱 라이브러리는 DNA 또는 cDNA 샘플의 무작위 단편화로 준비되며, 5` 및 3` 어댑터 결찰(adapter ligation)이 이어진다. 대안으로, 단편화 및 결찰 반응은 단일 단계로 결합되어 라이브러리 제조 프로세스의 효율을 크게 증가시킨다. 이어서, 어댑터-결찰된 단편은 PCR 증폭되고 겔 정제된다.
클러스터 생성을 위해, 라이브러리는 단편이 라이브러리 어댑터에 상보적인 표면-결합 올리고(oligos)의 론(lawn)에서 캡처되는 플로우셀에 로딩된다. 그런 다음, 각 단편은 브릿지 증폭을 통해 개별의 클론 클러스터로 증폭된다. 클러스터 생성이 완료되면, 템플릿을 시퀀싱을 할 수 있다. SBS에 대한 한 가지 접근법은 가역적 터미네이터-기반의 방법을 사용하여 단일 염기가 DNA 주형 스트랜드에 혼입될 때 단일 염기를 검출한다. 각 시퀀싱 주기 동안 4개의 가역적 터미네이터-결합 dNTP가 모두 존재하기 때문에, 자연 경쟁은 다른 기술에 비해 혼입 편향을 최소화하고 열 오류율을 줄인다. 데이터 분석 및 정렬 동안, 새로 식별된 서열 판독은 참조 게놈(reference genome)에 정렬된다. 정렬 후, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 또는 삽입-삭제(indel) 식별, RNA 방법에 대한 판독 카운팅, 계통발생학적(phylogenetic) 또는 메타게놈적(metagenomic) 분석 등과 같은 많은 변형적인 분석이 가능하다.
이미징 시스템에서 중요한 것은 스캐닝 작업이 수행될 수 있는 속도이다. 예를 들어 시퀀싱 시스템을 고려해보자. 이러한 시스템에서, 샘플 분자가 판독될 수 있는 속도를 증가시키는 것이 종종 바람직하다. 이미징 시스템의 처리량을 증가시키는 한 가지 방법은 이미징되는 구조물의 크기와 간격을 줄이는 것이다. 시퀀싱 시스템에서, 이는 주어진 단위 면적에 대해 달성될 수 있는 판독 횟수를 증가시키기 위해 주형 분자를 더 가깝게 패킹함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 이미징 시스템의 해상도는 빛의 파장, 광학장치의 조리개, 및 기타 요인에 의해서 제한된다.
1873년에 "Ernest Abbe"라는 독일 물리학자는 현미경의 해상도 한계를 정의하는 공식을 발표했다. 아베의 한계(Abbe’s limit)는 다음과 같이 정의된다:
여기서, λ는 시편을 조명하는 광파의 파장 또는 형광의 여기 파장 밴드이다. NA는 대물렌즈의 개구수이며, 이는 투과 매체의 굴절률 n과 개구 각도의 사인값(sin(α))을 곱한 값이며, 여기서 α = 렌즈에 들어가거나 나오는 광의 최대 원뿔의 절반 각이다. 따라서, NA = n*sin(α)로 표시될 수 있으며, 아베의 한계(Abbe's limit)는 다음과 같이 다시 쓰여질 수 있다:
종종 회절 장벽으로 지칭되는, 이 해상도 한계는 시편을 이미지화하는데 사용되는 광의 파장의 약 절반보다 작은 측면 거리만큼 분리 된 두 물체를 광학기구가 구별하는 능력을 정의한다. 이 과학적 한계를 뛰어 넘어 2014년 노벨 화학상을 수상했다. 실제로 Abbe의 한계는 여러 가지 기술로 극복되었다. 이러한 기술들로는 STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), STED (Stimated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivation Localization Microscopy), 및 SIM (Structured Illumination Microscopy)이 포함된다. 이러한 모든 방법을 사용하면 200nm 미만, STORM, STED 및 PALM의 경우 ~ 20nm까지, SIM의 경우 약 100nm의 해상도를 달성할 수 있다.
예를 들어, STORM은 단일-분자 형광의 스토캐스틱 스위칭에 의존하여, 소정 시간에 형광단의 작은 단편만이 확률 스토캐스틱으로 활성화되게 한다. 활성화된 형광단은 Abbe의 한계 내에서 해상될 수 있도록 충분히 분리되어 있다. 이를 통해 충분한 정밀도로 이들의 위치를 결정하는 것을 가능하게 한다. 그러나, 종종 프로세스가 반복되고 샘플의 여러 이미지(스냅샷)가 찍히고 각각은 형광단의 임의의 하위집합(subset)을 캡처하여, 최종 이미지를 재구성 할 수 있다. 최종 이미지는 여러 이미지를 누적하여 생성된다. 따라서, 활성화는 물리적으로 분리되어 이들은 광학적으로 해상된다.
비록 본 발명의 시스템 및 방법들은 도 1의 예시적인 시스템과 관련하여 본 명세서에서 설명될 수 있지만, 이는 본 발명의 시스템 및 방법이 구현될 수 있는 일 예일 뿐이다. 본 명세서에 기술된 시스템 및 방법은 이 스캐너 및 다른 스캐너, 현미경 및 다른 이미징 시스템으로 구현될 수 있다.
이미징 시스템을 위한 샘플 용기는 단일-분자 부착 요소의 어레이로서 구성될 수 있다. 단일 분자 스토캐스틱 시퀀싱을 위한 예시적인 용기가 도 2에 도시된다. 복수의 열의 부착 요소 (212)를 갖는 이러한 용기는 몇 개의 DNA 분자가 개별적으로 병렬로 배열될 수 있게 한다. 그러나, 다양한 응용 예에서 부착 요소 (212)의 최소 간격(d)은 시스템의 광학 해상도에 의해 제한될 수 있다. 일부 응용 예에서, 부착 요소(212)는 제로-모드 도파관(zero-mode waveguides)을 포함 할 수 있으며, 이는 관측 부피를 제한하는 역할을 하는 광학 나노 구조체이며, 단일-분자 현미경의 농도(concetration)를 확장시킨다.
도 3은 도2에 도시된 용기의 열의 측면도의 예를 도시한다. 도 4는 시퀀싱 프로세스의 예를 도시한다. 동작 410에서, 샘플 용기는 제작되고 부착 요소 또는 앵커(예: 부착 요소(212))를 구비한다. 부착 요소는 피치(d)를 갖는다. 일부 응용 예에서, 피치(d)는 양 방향으로 동일할 수 있는 반면, 다른 응용 예에서는 다를 수 있다. 예를 들어 일부 응용 예에서 피치(d)는 20nm 미만일 수 있다. 일부 적용 예에서 피치는 이 치수 범위보다 크거나 작을 수 있다. 추가의 예에서, 피치는 개별 분자가 예를 들어 분자 사이의 전하-전하 상호 작용과 같은 그들 사이의 물리적 상호 작용에 의해 영향을 받지 않으면서 가능한 최소 치수로 감소될 수 있다.
이 예에서, 단일-포트 실시간 화학이 시퀀싱에 사용된다. 개별 DNA 주형 분자(310)가 제공된다. 이들은 302에서 도 3에 도시된 바와 같이 부착 요소(212)(예를 들어, 부착 요소 (212)당 하나)에 고정될 수 있다. 따라서, 동작 412에서, 단일 DNA 주형 분자(310)가 각각의 부착 요소에 부착된다. 일 예에서, 패턴화된 부착 요소(212) 당 하나의 분자만이 존재하도록 하기 위해, 부착 요소는 분자 스케일(> ~ 20 nm)에 근접하는 매우 작은 스케일로 제조될 수 있다. 이러한 방식으로, 입체 장해(steric hindracne)를 통해 각 위치에 단 하나의 DNA 분자만 부착되도록 할 수 있다. 클러스터들이 가장 작은 크기일 수 있기 때문에, 단일 분자를 시퀀싱하는 것은 고밀도 클러스터를 가능하게 한다. 이는 최소 피치를 결정하기 위한 인자로서 클러스트 크기의 효과를 제거할 수 있게 한다. 또한, 단일-분자 시퀀싱을 사용하면, "패드-호핑(pad-hopping)"의 위험이 거의 없거나 전혀 없으며, 이에 따라 클러스터는 간극 공간을 가로질로 성장하고 인접 복제본을 만든다. 이 호핑은 증폭 과정의 결과이며 일반적으로 증폭이 없을 때는 발생하지 않는다. 또한, 증폭이 없기 때문에 시간뿐만 아니라 필요한 시약 비용도 절약 할 수 있다. 단일-분자 시퀀싱을 수행함으로써, 시퀀싱 동안 각 분자에서 위상 오류를 설명하는 것이 가능하다.
