KR102275997B1

KR102275997B1 - 숙주지향치료를 위한 조성물

Info

Publication number: KR102275997B1
Application number: KR1020190141597A
Authority: KR
Inventors: 신성재; 김이한; 이주미
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 주식회사 큐라티스
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2021-07-13
Also published as: KR20210055307A; WO2021091209A1

Abstract

본 발명은 비결핵항산균의 감염질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물의 화학식 1로 표시되는 화합물은 단독으로 사용한 경우에도 숙주 세포, 예를 들면 큰포식세포에 감염된 비결핵항산균의 성장 및 증식을 매우 효과적으로 억제시킬 수 있다. 나아가, 비결핵항산균의 TCA 사이클을 직접 억제하는 기존의 결핵 치료제와는 달리, 큰포식세포의 해당작용(glycolysis 또는 당대사)을 억제하여 항균 활성을 활성화시키기 때문에 기존의 비결핵항산균 감염질환 치료제와 함께 병용하여 사용되는 경우 비결핵항산균의 성장 및 증식 억제에 시너지 효과를 발휘할 수 있다.

Description

숙주지향치료를 위한 조성물{A composition for Host-directed therapy}

본 발명은 비결핵항산균에 대한 숙주지향치료(Host-directed therapy)를 위한 조성물에 관한 것이다.

마이코박테리움 속 균종들은 병원성 정도와 숙주에 감염력에 따라 절대병원성균인 결핵균 및 나병균을 포함하는 결핵균 그룹과, 이를 제외한 기회감염성 균종들인 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM)의 두 그룹으로 구분된다.

상기 비결핵항산균은 자연계에 널리 분포하며 균종에 따라 질환을 일으키는 발병력이 달라, M. kansasii, M. avium complex, M. abscessus 등은 상대적으로 발병력이 크고, M. fortuitum은 상대적으로 발병력이 낮다. 비결핵항산균으로 인한 질환은 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증, 파종성 질환 등 4가지 특징적인 임상 증후를 나타낸다.

비결핵항산균에 의해 유발된 폐질환에 대한 보고는 2000년 이후 증가하고 있으며, 대부분의 선진국에서 M. avium complex에 의한 폐질환이 현재 가장 많이 보고되고 있다. 또한 외국에서는 상대적으로 드물지만 국내에서는 두번째로 관찰되는 M. abscessus가 원인균으로 보고되고 있다. 특히 한국에서는 M. avium complex와 M. abscessus(또는 Mycobacterium abscessus complex)에 의해 다수의 환자가 발생되는 것으로 보고되고 있다. 상기 비결핵항산균의 감염에 의해 유발되는 폐 질환은 중년 이상의 비흡연자 여성에서 흔히 발생되며, 기침, 발열, 객혈 및 객담과 같은 증상이 나타난다.

비결핵항산균에 의해 유발된 폐질환 환자의 경우 치료를 위하여, ATS/IDSA와 BTS 지침에 따라 결핵 치료제인 리팜피신(rifampicin; RIF)과, 마크롤리드(macrolide)계열의 클라리트로마이신(clarithromycin; CLR) 또는 아지트로마이신(azithromycin; AZM)에 에탐부톨(ethambutol; EMB)을 병용하여 투여하는 방식으로 치료하고 있다. 그러나, 이와 같은 항생제들의 효과에 대해서는 명확하게 알려진 바가 없으며, 다양한 연구 분야에서 새로운 항생제 개발을 위한 노력이 진행되고 있는 실정이다.
(특허문헌 1) KR10-2018-0130340 A

본 발명의 목적은 비결핵항산균 감염질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구현 예에서는 비결핵항산균 감염질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함한다:

[화학식 1]

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 C1 내지 C9인 알킬기이다.

본 발명의 상기 "알킬기"는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 포화 1가 탄화수소 라디칼을 의미하며, 상기 알킬은 본 발명에 기재되는 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되거나, 치환되지 않을 수 있다. 본 발명의 상기 알킬기는 탄소수는 1 내지 9인 것으로서, 예를 들면 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, t-부틸기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, 또는 헥실기, 헵틸기 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 C1 내지 C3인 알킬기일 수 있고, 더욱 바람직하게는 메틸기 또는 에틸기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물 중 어느 하나인 것일 수 있다:

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명의 상기 조성물은 숙주의 면역세포, 특히 큰포식세포에 작용하여 기존의 TCA 사이클 억제가 아닌 숙주 지향 치료법(Host-directed therapies; HDTs)으로서 사용되어, 단독으로 사용될 경우뿐만 아니라 기존의 치료제와 병용하여 사용하는 경우 치료에 시너지 효과가 발휘되도록 할 수 있다.

