KR102281861B1 - 무화과 알코올 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법 및 이로부터 제조된 화장료 조성물 - Google Patents

무화과 알코올 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법 및 이로부터 제조된 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무화과 잎 및 열매를 70% 알코올을 이용하여 추출물을 획득하는 제1단계 및 상기 추출물을 9종의 혼합 유산균 또는 1종의 효모를 이용하여 발효하여 발효물을 획득하는 제2단계를 포함하는 무화과 알코올 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법 및 이로부터 제조되는 화장료 조성물에 관한 발명이다. 70% 알코올은 바람직하게 70% 에탄올일 수 있다. 무화과 잎 및 열매를 알코올 추출한 추출물을 발효시킴으로써 상기 추출물이 가지는 항염 성능 및 미백 성능을 향상시킬 수 있다.

Description

무화과 알코올 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법 및 이로부터 제조된 화장료 조성물{A method for preparing a cosmetic composition comprising fermented product of fig alcohol extract and the cosmetic composition prepared therefrom}
본 발명은, 화장료 조성물의 제조방법 및 이로부터 제조된 화장료 조성물에 관한 발명으로 무화과 알코올 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법 및 이로부터 제조된 화장료 조성물에 관한 발명이다.
무화과는 꽃이 피지 않는 과실로서 알려져 있다. 무화과 꽃은 실제 과실 내에서 피기 때문에 외부에서 확인할 수 없을 뿐이지만, 이러한 이유에서인지 무화과를 심미적 대상으로서 찾는 경우를 쉽게 접할 수는 없다.
하지만, 무화과는 니아신, 나트륨, 단백질, 당질, 레티놀, 베타카로틴, 비타민 A, B1, B2, B6, C, E, 식이섬유, 아연, 엽산, 인, 지질, 철분, 칼륨, 칼슘 등 다양한 성분을 포함하고 있어 무화과에 포함된 성분을 영양학적으로 또는 약학적으로 활용하고자 하는 사례는 쉽게 접할 수 있다.
최근에 들어서는, 무화과 성분을 추출하여 화장품에 적용하려는 사례도 나타나고 있다. 대한민국 공개특허공보 제10-2020-0114810호는 무화과잎 알코올 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법에 관한 발명을 개시하며, 무화과잎 알코올 추출물은 항산화, 항염증 및 미백 활성을 가지는 것으로 개시되어 있다.
대한민국 공개특허공보 제10-2020-0114810호(2020.10.07.)
본 발명은, 무화과 알코올 추출물을 이용하여 항염 성능 및 미백 성능을 향상시킬 수 있는 방법의 고안을 목적으로 한다.
본 발명은, 무화과 알코올 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법으로서, 무화과 잎 및 열매를 70% 알코올을 이용하여 추출물을 획득하는 제1단계 및 상기 추출물을 9종의 혼합 유산균을 이용하여 발효하여 발효물을 획득하는 제2단계를 포함한다. 상기 9종의 혼합 유산균은, 다음의 유산균으로 구성되며, 70% 알코올은 70% 에탄올이다.
1) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus　plantarum)
2) 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)
3) 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)
4) 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)
5) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)
6) 락토바실러스 애씨도필러스(Lactobacillus acidophilus)
7) 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles)
8) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)
9) 비피도박테리움 비피덤(Bfidobacterium bifidum)
상기 발효물은 루틴 및 퀘르세틴을 포함하며, 상기 제2단계는 상기 추출물에 포함되는 루틴을 분해하여 상기 추출물에 포함되는 퀘르세틴의 양을 증가시키는 단계이다.
본 발명은, 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물의 발효물을 포함하되, 상기 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물에 포함되는 루틴의 양보다 적은 양의 루틴을 포함하며, 상기 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물에 포함되는 퀘르세틴의 양보다 많은 양의 퀘르세틴을 포함하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
한편, 본 발명은, 무화과 잎 및 열매를 70% 알코올을 이용하여 추출물을 획득하는 제1단계 및 상기 추출물을 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 이용하여 발효하여 발효물을 획득하는 제2단계를 포함한다. 여기서, 70% 알코올은 70% 에탄올이다.
상기 발효물은 루틴 및 퀘르세틴을 포함하며, 상기 제2단계는 상기 추출물에 포함되는 루틴 및 퀘르세틴을 분해하는 단계이다.
본 발명은, 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물의 발효물을 포함하되, 상기 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물에 포함되는 루틴 및 퀘르세틴의 양보다 적은 양의 루틴 및 퀘르세틴을 포함하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은, 무화과 잎 및 열매(이하에서, "무화과 잎 및 열매"를 "무화과 잎/열매"로 기재할 수 있다)의 알코올 추출물의 발효물을 화장료 조성물에 적용하여 항염 성능 및 미백 성능을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명인 무화과 알코올 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법의 순서도이다.