동작 414 및 416에서, 시퀀싱 프라이머(primer)가 부착되고 단일-포트의 시약이 첨가된다. 이는 도 3에 304로 도시된다. 이들 시약들(314)은 라벨 모이어티(moiety)(예: 염료 분자)을 갖는 5'디포스페이트퀀쳐 분자(5'diphosphatequencher molecule) 및 3'포스페이트 블록(3’ phosphate block)을 가지는 4개의 뉴클레오티트 세트를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어"핵산"은 함께 연결된 2개 이상의 뉴클레오티드 유사체 단량체를 지칭할 수 있다. 핵산은 포스포다이에시터 결합(phosphodiester bonds)을 함유할 수 있지만, 일부 적용에서, 핵산은 예를 들어, 포스포아미드(phosphoramide), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 펩티드 핵산 백본(peptide nucleic acid backbones) 및 연결, 양성 백본(positive backbones) 또는 비-이온 백본(non-ionic backbones)을 포함하는 다른 유형의 백본을 갖는 유사체일 수 있다.
핵산은, 예를 들어, 리보스(천연 발생 RNA에 존재), 데옥시-리보스(천연 발생 DNA에 존재), 또는 디데옥시 리보스와 같은 펜토스 모이어티(pentose moiety)를 포함할 수 있다. 일부 응용 예에서, 핵산은 리보스 또는 데옥시 리보스 모이어티 대신에 비-펜토스 모이어티 또는 카보사이클릭 당을 가질 수 있다. 핵산은 아데닌 (A), 구아닌(G), 티민(T), 우라실(U), 시토신(C), 이노신, 크산타닌, 하이포잔타닌, 이소사이토신, 이소구아닌, 니트로피 롤 (3-니트로피롤(3-nitropyrrole) 포함) 및/또는 니트로인돌(5-니트로인돌(5-nitroindole) 포함)을 포함 하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 상이한 염기 부분을 가질 수 있다. 핵산은 명시된 바와 같이 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드일 수 있거나, 이중 스트랜드 및 단일 스트랜드 서열 모두의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA(예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA), RNA 또는 하이브리드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "뉴클레어티드 유사체"는 천연 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레어티드, 리보뉴클레어티드, 데옥시리보뉴클레어티드, 디데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드로 알려진 다른 분자를 포함하는 것으로 사용된다. 상기 용어는 예를 들어 DNA 또는 RNA 스트랜드에 존재하는 서브유닛(subunit)을 식별하기 위해 폴리머에 존재하는 단량체 단위를 지칭하는데 사용될 수 있다. 이 용어는 또한 폴리머에 반드시 존재하지는 않는 단량체 분자, 예를 들어, 폴리머라제에 의해 주형 의존 방식으로 폴리뉴클레오티드에 혼입될 수 있는 분자를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 상기 용어는 예를 들어 5 '탄소 상에 0, 1, 2, 3, 4, 5 개 이상의 포스페이트(phosphastes)를 갖는 뉴클레오사이드 단위를 지칭할 수 있다. 뉴클레어티드 유사체는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 우라실(U), 시토신(C), 이노신, 크산타닌, 하이포산 타닌, 이소사이토신, 이소구아닌, 니트로피롤 (3-니트로피롤을 포함) 및/또는 니트로인돌 (5-니트로인돌을 포함)을 포함하는 (하지만 이에 제한되지 않는) 염기 모이어티를 가질 수 있다. 예시의 천연 뉴클레오티드는 ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP, 및 dGMP를 포함한다(하지만 이에 제한되지 않음).
비-천연 뉴클레오티드는 자연 생물학적 시스템에 존재하지 않는 것들을 포함한다. 비-천연 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드에 혼입된 후에 추가로 연장될 수 없다. 예들는 가역적 또는 비가역적 차단 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드에 혼입된 후에 추가로 연장될 수 있다. 예들은 3 '하이드록실을 갖는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 응용 예에서, 뉴클레오티드 유사체(들)는 가역적 차단 모이어티를 포함하지 않으며, 또는 뉴클레오티드 유사체(들)는 비가역적 차단 모이어티를 포함하지 않으며, 또는 뉴클레오티드 유사체(들)는 어떠한 차단 모이어티도 전혀 포함하지 않을 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "차단 모이어티"는 뉴클레오티드 유사체와 관련하여 사용될 때 뉴클레오티드 유사체가 제2 뉴클레오티드 유사체에 대한 공유 결합을 형성하는 것을 억제하거나 방지하는 뉴클레오티드 유사체의 일부를 의미한다. 예를 들어, 펜토스 모이어티을 갖는 뉴클레오티드 유사체의 경우, 차단 모이어티는 뉴클레오티드의 3'산소와 제2 뉴클레오티드의 5'포스페이트 사이에서 포스포디에스테르 결합의 형성을 방지할 수 있다. 차단 모이어티는 핵산 중합체에 존재하는 단량체 단위인 뉴클레오티드의 일부일 수 있으며, 또는 차단 모이어티는 자유 뉴클레오티드 유사체 (예를 들어, 뉴클레오티드 트리포스페이트)의 일부일 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 일부인 차단 모이어티는 가역적일 수 있어서, 차단 모이어티는 변형되어 뉴클레오티드 유사체가 제2 뉴클레오티드 유사체에 대한 공유 결합을 형성할 수 있게 한다. 특히 유용한 가역적 차단 모이어티는 포스페이트, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트 에스테르 및 탄소 에스테르이다. 사용될 수 있는 가역적 차단 모이어티의 추가의 예는 이하에 제시되고 본원에 참조로 포함된 참조 문헌에 제시되어있다. 특정 응용 예에서, 가역적 차단 모이어티와 같은 차단 모이어티는 뉴클레오티드 유사체의 펜토스 모이어티의 3'위치 또는 2'위치에 부착될 수 있다.
본 명세서에 사용 된 용어 "라벨 모이어티"는, 뉴클레오티드 유사체와 관련하여 사용될 때, 뉴클레오티드 유사체에서 달리 나타내지 않는 식별 가능한 특성을 제공하는 뉴클레오티드 유사체의 일부를 의미한다. 식별 가능한 특성은 예를 들어 방사선의 흡광도, 형광 방출, 발광 방출, 형광 수명, 형광 편광 등과 같은 광학 신호; 리간드 또는 수용체에 대한 결합 친화력; 자기 특성; 전기적 특성; 요금; 질량; 방사능 등일 수 있다. 예시적인 라벨 모이어티는 형광단, 발광단, 발색단, 방사성 동위원소, 질량 라벨, 전하 라벨, 스핀 라벨, 수용체, 리간드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 라벨 모이어티은 핵산 폴리머에 존재하는 단량체 단위인 뉴클레오티드의 일부일 수 있으며, 또는 라벨 모이어티는 자유 뉴클레오티드 유사체 (예를 들어, 뉴클레오티드 트리포스페이트)의 일부일 수 있다.
본 명세서에 사용 된 용어 "라벨-변경 모이어티(laber-modifier moiety)"는 라벨 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 유사체와 관련하여 사용될 때, 라벨 모이어티의 구별 가능한 특성을 변화시키는 뉴클레오티드 유사체의 일부를 의미한다. 통상적으로, 구별 가능한 특성의 변화는 라벨-변경 모이어티의 존재 하에 나타나지만 라벨-변형 모이어티가없는 경우에는 나타나지 않는다. 예를 들어, 라벨-변경 모이어티는 라벨로부터 형광 또는 발광 방출을 감소시키는 소광제(quencher)일 수 있다. 다른 예에서, 라벨-변경 모이어티는 라벨로부터 검출된 형광 또는 발광 방출의 세기 또는 파장을 변경시키는 FRET(F
rster Resonance Energy Transfer) 공여체(donor) 또는 수용체일 수 있다. 라벨-변경 모이어티는 핵산 폴리머에 존재하는 단량체 단위인 뉴클레오티드의 일부일 수 있으며, 또는 라벨-변경 모이어티는 단량체 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 뉴클레오티드 트리포스페이트)의 일부일 수 있다.