본 발명의 상기 "숙주 지향 치료법"이란, 전통적인 항생제와 같이 병원체에 직접적으로 작용하는 것이 아닌, 병원체에 대하여 숙주-매개 반응을 통해 작용하는 치료법을 의미한다. 이와 같은 숙주 지향 치료법은 병원체가 존재하는 숙주의 환경, 예를 들면 대사반응 등을 변화시킴으로써 병원체가 숙주 내 감염되어 유지되거나, 성장하는데 불리하도록 하는 방법으로서, 면역 반응을 조절하거나, 숙주 세포의 대사반응을 조절하는 등의 작용을 통해 그 기능이 발휘될 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 숙주 세포, 예를 들면 큰포식세포에 감염된 비결핵항산균의 성장 및 증식을 효과적으로 억제할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 리팜피신(rifamficin), 리파펜틴(rifapentine), 아이소니아지드(isoniazid), 피라진아마이드(pyrazinamide), 에탐부톨(ethambutol), 스트렙토마이신(streptomycin), 플로퀴노론(fluoroquinolone), 카나마이신(kanamycin), 시클로세린 (Cycloserine), 프로치온 아미드(Prothionamide), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 리파부틴(Rifabutin), 카프레오마이신(Capeomycin), 아미카신(amikacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 프로티오나마이드(protionamide), 에티오나마이드(ethionamide), 사이클로세린(cycloserine), 티오아세타존(thioacetazone), 클로파지마인(clofazimine), 아목실린/클라불라네이트(amoxicillin/clavulanate), 다이아미노다이페닐설폰의 유도체(derivative of dianomidiphenylsulphone), 클라리트로마이신(clarithromycin), 아지트로마이신(azithromycin) 및 리네졸리드(Linezolid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 리팜피신(rifamficin), 아이소니아지드(isoniazid) 또는 에탐부톨(ethambutol) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 기존에 사용되고 있는 상기 림팜피신, 리파펜틴 등과 같은 치료제와 병용하여 사용되었을 때, 큰포식세포의 해당작용(glycolysis 또는 당대사)을 매우 효과적으로 억제함으로써 큰포식세포의 항균 작용을 활성화시켜 비결핵항산균의 사멸 또는 성장 억제에 시너지 효과가 발휘되도록 할 수 있다.

본 발명의 상기 "비결핵항산균"이란, 결핵균종(Mycobacterium tuberculousis complex)과 나병균(M. leprae)를 제외한 다른 모든 마이코박테리아를 지칭하는 것으로서, 예를 들면, 마이코박테리움 아비늄(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 인트라셀룰레어(Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 폴투이툼(Mycobacterium fortuitum) 및 마이코박테리움 압세수스 컴플렉스(Mycobacterium abscessus complex) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 "마이코박테리움 압세수스 컴플렉스(Mycobacterium abscessus complex)"는 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria; NTM) 감염 폐질환을 일으키는 가장 흔한 신속성장 원인균으로, 마이코박테리움 압세수스 서브스페시스 압세수스(Mycobacterium abscessus subsp . abscessus), 마이코박테리움 압세수스 서브스페시스 마실리엔시스(Mycobacterium abscessus subsp . massiliense), 또는 마이코박테리움 압세수스 서브스페시스 볼레티(Mycobacterium abscessus subsp. bolletii)를 포함할 수 있고, 바람직하게는 마이코박테리움 압세수스 서브스페시스 마실리엔시스(Mycobacterium abscessus subsp . massiliense) 및 마이코박테리움 압세수스 서브스페시스 볼레티(Mycobacterium abscessus subsp . bolletii)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 "예방"은 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 비결핵항산균 감염질환으로 인해 발생한 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 모두 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 "개선" 및 "치료"는 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 비결핵항산균 감염질환으로 인해 발생한 증상이 호전되거나 이롭게 되는 행위라면 제한없이 모두 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수 회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명의 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다.