도 2는 무화과 잎/열매 추출 시의 추출 매개체를 각각 열수, 50% 에탄올, 70% 에탄올 및 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-BG)로 하였을 때의 세포 생존률을 나타낸다.
도 3은 무화과 잎/열매 추출 시의 추출 매개체를 각각 열수, 50% 에탄올, 70% 에탄올 및 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-BG)로 하였을 때의 항염 성능을 나타낸다.
도 4는 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물과 이의 추출물을 9종의 혼합 유산균으로 발효하였을 때의 발효물의 세포 생존률을 나타낸다.
도 5는 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물과 이의 추출물을 9종의 혼합 유산균으로 발효하였을 때의 발효물의 항염 성능을 나타낸다.
도 6은 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물과 이의 추출물을 9종의 혼합 유산균으로 발효하였을 때의 발효물의 미백 성능을 나타낸다.
도 7은 표준품의 크로마토그램(Chromatogram)으로, 도 7(A)는 루틴의 크로마토그램이며 도 7(B)는 퀘르세틴의 크로마토그램이다.
도 8은 각 시료의 TIC (Total Ion Chromatogram) 결과로 도 8(A)는 70% 에탄올 추출물의 TIC 결과이며, 도 8(B)는 70% 에탄올 추출물의 유산균 발효물의 TIC 결과이며, 도 8(C)는 70% 에탄올 추출물의 엿기름 발효물의 TIC 결과이며, 도 8(D)는 70% 에탄올 추출물의 누룩 발효물의 TIC 결과이다.
도 9는 70% 에탄올 추출물의 EIC (Extracted Ion Chromatogram) 결과로 도 9(A)는 루틴의 EIC 결과이며, 도 9(B)는 퀘르세틴의 EIC 결과이다.
도 10은 70% 에탄올 추출물의 유산균 발효물의 EIC 결과로 도 10(A)는 루틴의 EIC 결과이며, 도 10(B)는 퀘르세틴의 EIC 결과이다.
도 11(A)는 루틴의 질량 스펙트럼(Mass spectra)(m/z: 609.2 [M-H]-)이고, 도 11(B)는 퀘르세틴의 질량 스펙트럼(m/z: 301.1[M-H]-)이다.
도 12는 70% 에탄올 추출물, 이의 추출물을 9종의 혼합 유산균으로 발효하였을 때의 발효물 및 EGCG(Epigallocatechin gallate)의 항염 성능을 나타낸다.
도 13은 70% 에탄올 추출물, 이의 추출물을 9종의 혼합 유산균으로 발효하였을 때의 발효물 및 알부틴(Arbutin)의 미백 성능을 나타낸다.
도 14는 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물과 이의 추출물을 1종의 효모로 발효하였을 때의 발효물의 세포 생존률을 나타낸다.
도 15는 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물과 이의 추출물을 1종의 효모로 발효하였을 때의 발효물의 항염 성능을 나타낸다.
도 16은 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물과 이의 추출물을 1종의 효모로 발효하였을 때의 발효물의 미백 성능을 나타낸다.
도 17은 표준품의 크로마토그램(Chromatogram)으로, 도 17(A)는 루틴의 크로마토그램이며 도 17(B)는 퀘르세틴의 크로마토그램이다.
도 18은 70% 에탄올 추출물의 크로마토그램으로, 도 18(A)는 에탄올 추출물의 TIC 결과이며, 도 18(B)는 루틴의 EIC 결과이며, 도 18(C)는 퀘르세틴의 EIC 결과이다.
도 19는 70% 에탄올 추출물의 효모 발효물의 크로마토그램으로, 도 19(A)는 효모 발효물의 TIC 결과이며, 도 19(B)는 루틴의 EIC 결과이며, 도 19(C)는 퀘르세틴의 EIC 결과이다.
도 20(A)는 루틴의 질량 스펙트럼(Mass spectra)(m/z: 609.2 [M-H]-)이고, 도 20(B)는 퀘르세틴의 질량 스펙트럼(m/z: 301.1[M-H]-)이다.
도 21은 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물과 이의 추출물을 1종의 유산균 및 1종의 효모로 각각 발효하였을 때의 발효물의 세포 생존률을 나타낸다.
도 22는 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물과 이의 추출물을 1종의 유산균 및 1종의 효모로 각각 발효하였을 때의 발효물의 항염 성능을 나타낸다.
도 23은 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물과 이의 추출물을 1종의 유산균 및 1종의 효모로 각각 발효하였을 때의 발효물의 미백 성능을 나타낸다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다. 다만, 본 발명이 예시적 실시 예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 목적 및 효과는 하기의 설명에 의해서 자연스럽게 이해되거나 보다 분명해 질 수 있으며, 하기의 기재만으로 본 발명의 목적 및 효과가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 본 발명과 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.