본원에 사용 된 용어 " 탈-차단제(deblocking agaent)"는 차단 모이어티를 변형 또는 제거할 수 있는 촉매, 효소, 시약 또는 다른 물질을 의미한다. 특정 응용 예에서, 탈-차단제(deblocking agaent)는 핵산 폴리머에 존재하는 단량체 단위인 뉴클레오티드의 일부인 차단 모이어티에 대한 특이성을 가질 수 있다. 이와 같이, 탈-차단제는 단량체 뉴클레오티드 유사체의 일부인 차단 모이어티(예를 들어, 뉴클레오티드 트리포스페이트)와 비교하여 핵산에 존재하는 뉴클레오티드 유사체로부터 차단 모이어티를 선택적으로 제거할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 탈-차단제는 단량체 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 뉴클레오티드 트리포스페이트) 또는 단일 스트랜드 핵상에서 단량체인 뉴클레오티드의 일부인 차단 모이어티와 비교하여 이중 스트랜드 핵산에 존재하는 뉴클레오티드 유사체로부터 차단 모이어티를 선택적으로 제거할 수 있다. 따라서, 일부 응용 예에서, 탈-차단제는 단량체 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 뉴클레오티드 트리포스페이트) 또는 단일 스트랜드 핵산의 단량체인 뉴클레오티드 유사체로부터 차단 모이어티를 제거하는 능력이 거의 없거나 거의 없을 수 있다. 예시적인 탈-차단제는 포스포에스테라제, 포스포디에스테라제, 포스포트리에스테라제, 에스테라제, 알킬 트랜스퍼라제 또는 메틸 트랜스퍼라제와 같은 효소; 또는 화학 시약을 포함할 수 있다(이에 제한되지 않음).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 두 번째 것과 비교하여 첫 번째 것을 "선택적으로" 조작(manipulating)(예를 들어 "선택적으로" 제거)하는 것에 대한 언급은, 조작이 두 번째 것에 대한 효과와 비교하여 첫 번?? 것에 대한 효과가 더 크다는 것을 의미한다. 조작이 두 번째 것에 대하여 영향을 줄 필요는 없다. 조작은 두 번째 것에 대한 영향보다 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99% 더 큰 영향을 미칠 수 있다. 조작은 두 번?? 것에 대한 효과보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 100배, 1×103 배, 1×104 배 또는 1×106배로 더 크게 첫 번째 것에 영향을 미칠 수 있다. 조작에는 다음이 포함될 수 있습니다: 예를 들어, 개질, 접촉, 처리, 변경, 절단(예를 들어, 화학 결합), 광-화학적으로 절단(예를 들어, 화학 결합), 형성(예를 들어, 화학 결합), 광-화학적 형성(예: 화학 결합), 공유 변형, 비-공유 변형, 파괴, 광-제거(photo-ablating), 제거, 합성, 중합, 광-중합, 증폭(예: 핵산), 복사(예: 핵산), 연장(예: 핵산), 결찰(예: 핵산), 또는 본원에 제시되거나 당업계에 공지된 다른 조작. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "일시적"은 반응 또는 반응 주기에서 종과 관련하여 사용될 때, 종이 반응 또는 반응주기 동안에 일시적으로만 존재함을 의미한다. 일시적 종은, 예를 들어 약 10분, 1분, 30초, 10초, 1초, 100밀리초, 10밀리초, 1밀리초, 100나초초, 10나노초, 또는 1나노초 이하의 기간 동안 존재할 수 있다. 특정 응용 예에서, 일시적 종은 일시적 종의 검출을 허용하기에 충분한 임시 시간 동안 존재한다. 예를 들어, 상술한 예시적인 최대 시간 기간에 추가로 또는 대안 적으로, 일시적 종은 적어도 1분, 30초, 10초, 1초, 100밀리초, 10밀리초, 1밀리초, 100나노초, 10나노초, 1나노초, 또는 1피코초 동안 존재할 수 있다.
광학적으로 검출 가능한 라벨이 특히 유용하다. 예는 발색단, 발광단 및 형광단을 포함한다. 형광단이 특히 유용하며, 예를 들어 형광단은, 형광 나노 크리스털; 양자 점(quantum dots), 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, Cy3, Cy5, 스틸벤, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 텍사스 레드(Texas Red), 알렉사 염료(Alexa dyes), SETA 염료, 아토 염료(Atto dyes), 피코에리틴, 보디피(bodipy), 및 이들의 유사체를 포함한다. 유용한 광학 프로브는 Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, Oreg.) 6판; 합성 카탈로그 (Houston, Tex.), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2판, Plenum Press New York (1999), 또는 WO 98/59066; WO 91/06678 또는 US 미국 특허 출원번호 2010/0092957 A1(이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 설명된다. 광학 라벨은 빠르고 비교적 비-침습적 검출의 이점을 제공하여, 주기적 반응의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.
일부는 비-광학 라벨인, 다른 라벨이 본 명세서에 제시된 방법 및 조성물의 다양한 응용 예에 사용될 수 있다. 예시는 자연적으로 풍부하지 않은 방사성 또는 무거운 동위 원소와 같은 동위 원소 표지; 자성 물질; 금속과 같은 전자가 풍부한 물질; Ru(bpy)32+와 같은 전기화학발광 라벨; 또는 핵 자기, 상자성, 전기, 전하 대 질량 또는 열 특성에 기초하여 검출될 수 있는 모이어티;를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 라벨은 또한 자성 입자 또는 광학적으로 인코딩된(encoded) 나노입자를 포함할 수 있다. 이러한 라벨은 당업자에게 공지된 적절한 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 충전된 라벨은 이온 토렌트(Guilford, Conn., Life Technologies 자회사)로부터 시판되는 시퀀싱 시스템에서 사용되는 것과 같은 전기 검출기 또는 미국 특허 출원 번호 2009/0026082 A1; 2009/0127589 A1; 2010/0137143 A1; 및 2010/0282617 A1(이들 각각은 본원에 참조로 포함됨) 에 기재된 검출 시스템을 사용하여 감지될 수 있다. 일부 응용 예에서 뉴클레오티드 유사체는 라벨을 가질 필요가 없다는 것이 이해되어야 할 것이다.
유용할 수 있는 다른 유형의 라벨은, 예를 들어 1차 라벨과의 상호 작용, 수용체(receptor)에 대한 결합 또는 효소 촉매 또는 다른 물질에 의한 검출 가능한 생성물로의 전환을 통해 간접적으로 검출되는 2차 라벨이다. 예시적인 2차 라벨은 아비딘(avidin), 스트렙트아비딘(streptavidin) 또는 이의 유사체와 같은 수용체에의 결합을 통해 검출될 수 있는 바이오틴 또는 이들의 유사체와 같은 리간드(ligand)이다. 다른 유용한 리간드는 항체 또는 이의 활성 단편과 같은 수용체에 결합할 수 있는 에피토프(epitopes), 및 렉틴(lectins)과 같은 수용체에 결합할 수 있는 탄수화물이다. 수용체는 예를 들어 광학 라벨로 라벨링되어 검출될 수 있다. 특정 응용 예에서, 리간드는 수용체에 대한 친화도(affinity)를 감소 또는 방지하는 방식으로 뉴클레오티드 유사체에 부착될 수 있다. 그러면, 뉴클레오티드 유사체로부터 분리될 때 리간드의 방출은 각각의 수용체에 대한 리간드의 친화도에 기초하여 검출될 수 있다. 리간드는 차단 모이어티에 추가로 부착 될 수 있으며, 또는 라벨 모이어티에 대해 보다 일반적으로 상기 기재된 바와 같이 그 자체가 차단 모이어티로서 기능할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 유사체로부터 리간드의 제거는 뉴클레오티드 유사체를 차단 해제하고 검출 가능한 이벤트를 제공하는 기능을 할 수 있다.
다른 예시적인 2차 라벨은 파이로포스페이트 또는 이의 유사체이다. 파이로포스페이트는 고체상 킬레이터(chelator) 및/또는 전자 바이오센서에 의해 검출될 수 있다. 일부 응용 예에서, 파이로포스페이트는 파이로포스페이트을 ATP로 전환한 다음 화학 발광으로 전환시키는 일련의 효소에 의해 검출될 수 있다. 예시적인 효소 캐스케이드들은 파이로시퀀싱(pyrosequencing)에 전형적으로 사용 및/또는 미국 특허 출원 제2005/0244870 A1호에 설명된 것들을 포함하며, 상기 미국 특허 출원은 본 명세서에 참조로서 통합된다. 일부 응용 예에서, ATP를 생성하는 효소 캐스케이드 검출 시스템의 사용은 폴리머라제에 의해 프라이머에 혼입되지만 파이로포스페이트 신호와 경쟁하는 배경 신호를 유발하지 않는, ATPγS와 같은, 아데닌 뉴클레오티드 유사체의 사용을 필요로 할 수 있다. 특정 응용 예에서, 파이로포스페이트 또는 이의 유사체는 트리포스페이트가 존재하는 5 '위치 이외의 위치에서 뉴클레오티드 유사체에 부착될 수 있다. 이 뉴클레오티드 유사체는 적절한 검출 시스템에서 2개의 파이로포스페이트-유도 신호를 생성 할 수 있으며, 하나는 (폴리머라제 활성화로 인한) 5' 위치로부터의 파이로포스페이트의 방출로 인한 것이며, 다른 하나는, 예를 들어 탈-차단제에 의해서, 다른 위치로부터의 방출로 인한 것이다. 2개의 파이로포스페이트-유도 신호의 생성은 검출 단계에서 잡음 대비 증가된 신호의 이점 또는 시퀀싱 데이터 평가에서 증가된 정확도의 이점을 제공할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체 상에 존재할 때, 특히 유용한 파이로포토페이트의 유사체는 전형적으로 파이로포스페이트에 음으로 하전된 하나 이상의 산소 모이어티에서 전하적으로 중성일 것이다. 일 예에서, 파이로포스페이트 유사체는 하전된 산소 원자를 갖지 않을 수 있다. 전하는 일부 폴리머라제 종과 중성적인 상호 작용을 선호할 수 있다. 파이로포스페이트 유사체가 일단 방출되면, 적절하거나 원해지는 경우, 검출 캐스케이드에서 효소와의 상호 작용을 위한 형태로 전환될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 방법 또는 조성물에 사용된 라벨 모이어티는, 연장된 프라이머에 혼입될 때 뉴클레어티드 유사체로부터 방출되는 양성도 또는 파이로포스페이트와 같은, 검출되는 자연 발생 분자에 존재하는 고유 라벨(즉, 내인성 라벨)일 수 있다. 파이로포스페이트 방출은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 또는 유사한 기술을 사용하여 검출될 수 있으며, 이들의 예는 454 Life Sciences (Branford, Conn., a Roche Company)로부터 상업적으로 이용가능하며, 또는 본 발명에 참조로서 통합된 미국 특허 출원 제 2005/0244870에 설명되어 있다. 양성자 방출에 기초한 프라이머 연장을 검출하기 위한 예시적인 시스템은 이오 Ion Torrent (Guilford, Conn., a Life Technologies subsidiary)로부터 상업적으로 이용가능하며, 또는, 각각이 본 명세서에서 참조로서 통합된, 미국 특허 출원 2009/0026082 A1; 2009/0127589 A1; 2010/0137143 A1; 및 2010/0282617 A1에 설명되어 있다. 고유 라벨의 검출에 더하여 또는 대안으로, 천연 뉴클레오티드 유사체에 외인성인 라벨을 검출할 수 있다. 따라서, 일부 응용 예에서, 내인성 프로브가 검출되지 않도록 외인성 프로브만 검출되고, 다른 응용 예에서는 외인성 프로브가 검출되지 않도록 내이성 프로브만 검출되며, 일부 응용 예에서는 외인성 프로브 및 내인성 프로브의 조합이 검출된다.