본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 상기 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물의 유효성분이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 포함하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 구체적으로, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등일 수 있다.

본 발명의 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 더 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 식품 조성물에 포함되는 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 핵심적인 요소에 해당하지 아니하지만, 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물의 화학식 1로 표시되는 화합물은 단독으로 사용한 경우에도 숙주세포, 예를 들면 큰포식세포에 감염된 비결핵항산균의 성장 및 증식을 매우 효과적으로 억제시킬 수 있다. 나아가, 비결핵항산균의 TCA 사이클을 직접 억제하는 기존의 결핵 치료제와는 달리, 큰포식세포의 해당작용(glycolysis 또는 당대사)을 억제하여 항균 활성을 활성화시키기 때문에 기존의 비결핵항산균 감염질환 치료제와 함께 병용하여 사용되는 경우 비결핵항산균의 성장 및 증식 억제에 시너지 효과를 발휘할 수 있다.

도 1의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 큰포식세포에서 디메틸 말로네이트(Dimethyl malonate; DMM) 또는 디에틸 말로네이트(Diethyl malonate; DEM)를 처리하였을 때 비결핵항산균의 성장 억제 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2 및 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 큰포식세포에서 치료제로 사용되는 클라리트로마이신(CLR), 리팜피신(RIF) 및 에탐부톨(EMB)와 DMM을 병용하여 처리하였을 때 다양한 비결핵항산균의 성장 억제 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 내지 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 비결핵항산균이 감염된 큰포식세포에서 DMM에 의한 OCR(Oxygen consumption rate)과 ECAR(Extracellular Acidification Rate) 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 비결핵항산균이 감염된 마우스에서 DMM 단독 또는 비결핵항산균 치료제와 DMM을 병용하여 처리하고 조직에서의 염증 억제 및 균주의 성장 억제 정도를 확인하기 위한 실험 프로세스를 모식도로 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 비결핵항산균이 감염된 마우스에서 DMM 단독 또는 클라리트로마이신과 DMM을 병용하여 처리하고, 조직에서의 염증 억제 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11의 A 내지 C는 본 발명의 일 실시예에 따른 비결핵항산균이 감염된 마우스에서 DMM 단독 또는 클라리트로마이신과 DMM을 병용하여 처리하고, 비결핵항산균의 성장 억제 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 비결핵항산균이 감염된 마우스에서 DMM 단독 또는 클라리트로마이신과 DMM을 병용하여 처리하고 조직에서의 염증 억제 및 비결핵항산균의 성장 억제 정도를 확인하기 위한 실험 프로세스를 모식도로 나타낸 것이다.
도 13 및 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 비결핵항산균이 감염된 마우스에서 DMM 단독 또는 클라리트로마이신과 DMM을 병용하여 처리하고, 조직에서의 염증 억제 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 비결핵항산균이 감염된 마우스에서 DMM 단독 또는 클라리트로마이신과 DMM을 병용하여 처리하고, 비결핵항산균의 성장 억제 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[준비예 1] 골수유래 큰포식세포(Macrophage) 분화 방법

마우스의 골수로부터 골수세포를 분리하였다. 그런 다음, 10% 우태아혈청(Biowest, 프랑스)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(Biowest, 프랑스)이 포함된 글루코스 함량이 높은 DMEM(Biowest, 프랑스) 배양 배지에, 10%의 L929 세포주 배양액을 넣어 분화 배지를 제조하였다. 그런 다음, 10 ml의 상기 분화 배지를 90×15 mm 페트리접시(SPL life science, 한국)에 넣고, 5% CO₂ 및 37 ℃의 조건의 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 그런 다음, 10 ml의 상기 분화 배지를 추가로 상기 페트리접시에 넣은 뒤 6 또는 7일 동안 더 배양하는 과정을 통해 큰포식세포를 얻었다. 추후 실시예에서 사용될 때에는, 트립신-EDTA(Biowest, 프랑스)를 이용하여 상기 큰포식세포를 분리한 뒤, 48웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 1.5 × 10⁵ 세포의 수로 분주하고, 24시간 동안 배양하는 과정을 통해 충분히 플레이트에 상기 큰포식세포가 부착될 수 있도록 하였다.

[준비예 2] 균주 배양을 위한 7H10 고체 배지 준비 방법

1 L 크기의 삼각 플라스크 안에 9.5 g의 Difco^TM Middlebrook 7H10 아가(BD bioscience, 미국) 가루를 넣고, 증류수 450 mL을 넣은 뒤에 충분히 섞어주었다. 그런 다음, 121 ℃의 고압증기멸균기를 이용하여 15분 동안 멸균하고, 60 ℃가 될때까지 충분히 식힌 뒤, 50 mL OADC (Oleic Acid + Albumin + Dextrose + Catalase; BD bioscience, 미국)를 추가하고 23 mL씩 90 × 15 mm 페트리접시 (SPL life science, 한국)에 붓고, 상온에서 하루 동안 방치하여 충분히 굳힌 뒤 추후 실험에 사용될 때까지 냉장보관 하였다.

[실시예 1] 큰포식세포 활성화에 의한 비결핵항산균 성장 억제 효과 확인

상기 제조예 1에서 48웰 플레이트에 부착된 큰포식세포의 각 웰에 1:3의 MOI(Multiplicity of infection)로 M. 아비움 104(Mycobacterium avium hominissuis 104 strain (M. avium 104))을 넣고 4시간 동안 배양하고, 상기 M. 아비움이 포함된 배양액을 제거하였다. 그런 다음, 0.09, 0.18, 0.38, 0.75, 1.5 또는 3 mM/ml의 디메틸 말로네이트(dimethyl malonate, 이하, 'DMM'이라 함; Sigma-Aldrich, 미국) 또는 1.5 mM/ml의 디에틸 말로네이트(diethyl malonate, 이하, 'DEM'이라 함; Sigma-Aldrich, 미국)가 포함된 상기 플레이트의 상기 제조예 1의 분화 배지를 각각의 웰에 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 여기서, 대조군으로는 상기 DMM 또는 DEM이 포함되지 않은 분화 배지만을 사용하였다.

배양이 완료된 후, 상기 플레이트의 각 웰을 1×PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 씻어준 뒤, 0.05% 트리톤 X-100을 상기 각 웰에 200 ㎕씩 넣고 10분 동안 배양하여 상기 큰포식세포의 막을 충분히 용해시켰다. 이후, 큰포식세포로부터 방출된 용해물을 1/100 또는 1/1000의 배율로 희석하고, 상기 희석된 용해물을 상기 준비예 2의 7H10 고체 배지의 페트리접시에 50 ㎕씩 분주한 뒤 미생물 인큐베이터에서 10일 동안 배양하였다. 배양이 완료된 뒤, 페트리접시에 발생된 박테리아 개수(CFU)를 측정하여, 그 결과를 도 1의 A 및 B에 나타내었다.

도 1의 A 및 B에서 보는 바와 같이, 1.5 mM의 DMM 또는 DEM을 처리하였을 때, 대조군(Ctl)과 비교하여 박테리아(M. 아비움 104)의 성장이 현저하게 감소되었으며, 이와 같은 박테리아(M. 아비움 104)의 성장 억제는 DMM의 농도에 의존적으로 증가되었다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 DMM 및 DEM은 큰포식세포에 감염된 비결핵항산균의 성장 및 증식을 매우 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 2] 병용 투여에 따른 균주 성장 억제 효과 확인(1)

기존의 치료제와의 병용 투여에 따른 비결핵항산균의 성장 억제 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 M. 아비움 104가 감염된 큰포식세포에 1.5 mM의 DMM과, 4 ㎍/ml의 클라리트로마이신(clarithromycin; CLR, C2220; TCI, 도쿄), 1 ㎍/ml의 리팜피신(rifamficin; RIF, R3501; Sigma-Aldrich, 미국) 또는 2 ㎍/ml의 에탐부톨(ethambutol; EMB, E4630; Sigma-Aldrich, 미국)를 병용하여 처리한 뒤, 3일 동안 배양하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 페트리접시에 발생된 박테리아 개수(CFU)를 측정하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, DMM을 단독으로 처리한 경우 클라리트로마이신(CLR), 리팜피신(RIF) 및 에탐부톨(EMB) 모두에 비하여 효과적으로 박테리아(M. 아비움 104)의 성장을 억제하였다. 나아가, 상기 클라리트로마이신(CLR), 리팜피신(RIF) 또는 에탐부톨(EMB)에 DMM을 추가로 처리한 경우에는 상기 약물들을 각각 단독으로 처리한 경우와 비교하였을 때, 박테리아(M. 아비움 104)의 성장 억제에 시너지 효과가 발휘되었다.

[실시예 3] 병용 투여에 따른 균주 성장 억제 효과 확인(2)

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 비결핵항산균의 다른 타입의 종인 M. 아비움 101(M. avium 101), M. 인트라셀룰라(M. intracellulare ATCC 13950) 또는 임상 균주(M. 아비움 YU-SM #7, 서울 삼성 병원으로부터 제공받음)을 큰포식세포에 감염시키고, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 병용투여에 따른 시너지 효과를 확인하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 여기서, 병용투여 약물은 클라리트로마이신을 사용하였다.

도 3에서 보는 바와 같이, M. 아비움 101, M. 인트라셀룰라 및 임상균주(M. 아비움 YU-SM #7) 모두에서, DMM 단독 처리에 의해 그 박테리아의 성장이 억제되었으며, 나아가 클라리트로마이신을 병용하여 처리한 경우, DMM을 단독으로 처리한 경우와 비교하여 상기 박테리아들의 성장이 더욱 현저하게 억제되는 시너지 효과가 발휘되는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 DMM 및 DEM은 기존의 치료제와 함께 병용하여 사용되는 경우, 큰포식세포의 해당작용(glycolysis 또는 당대사)을 억제하여 항균 활성을 활성화시켜 비결핵항산균의 성장 및 증식 억제에 시너지 효과를 발휘할 수 있다.

[실시예 4] 큰포식세포의 대사조절 변화 확인

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 M. 아비움 104가 감염된 큰포식세포의 배양액을 5%의 우태아혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체한 뒤, 1.5 mM/ml의 DMM 또는 동일 농도의 DMM과 4 ㎍/ml의 클라리트로마이신(CLR)을 처리하고 5% CO₂ 및 37 ℃의 조건의 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 구체적인 실험군의 설정은 하기 표 1과 같다.

군	감염균	투여 약물
G1	-	비히클(vehicle)
G2	-	4 ㎍/ml의 클라리트로마이신
G3	-	1.5 mM/ml DMM
G4	-	4 ㎍/ml의 클라리트로마이신 및 1.5 mM/ml DMM
G5	M. 아비움 104	비히클(vehicle)
G6	M. 아비움 104	4 ㎍/ml의 클라리트로마이신
G7	M. 아비움 104	1.5 mM/ml DMM
G8	M. 아비움 104	4 ㎍/ml의 클라리트로마이신 및 1.5 mM/ml DMM

그런 다음, 상기 DMEM 배지를 D-글루코스, 소듐 피루베이트(sodium pyruvate) 및 L-글루타민이 포함된 XF 어세이 배양액으로 교체한 뒤, CO₂가 존재하지 않는 37 ℃의 조건의 인큐베이터에서 한시간 동안 배양하였다. 이후, 8 μM의 올리고마이신(Oligomycin), 9 μM의 FCCP 및 10 μM의 로테논(Rotenone)을 XF24 세포 외 플럭스 어세이 키트(Extracellular Flux kit)에 각각 넣고, 분석 장비(Agilent)를 이용하여 OCR(Oxygen consumption rate)과 ECAR(Extracellular Acidification Rate)을 측정하여, 그 결과를 도 4 내지 7에 나타내었다.

도 4 및 도 5에서 보는 바와 같이, M. 아비움 104의 감염에 의해 큰포식세포의 기초 OCR(Basal OCR) 및 최대 OCR(maximal OCR)이 높은 수준으로 증가되었으나 (G1과 비교하였을 때 G5에서), 1.5Mm/ml의 DMM이 처리되었을 때 (G7)에는 M. 아비움 104가 감염되었음에도 불구하고 큰포식세포의 기초 OCR이 80 pMoles/min 정도 감소되었다. 하지만 클라리트로마이신과 병용 처리되었을 때 (G8)에서는 대조군 (G5)과 기초 OCR 및 최대 OCR의 큰 차이가 확인되지 않았다.

도 6 및 도 6에서 보는 바와 같이, M. 아비움 104의 감염에 의해 증가된 큰포식세포의 기초 ECAR(basal ECAR)은 1.5 mM/ml의 DMM이 처리되었을 때(G7) 감소되었다. 나아가, 1.5 mM/ml의 DMM만이 처리된 경우와 비교하여 DMM과 클라리트로마이신을 병용 투여하였을 때(G7과 비교하였을 때 G8에서), 기초 ECAR이 더욱 현저하게 감소되었다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 DMM은 큰포식세포에 감염된 비결핵항산균의 성장 및 증식을 억제할 수 있고, 나아가 다른 치료제와 병용하여 사용되는 경우 큰포식세포의 해당작용(glycolysis 또는 당대사)을 억제하여 항균 효과가 증대됨으로써 비결핵항산균의 성장 및 증식 억제에 현저한 시너지 효과가 발휘되도록 할 수 있다.

[실시예 5] 동물 모델에서의 효과 확인(1)

도 8에 도시된 바와 같이, C57BL/6 마우스에 임상균주(M. avium YU-SM #7)를 공기주입 방식을 통해 주입하고, 하기 표 2에 기재된 대로 비히클(vehicle), 클라리트로마이신 및 DMM을 투여하였다.

군	감염 주수	투여 약물	투여 주수^*
대조군	8주	비히클(vehicle)	-
1군	8주	2 mg/mouse의 클라리트로마이신	4주
2군	8주	1mg/mouse DMM	4주
3군	8주	2 mg/mouse의 클라리트로마이신 및 1mg/mouse DMM	4주
* 약물의 투여는 감염 시작 4주 후부터, 각 군별로 4주 동안 진행하였음.

상기 군들의 마우스의 1/3의 폐 조직을 멸균된 PBS를 이용하여 폐 관류(lung perfusion)한 뒤 떼어내고, 4 ~ 10%의 파라포름알데히드에 넣어 고정하였다. 이후, 상기 고정된 조직을 파라핀화하고, 절편을 얻어 통상의 방법에 따라 H&E 염색하여, 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다.또한, 상기 군들의 마우스의 폐, 비장 및 간을 적출하고, 멸균된 PBS에 넣고 충분히 갈아 조직의 용해물을 제조하였다. 상기 조직의 용해물을 1/100, 1/1000 또는 1/10000의 배율로 희석하여 희석된 용해물을 상기 준비예 2의 7H10 고체 배지의 페트리접시에 50 ㎕씩 분주한 뒤 미생물 인큐베이터에서 10일 동안 배양하였다. 배양이 완료된 뒤, 페트리접시에 발생된 박테리아 개수(CFU)를 측정하여, 그 결과를 도 11의 A 내지 C에 나타내었다.

도 9 및 10에서 보는 바와 같이, 대조군(G1)과 비교하여, 클라리트로마이신만이 처리된 1군(G2), DMM이 단독으로 처리된 2군(G3) 및 클라리트로마이신과 DMM이 병용하여 처리된 3군(G4)에서 폐에 발생된 염증이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다. 특히, 상기 3군에서는 다른 대조군, 1군 및 2군과 달리 폐에 발생된 염증이 더욱 현저하게 억제되었다.

도 11의 A 내지 C에서 보는 바와 같이, 대조군(G1)과 비교하였을 때, 1군(G2) 및 3군(G3)의 폐에서 임상균주(M. avium YU-SM #7)의 성장이 억제되었고, 클라리트로마이신과 DMM이 함께 처리된 3군(G4)에서는 1군 및 2군과 비교하여 비결핵항산균의 성장이 더욱 현저하게 억제되었다.

[실시예 6] 동물 모델에서의 효과 확인(2)

도 13에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 폐 조직의 H&E 염색과, 조직의 용해물로부터 생성된 박테리아 개수(CFU)를 측정하여, 그 결과를 도 13 및 14에 나타내었다. 여기서, 하기 표 3에 기재된 대로 비히클(vehicle), 클라리트로마이신 및 DMM을 투여하였다.

군	감염 주수	투여 약물	투여 주수^*
대조군 1	8주	-	-
대조군 2	12주	비히클(vehicle)	-
3군	12주	2 mg/mouse의 클라리트로마이신	4주
4군	12주	2 mg/mouse의 클라리트로마이신 및 1mg/mouse DMM	4주
* 약물의 투여는 감염 시작 8주 후부터, 각 군별로 4주 동안 진행하였음.

도 13 및 14에서 보는 바와 같이, 대조군 1(G1) 및 대조군 2(G2)와 비교하여 3군(G3)에서 일부 염증 억제 효과가 존재하였으나, 클라리트로마이신 및 DMM을 함께 처리한 4군(G4)에서는 상기 대조군 1, 대조군 2 및 3군과 비교하여 더욱 현저한 수준으로 염증을 억제하였다.

나아가, 도 15의 A 및 B에서 보는 바와 같이, 대조군(G1), 대조군 2(G2) 및 3군(G3)와 비교하여, 클라리트로마이신 및 DMM을 함께 처리한 4군(G4)에서 매우 높은 수준으로 비결핵항산균의 성장을 억제하는 것을 확인하였다.

상기 실시예 5 및 6의 결과를 통해 본 발명에 따른 DMM 및 DEM은 그 단독으로서 큰포식세포에 감염된 비결핵항산균의 성장 및 증식을 매우 효과적으로 억제시킬 수 있다. 나아가, 기존의 치료제와 함께 병용하여 투여되는 경우에는 비결핵항산균의 TCA 사이클을 조절하는 것이 아닌, 큰포식세포의 해당작용을 억제하여 항균 활성을 증대시킴으로써 비결핵항산균의 성장 및 증식 억제에 현저한 시너지 효과가 발휘될 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 1]

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 C1 내지 C9인 알킬기이다.
제 1항에 있어서,
상기 알킬기는 C1 내지 C3인 것인, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 큰포식세포의 당 대사 효율을 감소시키는 것인, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 비결핵항산균은 마이코박테리움 아비늄(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 인트라셀룰레어(Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 폴투이툼(Mycobacterium fortuitum) 및 마이코박테리움 압세수스 컴플렉스(Mycobacterium abscessus complex) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 리팜피신(rifamficin), 리파펜틴(rifapentine), 아이소니아지드(isoniazid), 피라진아마이드(pyrazinamide), 에탐부톨(ethambutol), 스트렙토마이신(streptomycin), 플로퀴노론(fluoroquinolone), 카나마이신(kanamycin), 시클로세린 (Cycloserine), 프로치온 아미드(Prothionamide), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 리파부틴(Rifabutin), 카프레오마이신(Capeomycin), 아미카신(amikacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 프로티오나마이드(protionamide), 에티오나마이드(ethionamide), 사이클로세린(cycloserine), 티오아세타존(thioacetazone), 클로파지마인(clofazimine), 아목실린/클라불라네이트(amoxicillin/clavulanate), 클라리트로마이신(clarithromycin), 아지트로마이신(azithromycin) 및 리네졸리드(Linezolid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것인, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 비결핵항산균 감염질환은 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 및 파종성 질환(disseminated disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물:
[화학식 1]

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 C1 내지 C9인 알킬기이다.
제 7항에 있어서,
상기 비결핵항산균은 마이코박테리움 아비늄(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 인트라셀룰레어(Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 폴투이툼(Mycobacterium fortuitum) 및 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 조성물은 리팜피신(rifamficin), 리파펜틴(rifapentine), 아이소니아지드(isoniazid), 피라진아마이드(pyrazinamide), 에탐부톨(ethambutol), 스트렙토마이신(streptomycin), 플로퀴노론(fluoroquinolone), 카나마이신(kanamycin), 시클로세린 (Cycloserine), 프로치온 아미드(Prothionamide), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 리파부틴(Rifabutin), 카프레오마이신(Capeomycin), 아미카신(amikacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 프로티오나마이드(protionamide), 에티오나마이드(ethionamide), 사이클로세린(cycloserine), 티오아세타존(thioacetazone), 클로파지마인(clofazimine), 아목실린/클라불라네이트(amoxicillin/clavulanate), 클라리트로마이신(clarithromycin), 아지트로마이신(azithromycin) 및 리네졸리드(Linezolid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것인, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 비결핵항산균 감염질환은 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 및 파종성 질환(disseminated disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 비결핵항산균 감염질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.