도 1은 본 발명인 무화과 알코올 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법의 순서도이다. 도 1을 참조하면, 본 발명은, 무화과 잎/열매를 70% 알코올을 이용하여 추출물을 획득하는 제1단계(S100) 및 상기 추출물을 9종의 혼합 유산균을 이용하여 발효하여 발효물을 획득하는 제2단계(S200)를 포함한다. 상기 9종의 혼합 유산균에 대한 설명은 다음과 같으며, 70% 알코올은 70% 에탄올인 것이 바람직하다.
1) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus　plantarum): 김치의 발효 후기에　작용하는 유산균으로 알려져 있다. 최근, 장 건강은 물론, 피부 가려움증 개선 및 피부 보습 등 피부 건강을 위한 유산균으로도 알려져 있다.
2) 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus): 유산균의 증식과 유해균의 억제에 도움을 주며, 배변 활동이 원활하도록 도움을 주는 유산균으로 알려져 있다.
3) 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei): 치즈의 생산에 이용되는 유산균으로 알려져 있다. 최근, 복통, 복부 팽만 개선에 도움을 주는 유산균으로도 알려져 있다.
4) 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei): 곰팡이균을 억제해 과민성대장증후군을 개선하는데 도움을 주는 유산균으로 알려져 있으며, 아토피나 건선과 같은 피부질환의 개선에도 효과적인 유산균으로도 알려져 있다.
5) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum): 내산성 또는 장 상피세포 부착성이 우수하여 경구 투여 시 대부분이 장에 도달할 수 있고, 장내 유해균의 번식을 효과적으로 억제할 수 있는 유산균으로 알려져 있다.
6) 락토바실러스 애씨도필러스(Lactobacillus acidophilus): 장 건강을 통한 면역력 강화에 도움이 되는 유산균으로 알려져 있으며, 비타민 B군 중 특히 엽산, 우유를 소화하는 락타아제를 생성할 수 있는 유산균으로도 알려져 있다.
7) 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles): 유산을 생성하여 장의 연동 운동을 촉진시킬 수 있고, 장내 유해균에 의해 생성되는 독소의 피해를 예방할 수 있는 유산균으로 알려져 있다.
8) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum): 장내 유해균 억제 효과가 큰 유산균으로 알려져 있으며, 설사 및 장염 등을 개선하는데 도움을 주는 유산균으로도 알려져 있다.
9) 비피도박테리움 비피덤(Bfidobacterium bifidum): 모유로 자란 아기의 대장에 주로 서식하는 유산균으로 알려져 있으며, 항생물질을 생성해 유해균 사멸 능력이 우수한 유산균으로도 알려져 있다.
본 발명은, 무화과 잎/열매를 70% 알코올을 이용하여 추출물을 획득하는 제1단계(S100) 및 상기 추출물을 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 이용하여 발효하여 발효물을 획득하는 제2단계(S200)를 포함한다. 사카로마이세스 세레비지에는 맥주 효모로 알려져 있다. 여기서, 70% 알코올은 70% 에탄올인 것이 바람직하다.
본 발명의 제1단계는 무화과 잎/열매로부터 추출물을 획득하는 단계이다. 추출 매개체는 열수, 알코올, 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-BG), 에틸아세테이트 중 하나를 선택할 수 있다. 다만, 추출의 목적은 무화과 잎/열매에서 유용한 물질을 추출하여 화장료 조성물로서 사용하는데 있으므로 화장료 조성물의 용도 및 효과를 고려하여 추출 매개체를 선택할 수 있다. 추출 매개체로서 알코올을 선택하는 경우, 40~80% 에탄올을 사용할 수 있으며, 바람직하게 70% 에탄올(에탄올:물=7:3)을 사용할 수 있다.
본 발명의 제2단계는 무화과 잎/열매 알코올 추출물을 발효하는 단계이다. 발효는 전술한 9종의 유산균 또는 전술한 1종의 효모를 이용한다. 발효는 세균 또는 효모와 같은 미생물이 유기 화합물을 분해하여 알코올류, 유기산류, 이산화탄소 등을 발생하는 작용을 말한다. 본 발명에서 발효는 무화과 잎/열매 알코올 추출물에 포함되는 루틴(Rutin)을 분해하는 과정을 말한다. 루틴은 플라보놀 배당체(글리코시드)의 하나로 연한 노란색의 바늘 모양 결정을 말하며, 배당체는 비당 성분인 아글리콘을 포함한다. 본 발명에 있어 아글리콘은 퀘르세틴을 말한다.