일부 응용 예에서, 사용되는 조건 하에서 검출 가능한 라벨 모이어티는 필요하지 않거나 바람직하지 않다. 따라서, 반응 혼합물에 존재하거나 본 명세서에 개시된 반응에 사용되는 뉴클레오티드 유사체는 단량체 형태이고 연장된 프라이머에 혼입될 때 특정 검출 가능한 라벨 모이어티가 결여될 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 그럼에도 불구하고 차단 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 응용 예에서, 탐지가 전혀 수행되지 않을 수 있다.
라벨 모이어티 이외에, 뉴클레오티드 유사체는 라벨-변경 모이어티를 더 포함할 수 있다. 라벨-변경 모이어티는 라벨 모이어티에 의해 생성 된 신호를 수정하는 기능을 할 수 있다. 일부 응용 예에서, 라벨-변경 모이어티의 존재 하에서 라벨 모이어티에 의해 생성된 신호는 라벨-변경 모이어티가 없는 경우에서 라벨 모이어티에 의해 생성된 신호와 구별될 수 있다. 예를 들어, 라벨 모이어티 및 라벨-변경 모이어티는 F
rster 공명에너지 전달(FRET) 공여체-수용체 쌍일 수 있다. 이와 같이, 뉴클레오티드 유사체로부터의 외부 형광 방출의 파장의 변화가 검출 될 수 있고, 라벨-변경 모이어티의 존재 또는 부재를 나타낼 것이다. FRET 쌍의 구성으로서 사용될 수 있는 형광단의 예는: 형광 나노 결정; 양자점; 디클로로(dichloro) [R110], 디클로로 [R6G], 디클로로 [TAMRA], 디클로로 [ROX] 등을 포함하는 d-로다민 수용체 염료(d-Rhodamine acceptor dyes); 플루오레세인, 6-FAM 등을 포함하는 플루오레세인 공여체 염료; Cy3B와 같은 시아닌 염료; Alex3 염료, SETA 염료, Cy3B 등과 FRET 쌍을 형성하는 Atto 647N과 같은 Atto 염료를 포함할 수 있다(이에 제한되지 않음).
다른 예에서, 라벨-변경 모이어티의 존재로 인해 발생하는 라벨 모이어티로부터 신호의 강도는 라벨-변경 모이어티가 없을 때 생성되는 신호의 강도와 구별될 수 있다. 예를 들어, 라벨은 형광단일 수 있고 라벨-변경 모이어티가 소광제일 수 있어서, 라벨-변경 모이어티의 부재가 뉴클레오티드 유사체로부터 형광 방출의 명확한 증거로서 검출될 수 있다. 예시적인 소광제는 DACYL(4-(4'-디메 아미노페닐아조) 벤조산), 블랙홀 소광제(Biosearch Technologies, Novato, CA), Qxl 소광제(Anaspec, Freemont, CA), 아이오와 블랙 소광제, DABCYL, BHQ1, BHQ2, QSY7, QSY9, QSY21, QSY35, BHQO, BHQ1, BHQ2, QXL680, ATTO540Q, ATTO580Q, ATTO612Q, DYQ660, DYQ661 및 IR 염료 QC-1 소광제를 포함한다(이에 제한되지 않음).
래칫 생화학 성분의 예사 도 5에 도시된다. 이 예는 3' 포스페이트 염료 및 5' 트리포스페이트 소염제를 포함한다. 이 예시 키트는 또한 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 폴리머라제, 및 3' 포스페이트 블록을 절단 할뿐만 아니라 혼입된 뉴클레오티드로부터만 절단하는 dsDNA 특이적 효소를 포함한다.
예를 들어, 생물학적 시스템 및 이의 기능적 변이로부터 분리된 단백질-기반 효소를 포함하여, 임의의 다양한 폴리머라제가 본원에 제시된 방법 또는 조성물에 사용될 수 있다. 하기 예시된 것과 같은 특정 폴리머라제에 대한 언급은 달리 지시되지 않는 한 그의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 이해 될 것이다. 폴리머라제의 특히 유용한 기능은 기존의 핵산을 주형으로 사용하여 핵산 스트랜드의 중합을 촉매하는 것이다. 유용한 다른 기능은 본 명세서의 다른 곳에 기술되어있다. 유용한 폴리머라제의 예는 DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제를 포함한다. 특히 유용한 폴리머라제는 하기 실시 예에 제시된 바와 같은 Pol217 및 Pol427 및 본 명세서에 참조로 통합된 US 2006/0240439 A1에 기재된 다른 폴리머라제를 포함한다.
고유 3' 내지 5' 교정(proofreading) 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제는 일부 응용 예에서 유용할 수 있다. 실질적으로 3' 내지 5' 교정 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 폴리머라제는 일부 응용 예, 예를 들어 대부분의 시퀀싱 응용에서 유용한다. 엑소뉴클레아제 활성의 부재는 야생형 특성 또는 변이체 또는 조작된 폴리머라제 구조에 의해 부여되는 특성일 수 있다. 예를 들어, 엑소누스 클레노프 단편(exominus Klenow fragment)은 3' 내지 5' 교정 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 클레노프 단편의 돌연변이 버전이다.
폴리머라제는 핵산으로부터의 해리 속도에 따라 특성화될 수 있다. 특정 응용 예에서, 상대적으로 높은 해리 속도를 갖는 폴리머라제를 사용하는 것이 바람직하다. 이는, 예를 들어 폴리머라제의 해리로 인해 탈-차단 단계가 진행되는 응용 예에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 탈-차단제로서 사용될 때 효소는 효소가 연장된 프라이머로부터 차단 모이어티를 제거하는 것을 방지하도록 폴리머라제에 의해 입체적으로(sterically) 차단될 수있다. 이러한 경우에, 차단 모이어티을 갖는 연장된 프라이머의 수명은 폴리머라제의 해리 속도에 의해 영향을 받을 수 있다. 해리 속도는 본원에 제시된 방법에서 반응 속도를 조정하도록 조절될 수 있는 폴리머라제의 활성도이다.
사용되는 예에 따라, 폴리머라제는 호열성 또는 열 비활성화될 수 있다. 호열성 폴리머라제는 전형적으로 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술에 사용되는 것과 같은 고온 조건 또는 열순환 조건에 유용하다. 호 열성 폴리머라제의 예로는 9° N DNA 폴리머라제, Taq DNA 폴리머라제, Phusion®DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, RB69 DNA 폴리머라제, KOD DNA 폴리머라제 및 VentR®DNA 폴리머라제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 비-호열성 유기체로부터 분리된 대부분의 폴리머라제는 열 비활성화된다. 예는 파지(phage)의 DNA 폴리머라제이다. 다양한 소스 중 임의의 것으로부터의 폴리머라제가 고온 조건에 대한 내성을 증가 또는 감소시키기 위해 변형될 수 있음을 이해되어야 할 것이다.
도 6은 뉴클레오티드의 혼입시 화학적 공정의 예를 도시한다. 이제 도 6을 참조하면, 614에서, 뉴클레오티드가 혼입됨에 따라 5' 트리포스페이트(triphosphate)가 절단된다. 소광제 분자가 부착되어 있기 때문에, 이 소광제 분자도 절단된다. 결과적으로, 형광 염료는 더 이상 소광되지 않으며 616에 나타낸 바와 같이 형광을 방출할 수 있다. 618에서, 뉴클레오티드가 dsDNA에 혼입되었으므로, 제2 효소는 이어서 부착된 염료와 함께 3'포스페이트를 절단할 수 있다. 이는 도 3에서 306에 표시된다. 이는 620에 도시된 바와 같이 분자를 다시 어둡게 하고, 다음 혼입을 위해 준비된 새로운 3'OH를 생성한다(622에 도시 됨). 혼입 이벤트가 발생하고 형광단의 스위치 켜짐과 형광단이 (여기 볼륨 박으로) 멀리 해리되도록 포스페이트 블록의 제거하고 스위치를 끄는 사이에 일정 시간이 있다.
