KR102272717B1 - 쿼세틴 및 티몰을 이용한 꿀벌응애 구제용 조성물 - Google Patents

쿼세틴 및 티몰을 이용한 꿀벌응애 구제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쿼세틴 및 티몰을 유효성분으로 포함하는 꿀벌응애 구제용 조성물, 이의 제조방법 및 꿀벌응애의 구제방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 비교적 경제적으로 대량생산이 가능하고, 벌들에게는 독성이 적어 안전할 뿐만 아니라 양봉농가의 가장 고질적인 해충으로 알려진 꿀벌응애가 내성을 가지고 있지 않아 방제효과가 우수하므로 꿀벌응애의 구제용으로 유용하게 이용될 수 있다. 이에 따라, 양봉농가의 생산성 향상에 기여함과 동시에 천연물로 조성되어 있어 양봉농가의 건강 및 양봉산물의 안전성을 확보하는데 기여할 수 있다.

Description

쿼세틴 및 티몰을 이용한 꿀벌응애 구제용 조성물{Composition for controlling Varroa destructor having Quercetin and Thymol}
본 발명은 쿼세틴 및 티몰을 이용한 꿀벌응애 구제용 조성물, 이의 제조방법 및 꿀벌응애의 구제방법에 관한 것이다.
양봉산업의 지속적인 발전을 위해서는 꿀벌의 질병인 세균, 바이러스, 곰팡이, 기생충 등으로부터 꿀벌을 보호하는 것이 중요하고, 특히 꿀벌응애(진드기) 등의 해충으로부터 꿀벌을 보호하는 것이 매우 중요하다.
꿀벌응애는 원래 동남아 지역에서 동양종 꿀벌의 외부 기생충 이었으나, 인간의 활동에 의한 봉군의 이동으로 인해 서양종 꿀벌 지역으로 옮겨졌고, 전 세계로 분포, 확산되었다. 꿀벌응애가 어떤 지역에 침입하고 몇 년에 걸쳐 정착을 한다면 이것을 완전히 없애는 것은 거의 불가능하다는 것이 경험적으로 밝혀져 있다. 그러므로 꿀벌응애의 감염 경로 및 생활사를 이해하고 그 밀도를 조절함으로써 경제적인 손실을 최소화하는 작업이 필요하다.
꿀벌응애의 암컷은 꿀벌의 유충, 번데기 및 성충벌에 기생하여 림프혈을 흡입하여 소위 진드기병을 유발한다. 감염된 꿀벌 성충의 무게는 정상적인 것보다 7.1~ 30.4%까지 감소하며, 기생이 심한 경우에는 불구벌이 되거나 발육이 정지되기도 한다. 꿀벌 번데기의 경우에도 꿀벌응애의 기생(또는 감염)이 심한 경우 10%의 체중감소를 보인다. 심한 경우에는 다리의 불구 또는 번데기가 죽게 되기도 한다(De Jong 등, 1982; Schneider 등, 1987). 더 큰 피해는 봉세 약화로 말미암아 채밀 성적이 크게 떨어져 채밀량이 30~46% 가량 감소하는 결과를 나타낸다. 진드기 피해를 입는 양봉농가는 한 해 평균 2만여 곳에 이르고 추산되는 피해액은 해마다 증가하고 있다.
꿀벌 유충 수의 3% 정도가 진드기에 감염됐을 때는 방역 약품을 사용해야 피해를 가장 줄일 수 있다.
국내에는 이미 전국적으로 만연한 상태여서 큰 피해를 주고 있으며, 설문조사결과 절반이상의 농가에서 이 꿀벌응애에 의한 직접적인 피해가 30% 이상이라고 보고되고 있다. 그동안 국내에서는 벌의 생육 및 양봉농가에 큰 피해를 끼치는 꿀벌응애에 대한 방제를 위해 주로 유기합성 살충제들을 이용하여 필요 이상의 방제를 하여 왔고, 이 때문에 국내 서식 꿀벌응애들이 기존의 약제에 대한 강한 내성을 보이는 문제점도 발생하고 있다.
구체적으로, 꿀벌응애의 방제를 위한 기존 사용 방법으로는 현재 플루발리네이트, 플루메트린, 아미트라즈, 브롬프로피레이트 등 약제를 이용한 방제를 주로 이용하고 있으며, 처리방법으로는 훈연, 분무, 급이, 접촉 등이 있다.
약제의 훈연 처리시에는 약제의 독성으로 인한 중독의 위험이 있어서 훈연연기를 맡지 않게 조심하여야 하며, 급이 시에는 약제가 벌꿀에 잔류될 가능성이 더욱 높으므로 각별한 주의가 필요하다. 현재 가장 많이 사용되고 있는 플루바리네이트, 플루메트린을 이용한 접촉용 스트립 형태의 약제는 기온이 떨어지는 시기에는 효율성이 떨어지며 벌집에 직접적 접촉은 반드시 피해야 한다.