무화과 잎/열매 알코올 추출물을 발효할 수 있는 미생물로서 전술한 9종의 유산균 또는 전술한 1종의 효모 외에도 락토바실러스 김치커스(Lactobacillus kimchicus)를 포함할 수 있다. 락토바실러스 김치커스는 김치 유산균으로 알려져 있다. 무화과 잎/열매 알코올 추출물을 발효할 수 있는 미생물이 이에 한정되는 것은 아니다. 루틴을 분해할 수 있는 미생물이라면 어떠한 미생물도 이에 포함될 수 있다. 이하에서, 본 발명의 실험예들에 대해 설명하도록 한다.
도 2 및 3은 무화과 잎/열매 추출 시의 추출 매개체를 각각 열수, 50% 에탄올, 70% 에탄올 및 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-BG)로 하였을 때의 세포 생존률 및 항염 성능을 나타낸다.
추출 대상인 무화과 잎/열매의 시료 확보 과정은 다음과 같다. 무화과 잎은 깨끗하게 세척한 후, 바람이 잘 통하고 햇빛이 차단된 곳에서 7일간 건조하였다. 무화과 열매는 깨끗하게 세척한 후, 각 열매를 4등분하여 건조기에서 5일간 건조하였다. 건조된 무화과 잎/열매는 건냉암소에 보관하였고, 분쇄기로 40 Mesh의 입자로 분쇄하여 파우더 형태의 시료를 확보하였다. 각 추출 매개체를 이용한 무화과 잎/열매 추출물의 획득 방법은 다음과 같다.
열수의 경우, 무화과 잎/열매 파우더 10g과 물 100g을 1:10 비율로 혼합하고 소니케이터에서 인큐베이션(42℃, 3시간)하여 추출한 후 공극 크기(pore size)가 11.0μm인 필터를 이용하여 여과하여 무화과 잎/열매 추출물(이하, 시료 1)을 획득하였다.
50% 에탄올의 경우, 무화과 잎/열매 파우더 10g과 50% 에탄올 100g을 1:10 비율로 혼합하고 소니케이터에서 인큐베이션(60℃, 1.5시간)하여 추출하였다. 무화과 잎/열매 추출물을 30℃로 냉각하고 공극 크기(pore size)가 11.0μm인 필터를 이용하여 여과하였고, 45℃ 및 70 mbar의 감압 농축 후 30분 동안 3,000RPM의 원심 분리하여 무화과 잎/열매 추출물(이하, 시료 2)을 획득하였다.
70% 에탄올의 경우, 무화과 잎/열매 파우더 10g과 70% 에탄올 100g을 1:10 비율로 혼합하고 소니케이터에서 인큐베이션(60℃, 1.5시간)하여 추출하였다. 무화과 잎/열매 추출물을 30℃로 냉각하고 공극 크기가 11.0μm인 필터를 이용하여 여과하였고, 45℃ 및 70 mbar의 감압 농축 후 30분 동안 3,000RPM의 원심 분리하여 무화과 잎/열매 추출물(이하, 시료 3)을 획득하였다.
1,3-부틸렌글라이콜의 경우, 무화과 잎/열매 파우더 10g과 1,3-부틸렌글라이콜 100g을 1:10 비율로 혼합하고 소니케이터에서 인큐베이션(42℃, 3시간)하여 추출한 후 공극 크기(pore size)가 11.0μm인 필터를 이용하여 여과하였고 무화과 잎/열매 추출물(이하, 시료 4)을 획득하였다.
세포 생존률 측정(세포독성 실험) 방법은 다음과 같다. 세포 생존률을 측정하기 위하여 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 진행하였다. 96 well plate에 3Х103개의 B16F10 mouse melanoma (미백), Raw264.7 (항염) 세포를 접종하고, 48시간 후 추출물을 처리하였다. 추출물이 처리된 세포를 48시간 배양 후 0.5mg/mL MTT (Sigma-Aldrich)로 처리하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 후 배지를 제거하고 생성된 MTT formazan을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 용해하여 595nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 비교하여 세포 생존률을 나타내었다.
항염 성능 측정 방법은 다음과 같다. 항염 성능은 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 사이토카인의 전사 요인인 NF-kB의 전사 능력이 무화과 잎/열매 추출물에 의해 억제되는지를 통해 나타낼 수 있다. 따라서, 면역 세포에 무화과 잎/열매 추출물을 처리하였을 때 NF-kB 전사 능력이 어느 정도 억제되는지 확인하기 위하여 NF-kB reporter assay를 진행하였다.