다른 추가의 예로서, 일부 응용 예에서, 시퀀싱 프로세스는 뉴클레오티드를 커플링할 수 있는 효소, 탈-차단제, 고체 지지체에 고정된 뉴클레어티드 시퀀스에 상보적인 시퀀스를 가지는 뉴클레오티드 스트랜드에 결합된 핵산, 및 라벨 모이어티가 있는 염기와 상응한 소광제 모이어티를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 라벨 모이어티는 특정 염기 모이어티와 상관될 수 있다. 상기 프로세스는 어레이 내에서 라벨 모이어티를 동시에 이미징(예를 들어, 이하의 동작 418)하면서 혼합물에서 여러 반응 주기를 통해 진행하도록 핵산에 복수의 뉴클레오티드 유사체를 순차적으로 첨가하는 것을 추가로 허용할 수 있다. 일부 응용 예에서, 각 반응주기는 다음을 포함 할 수 있다: (i) 폴리머라제는 소광제 모이어티를 절단하고 라벨 모이어티를 포함하는 일시적 핵산 종을 형성함으로써 핵산에 뉴클레오티드 유사체를 첨가; 및 (ii) 탈-차단제는 라벨 모이어티를 제거하기 위해 일시적 핵산 종을 변형. 다양한 적용 예에서, 여러 반응 주기는 100개 이상의 반응 주기를 포함할 수 있으며, 이에 의해 핵산은 적어도 100개의 뉴클레오티드 유사체의 첨가에 의해 연장된다. 뉴클레오티드를 커플링할 수 있는 효소는 폴리머라제, 미오신(myosion) 또는 키나제(kinase)를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 3' 탄소를 갖는 펜토스 모이어티를 포함할 수 있으며, 라벨 모이어티는 3' 탄소에서 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 다른 예에서, 뉴클레오티드 유사체는 트리포스페이트 모이어티를 포함할 수 있으며, 소광제 모이어티는 트리포스페이트 모이어티에 부착될 수 있다.
일부 응용 예에서, 탈-차단제는 포스포에스터라제(phosphoesterase) 효소(예: 포스포디에스테라제, 포스 포트리에스테라제)를 포함할 수 있으며, 이는 일시적 핵산 종으로부터 포스포디에스테르(phosphodiester) 모이어티 또는 포스포트리에스테르(phosphotriester) 모이어티를 선택적으로 제거하기 위해 포함될 수 있다. 포스포에스테라제는 엔도뉴클레아제 IV 및 AP 엔도뉴클레아제로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일시적 차단 핵산 종은 탈-차단제가 라벨 모이어티를 제거하기 위해 일시적 핵산 종을 변형시키기 전에 적어도 1ms 동안 존재할 수 있다. 추가 예로서, 일시적 차단 핵산 종은 탈-차단제가 라벨 모이어티를 제거하기 위해 일시적 핵산 종을 변형시키기 전에 30초 이하 동안 존재할 수 있다.
이제도 4로 돌아 가면, 동작 418에서, 시퀀서(sequencer)의 이미징 시스템은 4개의 채널(ACGT) 각각에서 신호의 세기를 검출하고, 염료의 형광은 혼입된 염기에 상응하는 신호의 증가로 나타난다. 따라서, 형광은 이미징 시스템(예: 도 1의 예시적인 이미징 시스템에서 카메라 시스템(140))에서 이미지 센서에 의해 검출되고, 이미지가 기록될 수 있다. 이미징 및 기록 시스템은 다수의 채널을 동시에 이미지화 및 기록할 수 있고(예를 들어, 각 염기에 대해 하나의 채널), 각 채널은 그 시야 내의 모든 위치에서 그 채널에 대한 온 및 오프 시퀀스를 이미지화 및 기록할 수 있다. 프로세스의 스토캐스틱 특성으로 인해, 이미징 시스템의 시야 내의 모든 분자가 동시에 활성화될 수 있으며, 발생하는 반응은 시야 내의 모든 분자에 대해 동시에 각 채널에 기록된다.
즉, 다양한 적용 예에서, 시퀀싱은 주어진 분자에 대한 폴리머라제에 의해 정확한 뉴클레오티드를 혼입함으로써 발생하는 동안, 다른 혼입 이벤트가 그 주위에서 무작위로 진행되며, 각 분자에서 발생하는 반응을 감지하기 위해 이미징이 실시간으로 실행될 수 있다. 언급된 바와 같이, 이미징은 4개의 상이한 색 채널을 관찰하도록 배열될 수 있으며, 각 염기마다 그리고 각 채널 마다의 이미징 시스템은 형광을 켜고 끄는 것을 감지하고 기록할 수 있다.
도 7은 상술한 화학 프로세스를 이용한 초-해상 이미징 프로세스의 일례를 도시한 것이다. 이는 단일 분자(722)에 대해 뉴클레오티드 혼입 및 탈-차단 이벤트가 시간이 지남에 따라 발생하는 "온(on)"및 "오프(off)" 이벤트 (742)의 예를 도시한다. 해당 분자의 서열을 결정하기 위해 각 분자에 대한 온/오프 상태의 시간 추적. 예시된 예에서, '온' 상태(744)는 ACTGCT의 시퀀스로 분자(722)에 대해 예시된다.
다양한 적용 예에서, 혼입 및 탈-차단 이벤트는 스토캐스틱이며 분자간에 동기화되지 않는다. 따라서, 통계적으로, 주어진 위치에서 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 '온' 이벤트는 인접 또는 주변 위치에서 다른 분자에 대한 해당 염기에 대한 '온' 이벤트와 다른 시간에 발생할 수 있다. 따라서, 각 채널에 대해, 그 채널에 대한 '온' 이벤트가 시공각적으로 충분히 분리될 수 있는 통계적 확률이 있어서, Abbe의 한계에 의해 허용되는 것보다 더 작은 피치로 이격되어 있음에도 불구하고 이미징 시스템에 의해 별도의 이벤트로 해상될 수 있다. 주어진 염기에 대한 '온' 이벤트들 사이에서 무작위로 생성된 시공간적 분리는 실제 웰 간격보다 이벤트들 사이에서 더 효과적인 피치를 제공하며, 이는 이미징 시스템의 광학장치에 의해 '온' 이벤트를 해상할 수 있게 만든다. 이에 대한 예는 그림 3의 304에 도시된다. 이 예에서, 이 중심 열에 있는 각 분자는 인접 분자와 다른 염기에 대해 '온' 이벤트를 나타내고 있다. 이 예에서, 좌측에서 우측으로의 분자는 염기 A, C, G, T, G, A, C, T 및 C에 대한 '온' 이벤트를 나타낸다. 동일한 염기에 대해 가장 가까운 '온' 이벤트는 길의 오른쪽에 있는 두 개의 C 이벤트와 열의 중앙을 향한 2개의 G 이벤트이다. 각각의 경우에, 이들은 2d 만큼 이격되며, 또는 부착 요소(212)의 평균 피치의 2배 이격된다.
포토-스위칭은 확률론적(stochastic)이기 때문에, Abbes의 한계에 의해 허용되는 것보다 더 가까이에 2개 이상의 분자(예를 들어, 2 개의 인접한 분자)가 서로 동일한 분자에 대해 동시에 스위치 '온' 되는 경우가 있을 수 있다. 이 경우 이러한 분자는 해상되지 않을 수 있다. 이러한 가능성은 인접한 이벤트가 드물게 되게 스위칭 속도를 제어함으로써 완화될 수 있다. 예를 들어, 염기를 식별하기에 충분한 시간 동안 염료가 '온' 되도록 뉴클레오티드 및 효소의 농도를 조정할 수 있다. 또한, 이러한 농도는 충분한 '온' 시간뿐만 아니라 '오프' 시간이 길어 서로 비슷한 '온' 이벤트가 거의 또는 전혀 발생하지 않도록 선택할 수 있다. 예를 들어, 하나의 응용 예에서, 온 및 오프 시간은 염료가 바로 인접한 위치에 있는 동시에 주어진 위치에 대해 염료가 존재할 확률이 0.5% 이하가 되도록 선택된다. 다른 응용 예에서, 온 및 오프 시간은 염료가 바로 인접한 위치에 있는 동시에 주어진 위치에 대해 염료가 존재할 확률이 0.5 % 이상이 되도록 선택된다. 다른 응용 예에서, 온 및 오프 시간은 염료가 바로 인접한 위치에 있는 동시에 주어진 위치에 대해 염료가 존재할 확률이 0.1% 내지 0.5%의 범위에 있도록 선택된다. 다른 응용 예에서, 온 및 오프 시간은 염료가 바로 인접한 위치에 있는 동시에 주어진 위치에 대해 염료가 존재할 확률이 0.1% 내지 0.8%의 범위에 있도록 선택된다. 다른 응용 예에서, 온 및 오프 시간은 이 인접 확률은 이것이 적용되는 주어진 시퀀싱 애플리케이션에서 허용 가능한 에러율보다 낮도록 선택된다.