현재 우리나라에서 가장 많이 사용하고 있는 왕스, 마브릭, 만패, 아피스탄 등도 모두 합성 플루바리네이트를 원제로 하고 있으나, 그 방제 효과가 떨어지는 문제점이 있다. 이는 이들 약제를 연속적으로 사용함으로써 꿀벌응애에 내성을 갖게 하였음이 그 원인이다. 이미 대다수 양봉가들이 현재 사용하고 있는 약제의 약효에 대해 의문점을 가지고 있는데, 그 이유는 이미 오랫동안 사용해온 탓에 유럽의 경우처럼 저항성이 상당한 수준에 달했기 때문으로 볼 수 있다.
현재 꿀벌응애에 의한 피해는 전국적으로 지역에 관계없이 지속적으로 발생하고 있고 효율적인 방제효과를 얻지 못하고 있어, 친환경적이면서 내성이 없는 새로운 약제의 개발 및 도입이 절실히 필요하다.
KR 10-1384515 B KR 10-0340016 B
본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 내성이 없고 방제효과가 우수한 꿀벌응애 구제용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 조성물을 이용한 꿀벌응애의 구제방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 쿼세틴(Quercetin) 및 티몰(Thymol)을 유효성분으로 포함하는 꿀벌응애 구제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 쿼세틴(Quercetin)을 0.01 내지 5 중량%; 및 티몰(Thymol)을 0.01 내지 5 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물에서 티몰은 상기 쿼세틴 1 중량부에 대하여 0.1 내지 10 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 디에틸렌글리콜모노에틸에테르(Diethyleneglycolmonoethylether)로 이루어진 용해제; 및 폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)의 계면활성제;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 오일을 더 포함하되, 상기 오일은 중쇄지방산 오일, 올레산의 모노-글리세라이드, 올레산의 디-글리세라이드, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 에틸 리놀리에이트, 에틸 올리에이트, 옥수수유, 올리브유, 대두유, 어유(fish oil), 스쿠알렌, 스쿠알란, 액상 올레산, 액상 리놀레산 및 토코페릴 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 용해제는 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 계면활성제는 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 20 내지 40 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene sorbitan monostearate(Tween 60)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미에이트(Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate(tween40)) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene sorbitan monolaurate(tween 20))로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 쿼세틴 0.1 내지 5 중량% 및 티몰 0.1 내지 5 중량%를 포함하고, 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부의 디에틸렌글리콜모노에틸에테르; 및 20 내지 40 중량부의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80))를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 쿼세틴 0.1 내지 5 중량% 및 티몰 0.1 내지 5 중량%를 포함하고, 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부의 디에틸렌글리콜모노에틸에테르; 20 내지 40 중량부의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)); 및 5 내지 20 중량부의 중쇄지방산 오일;을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 꿀벌응애 구제용 조성물은 물과 혼합시 자가유화(self-emulsification)하여 평균 입자 크기가 50 nm 이하인 나노에멀젼을 형성할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 쿼세틴(Quercetin); 티몰(Thymol); 디에틸렌글리콜모노에틸에테르로 이루어진 용해제;를 40 내지 70 ℃의 온도에서 혼합하는 단계; 및 (2) 상기 (1) 단계의 혼합물에 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene sorbitan monostearate(Tween 60)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미에이트(Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate(tween40)) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene sorbitan monolaurate(tween 20))로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 계면활성제를 혼합하는 단계;를 포함하는 꿀벌응애 구제용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 꿀벌응애 구제용 조성물을 10 내지 100 중량 배의 물과 혼합하여 나노에멀젼이 형성되도록 하는 단계; 및 상기 나노에멀젼을 꿀벌응애에 감염된 벌에 분무하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 비교적 경제적으로 대량생산이 가능하고, 벌들에게는 독성이 적어 안전할 뿐만 아니라 양봉농가의 가장 고질적인 해충으로 알려진 꿀벌응애가 내성을 가지고 있지 않아 방제효과가 우수하므로 꿀벌응애의 구제용으로 유용하게 이용될 수 있다. 이에 따라, 양봉농가의 생산성 향상에 기여함과 동시에 천연물로 조성되어 있어 양봉농가의 건강 및 양봉산물의 안전성을 확보하는데 기여할 수 있다.
도 1은 꿀벌의 성충에 기생하고 있는 꿀벌응애들의 모습을 나타내는 사진이다.
도 2는 꿀벌의 유충들에 기생하고 있는 꿀벌응애들의 모습을 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
양봉농가에서 꿀벌을 사육하는 과정에서 가장 중요한 것은 꿀벌의 질병 관리 및 사양관리의 편리성을 통한 고품질의 양봉산물을 안정적으로 생산하는 것이다.
이렇듯 양봉농가들이 꿀벌을 사육하는 과정에서 주변 환경의 변화를 비롯한 꿀벌의 병해충에 의한 꿀벌의 피해가 발생하여 양봉농가의 생산성에 악영향을 준다
이들 병해충 중에서 가장 심각한 피해를 유발하며, 가장 방제하기가 어려운 것으로 꿀벌응애를 들 수 있다.
본 발명은 쿼세틴(Quercetin) 및 티몰(Thymol)을 유효성분으로 포함하는 꿀벌응애 구제용 조성물을 제공한다.
상기 쿼세틴(quercetin, 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone)은 주요 플라보노이드의 일종으로, 4,000 종에 가까운 플라보노이드 성분 중 가장 대표적인 물질이다. 퀘세틴은 적포도주나 양파, 녹차, 사과, 베리, 배추 등의 식품에 풍부하며, 은행잎, 세인트 존스 워트, 아메리칸 엘더에도 다량 함유되어 있다고 알려져 있다. 또한 쿼세틴은 혈관보호제로 많은 나라에서 사용되고 있고, 수많은 종합 비타민제와 한약의 재료로 사용되고 있는 물질이다.
본 발명에서 쿼세틴은 꿀벌응애 방제효과에 대해 특별히 높은 살충율을 나타낸다.
이러한 쿼세틴은 본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물에 0.01 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1.0 중량%, 가장 바람직하게는 0.02 내지 0.5 중량%로 포함될 수 있다.
이때, 쿼세틴의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 꿀벌응애에 대한 구제 효과가 미미할 우려가 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 쿼세틴의 난용성으로 인해 현탁 내지는 석출되는 쿼세틴이 있을 수 있어 균질한 살포가 불가능해질 수 있다.
또한 티몰(Thymol)은 천연으로는 사향초유에 함유되어 있고, 또 꿀풀과 식물 정유(精油)의 주성분으로 되어 있다.
티몰은 멘톨의 합성원료, 방부제 또는 살균제로서 치약 또는 비누 등에 사용되는 외에, 분석시약으로서 타이타늄 또는 암모니아 등의 분석에 사용되며, 또한 의약품으로서 구충제 등에도 사용되고 있다.
본 발명의 조성물에서 티몰은 꿀벌응애 방제효과에 대해 특별히 속효성을 나타낸다.
이러한 티몰은 본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물에 0.01 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1.0 중량%, 가장 바람직하게는 0.02 내지 0.5 중량%로 포함될 수 있다.
상기 티몰의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 쿼세틴과의 상호작용에 의해 꿀벌응애에 대한 구제 효과가 미미할 우려가 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 용해도가 급격하게 낮아져 보관 중 상분리가 일어나거나 함량이 저하되는 등 안정성이 불량해질 수 있다.
또한, 상기 티몰은 상기 쿼세틴 1 중량부에 대하여 0.1 내지 10 중량부, 바람직하게는 0.2 내지 8 중량부, 더욱 바람직하게는 0.25 내지 6 중량부, 가장 바람직하게는 1 내지 5 중량부로 포함될 수 있다. 특히, 쿼세틴 및 티몰의 비율이 1 : 1 내지 5 범위 이내인 경우에는 빠른 시간 내에 현저히 높은 꿀벌응애 퇴치 효과를 나타내는 것을 구체적 실험을 통해 확인하였다.
상기 쿼세틴에 대한 티몰의 중량비가 상기 범위 미만인 경우에는 꿀벌진드기 퇴치의 상호 상가 효과 및 시너지 효과, 예를 들면 티몰과의 시너지 효과로 인한 속효성이 미미해질 우려가 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 유효성분 중 하나인 쿼세틴 및 티몰은 물에 잘 녹지 않는 성질로 인해 분무 방식으로 이용하기 위한 액상 제형으로 제조하기가 쉽지 않다. 이를 극복하기 위해 자가미세유화 약물전달시스템(SMEDDS; Self-microemulsifying drug delivery system)을 응용하게 되었다.
본 발명에서 "자가미세유화 약물전달시스템"의 기본적인 원리는, 상기 시스템이 물과 접촉시, 이는 완만한 기계적인 교반 하에서 수중유 미세유화물을 자동적으로 형성한다는 점이다.
본 발명자들은 쿼세틴의 난용성을 개선하고 꿀벌응애에 대한 침투력 및 살충력을 증가시키기 위한 자가미세유화 약물전달시스템을 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, 쿼세틴 및 티몰에 특정 용해제 및 계면활성제를 혼합하여 농축액을 구성하면, 물과 혼합하여 희석시 자가유화됨으로써 쿼세틴 및 티몰이 수용액상에서 나노에멀젼 상태로 존재하게 되고, 유효성분 입자 크기가 최소화되므로 가용화가 크게 향상되어 꿀벌응애에 대한 침투율, 살충력 및 속효성이 크게 증대된다는 것을 확인하였다.
이에, 바람직한 일 양태로서, 본 발명은 쿼세틴 및 티몰을 유효성분으로 하며, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르(Diethyleneglycolmonoethylether)로 이루어진 용해제; 및 폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)의 계면활성제;를 더 포함하여 이루어진 꿀벌응애 구제용 조성물을 제공할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 조성물에 디에틸렌글리콜모노에틸에테르로 이루어진 용해제 및 폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)의 계면활성제를 더 포함하는 경우 유효성분인 쿼세틴 및 티몰이 유상부를 이루어 별도의 오일 성분을 추가하지 않아도 자가미세유화 약물전달시스템을 이룰 수 있게 된다. 특히, 하기 실시예 또는 비교예 등에는 명시적으로 기재하지는 않았지만, 본 발명의 조성물은 별도의 오일 성분이 없이 용해제로서 상기 디에틸렌글리콜모노에틸에테르가 아닌 다른 화합물을 포함하는 경우에는 물과 혼합시 불안정한 자가미세유화 약물전달시스템을 이루게 되며, 별도의 오일 성분이 포함된 경우에야 안정한 자가미세유화 약물전달시스템을 이루는 것을 구체적인 실험을 통해 확인하였다.
본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물은 쿼세틴 및 티몰의 용해제로서 디에틸렌글리콜모노에틸에테르(Diethyleneglycolmonoethylether)를 포함할 수 있다.
상기 용해제는 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부로 포함될 수 있다.
상기 용해제의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 용해되지 않는 쿼세틴 또는 티몰로 인해 제형 안정성이 낮아질 우려가 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 유효성분인 쿼세틴 또는 티몰의 용해에는 문제가 없으나, 용해제의 과량 사용에 따른 추가적인 계면활성제의 양이 증가하여 생산원가가 높아지고 주성분의 농도가 낮아져서 포장용기의 거대화에 따른 물류비용 증대, 보관의 불편함 등이 추가적으로 발생할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 쿼세틴 및 티몰과 같은 오일 성분과 상기 용해제를 안정하게 유화시키기 위한 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)의 계면활성제를 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene sorbitan monostearate(Tween 60)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미에이트(Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate(tween40)) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene sorbitan monolaurate(tween 20))로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 계면활성제는 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 20 내지 40 중량부로 포함될 수 있다.
상기 계면활성제의 함량이 상기 하한치 미만으로 포함되는 경우에는 나노에멀젼이 형성되지 못하며, 이로 인해 봉군에 제품 적용시 정확한 용법용량이 불가능해진다. 또한 상기 상한치를 초과하여 포함되는 경우에는 불필요하게 부형제를 과다하게 사용하여 주성분의 농도가 낮아지며, 제품의 부피가 커져서 보관 및 운송에 부적절하여 바람직하지 않다.
한편, 상기한 본 발명의 조성물은 오일을 더 포함할 수 있다. 오일은 상기 용해제(또는 공계면활성제) 및 계면활성제와 잘 혼화되고, 수중에서 유화되어 안정한 나노에멀젼을 형성시킬 수 있으며, 유효성분인 쿼세틴 및 티몰을 포함한 조성 화합물을 더욱 잘 녹일 수 있게 된다.
구체적으로 예를 들면, 상기 오일은 (a) 지방산 트리글리세라이드류, 바람직하게는 중급 지방산 트리글리세라이드, 예를 들면 분별된 코코넛 오일(상품명: 미글리올812N, 제조회사: Huls), (b) 모노-, 디- 또는 모노/디-글리세라이드류, 바람직하게는 올레산의 모노- 또는 디-글리세라이드류, (c) 지방산과 일가 알칸올의 에스테르 화합물, 특히 탄소수 8 내지 20개의 지방산과 탄소수 2 내지 3개의 일가 알칸올의 에스테르 화합물, 예를 들면 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 에틸 리놀리에이트 또는 에틸 올리에이트, (d) 천연 식물성 또는 동물성 오일, 예를 들면 옥수수유, 올리브유, 대두유(soybean oil) 또는 어유(fish oil), (e) 탄화수소류, 예를 들면 스쿠알렌 또는 스쿠알란, (f) 유리지방산류, 바람직하게는 액상의 올레산 또는 리놀레산 등, (g) 토코페롤류, 예를 들면 dl-a-토코페릴 아세테이트(dl-a-Tocopheryl acetate) 등이 단독으로 또는 혼합되어 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 상기 오일로서 중쇄지방산 오일, 올레산의 모노-글리세라이드, 올레산의 디-글리세라이드, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 에틸 리놀리에이트, 에틸 올리에이트, 옥수수유, 올리브유, 대두유, 어유(fish oil), 스쿠알렌, 스쿠알란, 액상 올레산, 액상 리놀레산 및 토코페릴 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 5 내지 20 중량부, 보다 바람직하게는 5 내지 15 중량부, 가장 바람직하게는 5 내지 10 중량부일 수 있다. 상기 오일의 함량이 상기 범위의 상한치를 초과하면 에멀젼 입자 크기가 기하급수적으로 증가하며 안정성에서 매우 불안정해져 나노에멀젼이 생성되지 않는 문제점이 발생할 수 있다.
바람직한 일례로, 본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물은 쿼세틴 0.1 내지 5 중량% 및 티몰 0.1 내지 5 중량%를 포함하고, 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부의 디에틸렌글리콜모노에틸에테르; 및 20 내지 40 중량부의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80))를 포함하는 것일 수 있다.
바람직한 다른 일례로, 본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물은 쿼세틴 0.1 내지 5 중량% 및 티몰 0.1 내지 5 중량%를 포함하고, 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부의 디에틸렌글리콜모노에틸에테르; 20 내지 40 중량부의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)); 및 5 내지 20 중량부의 중쇄지방산 오일;을 포함하는 것일 수 있다.
한편, 본 발명자들은 오일로는 중쇄지방산 오일, 용해제로는 디에틸렌글리콜모노에틸에테르 및 계면활성제로는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트가 쿼세틴 및 티몰에 대해 높은 용해도를 나타냄을 구체적인 실험을 통해 확인하였다.
본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물은 사용 직전에 10 내지 100 중량 배의 물과 혼합하여 희석한 후 이용할 수 있으며, 이러한 경우 평균 입자 크기가 50 nm 이하인 나노에멀젼이 형성될 수 있다. 이와 같이 본 발명의 유효성분인 쿼세틴 및 티몰이 수용액상에서 나노에멀젼 상태로 존재하게 되면 가용성이 크게 향상되어 꿀벌응애에 대한 침투율, 살충력 및 속효성이 크게 증대될 수 있다.
즉, 쿼세틴 및 티몰을 유효성분으로 포함하고, 자가미세유화 약물전달시스템을 이용하는 본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물은 물과 혼합되기 쉽고, 부착 및 점착능이 우수하며, 꿀벌응애에 감염된 벌에게 분사 또는 분무 후 쉽게 휘발되지 않아 약효가 우수하다.
본 발명은 또한, (1) 쿼세틴(Quercetin); 티몰(Thymol); 및 디에틸렌글리콜모노에틸에테르로 이루어진 용해제;를 40 내지 70 ℃의 온도에서 혼합하는 단계; 및 (2) 상기 (1) 단계의 혼합물에 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene sorbitan monostearate(Tween 60)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미에이트(Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate(tween40)) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene sorbitan monolaurate(tween 20))로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 계면활성제를 혼합하는 단계;를 포함하는 꿀벌응애 구제용 조성물의 제조방법을 제공한다.
한편, 꿀벌응애(진드기)를 구제하기 위하여 다양한 방법이 개발되어 사용되고 있으며, 대표적인 방법으로는 아래의 네 가지 방법이 있다.
첫 번째, 2월 말에서 4월 말에 이르기까지 일반적인 구제약품을 처리한다. 이는 스트립처리법으로서 벌통 내에 스트립을 처리하여 약이 발산, 승화되도록 함으로써 약이 진드기 몸체에 접촉되어 진드기를 구제하는 방법이다. 두 번째, 훈연처리법으로서 약을 태워서 연기에 의해 진드기를 구제하는 방법이다. 세 번째는, 약품을 뿌려주는 방법으로서 약품을 물에 희석하여 소비 사이에 분무하여 진드기를 구제하는 방법이다. 네 번째는, 약품을 섭취시키는 방법으로서 약품을 설탕물(사양수)에 혼합하여 처리함으로써 진드기를 구제하는 방법이다.
본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물은 특별히 제형 또는 이용 방법이 제한되지는 않으나 상기 방법 중에서 액상 제형으로 제조한 후 분무하는 방법으로 이용하는 것이 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명은 상기 쿼세틴(Quercetin) 및 티몰(Thymol)을 유효성분으로 포함하는 꿀벌응애 구제용 조성물을 10 내지 100 중량 배의 물과 혼합하여 나노에멀젼이 형성되도록 하는 단계; 및 상기 나노에멀젼을 꿀벌응애에 감염된 벌에 분무하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제방법을 제공한다.
본 발명의 꿀벌응애 구제방법은 본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물을 단 1회 분무하는 것만으로도 꿀벌응애에 대한 구제 효과가 우수하다.
상기의 분무는 1일 1회 수행하는 것이 바람직하며, 3일 동안 연속하여 분무하는 것이 더욱 바람직하다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
<실시예>
실시예 및 비교예: 꿀벌응애 구제용 조성물 제조
본 발명의 꿀벌응애 구제용 조성물의 용해제로는 디에틸렌글리콜모노에틸에테르(Diethyleneglycolmonoethylether; Carbitol), 폴리에틸렌글리콜(PEG200) 또는 프로필렌글리콜(PPG)를 이용하여 하기 표 1의 조성대로 꿀벌응애 구제용 조성물을 제조하였다.
또한, 상기 꿀벌응애 구제용 조성물의 계면활성제로는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)) 및 크레모포 EL(Cremophor EL)을 이용하였다.
또한, 오일로는 중쇄지방산 오일 중 하나인 Capmulㄾ MCM(ABITEC Corporation)을 이용하였다.
구체적인 제조방법으로는, 하기 표 1의 조성대로 용해제에 쿼세틴 분말 및 티몰을 용기에 넣고 용해제를 첨가한 다음, 60 ℃로 가열하면서 쿼세틴 및 티몰을 완전히 용해시켰다. 이후, 상기 용액을 상온으로 식힌 후, 계면활성제를 첨가하여 완전히 혼합하였다.
구분(g) 실시예 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
유효성분 쿼세틴 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
티몰 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
오일 Capmul® MCM - - - - - -
용해제 Carbitol 7.8 7.8 - - - -
PEG200 - - 7.8 7.8 - -
PPG - - - - 7.8 7.8
계면
활성제		 Tween80 11.8 - 11.8 - 11.8 -
Cremophor EL - 11.8 - 11.8 - 11.8
총 중량 20 20 20 20 20 20
구분(g) 실시예 1 실시예 2 대조군 비교예 6 비교예 7
유효성분 쿼세틴 0.2 0.2 - 0.4 -
티몰 0.2 0.2 - - 0.4
오일 Capmul® MCM - 5 - - -
용해제 Carbitol 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8
계면활성제 Tween80 11.8 11.8 11.8 11.8 11.8
총 중량 20 25 20 20 20
상기 표 1 및 표 2의 조성대로 제조된 조성물을 사용하고자 할 때에는, 상기 조성물을 10 내지 100 중량 배의 물과 혼합하여 나노에멀젼이 형성되도록 한 후, 꿀벌응애에 감염된 벌에 분무하면 된다.
<실험예>
실험에 이용한 벌의 종류
국내 양봉농가에서 보편적으로 사육 중인 이탈리안 종(Apis melliffera)을 실험에 이용하였다.
실험 봉장 환경
실험에 투입할 벌들의 안정을 위하여 실험 7일 전에 미리 봉군 배치를 완료하였다. 실험 봉군의 수는 25 봉군이었으며, 각각의 벌통마다 봉군번호를 부여하였다. 군 간 벌통과 벌통 사이의 경계를 분명하게 구분하였고, 사봉의 숫자를 파악할 수 있도록 바닥에는 섬유류를 깔아두었다.
시료 처리 방법
각 실험군(대조군, 실시예 및 비교예 1 내지 7)에 대하여 개체수, 소비수 그리고 진드기 오염도가 유사한 봉군들을 각각 3봉군씩 실험장에 준비하였다. 각각의 시료는 봉군을 열고 소비를 취해 앞면 뒷면에 3회 분무하는 방식을 이용하여 처리하였다. 또한, 각각의 시료는 실험 양봉장에 실험용 벌을 배치 완료한 상태에서 안정기를 거친 후 벌들이 모두 귀소하는 해질 무렵에 처리하였다.
실험예 1. 제형의 안정성(Stability test)
실시예 및 각각의 비교예의 조성물을 물로 100배 희석하여 간헐적으로 흔들어 혼합하였다. 상기 혼합 후, 6시간 이상 경과한 다음 particle analyzer를 이용하여 입자 크기를 측정하였다. 그리고, '안정성'은 제조 직후와 제조 후 6시간 이상 경과한 후의 형태 및 입자크기를 비교하여 시간이 지나도 형태 및 입자크기에 변함이 없는 경우에 '○'라고 평가하였다. 상기 측정 및 평가 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구분 실시예 1 실시예 2 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
형태
(Appearance)		 nano- particle nano- particle emulsion nano- particle emulsion nano- particle emulsion
평균 입자크기
(nm)		 39 28 480 80 55 320 2100
안정성
(Stability)		 ○ ○ ○ × × × ×
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1, 실시예 2, 비교예 2 및 비교예 4의 경우에만 nano-particle 형태의 조성물이 제조된 것을 확인할 수 있었다. 상기 nano-particle 형태의 조성물은 균일한 살포가 가능하다는 장점이 있다. 반면, emulsion 형태의 조성물은 액체 상태에서 시간의 경과에 따라 균일성이 낮아져 균일한 살포가 불가능해진다는 문제점이 있어 바람직하지 않다.
또한, 상기 nano-particle 조성물 중에서는 '실시예 1' 및 '실시예 2'의 경우에만 시간이 지나도 형태 및 입자 크기에 변함이 없어 '안정성'이 있다고 평가된 것으로 확인되었다.
참고로, 실시예 1의 경우 쿼세틴 및 티몰에 본 발명의 용해제 및 계면활성제를 혼합하는 것만으로 자가미세유화 약물전달시스템을 안정적으로 이루는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 안전성 시험(Safety test)
안전성 시험은 꿀벌응애 구제에 대한 효과를 확인하기 이전에 대조군, 실시예 또는 비교예의 조성물에 의한 벌의 위해성을 확인 및 검증하는 시험을 말한다.
실험예 2-1. 단회 투여에 따른 안전성 평가
먼저, 각각의 실험군마다 준비된 3 개의 봉군으로부터 10 마리씩의 벌을 포획하여 실험을 위한 3 개의 벌 포집통에 집어넣은 다음 각각 수돗물로만 이루어진 Blank 시료, 10 중량배의 수돗물로 희석한 대조군 시료, 각각 10 중량배의 수돗물로 희석한 실시예 1의 시료, 실시예 2의 시료, 비교예 1의 시료, 비교예 6의 시료 및 비교예 7의 시료를 분무기에 각각 옮겨 담은 후, 상기 각각의 벌 포집통 내에 분사하였다. 1회 분사량이 약 0.8 mL인 분무기를 이용하였고, 3회 분사를 한 세트로 진행하였다. 한 세트를 3회 반복하여 분사하여 상기 벌들이 완전히 시료에 젖도록 하였다. 분무 직후, 벌들은 모두 비행이 불가하여 기어 다닐 수밖에 없는 상태가 되었으며, 시료가 증발한 다음 벌이 원래의 집으로 돌아갈 수 있는지를 파악하였다. 10 마리씩 3번 반복한 시험을 통해 모든 벌들은 수분이 건조되면 비행이 가능하며, 자신의 집(벌통)으로 복귀함을 확인할 수 있었다. 이로 인해, 실시예의 시료의 안전성을 확인할 수 있었다.
실험예 2-2. 반복 투여에 따른 안전성 평가
준비된 각각의 시료를 4일 간격으로 각 벌통의 소비(巢脾)마다 4회씩(소비 앞뒤로 2회씩) 분무하는 방식으로 반복 투여하면서 그 효과와 안전성을 측정하였다. 총 3회 실험을 진행하며 관찰한 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 하기 표 4에 기재된 사봉수는 각 시료를 분무한 후에 48 시간이 경과한 후 포집벌통 주변의 죽은 벌들을 계수하여 누적된 값을 나타낸 것이다.
구분 사봉수(누적 수치) 벌통에 남은 벌 수
1회차 분무 2회차 분무 3회차 분무
Blank(수돗물) 36 51 76 16,845
대조군(부형제) 49 70 101 17,104
실시예 1 55 76 95 17,036
실시예 2 53 72 90 17,131
비교예 1 59 79 97 17,127
비교예 6 43 69 86 16,834
비교예 7 44 73 91 17,223
상기 표 4를 살펴보면, 실시예의 조성물에 의하여 죽은 벌들의 수는 Blank 실험군 및 대조군과 큰 차이가 없어 벌들에게 안전한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 구제 효과(efficacy test)
분무기에 각각의 시료를 담은 다음, 해당 봉군에 분사하였다. 이때, 개개의 소비를 들고 앞면과 뒷면에 각각 2회씩 약 30 cm 거리에서 분사하였으며, 봉군 내의 모든 소비에 살포하였다. 각 봉군 내 소비 개수는 동일하게 구성하였으며(평균 8.5개), 봉군 당 벌의 군집 크기는 2만 마리 내외(약 17,000 마리)인 것으로 선택하였다. 각 봉군에 속한 벌들은 다른 질병이 없으며, 꿀벌응애의 감염 정도가 비슷한 봉군들을 준비하여 실험에 이용하였다.
벌통 바닥에 떨어진 꿀벌 및 꿀벌응애를 계수하기 위하여 시판되는 시트지를 벌통 바닥 면적에 맞는 42×27cm 크기의 규격으로 잘라 시트지의 접착제가 묻어 있는 끈끈한 부분이 위쪽으로 향하도록 벌통 바닥에 설치하여, 꿀벌응애가 낙하하는 대로 부착될 수 있도록 하였다. 구체적으로, 접착제가 묻어 있는 표면에 꿀벌응애가 낙하하는 대로 부착되어 운반, 계수하기에 용이하면서도 꿀벌들은 시트지 위로 기어 다닐 수 있을 정도의 접착성을 가지고 있는 시트지를 이용하였다. 시트지 투입 후 24 시간이 경과한 시점에 시트지를 수거하여 시트지 위에 붙어 있는 꿀벌응애의 숫자를 현미경을 사용하여 계수하였다. 또한, 24 시간이 경과된 시점에서 시트지를 수거한 각 벌통에는 새로운 시트지를 바닥에 설치한 후, 그로부터 24 시간이 경과(시료 분사 후 총 48시간 경과)된 시점에 시트지를 수거하여 시트지 위에 붙어 있는 꿀벌응애의 숫자를 계수하여 약효의 지속성이 있는지를 확인하였다.
상기 시트지 위에 붙어 있는 꿀벌응애 숫자를 계수한 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 하기 표 5에 나타낸 결과는 각 시료마다 3회 반복 실험하여 얻은 값의 평균값을 나타낸 것이다.
구분 유효성분의 투여농도에 따른 경과시간별 꿀벌응애의 사충수(마리)
1배 농도(w/w) 2배 농도(w/w) 6배 농도(w/w)
24시간 후 48시간 후 24시간 후 48시간 후 24시간 후 48시간 후
Blank 12 24 - - - -
대조군 73 93 - - - -
실시예 1 489 1,236 538 1,667 616 1,671
실시예 2 568 1,362 692 1,679 801 1,685
비교예 6 236 723 457 1,284 568 1,258
비교예 7 152 459 428 697 497 692
구분 유효성분의 투여농도에 따른 꿀벌응애의 퇴치율(%)
1배 농도(w/w) 2배 농도(w/w) 6배 농도(w/w)
48시간후 남은
응애수		 퇴치율(%) 48시간후 남은
응애수		 퇴치율(%) 48시간후 남은
응애수		 퇴치율(%)
Blank 34 1,666 2.0 - - - - -
대조군 94 1,606 5.5 - - - - -
실시예 1 1,236 464 72.7 1,667 33 98.1 1,671 29 98.3
실시예 2 1,362 338 80.1 1,679 21 98.8 1,685 15 99.1
비교예 6 723 977 42.5 1,284 550 75.5 1,258 376 76.9
비교예 7 459 1,241 27.0 697 1,003 41.0 692 942 42.4
상기 표 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 꿀벌응애 구제용 조성물은 한 번의 분무로도 빠른 시간 내에 매우 높은 꿀벌응애 퇴치율을 나타내어 뛰어난 구제 효과가 있는 것을 확인하였다.
구분 쿼세틴 및 티몰 중량비에 따른 꿀벌응애의 사충수(마리)
쿼세틴:티몰 = 1 : 0.5 쿼세틴:티몰 = 1 : 2 쿼세틴:티몰 = 1 : 4
24시간 후 48시간 후 24시간 후 48시간 후 24시간 후 48시간 후
Blank 12 39 - - - -
대조군 73 82 - - - -
실시예 1 727 1,467 842 1,618 916 1,658
구분 쿼세틴 및 티몰 중량비에 따른 꿀벌응애의 퇴치율(%)
쿼세틴:티몰 = 1 : 0.5 쿼세틴:티몰 = 1 : 2 쿼세틴:티몰 = 1 : 4
48시간후 남은
응애수		 퇴치율(%) 48시간후 남은
응애수		 퇴치율(%) 48시간후 남은
응애수		 퇴치율(%)
Blank 39 1,661 2.3 - - - - -
대조군 82 1,618 4.8 - - - - -
실시예 1 1,467 233 86.3 1,618 82 95.2 1,658 42 97.5
상기 표 7 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 꿀벌응애 구제용 조성물은 쿼세틴 : 티몰의 중량비가 1 : 1 내지 5의 범위 이내인 경우에 현저히 높은 꿀벌응애 퇴치 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (13)

  1. 쿼세틴(Quercetin) 및 티몰(Thymol)을 유효성분으로 포함하되,
    쿼세틴을 0.01 내지 5 중량%, 티몰을 0.01 내지 5 중량%로 포함하고,
    상기 티몰은 상기 쿼세틴 1 중량부에 대하여 0.1 내지 10 중량부인 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    디에틸렌글리콜모노에틸에테르(Diethyleneglycolmonoethylether)로 이루어진 용해제; 및
    폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)의 계면활성제;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은
    오일을 더 포함하되, 상기 오일은 중쇄지방산 오일, 올레산의 모노-글리세라이드, 올레산의 디-글리세라이드, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 에틸 리놀리에이트, 에틸 올리에이트, 옥수수유, 올리브유, 대두유, 어유(fish oil), 스쿠알렌, 스쿠알란, 액상 올레산, 액상 리놀레산 및 토코페릴 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제용 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제4항에 있어서,
    상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene sorbitan monostearate(Tween 60)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미에이트(Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate(tween40)) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene sorbitan monolaurate(tween 20))로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제용 조성물.
  9. 제4항에 있어서,
    쿼세틴 0.01 내지 1.5 중량% 및 티몰 0.01 내지 1.5 중량%를 포함하고,
    상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부의 디에틸렌글리콜모노에틸에테르; 및 20 내지 40 중량부의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80))를 포함하는 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제용 조성물.
  10. 제5항에 있어서,
    쿼세틴 0.01 내지 1.0 중량% 및 티몰 0.01 내지 1.0 중량%를 포함하고,
    상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부의 디에틸렌글리콜모노에틸에테르; 20 내지 40 중량부의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)); 및 5 내지 20 중량부의 중쇄지방산 오일;을 포함하는 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제용 조성물.
  11. 제4항에 있어서,
    상기 꿀벌응애 구제용 조성물은 물과 혼합시 자가유화(self-emulsification)하여 평균 입자 크기가 50 nm 이하인 나노에멀젼을 형성하는 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제용 조성물.
  12. (1) 쿼세틴(Quercetin); 상기 쿼세틴 1 중량부에 대하여 0.1 내지 10 중량부의 티몰(Thymol); 및 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부의 디에틸렌글리콜모노에틸에테르;를 40 내지 70 ℃의 온도에서 혼합하는 단계; 및
    (2) 상기 (1) 단계의 혼합물에 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate(Tween 80)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene sorbitan monostearate(Tween 60)), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미에이트(Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate(tween40)) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene sorbitan monolaurate(tween 20))로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 계면활성제를 상기 쿼세틴 및 티몰의 총중량 1 중량부에 대하여 20 내지 40 중량부로 혼합하는 단계;를 포함하는 꿀벌응애 구제용 조성물의 제조방법.
  13. 제4항, 제5항, 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 꿀벌응애 구제용 조성물을 10 내지 100 중량 배의 물과 혼합하여 나노에멀젼이 형성되도록 하는 단계; 및
    상기 나노에멀젼을 꿀벌응애에 감염된 벌에 분무하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 꿀벌응애 구제방법.
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