NF-kB에 의하여 전사가 진행된다고 알려진 유전자의 프로모터 영역(promoter region)을 루시퍼라제(luciferase) 유전자가 포함된 벡터에 클로닝하여 면역 세포에 삽입시켰다. 이 후, NF-kB 전사를 유도하는 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, 이하에서 "LPS"로 기재하기로 한다)를 처리하여 NF-kB 전사 능력을 활성화시킨 뒤 무화과 잎/열매 추출물을 처리하여 루시퍼라제(luciferase) 활성을 측정하였다.
참고로, 루시퍼라제 활성은 IgGκ chain 유전자의 NF-κB 결합 자리(binding site)인 IgGκ-NF-κB site (sequence 5'-GGGGACTTTCC-3') 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)가 minimal IL-8 promoter (position -67 to +44)의 상류(upstream)에 위치하도록 구축된 luciferase reporter gene construct를 이용하였으며, lipofectamine plus (Gibco-BRL)를 이용하여 시약 매뉴얼에 따라 유전자를 면역 세포에 삽입시켰다.
유전자가 삽입된 면역 세포에 LPS를 처리하여 NF-kB의 전사 능력을 활성화시킨 뒤, 24시간 배양하였다. 배양된 면역 세포는 수확(harvest) 시점에서 0.1 ml의 lysis buffer(0.1 M HEPES, pH 7.6, 1% Triton-X, 1 mM DTT and 2 mM EDTA)를 직접 첨가하여 cell lysate를 수확한 후 4℃에서 10분 동안 14,000 rpm의 원심분리하여 세포 단백을 얻었다. Bradford assay(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 단백 농도를 측정한 후, 20μg의 단백질을 luciferase assay mix (25mM glycylglycine, 15mM MgSO4, 1mg/ml bovine serum albumin (BSA), 5mM ATP and 1mM D-luciferin (Analytical Luminescence Laboratory, San Diego, CA))에 첨가한 후, Monolight 2010 (Analytical Luminescence Laboratory)을 이용하여 20초 동안 luminescence를 3회 반복 측정하여 평균값을 얻어 나타내었다.
도 2를 참조하면, 시료 1 내지 3의 경우, 시료 농도가 200μg/ml에서도 90% 이상의 세포 생존률이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 시료 4의 경우, 시료 농도 50μg/ml를 기준으로 시료 1 내지 3과 비교하였을 때 더 낮은 세포 생존률이 나타나는 것을 확인할 수 있다.
도 3을 참조하면, 시료 1 내지 3 중 시료 3에서 가장 우수한 항염 성능이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 시료 4의 경우, 시료 농도 50μg/ml를 기준으로 시료 2의 항염 성능과 유사한 항염 성능이 나타나는 것을 확인할 수 있다.
도 4 내지 6은 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물(이하, 시료 5)과 이의 추출물을 9종의 혼합 유산균으로 발효하였을 때의 발효물(이하, 시료 6)의 세포 생존률, 항염 성능 및 미백 성능을 나타낸다. 9종의 혼합 유산균의 종류는 전술한 바와 같으며, ㈜락토메이슨 社의 9종 혼합 유산균 제품(Lot no.: S-190916-1)을 이용하였다.
추출 대상인 무화과 잎/열매의 시료 확보 과정, 추출 매개체로서 70% 에탄올 이용한 무화과 잎/열매 추출물의 획득 방법은 전술한 바와 같다. 시료 6은 시료 5에 상기 9종의 혼합 유산균을 첨가하여 37℃에서 5일간 발효시켜 획득하였다. 세포 생존률 및 항염 성능의 측정 방법은 전술한 바와 같고, 미백 성능의 측정 방법은 다음과 같다.
미백 성능의 측정은, B16F10 mouse melanoma 세포 내 멜라닌을 추출하여 흡광도를 측정하는 방법을 이용하였다. 60-mm cell culture dish에 2Х105 개의 B16F10 mouse melanoma 세포를 접종하고 48시간 배양하였다. 배양 후 세포에 멜라닌 생성 유도 물질인 α-MSH와 무화과 잎/열매 추출물을 처리하고 48 시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 수확하여 PBS(Phosphate-buffered saline)로 1회 세척하고 세포 수를 개수하였다. 동일량의 세포가 분주된 각 샘플에 1 N 수산화 나트륨 수용액(NaOH, Sigma-Aldrich) 100μL를 첨가하여 95℃에서 15분 동안 세포를 용해하였다. 그 후 450nm 파장에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 확인하였다.
도 4 내지 6을 참조하면, 시료 5 및 시료 6은 시료 농도가 50μg/ml에서도 90% 이상의 세포 생존률이 나타나는 것을 확인할 수 있으며, 시료 5보다 시료 6에서 더 우수한 항염 성능 및 미백 성능이 나타나는 것을 확인할 수 있다.
이하에서, 시료 6에 포함되는 루틴 및 퀘르세틴을 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS/MS)을 이용하여 정량 분석한 결과를 설명하기로 한다. 다만, 정량 분석 시 이용되는 시료를 시료 6에 한정하지 않고 보다 명확한 결론을 도출하기 위해 시료 5, 70% 에탄올 추출물의 엿기름 발효물(이하, 시료 7) 및 70% 에탄올 추출물의 누룩 발효물(이하, 시료 8)의 정량 분석 결과를 함께 설명하기로 한다.
먼저, 각 시료의 전처리 과정으로서 시료 5 내지 8을 MeOH/D.W. 혼합 용매에 용해한 후 여과지로 여과하여 검액으로 이용하였으며, 루틴 및 퀘르세틴 표준품 1mg을 정밀하게 측정하고 MeOH 1mL를 가하고 20분간 초음파 진탕한 후 여과하여 표준 원액으로 하였다. 이 표준 원액을 연속희석법으로 희석하여 0.5, 1, 5, 10 그리고 100μg/mL 농도의 검량선용 표준액을 만들어 이용하였다.
Instrument Agilent Technologies 6410 Triple Quad (LC-MS/MS)
Column Chromasil C183.0 mm Х 150 mm, 3.0 ㎛
Solvent A; 0.1% Formic acid in Water
B; 0.1% Formic acid in Acetonitrile
Flow rate 0.4 mL/min
Injection vol. 5 μL
Gradient (1) 0 min, 5% (2) 30 min, 100% (3) 32 min 100%
Ionization Mode -ESI, scan mode
Gas temp. 350 ℃
Capillary volt. 4000 V
Nebulizer 40 psig
Fragmentor 135 V
도 7(A) 및 7(B)는 표준품의 루틴 및 퀘르세틴의 크로마토그램이다. 도 8(A) 내지 8(D)는 각각 시료 5, 시료 6, 시료 7, 시료 8의 TIC 결과이다. 도 9(A) 및 9(B)는 시료 5의 루틴 및 퀘르세틴의 EIC 결과이다. 도 10(A) 및 10(B)는 시료 6의 루틴 및 퀘르세틴의 EIC 결과이다. 도 11(A) 및 11(B)는 루틴의 질량 스펙트럼(Mass spectra)(m/z: 609.2 [M-H]-) 및 퀘르세틴의 질량 스펙트럼(m/z: 301.1[M-H]-)이다.
표 2는 루틴 및 퀘르세틴을 타겟 물질로 한 검량선(calibration curve) 정보이며, 표 3은 시료 5 내지 8에 포함되는 루틴 및 퀘르세틴의 양을 나타낸 표이다. 표 3에서 각 수치의 단위는 μg/mg이며, "N.D."는 검출되지 않음(Not Detected)을 의미한다.
Compound Regression equation Linear range
(μg/mL)		 Correlation coefficient
(R2)
루틴 y = 62,420.8765x + 8,997.3845 0.5-10 0.9992
퀘르세틴 y = 314,373.8219x + 39,651.7192 0.5-5 0.9989
시료 루틴 퀘르세틴
시료 5 1.884 0.002
시료 6 1.002 0.132
시료 7 N.D. N.D.
시료 8 N.D. N.D.
도 7 내지 11 및 표 2 및 3을 참조하면, 시료 6에 시료 5 보다 더 적은 양의 루틴이 포함되며, 시료 6에 시료 5 보다 더 많은 양의 퀘르세틴이 포함되는 점을 확인할 수 있다. 따라서, 70% 에탄올 추출물의 상기 9종의 혼합 유산균 발효 시, 배당체인 루틴이 분해되어 아글리콘(aglycone)인 퀘르세틴의 양이 증가함에 따라 즉, 발효를 통한 물질의 생물학적 전환을 통해 항염 성능 및 미백 성능이 향상되는 것을 확인할 수 있다.
도 12는 70% 에탄올 추출물(이하, 시료 9), 이의 추출물을 9종의 혼합 유산균으로 발효하였을 때의 발효물(이하, 시료 10) 및 EGCG(Epigallocatechin gallate)(이하, 시료 11)의 항염 성능을 나타낸다. 9종의 혼합 유산균의 종류, 발효 과정 및 항염 성능 측정 방법은 전술한 바와 같다.
도 12의 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG, 갈산염-3-에피갈로카테킨) 혹은　카테킨은 녹차엽의 추출물인 폴리페놀의 일종으로 강력한 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
도 12를 참조하면, 시료 9 및 시료 10의 농도가 증가함에 따라 항염 성능이 향상되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 시료 10의 농도가 50 μg/ml 일 때의 항염 성능은 시료 11의 농도가 10 μg/ml 일 때의 항염 성능에 근접하는 것을 확인할 수 있다. 참고로, 시료 11의 농도 μg/ml 는, (EGCG의 질량) / (EGCG가 포함된 배지의 부피)를 의미하며, 상기 배지는 RPMI 배지(Raw264.7 세포)이다.
도 13은 70% 에탄올 추출물(이하, 시료 12), 이의 추출물을 9종의 혼합 유산균으로 발효하였을 때의 발효물(이하, 시료 13) 및 알부틴(Arbutin)(이하, 시료 14)의 미백 성능을 나타낸다. 9종의 혼합 유산균의 종류, 발효 과정 및 미백 성능 측정 방법은 전술한 바와 같다.
도 13의 알부틴은 멜라닌의 생성을 조절하는 효소인 티로시나아제 활성을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제하는 생리적 활성을 가지고 있어 피부 미백제 등에 이용되는 것으로 알려져 있다.
도 13을 참조하면, 시료 12 및 시료 13의 농도가 증가함에 따라 미백 성능이 향상되는 것을 확인할 수 있으며, 시료 13의 농도가 50 μg/ml 일 때의 미백 성능은 시료 14의 농도가 20 μg/ml 일 때의 미백 성능보다 우수한 것을 확인할 수 있다. 참고로, 시료 14의 농도 μg/ml 는, (알부틴의 질량) / (알부틴이 포함된 배지의 부피)를 의미하며, 상기 배지는 DMEM 배지(B16F10 세포)이다.
도 14 내지 16은 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물(이하, 시료 15)과 이의 추출물을 1종의 효모로 발효하였을 때의 발효물(이하, 시료 16)의 세포 생존률, 항염 성능 및 미백 성능을 나타낸다. 1종의 효모는 전술한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)이다.
추출 대상인 무화과 잎/열매의 시료 확보 과정, 추출 매개체로서 70% 에탄올 이용한 무화과 잎/열매 추출물의 획득 방법은 전술한 바와 같다. 시료 16은 시료 15와 배양액을 혼합하고 맥주 효모균을 접종한 후 25℃, 150rpm, 24h의 조건에서 배양하여 획득하였다. 세포 생존률, 항염 성능 및 미백 성능의 측정 방법은 전술한 바와 같다.
도 14 내지 16을 참조하면, 시료 15 및 시료 16 모두 시료 농도 20μg/ml에서도 90% 이상의 세포 생존률이 나타나는 것을 확인할 수 있으며, 시료 16이 시료 15보다 시료 농도 10μg/ml 및 20μg/ml에서 항염 성능이 더 우수한 것을 확인할 수 있으며, 시료 16이 시료 15보다 모든 시료 농도에서 미백 성능이 더 우수한 것을 확인할 수 있다.
도 17(A) 및 17(B)는 표준품의 루틴 및 퀘르세틴의 크로마토그램이다. 도 18(A)는 시료 15의 TIC 결과이며, 도 18(B)는 시료 15의 루틴의 EIC 결과이며, 도 18(C)는 시료 15의 퀘르세틴의 EIC 결과이다. 도 19(A)는 시료 16의 TIC 결과이며, 도 19(B)는 시료 16의 루틴의 EIC 결과이며, 도 19(C)는 시료 16의 퀘르세틴의 EIC 결과이다. 도 20(A)는 루틴의 질량 스펙트럼(Mass spectra)(m/z: 609.2 [M-H]-)이고, 도 20(B)는 퀘르세틴의 질량 스펙트럼(m/z: 301.1[M-H]-)이다.
Compound Regression equation Linear range
(μg/mL)		 Correlation coefficient
(R2)
루틴 y = 72,770.1869x + 12,519.4791 0.5-10 0.9992
퀘르세틴 y = 554,724.5714x - 9,711.0000 0.25-1 1.0000
시료 루틴 퀘르세틴
시료 15 4.020 0.042
시료 16 0.960 0.016
표 4는 루틴 및 퀘르세틴을 타겟 물질로 한 검량선(calibration curve) 정보이며, 표 5는 시료 15 및 16에 포함되는 루틴 및 퀘르세틴을 정량 분석하여 결과를 나타낸 표이다. 표 5에서 각 수치의 단위는 μg/mg이다. 시료 15 및 16에 대한 정량 분석 방법 및 과정은 전술한 시료 5 내지 8에 대한 정량 분석 방법 및 과정과 동일한 조건에서 진행하였다.
도 17 내지 20 및 표 4 및 5를 참조하면, 시료 16에 시료 15 보다 더 적은 양의 루틴 및 퀘르세틴이 포함되는 것을 확인할 수 있다. 표 4의 결과와 비교하면, 발효에 의해 루틴이 분해되어 루틴의 양이 감소하는 것은 공통되나, 퀘르세틴의 양이 유산균 발효 시에는 증가하고 효모 발효 시에는 감소하는 결론 지을 수 있다.
도 21 내지 23은 70% 에탄올을 이용하여 무화과 잎/열매를 추출하였을 때의 추출물(이하, 시료 17), 시료 17을 1종의 유산균으로 발효하였을 때의 발효물(이하, 시료 18) 및 시료 17을 1종의 효모로 발효하였을 때의 발효물(이하, 시료 19)의 세포 생존률, 항염 성능 및 미백 성능을 나타낸다. 1종의 유산균은 김치 유산균으로도 불리우는 락토바실러스 김치커스(Lactobacillus kimchicus)이며, 1종의 효모는 전술한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)이다.
추출 대상인 무화과 잎/열매의 시료 확보 과정, 추출 매개체로서 70% 에탄올 이용한 무화과 잎/열매 추출물의 획득 방법, 유산균 발효 방법 및 효모 발효 방법은 전술한 바와 같다. 다만, 전술한 바와 달리, 각 시료(샘플)를 vol%를 달리하여 준비하였고, vol%는 발효물 부피/[발효물 부피 +동물 세포 배양 배지의 부피]를 기준으로 한다.
도 21을 참조하면, 0.5 vol% 이하에서 시료 17 내지 19 모두 90% 이상의 세포 생존률이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 도 22를 참조하면, 시료 18이 시료 농도 0.25 vol% 및 0.5 vol%에서 시료 17보다 우수한 항염 성능을 나타내며, 시료 19가 시료 농도 전부에서 시료 17보다 우수한 항염 성능을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 도 23을 참조하면, 시료 18 및 19가 시료 농도 전부에서 시료 17보다 우수한 미백 성능이 나타나는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 무화과 잎/열매 알코올 추출물의 발효물을 필수 성분으로 하고, 통상적으로 화장료 조성물에 배합되는 다른 성분을 포함할 수 있으며, 배합 성분으로서 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유화제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 무화과 잎/열매 알코올 추출물의 발효물의 항염 성능에 기초하여 여드름 완화 내지 치료와 같이 피부 트러블을 케어할 수 있는 제형을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 무화과 잎/열매 알코올 추출물의 발효물의 미백 성능에 기초하여 미백 케어 할 수 있는 제형을 제공할 수 있다.
전술한 피부 트러블 케어용 및/또는 미백 케어용 제형은 스킨로션, 스킨 소프터, 스킨 토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스춰크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
이상에서 대표적인 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상술한 실시예에 대하여 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 그러므로 본 발명의 권리범위는 설명한 실시예에 국한되어 정해져서는 안되며, 후술하는 청구범위뿐만 아니라 청구범위와 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태에 의하여 정해져야 한다.
S100: 무화과 잎/열매를 알코올 추출하여 추출을 획득하는 단계
S200: 추출물을 유산균 또는 효모 발효하여 발효물을 획득하는 단계

Claims (8)

  1. 무화과 잎 및 열매를 70% 알코올을 이용하여 추출물을 획득하는 제1단계; 및
    상기 추출물을 9종의 혼합 유산균을 이용하여 발효하여 발효물을 획득하는 제2단계를 포함하며,
    상기 9종의 혼합 유산균은,
    락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus　plantarum);
    락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus);
    락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei);
    락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei);
    락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum);
    락토바실러스 애씨도필러스(Lactobacillus acidophilus);
    스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles);
    비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum); 및
    비피도박테리움 비피덤(Bfidobacterium bifidum)으로 구성되며,
    상기 70% 알코올은 70% 에탄올이며,
    상기 제2단계는 상기 추출물에 포함되는 루틴을 분해하여 상기 추출물에 포함되는 퀘르세틴의 양을 증가시키는 단계이며,
    상기 발효물은 루틴 및 퀘르세틴을 포함하는 것을 특징으로 하는, 무화과 알코올 추출물의 발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
  2. 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물의 발효물을 포함하되,
    상기 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물의 발효물은 상기 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물에 포함되는 루틴의 양보다 적은 양의 루틴을 포함하며,
    상기 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물의 발효물은 상기 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물에 포함되는 퀘르세틴의 양보다 많은 양의 퀘르세틴을 포함하며,
    상기 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물의 발효물은 9종의 혼합 유산균을 이용하여 상기 무화과 잎 및 열매의 에탄올 추출물을 발효하여 얻어진 것이며,
    상기 9종의 혼합 유산균은,
    락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus　plantarum);
    락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus);
    락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei);
    락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei);
    락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum);
    락토바실러스 애씨도필러스(Lactobacillus acidophilus);
    스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles);
    비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum); 및
    비피도박테리움 비피덤(Bfidobacterium bifidum)으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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