또한, 주어진 채널에 대한 '온' 이벤트가 너무 가깝게 발생하여 이미징 시스템에 의해 해상될 수 없는 상황을 해결하는 다른 방법이 있을 수 있다. 일례에서, 시스템은 평균 또는 기준선 조명 세기보다 큰 조명 세기, 또는 다른 임계 값을 검출 할 수 있으며, 이는 Abbe의 한계보다 더 가까운 2개 이상의 분자에 대해 주어진 염기에 대해 조명 이벤트가 발생했음을 나타낸다. 마찬가지로, 스팟 크기 또는 스팟 형상을 사용하여, Abbe의 한계보다 가까운 두 개 이상의 분자가 주어진 염기에 대해 동시에 나타나고 있는 상황을 결정할 수 있다. 따라서, 조명 이벤트를 조명 세기 임계값, 스팟 크기 임계값, 또는 둘 다와 비교하는 것은 시스템이 동일한 염기에 대해 2개의 인접한 분자가 동시에 '온' 이벤트를 나타내는지 여부를 결정하는데 사용되는 기술일 수 있다. 이는 이들 인접성에 대한 시스템의 허용 오차를 증가시킬 수 있으며, 그 결과, 이들 임계값 결정 중 하나 또는 둘 다 없이 허용될 수 있는 것보다 더 높은 인접 확률을 허용하도록 '온' 및 '오프' 시간이 선택될 수 있다. 참조 게놈에 일단 정렬되면, 동일한 시점에 인접한 판독에서 어느 염기가 발생했는지 관찰함으로써 명백한 "삭제" 오류가 해상될 수 있도록 하는 추가의 예가 또한 구현될 수 있다. 예를 들어, "C"였어야 했던 삭제는 인접한 장소에서 올바르게 불리는 "C"와 일치한다.
본 명세서에 기술된 프로세스는 암흑 상태와 광 상태 사이의 형광단의 효소적 사이클링에 의해 포토-스위칭을 달성하는 방법을 제공한다. 이 사이클링은 많은 효소 중 하나, 예를 들어 본 명세서에 기재된 폴리머라제를 통해 이루어질 수 있다. 또한, 뉴클레오티드(예: 미오신 또는 키네신에 의한 ATP(Adenosine triphosphate))를 전환시키는 다른 효소, 또는 효소 프로세스가 부분들(예를 들어, 형광 염료로부터의 소광제)을 분리하는 임의의 복수의 부분으로 나뉜 기판을 통과할 수 있는 다른 효소를 통해서도 가능하다. 이는 위에서 설명한 프로세스와 비슷한 5' 끝(3'-염료 라벨이 붙어 있음)에서 퀀칭될 수 있으며, 따라서 가수 분해될 때 형광을 일으킨 다음 ADP 제품이 해제될 때 어둡게 돌아온다. 다른 예는 기능성 형광단을 생성하는 반응에서 비-형광 분자를 함께 결합시키는 효소 프로세스일 수 있다. 이 형광단은 직교 화학의 적용에 의해서 다시 분해될 수 있다.
추가 응용 예에서, 본원에 기술된 시스템 및 방법은 동시에 인접한 반응에서 분자의 스토캐스틱 포토-스위칭을 달성하기 위해 전술한 래칫 화학 프로세스에 대한 대안 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상술한 화학에 의해서 달성된 것과 유사한 효과를 갖는, STORM(STochastic Optical Reconstruction Microscopy)의 포토-스위칭 기술 또는 형광단의 포토-스위칭을 위한 DNA-PAINT(DNA Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) 기술이 상술한 바와 같이 사용될 수 있다. 따라서, '온' 및 '오프' 스위칭은 예를 들어, 광화학 반응(dSTORM)에 의해 구동되는 직접 스위칭, 또는 DNA 라벨의 일시적 DNA 하이브리드화(DNA-PAINT)와 같은 많은 다른 방식으로 달성될 수 있다.
예를 들어, STORM은 공간적으로 멀리 떨어진 위치에서 스위치를 온 및 오프하는 형광단을 가짐으로써 원래 Abbe의 한계를 극복했으며, 이러한 이벤트의 순차적인 프레임은 위치가 변경됨에 따라 기록된다. 임의의 주어진 프레임에서, 형광단의 작은 단편만이 스위치 온될 것이며, 이들은 Abbe의 한계를 넘어 충분히 분리되어 있다. 그러나, 형광단에 에너지를 공급하고, 기록하고, 소거 한 다음 모든 분자가 캡처될 때까지 모든 위치에서 공정을 반복해야만 하는 순차적인 프로세스이다. 이는 모든 분자가 기록될 수 있고 대상의 완전한 이미지를 얻을 수 있도록 많은 연속적인 프레임의 획득을 요구할 것이다. 그러나, 본 명세서에 개시된 프로세스의 응용 예들은 시야 내에 모든 분자들에 대한 반응이 (충분히 분리된 분자를 활성화, 소거, 및 반복하는 대신에) 동시에 발생하고 프로세스가 발생하는 순간에 실시간으로 이미징할 수 있게 한다. 이는 반응의 스토캐스틱 특성을 이용하여, 이들이 서로 자주 발생하지 않고 이미징 시스템의 복수의 채널(예: 각 염기마다 하나의 채널)에 의해 실시간으로 캡처될 수 있다.
개시된 기술의 다양한 예가 위에서 설명되었지만, 이들은 제한이 아닌 단지 예로서 제시된 것으로 이해되어야 한다. 마찬가지로, 다양한 흐름도는 개시된 기술에 포함될 수 있는 특징 및 기능을 이해하는 것을 돕기 위해 개시된 기술에 대한 예시적인 아키텍처 또는 다른 구성을 도시할 수 있다. 개시된 기술은 도시 된 예시적인 아키텍처 또는 구성으로 제한되지 않지만, 원하는 대안적인 특징은 다양한 대안적인 아키텍처 및 구성을 사용하여 구현될 수 있다. 실제로, 본 명세서에 개시된 기술의 원하는 특징을 구현하기 위해 대안적인 기능적, 논리적 또는 물리적 분할 및 구성이 어떻게 구현 될 수 있는지가 당업자에게 명백 할 것이다. 또한, 본 명세서에 도시 된 것 이외의 다수의 상이한 구성 모듈 이름이 다양한 파티션에 적용될 수 있다. 또한, 흐름도, 동작 설명 및 방법 청구 범위와 관련하여, 본 명세서에 제시된 단계의 순서는 문맥이 달리 지시하지 않는 한 인용 된 기능을 동일한 순서로 수행하기 위해 다양한 예가 구현되도록 요구하지 않아야 한다.
개시된 기술이 다양한 예시적인 예 및 구현의 관점에서 상술되었지만, 하나 이상의 개별 예에 기술 된 다양한 특징, 양태 및 기능은 이들이 기술된 특정 예에 대한 적용 가능성으로 제한되지 않으며, 대신에, 그러한 예들이 설명되는지 여부와 그러한 특징들이 설명된 예의 일부로서 제공되는지 여부와 같이, 개시된 기술의 다른 예들 중 하나 이상에 단독으로 또는 다양한 조합으로 적용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 기술의 폭 및 범위는 전술한 임의의 예에 의해 제한되지 않아야 한다. 전술한 개념(이러한 개념이 서로 일치하지 않는 경우)의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 특히, 본 개시의 끝에 나타나는 청구항들의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 및 문구, 및 그 변형은 제한이 아니라 개방된 것으로 해석되어야 한다. 이에 대한 예는 다음과 같다: “포함하는” 이라는 용어는 “제한 없이 포함하는 것” 등을 의미하는 것으로 이해되어야 하며; “예/예시”라는 용어는 논의중인 항목의 예시적인 예를 제공하기 위해 사용되며, 그 전체 항목 또는 제한 항목이 아니며; 단수의 사용은 “적어도 하나”, “하나 이상” 등을 의미하는 것으로 이해되어야 하며; “상용적” “통상적”, “정상”, “표준”, “알려진”과 같은 형용상 및 유사한 의미의 용어는 주어진 기간 또는 현재 사용 가능한 항목으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 대신에 현재 또는 미래에 언제든지 이용 가능하거나 알려진 기존의, 전통적, 정상적, 또는 표준 기술을 포괄하도록 읽혀져야 한다. 본 명세서에 포함된 용어는 인용된 요소뿐만 아니라 임의의 추가 요소를 포함하여 개방형인 것으로 해석되어야 한다. 마찬가지로, 본 명세서가 통상의 기술자에게 명백하거나 알려진 기술을 언급하는 경우, 이러한 기술은 현재 또는 미래에 언제든지 통상의 기술자에게 명백하거나 알려진 기술을 포함한다. 적용 가능한 범위에서, 본 명세서에서 “제 1”, “제 2”“제 3”등의 용어는 이들 용어에 의해 기술된 각각의 목적을 별개의 실체로서 나타내기 위해 사용되며, 본 명세서에 명시적으로 달리 기재되지 않는 한, 연대순의 의미를 내포하지는 않는다.
용어 “커플링(coupled)”은 직접 또는 간접 결합, 연결, 체결, 접촉 또는 연결을 지칭하고, 물리적, 광학적, 전기적, 유체 적, 기계적, 화학적, 자기, 전자기, 통신과 같은 다양한 형태의 결합, 또는 다른 커플 링, 또는 전술 한 것의 조합을 지칭 할 수 있다. 한 형태의 커플 링이 지정된 경우, 다른 형태의 커플 링이 배제되는 것은 아니다. 예를 들어, 다른 구성 요소에 물리적으로 결합된 하나의 구성 요소는 (직접적으로 또는 간접적으로) 두 구성 요소 사이의 물리적 부착 또는 접촉을 참조 할 수 있지만, 예를 들어 통신 링크(예를 들어, RF 또는 광 링크)도 두 구성 요소를 통신적으로 연결한다. 마찬가지로, 다양한 용어 자체는 상호 배타적인 것이 아니다. 예를 들어, 유체 결합, 자기 결합 또는 기계적 결합은 물리적 결합의 형태일 수 있다.
청구 범위를 포함하여 본 개시 전반에 걸쳐 사용 된 용어 "실질적으로" 및 "약"은 처리의 변동으로 인한 작은 변동을 설명하고 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 이들은 ±5% 이하, 예컨대 ±2% 이하, 예컨대 ±1% 이하, 예컨대 ±0.5% 이하, 예컨대 이하 또는 ±0.2% 이하, 예를 들어 ±0.1% 이하, 예를 들어 ±0.05 % 이하를 언급할 수 있다.
일부 경우에 "하나 이상", "적어도", "그러나 이에 제한되지 않는"또는 다른 유사한 문구와 같은 확장 단어 및 문구의 존재는 더 좁은 경우가 의도되거나 요구됨을 의미하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이러한 확장 문구가 없을 수 있다. "구성 요소"라는 용어의 사용은 구성 요소의 일부로서 설명되거나 청구 된 요소 또는 기능이 모두 공통 패키지로 구성되는 것을 의미하지는 않는다. 실제로, 구조적 요소를 포함하여, 구성 요소의 다양한 요소 중 임의의 것 또는 전부는 단일 패키지로 결합되거나 개별적으로 유지 될 수 있고, 다수의 그룹화 또는 패키지로 더 분산될 수 있다.
또한, 본 명세서에 제시된 다양한 예는 예시적인 다이어그램 및 다른 예시의 관점에서 설명된다.본 명세서를 읽은 후 당업자에게 명백한 바와 같이, 예시된 예 및 그들의 다양한 대안은 예시된 예에 한정되지 않고 구현될 수 있다. 예를 들어, 블록 다이어그램 및 해당 설명은 특정 아키텍처 또는 구성을 요구하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
이하에서 더 상세히 논의되는 (이러한 개념이 서로 일치하지 않는 경우) 전술한 개념 및 추가 개념의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 특히, 본 개시의 끝에 나타나는 청구항의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다.
Claims (32)
- 샘플 용기 상의 복수의 부착 요소 중 제1 부착 요소에 제1 DNA 주형 분자를 부착하는 단계, 및 복수의 부착 요소 중 제2 부착 요소에 제2 DNA 주형 분자를 부착하는 단계;
샘플 용기에 스토캐스틱 포토-스위칭 화학을 준비하는 단계;
스토캐스틱 포토-스위칭에 의해서 부착된 분자가 최대 4개의 다른 색상으로 온 및 오프 이벤트에서 형광을 일으키도록 스토캐스틱 포토-스위칭 화학을 모든 분자에 동시에 적용하는 단계;
온 및 오프 이벤트가 발생함에 따라 실시간으로 제1 DNA 주형 분자에 대해 일련의 온 및 오프 이벤트를 이미징하는 단계; 및
온 및 오프 이벤트가 발생함에 따라 실시간으로 제2 DNA 주형 분자에 대해 일련의 온 및 오프 이벤트를 이미징하는 단계;를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법으로서,
DNA 주형 분자를 부착하는 단계에서, 제1 부착 요소 및 제2 부착 요소 사이의 거리는 Abbe의 한계 미만이며,
상기 스토캐스틱 포토-스위칭 화학은: 라벨 모이어티를 갖는 3'포스페이트 블록(3’ phosphate block)의 분자 및 5'디포스페이트퀀쳐 분자(5'diphosphatequencher molecule)의 분자 세트; 뉴클레오티드 세트의 하나의 뉴틀레오티드를 병합하고 5'디포스테이트퀀쳐 분자를 절단하는 폴리머라제; 및 라벨 모이어티를 갖는 3'포스페이트 블록을 절단하는 효소를 포함하며,
각각의 온 이벤트는 폴리머라제가 뉴클레오티드 세트의 하나의 뉴클레오티드를 병합하고 5'디포스테이트퀀쳐 분자를 절단할 때 발생하며, 각각의 오프 이벤트는 효소가 라벨 모이어티를 갖는 3'포스페이트 블록을 절단할 때 발생하며,
제1 DNA 주형 분자에 대한 일련의 온 및 오프 이벤트, 및 제2 DNA 주형 분자에 대한 일련의 온 및 오프 이벤트는 스토캐스틱이고 동기화되지 않는 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
샘플 용기 상에 각각의 부착 요소는 온 및 오프 이벤트를 이미징하는데 사용되는 이미저(image)의 시야 내에 있어서, 제1 DNA 주형 분자 및 제2 DNA 주형 분자에 대해 온 및 오프 이벤트의 이미징이 동시에 발생하도록 하는 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
포토-스위칭의 스토캐스틱 특성으로 인해, 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 동일한 염기에 대한 온 이벤트와 동시에 발생할 확률이 0.5% 미만인 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
스토캐스틱 포토-스위칭을 위한 시약의 농도는 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 동일한 염기에 대한 온 이벤트가 동시에 발생할 확률이 0.5% 미만이 되도록 하기에 충분한 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
제1 DNA 주형 분자에 대해 제1 뉴클레오티드 염기에 대한 온 이벤트가 효소의 농도 및 뉴클레오티드 세트의 농도를 기반한 제2 DNA 주형 분자에 대해 뉴클레오티드 염기에 대한 온 이벤트가 동시에 일어날 가능성을 제어 하도록 온 및 오프 이벤트가 발생하는 속도를 제어하는 단계를 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
(i) 색상 채널에서 감지된 온 이벤트의 조명 세기가 기결정된 임계값보다 큰지 여부를 결정하는 단계 또는 (ii) 색상 채널에서 감지된 온 이벤트의 스팟 크기가 기결정된 임계값보다 큰지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
제1 부착 요소 및 제2 부착 요소 사이의 거리는 20nm 미만인 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법. - 제 7 항에 있어서,
제1 부착 요소 및 제2 부착 요소 사이의 거리는 2nm 내지 20nm의 범위 내에 있는 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법. - 제 1 항에 따른 방법을 수행하기 위한 이미징 조립체로서,
상기 조립체는:
복수의 부착 요소를 포함하는 샘플 용기; 및
스토캐스틱 포토-스위칭 화학이 스토캐스틱 포토-스위칭 화학이 가해질 때 제1 DNA 주형 분자 및 제2 DNA 주형 분자를 위한 온 및 오프 이벤트가 발생하는 것과 동시에 복수의 색상 채널에서 온 및 오프 이벤트를 캡처함으로써, 제1 부착 요소 및 제2 부착 요소에서 발생하는 포토-스위칭 이미징하도록 위치된 이미저;를 포함하며,
제1 DNA 주형 분자는 제1 부착 요소에 부착되며, 제2 DNA 주형 분자는 제2 부착 요소에 부착되며, 인접한 부착 요소 사이의 평균 거리는 Abbe의 한계 미만인 이미징 조립체. - 제 9 항에 있어서,
샘플 용기는 복수의 샘플 위치에서 복수의 부착 요소를 포함하는 플로우셀을 포함하는 이미징 조립체. - 제 9 항에 있어서,
샘플 용기 상에 각각의 복수의 부착 요소는 온 및 오프 이벤트의 캡처가 시에 발생하도록 포토-스위칭을 이미징하는데 사용되는 이미저의 시야 내에 있는 이미징 조립체. - 제 9 항에 있어서,
스토캐스틱 포토-스위칭을 위한 시약의 농도는 주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 동일한 염기에 대한 온 이벤트가 동시에 발생할 확률이 0.5% 미만이 되도록 하기에 충분한 이미징 조립체. - 제 9 항에 있어서,
주어진 분자에 대해 주어진 염기에 대한 온 이벤트가 주어진 분자에 인접한 분자에서 같은 염기에 대한 온 이벤트와 동시에 발생할 확률이 본 방법에 적용되는 시퀀싱 어플리케이션에서 결정된 에러율보다 낮도록 온 및 오프 이벤트가 발생하는 속도를 조정하는 이미징 조립체. - 제 9 항에 있어서,
인접한 요소들 사이의 평균 거리는 20nm 미만인 이미징 조립체. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862640909P | 2018-03-09 | 2018-03-09 | |
| US62/640,909 | 2018-03-09 | ||
| PCT/US2019/021013 WO2019173515A1 (en) | 2018-03-09 | 2019-03-06 | Generalized stochastic super-resolution sequencing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200024794A KR20200024794A (ko) | 2020-03-09 |
| KR102299751B1 true KR102299751B1 (ko) | 2021-09-08 |
Family
ID=67843731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020197038832A KR102299751B1 (ko) | 2018-03-09 | 2019-03-06 | 일반화된 스토캐스틱 초-해상 시퀀싱 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11111533B2 (ko) |
| EP (1) | EP3762507A4 (ko) |
| JP (2) | JP7143341B2 (ko) |
| KR (1) | KR102299751B1 (ko) |
| CN (1) | CN111094592A (ko) |
| AU (2) | AU2019231688B2 (ko) |
| BR (1) | BR112019027603A2 (ko) |
| CA (1) | CA3067144C (ko) |
| IL (1) | IL271411B2 (ko) |
| MX (1) | MX2019014803A (ko) |
| RU (1) | RU2739571C1 (ko) |
| SG (1) | SG11201911971SA (ko) |
| WO (1) | WO2019173515A1 (ko) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10378053B2 (en) | 2017-03-17 | 2019-08-13 | Apton Biosystems, Inc. | Sequencing and high resolution imaging |
| EP2920725B1 (en) | 2012-11-19 | 2021-11-10 | Apton Biosystems, Inc. | Digital analysis of molecular analytes using single molecule detection |
| US10829816B2 (en) | 2012-11-19 | 2020-11-10 | Apton Biosystems, Inc. | Methods of analyte detection |
| KR20220018622A (ko) | 2013-08-22 | 2022-02-15 | 앱톤 바이오시스템즈, 인코포레이티드 | 전기적 방법을 이용한 분자 분석물질의 디지털 분석 |
| BR112019027603A2 (pt) | 2018-03-09 | 2020-11-10 | Illumina, Inc. | sequenciamento estocástico generalizado de super-resolução |
| EP3853382A4 (en) | 2018-09-19 | 2022-06-22 | Apton Biosystems, Inc. | DENSELY PACKED ANALYTE LAYERS AND DETECTION METHODS |
| KR20220115857A (ko) * | 2019-12-16 | 2022-08-19 | 일루미나, 인코포레이티드 | 키트 및 플로우 셀 |
| EP3990891A4 (en) * | 2019-12-31 | 2023-07-26 | Illumina, Inc. | AUTO FOCUS FEATURE IN OPTICAL SAMPLE ANALYSIS |
| US11408032B2 (en) | 2020-01-17 | 2022-08-09 | Element Biosciences, Inc. | Tube lens design for improved depth-of-field |
| KR102619825B1 (ko) | 2020-10-20 | 2024-01-03 | 한양대학교 산학협력단 | 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 |
| KR102654655B1 (ko) | 2020-10-20 | 2024-04-05 | 한양대학교 산학협력단 | 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 및 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치 |
| KR20230059684A (ko) | 2021-10-26 | 2023-05-03 | 한양대학교 산학협력단 | 단분자 수준에서의 고분자 박막의 극성 센싱 방법 |
| KR20230120819A (ko) | 2022-02-10 | 2023-08-17 | 한양대학교 산학협력단 | 형광현미경 또는 초고해상도 형광현미경을 이용한 용매의 수소 결합 센싱 방법 |
| WO2024122327A1 (ja) * | 2022-12-09 | 2024-06-13 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 遺伝子パネルシーケンサー、及び遺伝子パネルのシーケンス方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013112999A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | Cornell University | Methods and arrays for controlled manipulation of dna and chromatin fragments for genetic and epigenetic analysis |
| WO2016065300A1 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Eshoo Mark W | Microfluidic cartridge |
| US20160168632A1 (en) | 2013-08-02 | 2016-06-16 | Stc Unm | Dna sequencing and epigenome analysis |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2044616A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-04-27 | Roger Y. Tsien | Dna sequencing |
| AU8162498A (en) | 1997-06-25 | 1999-01-04 | Orchid Biosciences, Inc. | Methods for the detection of multiple single nucleotide polymorphisms in a single reaction |
| US20050244870A1 (en) | 1999-04-20 | 2005-11-03 | Illumina, Inc. | Nucleic acid sequencing using microsphere arrays |
| GB0321306D0 (en) | 2003-09-11 | 2003-10-15 | Solexa Ltd | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
| WO2008042067A2 (en) | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleotide sequencing |
| EP2639578B1 (en) | 2006-12-14 | 2016-09-14 | Life Technologies Corporation | Apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays |
| US8262900B2 (en) | 2006-12-14 | 2012-09-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
| US8349167B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-01-08 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays |
| US7909193B2 (en) | 2007-11-15 | 2011-03-22 | Target Brands, Inc. | Packaging cap |
| US20100137143A1 (en) | 2008-10-22 | 2010-06-03 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
| EP2802411B1 (en) | 2012-01-13 | 2017-04-05 | Koninklijke Philips N.V. | Dna sequencing with reagent recycling on wiregrid |
| CN103866010B (zh) * | 2014-02-28 | 2016-04-20 | 郭诚 | 一种基因测序的方法 |
| WO2016112999A1 (en) * | 2015-01-16 | 2016-07-21 | Longsand Limited | Number of revisions of file to store based on category |
| WO2017087823A1 (en) * | 2015-11-18 | 2017-05-26 | Mir Kalim U | Super-resolution sequencing |
| US20180088048A1 (en) * | 2016-04-29 | 2018-03-29 | Northwestern University | Devices, methods, and systems relating to super resolution imaging |
| BR112019027603A2 (pt) | 2018-03-09 | 2020-11-10 | Illumina, Inc. | sequenciamento estocástico generalizado de super-resolução |
-
2019
- 2019-03-06 BR BR112019027603-3A patent/BR112019027603A2/pt unknown
- 2019-03-06 SG SG11201911971SA patent/SG11201911971SA/en unknown
- 2019-03-06 US US16/294,696 patent/US11111533B2/en active Active
- 2019-03-06 JP JP2019571589A patent/JP7143341B2/ja active Active
- 2019-03-06 RU RU2019140388A patent/RU2739571C1/ru active
- 2019-03-06 EP EP19763850.5A patent/EP3762507A4/en active Pending
- 2019-03-06 CA CA3067144A patent/CA3067144C/en active Active
- 2019-03-06 KR KR1020197038832A patent/KR102299751B1/ko active IP Right Grant
- 2019-03-06 WO PCT/US2019/021013 patent/WO2019173515A1/en active Application Filing
- 2019-03-06 IL IL271411A patent/IL271411B2/en unknown
- 2019-03-06 AU AU2019231688A patent/AU2019231688B2/en not_active Ceased
- 2019-03-06 CN CN201980003320.3A patent/CN111094592A/zh active Pending
- 2019-03-06 MX MX2019014803A patent/MX2019014803A/es unknown
-
2021
- 2021-08-05 US US17/395,294 patent/US12091713B2/en active Active
-
2022
- 2022-06-29 AU AU2022204662A patent/AU2022204662A1/en not_active Abandoned
- 2022-09-14 JP JP2022145883A patent/JP7462002B2/ja active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013112999A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | Cornell University | Methods and arrays for controlled manipulation of dna and chromatin fragments for genetic and epigenetic analysis |
| US20160168632A1 (en) | 2013-08-02 | 2016-06-16 | Stc Unm | Dna sequencing and epigenome analysis |
| WO2016065300A1 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Eshoo Mark W | Microfluidic cartridge |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US11111533B2 (en) | 2021-09-07 |
| CN111094592A (zh) | 2020-05-01 |
| JP7462002B2 (ja) | 2024-04-04 |
| EP3762507A1 (en) | 2021-01-13 |
| BR112019027603A2 (pt) | 2020-11-10 |
| IL271411A (en) | 2020-01-30 |
| JP2021510292A (ja) | 2021-04-22 |
| SG11201911971SA (en) | 2020-01-30 |
| US20190276886A1 (en) | 2019-09-12 |
| RU2739571C1 (ru) | 2020-12-25 |
| WO2019173515A1 (en) | 2019-09-12 |
| EP3762507A4 (en) | 2021-11-10 |
| US20210363578A1 (en) | 2021-11-25 |
| IL271411B1 (en) | 2023-11-01 |
| MX2019014803A (es) | 2021-02-09 |
| JP7143341B2 (ja) | 2022-09-28 |
| KR20200024794A (ko) | 2020-03-09 |
| IL271411B2 (en) | 2024-03-01 |
| AU2019231688A1 (en) | 2020-01-02 |
| CA3067144A1 (en) | 2019-09-12 |
| AU2019231688B2 (en) | 2022-03-31 |
| CA3067144C (en) | 2023-09-05 |
| AU2022204662A1 (en) | 2022-07-21 |
| US12091713B2 (en) | 2024-09-17 |
| JP2022191231A (ja) | 2022-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102299751B1 (ko) | 일반화된 스토캐스틱 초-해상 시퀀싱 | |
| US7476504B2 (en) | Use of reversible extension terminator in nucleic acid sequencing | |
| US9587275B2 (en) | Single molecule sequencing with two distinct chemistry steps | |
| EP3415641B1 (en) | Method for analysis of molecules | |
| US7906284B2 (en) | Arrays of optical confinements and uses thereof | |
| US20100143900A1 (en) | Asynchronous sequencing of biological polymers | |
| US20230080657A1 (en) | Methods for nucleic acid sequencing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |