KR102262179B1 - 설사를 치료하기 위한 물질 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치료용 조성물, 및 설사와 같은 위장병 및 위장 질환의 치료, 재수화의 제공, 전해질 및 액 불균형의 교정(correcting), 및/또는 소장 기능의 개선을 위한 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 장관 투여를 위해 제형화된 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 글루코스를 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 구강(oral) 재수화 드링크로 투여하기 위해 제형화된다.
Description
관련출원에 상호 참조
본 출원은, 본 출원에 전체로 참조로 결합되는, 2012년 2월 8일에 출원된 미국 가출원 제61/596,480호를 우선권 주장한다.
로타 바이러스 감염(Rotavirus infection)은, 세계적으로 어린아이 및 유아에 심한 설사병 및 탈수증(dehydration)의 유발 원인이다. 로타 바이러스 감염의 증상은, 수성설사(watery diarrhea), 심한 탈수증, 열, 및 구토를 포함한다. 또한, 로타 바이러스 감염은, 셋째 날 후접종(post-inoculation)에 발생한 최대 손상을 갖는 공장 병변(jejunal lesions)을 일으킬 수 있고, 예를 들어, 몇 가지 예로서, 정상의 30 % 내지 50 %까지 융모 표면적(villus surface area)의 감소를 일으킨다(Rhoads et al.(1996) J. Diarrhoeal Dis. Res. 14(3):175-181).
로타바이러스가 설사를 유발하는 것에 관한 병태생리 메카니즘(pathophysiological mechanism)은 소장 상피 세포(epithelial cells) 상에 엔테로톡신-비특이성 단백질-4(enterotoxin - non-specific protein-4, NSP4)의 활동에 의한 것이다. NSP4는 크고 작은 모든 창자의 소낭선 상피(crypt epithelia) 내에서 세포 내(intracellular) Ca2 +을 도입하여(mobilizes) cAMP-의존 플루이드 분비(fluid secretion)를 강화시켜(potentiating) 콜린성 촉진제 카르바콜(cholinergic agonist carbachol, CCh)의 분비효과(secretory effects)를 모방한다.
세포 내 cAMP([cAMP]i)및 Ca2 +([Ca2 +]i)의 증가는 염증성 질환(inflammatory conditions)뿐만 아니라 전염성 질환에 관련된 설사에서 Cl- 및/또는 HCO3 - 분비를 중재하는 것으로 알려져 있다(Zhang et al.(2007)J Physiol 581(3):1221-1233). 염화물계 분비(chloride secretion)에 의해 발생하는 삼투압 기울기(osmotic gradient)는 창자의 루멘 내에 물의 수동운동(passive movement)을 일으키고, 이에, 물똥(watery stool)의 원인이 된다. 수동적 수분 이동(passive water movement)과 함께 Cl-분비는 정상 소화 및 흡수(absorption) 과정에서 더 적은 양으로 발생하며, 이는 내장 루멘(gut lumen)을 통한 적절한 혼합, 씹힘 및 순조로운 추진력(smooth propulsion)에 있어서 필수적이다. 정상 흡수성의 소장에서, 융모 세포(villus cell) 영역 내에서 발생하는 흡수 및 소낭선 세포(crypt cells)로부터의 분비 간의 적절한 균형이 있다. 감소된 흡수, 증가된 분비, 또는 복합 효과(combined effect)의 결과에 의한 불균형(imbalance)이 설사를 일으킨다.
칼슘 의존성 염소 채널(Calcium activated chloride channels, CaCCs)은 중요한 생리적 공정(physiological processes) 내에 포함된다. IL-4에 의해 조절되는 각각의 막단백질(membrane proteins)에 반하는 특이적 작은 간섭 RNA(specific small interfering RNA)로 상피 세포의 형질주입(Transfection)은, 알려지지 않은 기능을 갖는 추정적 플라즈마 막 단백질군(family of putative plasma membrane protein)의 멤버, TMEM16A가 칼슘-의존 염소 전류(calcium-dependent chloride current)에 관련되는 것으로 언급한다(Caputo et al.(2008) Science 322(5901):590-594). TMEM16A는, 기관, 창자 및 선의 상피(tracheal, intestinal, and glandular epithelia), 부드러운 근세포(smooth muscle cells), 및 위장관(gastrointestinal tract) 내의 카할(Cajal)의 간질 세포(interstitial cells)를 포함하는, 포유류 조직(mammalian tissues)에서 광범위하게 발현된다(Namkung et al.,J. Biol. Chem. 286(3):2365-2374).
소장 내에서 장세포(enterocyte)에 의한 루미날 글루코스 흡수는 이차 능동 수송(secondary active transport)이 뒤따른다(Hediger et al.(1994) Physiol . Rev. 74(4):993-1026; Wright et al.(2004) Physiology(Bethesda)19:370-376). 소듐-글루코스 수송체(SGLT-1)는 2:1의 화학양론을 가지며, 이어서, 루미날 막(luminal membrane)을 걸쳐서 하나의 글루코스 분자에 대한 두 개의 소듐 이온을 수송한다(Chen et al.(1995) Biophys . J. 69(6):2405-2414)). 단단하게 결합된(tightly coupled) 소듐 글루코스 수송체는 Na-K-ATPase 활성에 의해 형성된 Na+전기화학적 기울기에 의해 진행된다. SGLT-1-중재된, 전기발생(electrogenic) Na+흡수는 용매 끌기(solvent drag)를 야기하고, 그 결과, 루멘으로부터 물의 수동(passive) 흡수를 유도한다.
수화(hydration)의 유지(Maintenance)는 로타바이러스-유발 설사를 포함하는 설사병의 치료에서 중요한 구성 요소(critical element)이다. 현재로, 분비성 설사는 경구 재수화 드링크(oral rehydration drink)(ORD) - 상당한 양의 글루코스와 다른 당분자 및 소듐 함유 염 용액으로 치료된다. 글루코스는, 질병상태(disease conditions)에 관련된 영양소 흡수 결함 및 전해질(electrolyte)을 교정하기 위한 경장(enteral) 및 비경구적 액(parenteral fluids) 둘 다에 언제나 중요한 것(mainstay)이다. ORD는 소장(small intestine) 내에서 소듐 및 글루코스의 능동적 결합 흡수(coupled uptake)시, 흡수 상태(absorbed state)의 이동 후에 물의 차후 인플럭스(subsequent influx)가 있다는 이론에 기초하여, 분비성 설사(secretory diarrhea) 내에 액(fluids) 및 전해질의 손실을 교정하도록 디자인된다.
ORD가 콜레라 및 다른 설사 질환(diarrheal conditions)의 치료에서 중요한 진전(breakthrough)을 제공하지만, 이의 효율성의 개선에 대한 필요성이 있다. 현재 존재하는 ORD 제제(formulations)에 의해 제공되는 매우 낮은 재수화율로 인하여 개선된 제형이 필요하다. 설사 환자의 재수화율은, 전해질 손실율과 보조를 맞추지 않는다. 현재 존재하는 ORD 제제는 로타바이러스-유발 설사를 치료하는데 효력이 없는 것으로 보이고, 무효력에 대한 정확한 사인은 알려지지 않았다. 따라서, 설사의 치료를 위한 개선된 ORD 제제에 대해 필요성이 존재한다.
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발명의 요약
본 발명은 설사와 같은 위장병 및 위장 질환의 치료, 재수화의 제공, 전해질 및 액 불균형(fluid imbalances)의 교정(correcting) 및/또는 소장 기능을 개선하는 방법 및 치료용 조성물(therapeutic compositions)을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 장관 투여(enteral administration)를 위해 제형화된 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 글루코스를 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 경구 재수화 드링크(ORD)로 제형화될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 분말형태이고, ORD로 사용하기 위해서 물에서 환원(reconstituted)될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 프리 아미노산; 전해질; 디-펩타이드 및/또는 올리고펩타이드; 비타민; 및 임의적으로 물, 치료적으로 허용가능한(therapeutically acceptable) 담체, 부형제(excipients), 완충제, 착향제, 염료, 및/또는 보존제로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 조성물의 총오스몰 농도는 약 100 mosm 내지 250 mosm이다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 약 2.9 내지 7.3의 pH를 갖는다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 본 발명의 조성물의 유효량(effective amount)을, 이러한 치료가 필요한 대상에, 경장 경로를 통하여, 투여하는 단계를 포함하는 치료(treatment)를 제공한다. 상기 조성물은 하루당 한번 또는 여러 번 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 경구적으로 투여된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 로타 바이러스 감염 및/또는 NSP4에 의해 유발된 설사의 치료를 제공한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 감소된 Cl- 및/또는 HCO3 - 분비 및/또는 개선된 액 흡수를 초래한다.
도 1은 Na+-결합된 글루코스 및 Na+-결합된 3-O-메틸글루코스(3-OMG) 수송에 대한 포화 역학을 보여준다. (도 1a) 루멘 글루코스(lumen glucose)의 농도 증가는 I sc에서 농도-의존 증가(concentration-dependent increase)를 일으킨다. 효소반응 속도(enzyme kinetics)를 위한 Michaelis-Menten model에 적합한 비선형 곡선(Nonlinear curve)은 Vmax=3.3±0.19μeq·h-1·cm-2 및 Km=0.24±0.06 mM를 보여준다. (도 1b) 3-OMG의 루멘 농도 증가는 Vmax=1.9±0.13μeq·h-1·cm-2 및 Km=0.22±0.07mM를 갖는 I sc에서 농도-의존 증가를 일으킨다. H-89로 전처리된 조직(tissues pre-treated) 내에서 3-OMG의 농도 증가는 H-89로 전처리되지 않은 조직과 비교시, I sc에서 상당한 감소를 일으킨다. (도 1c) 프롤리진(phlorizin)으로 전처리된 조직 내에서 3-OMG의 농도의 추가 증가는 글루코스에 대한 반응이 없는 것을 보여준다. 상기 수치는 n=6 조직으로부터 획득된다.
도 2는 Na+(도 2a) 및 Cl-(도 2b)의 단일 방향(unidirectional) 및 네트 흐름(net flux)을 보여준다. (도 2a) 0, 0.6, 또는 6 mM의 농도에서의 글루코스로 소장 조직의 배양은, J msCl-에서 상당한 차이를 일으키지 않는다. 글루코스는 소장 내에서 J smCl-의 증가를 유발한다. 구체적으로, J smCl-은, 0 mM 글루코스인 것과 비교시, 0.6 및 6 mM 글루코스의 존재 하에서 상당히 더 높다. 0.6 mM 및 6 mM 글루코스에서, Cl-분비가 측정되는 반면에, 0 mM 글루코스에서, 상당한 Cl-흡수가 측정된다(0.6 mM 및 6 mM 글루코스에서 Cl-흡수와 비교시). (도 2b) 0 mM 글루코스에서, 네트 Na+흡수는 소장 조직 내에서 측정된다. 최소 Na+흡수는 0.6 mM 글루코스에서 측정되고, 반면에, 상당한 Na+흡수가 6 mM 글루코스에서 측정된다. 단일 방향 흐름(Unidirectional fluxes)(J ms및 J sm)은 0, 0.6 또는 6mM 글루코스에서 상당한 차이를 나타내지 않는다. 상기 수치는 n=8 조직으로부터 획득된다.
도 3은 회장의 융모 및 소낭선 및 전체 세포 분획(villus, crypt and whole cell fraction of ileum) 내의 세포 내 cAMP에 대한 글루코스 및 3-O-메틸-글루코스의 효과를 보여준다. (도 3a) 포르스콜린 처리(Forskolin treatment)는 유사한 방식으로 소낭선 및 융모 세포 내의 세포 내 cAMP 수준을 상당하게 증가시킨다. (도 3b) 8 mM 글루코스로 세포의 배양(Incubation)은 융모 세포 내의 세포 내 cAMP 수준에서 상당한 증가를 일으켰으나, 소낭선 세포 내에서는 일으키지 않는다. (도 3c) 글루코스 및 3-O-메틸-글루코스로, 융모 및 소낭선 상피 세포 둘 모두로 구성된 점막의 찰과 표본(mucosal scraping)의 배양은, 각각, 세포 내 cAMP 수준에서 상당한 증가를 일으킨다. 6 mM에서 3-O-메틸-글루코스로 세포의 배양은 세포 내 cAMP 수준에서 적지만 유의한 증가를 일으킨다. 상이한 농도의 글루코스를 사용한 세포 배양은, 세포 내 cAMP 수준에서 유사한 효과를 생성한다. 컬럼은 평균수치를 나타내고, 바(bars)는 S.E.M를 보여준다. 상기 수치는 3회 반복된 n=4 다른 쥐들로부터 획득된다. cAMP 수준은, 각각의 분획(fractions)으로부터 단백질 수준(protein levels)에 표준화되고, pmol(mg protein)- 1으로 표현된다. 포르스콜린 또는 글루코스 첨가 이후의 그룹과 비교된 * P < 0.001; 식염수 처리된 융모 세포 및 글루코스 처리된 융모 세포 간의 비교 #P < 0.01. NS=상당하지 않음(Bonferroni's multiple comparisons).
도 4는 Caco-2 세포 내의 세포 내 Ca2 +수준에 대한 글루코스 및 3-O-메틸-글루코스의 효과를 보여준다. (도 4a) 0.6 mM 글루코스로 Caco-2 세포의 배양은, 대조군과 비교 시, 형광(fluorescence)에서 증가를 일으킨다. 6 mM 글루코스로 배양은, 대조군 및 0.6 mM 글루코스의 것과 비교 시, 형광에서 상당한 증가를 일으킨다. 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid, BAPTA-AM)으로 전-배양된(45 분 기간 동안) 세포에서, 글루코스는 세포 내 Ca2 +수준의 어떠한 증가를 자극하는데 실패하였다. 3-OMG로 배양은, 유사 농도에서의 글루코스에 의한 것보다, 세포 내 Ca2+수준에서 상당히 더 낮은 글루코스-자극 증가(glucose-stimulated increase)를 일으킨다. (도 4b) 0.6mM 및 6 mM의 농도에서의 글루코스에 의해 자극된 세포 내 Ca2+수준에서 증가를 보여주는 대표적 트레이스(Representative trace).
도 5는 Cl--의존(Cl--dependent) 및 Cl--비의존(Cl--independent) HCO3 -분비를 나타낸 pH 통계 실험(pH stat experiments)결과를 보여준다. (도 5a) 글루코스의 결핍에서, Cl--비의존 HCO3 -분비의 최소 수준이 있다. 6 mM 글루코스의 존재 하에서, 루멘 Cl-의 제거는 HCO3 -분비에서 상당한 감소를 일으키지 않았다. (도 5b) HCO3 -분비에 대한 음이온 교환 억제제 및 음이온 채널 블럭커(anion channel blocker)의 효과. 실험은 루멘 Cl-의 존재 하에서 수행된다. 글루코스의 부재에서, 100 μM 4,4'-디이소티오시아노-2,2'-스틸벤디설폰산(4,4'-diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid, DIDS)의 첨가는 HCO3 -분비를 저해시키는(abolishes) 반면에 10 μM 5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)-벤조산(NPPB)은 HCO3 -분비에서 어떠한 억제효과를 갖지 않는다. 6 mM 글루코스의 존재하에서는, DIDS가 아닌 NPPB가 HCO3 -분비를 억제한다(inhibit). 상기 값은, 다른 쥐들에 따른 n = 6 조직으로부터 획득된다. P < 0.001.
도 2는 Na+(도 2a) 및 Cl-(도 2b)의 단일 방향(unidirectional) 및 네트 흐름(net flux)을 보여준다. (도 2a) 0, 0.6, 또는 6 mM의 농도에서의 글루코스로 소장 조직의 배양은, J msCl-에서 상당한 차이를 일으키지 않는다. 글루코스는 소장 내에서 J smCl-의 증가를 유발한다. 구체적으로, J smCl-은, 0 mM 글루코스인 것과 비교시, 0.6 및 6 mM 글루코스의 존재 하에서 상당히 더 높다. 0.6 mM 및 6 mM 글루코스에서, Cl-분비가 측정되는 반면에, 0 mM 글루코스에서, 상당한 Cl-흡수가 측정된다(0.6 mM 및 6 mM 글루코스에서 Cl-흡수와 비교시). (도 2b) 0 mM 글루코스에서, 네트 Na+흡수는 소장 조직 내에서 측정된다. 최소 Na+흡수는 0.6 mM 글루코스에서 측정되고, 반면에, 상당한 Na+흡수가 6 mM 글루코스에서 측정된다. 단일 방향 흐름(Unidirectional fluxes)(J ms및 J sm)은 0, 0.6 또는 6mM 글루코스에서 상당한 차이를 나타내지 않는다. 상기 수치는 n=8 조직으로부터 획득된다.
도 3은 회장의 융모 및 소낭선 및 전체 세포 분획(villus, crypt and whole cell fraction of ileum) 내의 세포 내 cAMP에 대한 글루코스 및 3-O-메틸-글루코스의 효과를 보여준다. (도 3a) 포르스콜린 처리(Forskolin treatment)는 유사한 방식으로 소낭선 및 융모 세포 내의 세포 내 cAMP 수준을 상당하게 증가시킨다. (도 3b) 8 mM 글루코스로 세포의 배양(Incubation)은 융모 세포 내의 세포 내 cAMP 수준에서 상당한 증가를 일으켰으나, 소낭선 세포 내에서는 일으키지 않는다. (도 3c) 글루코스 및 3-O-메틸-글루코스로, 융모 및 소낭선 상피 세포 둘 모두로 구성된 점막의 찰과 표본(mucosal scraping)의 배양은, 각각, 세포 내 cAMP 수준에서 상당한 증가를 일으킨다. 6 mM에서 3-O-메틸-글루코스로 세포의 배양은 세포 내 cAMP 수준에서 적지만 유의한 증가를 일으킨다. 상이한 농도의 글루코스를 사용한 세포 배양은, 세포 내 cAMP 수준에서 유사한 효과를 생성한다. 컬럼은 평균수치를 나타내고, 바(bars)는 S.E.M를 보여준다. 상기 수치는 3회 반복된 n=4 다른 쥐들로부터 획득된다. cAMP 수준은, 각각의 분획(fractions)으로부터 단백질 수준(protein levels)에 표준화되고, pmol(mg protein)- 1으로 표현된다. 포르스콜린 또는 글루코스 첨가 이후의 그룹과 비교된 * P < 0.001; 식염수 처리된 융모 세포 및 글루코스 처리된 융모 세포 간의 비교 #P < 0.01. NS=상당하지 않음(Bonferroni's multiple comparisons).
도 4는 Caco-2 세포 내의 세포 내 Ca2 +수준에 대한 글루코스 및 3-O-메틸-글루코스의 효과를 보여준다. (도 4a) 0.6 mM 글루코스로 Caco-2 세포의 배양은, 대조군과 비교 시, 형광(fluorescence)에서 증가를 일으킨다. 6 mM 글루코스로 배양은, 대조군 및 0.6 mM 글루코스의 것과 비교 시, 형광에서 상당한 증가를 일으킨다. 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid, BAPTA-AM)으로 전-배양된(45 분 기간 동안) 세포에서, 글루코스는 세포 내 Ca2 +수준의 어떠한 증가를 자극하는데 실패하였다. 3-OMG로 배양은, 유사 농도에서의 글루코스에 의한 것보다, 세포 내 Ca2+수준에서 상당히 더 낮은 글루코스-자극 증가(glucose-stimulated increase)를 일으킨다. (도 4b) 0.6mM 및 6 mM의 농도에서의 글루코스에 의해 자극된 세포 내 Ca2+수준에서 증가를 보여주는 대표적 트레이스(Representative trace).
도 5는 Cl--의존(Cl--dependent) 및 Cl--비의존(Cl--independent) HCO3 -분비를 나타낸 pH 통계 실험(pH stat experiments)결과를 보여준다. (도 5a) 글루코스의 결핍에서, Cl--비의존 HCO3 -분비의 최소 수준이 있다. 6 mM 글루코스의 존재 하에서, 루멘 Cl-의 제거는 HCO3 -분비에서 상당한 감소를 일으키지 않았다. (도 5b) HCO3 -분비에 대한 음이온 교환 억제제 및 음이온 채널 블럭커(anion channel blocker)의 효과. 실험은 루멘 Cl-의 존재 하에서 수행된다. 글루코스의 부재에서, 100 μM 4,4'-디이소티오시아노-2,2'-스틸벤디설폰산(4,4'-diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid, DIDS)의 첨가는 HCO3 -분비를 저해시키는(abolishes) 반면에 10 μM 5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)-벤조산(NPPB)은 HCO3 -분비에서 어떠한 억제효과를 갖지 않는다. 6 mM 글루코스의 존재하에서는, DIDS가 아닌 NPPB가 HCO3 -분비를 억제한다(inhibit). 상기 값은, 다른 쥐들에 따른 n = 6 조직으로부터 획득된다. P < 0.001.
본 발명은 설사와 같은 위장병 및 위장 질환의 치료, 재수화의 제공, 전해질 및 액 불균형의 교정 및/또는 소장 기능을 개선하는 방법 및 치료용 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 장관 투여를 위해 제형화된 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 글루코스를 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 경구 재수화 드링크(ORD)로 제형화된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 분말 형태이고, ORD로 사용하기 위해 물에 환원될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 프리 아미노산; 전해질; 디-펩타이드 및/또는 올리고펩타이드; 비타민; 및 임의적으로, 물, 치료적으로 허용가능한 담체, 부형제, 완충제, 착향제, 염료, 및/또는 보존제로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물의 총오스몰 농도는 약 100 mosm 내지 250 mosm이다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 약 2.9 내지 7.3의 pH를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은, 본 발명의 조성물의 유효량을, 이와 같은 치료가 필요한 대상에 경장 경로를 통하여, 투여하는 단계를 포함하는 치료를 제공한다. 상기 조성물은 하루당 한번 또는 여러번 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 경구적으로 투여된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 로타 바이러스 감염 및/또는 NSP4에 의해 유발된 설사의 치료를 제공한다. 바람직한 다른 구현예에서, 본 발명은 감소된 Cl- 및/또는 HCO3 -분비 및/또는 개선된 액 흡수를 초래한다.
글루코스에
의한 음이온 분비의 유도(Induction of Anion Secretion by Glucose)
본 발명에 관련해서, 루멘 글루코스가 소장 내에서 네트 이온 분비(net ion secretion)를 유발하는 것을 발견하였다. 구체적으로, 글루코스는 세포 내 cAMP 및 Ca2 +수준 증가에 의해 중재된 능동 염화물계 분비(active chloride secretion)를 유발한다. 또한, 소장 내에서 네트 Na+수송은 글루코스 고농도에서 흡수성(absorptive)이다. 추가로, 글루코스는, 소장 내에 비카보네이트 분비(bicarbonate secretion)를 일으킨다.
본 발명가들은, 세포 내 cAMP 수준의 증가는 Cl- 및/또는 HCO3 -분비를 중재하는 것을 보여준다. Cl- 및/또는 HCO3 -분비는, 수많은(~ 20) 잠재적(potential) 세린 및 트레오닌 인산화반응 부위(phosphorylation sites)를 갖는, 낭성섬유증 막전위 전도도 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)이온 채널에 의해 주로 중재된다. 단백질 인산화효소 A(Protein kinase A, PKA) 및 단백질 인산화효소 C(PKC)는 CFTR 음이온 채널을 활성화하는 것을 알려져 있다. 패치고정법(patch clamp)연구는, CFTR 채널이, PKA에 의해 지속적으로 활성화되지 않는다면, 신속하게 비활성화("런다운(run down)")되고 이는 CFTR의 활성화(activation)에서 PKA의 중요성을 나타내는 것을 보여준다. 이러한 측정 결과와 일치하는, 강한(potent) PKA 억제제 H89로 소장 세포의 전-치료(pre-treatment)는, I sc 에서 글루코스-자극 네트 증가(glucose-stimulated net increase)의 상당한 감소를 일으킨다.
PKA 길항제(antagonists)는, 글루코스 노출에 이어서 SGLT1 단백질 발현(protein expression)을 억제하는 것으로 보여진다(Dyer et al.(2003) Eur . J. Biochem.270(16):3377-3388). CFTR 채널은 cAMP-의존단백질 인산화효소(PKA)에 의해 활성화되고, 음이온 분비를 유도한다. 소장 내 I sc에서 글루코스-자극 증가는 부분적으로 CFTR-중재 이온 수송에 의해 중재된다(Glucose-stimulated increase in I sc in the small intestine is partially mediated by CFTR-mediated ion transport)
PKA 작용제(cAMP와 같은) 뿐만 아니라 글루코스는 브러시보더 막(brush border membrane)으로 SGLT1의 운반(trafficking of SGLT1)을 증가시키는 것으로 보여진다(Wright et al.(1997) J. Exp . Biol . 200(Pt2):287-293;Dyer et al.(2003) Eur. J. Biochem . 270(16):3377-3388). Vmax의 감소는 전류 내 총 감소(total decrease in current)를 의미하며, 이는 글루코스 수송에서의 감소를 나타낸다. Vmax의 감소는, 글루코스 수송체 SGTL1의 총 갯수의 감소로부터 초래될 수 있으며, 이는 융모 상피 세포에서 주로 발견된다. 융모 손실은 세포 내로 글루코스를 가져가는데 이용가능한 수송체의 상당한 감소를 일으킨다.
글루코스로 장세포를 배양하는 것이 세포 내 cAMP 수준을 증가시킨다는 것이 발견되었다. 글루코스-유발 세포 내 cAMP 수준에서의 더 큰 증가는 소낭선 세포 내에서보다 융모 세포 내에서 측정된다. 포르스콜린(forskolin)으로 장세포를 배양하는 것은 소낭선 및 융모 세포 모두 내에서의 세포 내 cAMP 수준을 증가시킨다(도 3a). SGLT1-중재 글루코스 수송은, 더 많은 수의 SGLT-1가 소낭선 영역보다 융모 영역에 위치되기 때문에, 소낭선 세포 대신에 융모 세포에서 대부분 발생한다(Knickelbein et al.(1988)J . Clin . Invest. 82(6):2158-2163). 따라서, 소낭선 세포에서 글루코스 농도의 증가는 증가된 cAMP 반응(도 3b)을 야기하지 않는다.
낮은 농도(예컨대, 대략 이의 Vmax의 절반인 0.6 mM 글루코스)에서 조차, 루멘 글루코스는 네트 음이온 분비를 유발한다. 더 높은 글루코스의 농도에서는, 소듐 흡수가 우세하다(predominant). 증가된 루멘 글루코스 농도는 세포 내 cAMP 및 Ca2+수준을 증가시킨다. 이전 연구들은, Na+-결합된 글루코스 수송을 위한 Km이 0.2 내지 0.7 mM 범위 내에 있는 것을 보여준다(Lo & Silverman(1998) J. Biol . Chem . 273(45):29341-29351).
H-89로 전-처리된 세포 내 I sc 에서 잔여 글루코스-중재 증가의 존재는 PKA 비의존 경로(PKA independent pathway(s))가 글루코스-유발 음이온 분비 내에 존재하는 것을 의미한다. 소장 전체에 걸친 전기발생 음이온 분비는(Eletrogenic anion secretion across the small intestine) 이온 채널에 의해 중재되며, 이는 cAMP, Ca2+,세포-용적(cell-volume) 및 막전위(membrane potential)에 의한 활성화와 같이, 이들의 활성화 메카니즘을 기초로 하여 분류될 수 있다.
또한, 루멘 글루코스가 세포 내 Ca2 +수준의 증가를 유발하는 것이 발견되었다. 또한, 상기 글루코스-유발 Cl-분비는 PKA-비의존 경로뿐만 아니라 PKA-의존 경로에 의해 중재된다. 이는, CFTR에 추가하여, 칼슘 의존성 염소 채널(CaCCs)도 글루코스-유발 음이온 분비에서 역할을 하는 것을 의미한다.
추가로, 글루코스는 전기발생 HCO3 -분비를 자극한다. 글루코스로 배양된 소장 세포는 루멘 Cl-프리 용액보다 루멘 Cl--함유 용액에서 더 높은 HCO3 -분비 수준을 보여준다(도 4a 및 4b). 이러한 결과는 음이온 채널이 글루코스의 존재에서 HCO3 -분비를 중재하는 것을 의미한다. 또한, 글루코스의 첨가는, 글루코스의 첨가 없는 세포와 비교 시, Cl--HCO3 -교환에서 약간의 감소를 일으킨다. 이러한 감소는 글루코스를 갖는 세포 내 cAMP 수준에서의 증가에 비해 부차적인 것일 수 있다. 또한, 이는 글루코스가 음이온 채널-중재 분비를 유발하고, 전기적 중성 Cl--HCO3 -교환을 억제한다는 것을 의미한다.
추가로, 소장 세포는 각각 음이온 채널 블럭커(100 mM NPPB) 및 음이온 교환 억제제(100 mM DIDS)로 배양되었다. NPPB(100 mM)(4.2 ± 0.7 vs 7.6 ±1.5 mEq.h-1.cm-2)에 의한 글루코스-유발, 음이온 채널-중재(anion channel-mediated) HCO3 -분비의 상당한 억제가 있다.
음이온 채널 억제제의 존재에서, 잔여 HCO3 -분비는 여전히 측정된다. 이는, 글루코스-중재 분비 내에 Cl--HCO3 -교환이 존재한다는 것을 의미한다. 또한, 이는, 상승된 세포 내 칼슘 수준이, 특정 질병 상태뿐만 아니라 정상 소화기능(digestive function) 동안에, 소듐-하이드로젠 교환체 3(sodium-hydrogen exchanger 3, NHE3)의 활성을 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 이는, SGLT1이 소듐 흡수를 조절하고, 때때로, 분비 결함 및/또는 흡수성 결함을 자극하는 역할을 한다는 것을 의미한다.
글루코스-유발 분비 메카니즘의 발견은 설사를 포함하는 위장병의 치료에 이용될 수 있다. 극심한 설사병을 갖는 환자는 위장관(tract)의 상부에서 발생하는 손상된 글루코스 흡수력을 통상적으로 가진다. 비흡수된 카보하이드레이트(unabsorbed carbohydrates)존재는 창자에 삼투 효과(osmotic effect)를 가하고, 설사를 유도한다. 추가로, 글루코스는 세포 내 Ca2 + 및/또는 cAMP 수준을 증가시키고, 음이온 분비를 유발한다. 글루코스의 분비 효과는 이전에, 동시 발생하는 Na+-글루코스 흡수에 의해 가려지거나, 대역되어왔다. 또는, 이의 분비효과 때문에, 글루코스 투여는, 융모의 쇼트닝에 관련되어 극도로 흡수가 제대로 이루어지지 못하는, 크론병(Crohn's disease) 및 방사선 조사 또는 화학요법-유발 장염과 같은, 손상된 Na+-글루코스 흡수를 갖는 위장병을 악화시킨다.
로타 바이러스 감염 중에, 주로 융모 세포 내에서 발현되는 소듐-의존 글루코스 공수송체(cotransporter)(SGLT-1)를 통한 우세한 글루코스-결합 Na+흡수가 있지만, 소장 내에서 칼슘 의존성 염소채널(CaCC 또는 TMEM-16a)을 통한 상당한 칼슘 의존성 Cl-분비가 있다. 추가로, 세포 내 글루코스는 칼슘-활성 염화물(calcium-activated chloride) 및 액 분비를 활성화한다. 비구조적 단백질(Non-structural protein)(NSP4)은 로타바이러스에 의해 생산된 엔트로톡신(entero-toxin)이다. 글루코스 및 NSP4이 함께 투여될 때, 세포 내에서 일관된(sustained) 염화물계 분비를 일으키는 것이 발견되었다. 결과적으로, 상당한 양의 글루코스를 포함하는 현재 존재하는 ORD 제제는 칼슘-자극 염화물계 분비를 더 증가시키고 이로써, 로타바이러스-유발 설사를 악화시킨다(worsening).
치료용 조성물(Therapeutic Compositions)
하나의 양상에서, 본 발명은 설사와 같은 위장병 및 위장 질환의 치료, 재수화의 제공, 전해질 및 액 불균형의 교정, 및/또는 소장 기능을 개선하기 위한 치료용 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 장관 투여를 위해 제형화되고, 글루코스를 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 경구 재수화 드링크로 제형화 된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 분말 형태이고, 경구 재수화 드링크로서 사용하기 위해 물에 환원될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 조성물은 글루코스 수송체의 어떠한 기질도 포함하지 않는다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 조성물은, 이에 제한하지 않으나, 글루코스 유사체(예컨대, SGLT-1를 위한 비대사성 글루코스 작용제(non-metabolizable glucose agonists)) 및 다른 카보하이드레이트(당류(sugars)와 같은)를 포함하는 소듐-의존 글루코스 공수송체(SGLT-1)의 작용제를 포함하지 않는다.
SGLT-1의 다양한 기질은, α-메틸-D-글루코피라노사이드(α-methyl-D-glucopyranoside, AMG), 3-O-메틸글루코스(3-O-methylglucose, 3-OMG), 데옥시-D-글루코스(deoxy-D-glucose), 및 α-메틸-D-글루코스(α-methyl-D-glucose)와 같은 비대사성(non-metabolizable)글루코스 유사체; 및 갈락토스(galactose)를 포함하는 것으로 알려져 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 글루코스 수송체의 기질(예컨대, SGLT-1)은 기술 분야에서 알려진 작용제 평가(agonist assays)를 기초로 하여 선택될 수 있다. 또한, 글루코스 및 다른 카보하이드레이트(당류와 같은)의 구조적 변형은 글루코스 수송체의 기질(예컨대, SGLT-1)을 획득하도록 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 글루코스를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 글루코스 또는 글루코스 수송체(예컨대, SGLT-1)의 기질로 가수분해될 수 있는 다른 화합물, 또는 카보하이드레이트(디-, 올리고-, 또는 다당류와 같은)를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 조성물은, 프리 아미노산; 전해질; 디-펩타이드 및/또는 올리고펩타이드; 비타민; 및 임의적으로, 물, 치료적으로 허용가능한 담체, 부형제, 완충제, 착향제, 염료, 및/또는 보존제로부터 선택된 하나 이상의 성분으로 이루어지거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 포함한다.
다른 대안적 구현예에서, 조성물은, 프리 아미노산; 전해질; 디-펩타이드(di-peptides) 및/또는 올리고펩타이드(oligo-peptides); 비타민; 및 임의적으로, 물, 치료적으로 허용가능한 담체, 부형제, 완충제, 착향제, 염료, 및/또는 보존제로부터 선택된 하나 이상의 성분으로 이루어지거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 포함하며, 여기에서, 상기 글루코스 수송체(예컨대, SGLT-1)의 기질(글루코스, 글루코스 유사체와 같은) 및/또는 글루코스 수송체(예컨대, SGLT-1)의 기질로 가수분해될 수 있는 화합물(카보하이드레이트와 같은)은, 상기 조성물 내에 존재한다면, 0.05 mM 미만의 총 농도, 또는 이에 제한하지 않으나, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.008, 0.005, 0.003, 0.001, 0.0005, 0.0003, 0.0001, 10-5, 10-6 또는 10- 7mM미만을 포함하는, 0.05 mM 미만(lower than)의 임의의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 지사제 조성물(anti-diarrhea composition)은 당류(sugar)를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 지사제 조성물은 글루코스 수송체(예컨대, SGLT-1) 기질(글루코스, 글루코스 유사체와 같은) 및/또는 글루코스 수송체(예컨대, SGLT-1)의 기질로 가수분해될 수 있는 화합물(카보하이드레이트와 같은)을 포함하지 않는다.
본 발명의 지사제 조성물에 유용한 아미노산은, 알라닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 라이신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민, 아르지닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 및 타이로신을 포함하고, 이에 제한하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 지사제 조성물을 제공하며, 상기 조성물은, 프리 아미노산 라이신, 글리신, 트레오닌, 발린, 타이로신, 아스파르트산, 이소류신, 트립토판, 및 세린; 및 임의적으로, 라이신, 글리신, 트레오닌, 발린, 타이로신, 아스파르트산, 이소류신, 트립토판, 및 세린으로부터 선택된 하나 이상의 프리 아미노산으로 제조된 디펩타이드 또는 올리고펩타이드, 치료적으로 허용가능한 담체, 전해질, 완충제, 보존제, 및 착향제로 이루어지거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 포함한다.
일 구현예에서, 상기 지사제 조성물에 포함된 아미노산은 L-형이다. 일 구현예에서, 상기 치료 조성물에 포함된 상기 프리 아미노산은 중성(neutral) 또는 염형태(salt forms)로 존재될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 치료 조성물은 Na+, K+, Ca2 +, HCO3 -,및 Cl-로부터 선택된 하나 이상의 전해질을 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 치료 조성물은 소듐 클로라이드(sodium chloride), 소듐 비카보네이트(sodium bicarbonate), 칼슘 클로라이드(calcium chloride), 및/또는 포타슘 클로라이드(potassium chloride)를 포함한다.
특정 구현예에서, 각 프리 아미노산은 4 mM 내지 40 mM의 농도 또는, 이들 사이의 임의의 수치에서 존재 될 수 있으며, 상기 조성물의 총오스몰 농도는 약 100 mosm 내지 250 mosm이다. 본 발명에서 사용된 "로 필수적으로 이루어진"이라는 용어는, 상기 성분과 단계의 범위를, 예컨대, 위장병 및 위장 질환의 치료(특정 구현예에서, 로타바이러스-유발 설사와 같은 설사의 치료인), 재수화의 제공, 전해질 및 액 불균형의 교정, 및/또는 소장 기능의 개선방법 및 조성물과 같은, 본 발명의 기초적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는(materially affect)는, 특정 물질 또는 단계로 제한한다. 예를 들어, "로 필수적으로 이루어진"의 사용으로, 상기 치료 조성물은, 이에 제한하지 않으나, 위장병 및 위장 질환(특정 구현예에서, 로타바이러스-유발 설사와 같은 설사의 치료)의 치료, 재수화의 제공, 전해질 및 액 불균형의 교정 및/또는 소장 기능의 개선 상의 치료학적 효과(therapeutic effect)를 불리하게 하거나 또는 직접적인 이로움을 갖는, 비특정화된(unspecified) 프리 아미노산, 디-, 올리고-, 또는 폴리펩타이드(polypeptides) 또는 프로테인(proteins); 모노-, 디-, 올리고-, 또는 다당류(polysaccharides); 또는 카보하이드레이트를 포함하는 어떠한 비특정화된 성분을 포함하지 않는다.
또한, "로 필수적으로 이루어진"이라는 용어의 사용으로, 상기 조성물이, 위장병 및 위장 질환의 치료(특정 구현예에서, 로타바이러스-유발 설사와 같은 설사 치료), 재수화의 제공 전해질 및 액 불균형의 교정, 및 /또는 소장 기능의 개선 상에 치료학적 효과를 가지지 않는 물질(substances)을 포함할 수 있으며; 이와 같은 성분은, 위장병 및 위장 질환의 치료(일 구현예에서, 설사의 치료), 재수화의 제공, 전해질 불균형 교정, 및/또는 소장 기능의 개선에 영향을 주지 않는 담체, 부형제, 착향제, 염료, 및 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 "올리고펩타이드(oligopeptide)"이라는 용어는 3 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 관련된다.
본 발명에서 사용된 "올리고당(oligosaccharide)"이라는 용어는, 3 내지 20개의 단당류로 이루어진 당질(saccharide)에 관련된다. 본 발명에서 사용된 "카보하이드레이트(carbohydrates)"이라는 용어는, 일반적 화학식 Cn(H2O)n를 갖는 화합물에 관련되고, 여기서, n은 1로부터 시작하는 정수이다; 단당류(monosaccharaides), 이당류(disaccharides), 올리고당류(oligosaccharides), 및 다당류를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 조성물의 총 오스몰 농도는 약 100 mosm 내지 250 mosm, 또는, 이에 제한하지 않으나, 120 mosm 내지 220 mosm, 150 mosm 내지 200 mosm, 및 130 mosm 내지 180 mosm를 포함하는 상기 범위 내의 임의의 수치를 포함한다.
다른 구현예에서, 조성물의 총오스몰 농도는 약 230 mosm 내지 280 mosm 또는 이들 사이의 임의의 수치이다. 바람직하게는, 상기 총 오스몰 농도는 약 250 내지 260 mosm 이다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 280 mosm 미만의 임의의 수치인 총 오스몰 농도를 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 조성물은 약 2.9 내지 7.3의 pH를 포함하고, 또는, 이에 제한하지 않으나, pH 3.3 내지 6.5, 3.5 내지 5.5, 및 4.0 내지 5.0를 포함하는, 이들 사이의 임의의 수치를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 조성물은 약 7.1 내지 7.9, 또는 이들 사이의 임의의 수치의 pH를 갖는다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약 7.3 내지 7.5, 더 바람직하게는 약 7.2 내지 7.4, 또는 더욱더 바람직하게는 약 7.2의 pH를 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 조성물은, 올리고- 또는 다당류 또는 카보하이드레이트; 올리고- 또는 폴리펩타이드 또는 단백질; 지질; 짧은-, 중간-, 및/또는 긴-사슬 지방산(chain fatty acids); 및/또는 하나 이상의 상기 언급된 영양소(nutrients)를 포함하는 식품 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함하지 않는다.
위장병 및 위장 질환의 치료(Treatment of Gastrointestinal Diseases and Conditions)
본 발명의 다른 양상은, 위장병 및 위장 질환의 치료 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 설사를 치료하고, 재수화를 제공하고, 전해질 및 액 불균형을 교정하고 및/또는 소장 기능을 개선하는데 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 로타바이러스-유발 설사의 치료를 제공한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 NSP4에 의한 유발 설사의 치료를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 방법은, 본 발명의 조성물의 유효량을, 이와 같은 치료가 필요한 대상에게 경장 경로(enteral route)를 통하여 투여하는 단계를 포함한다. 상기 조성물은 하루 당 한번 또는 여러번 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 경구적으로 투여된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 Cl- 및/또는 HCO3 -의 감소 분비 및/또는 액(fluid)흡수의 개선을 제공한다.
본 발명에 사용된 "치료(treatment)" 또는 이의 임의적 문법적 변형(예컨대, 치료하다, 치료한, 및 치료 등)은 이에 제한하지 않으나, 질병 또는 질환의 증상을 완화하고 또는 경감하고; 및/또는 질환 또는 질병의 혹독한 고통을 줄이는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 설사의 완화 또는 경감, 설사의 고통을 줄임, 설사 기간을 줄임, 창자 힐링(intestinal healing)을 개선함, 재수화를 제공함, 전해질 불균형을 교정함, 소장 점막 힐링을 개선함 및 설사가 있는 대상에서 융모의 높이(villus height)를 증가시킴.
본 발명에서 사용된 "유효량(effective amount)"이라는 용어는, 질병 또는 질환을 경감시키고, 치료가능하고, 또는 의도된 치료법적 효과(therapeutic effect)의 생성이 가능한 함량에 관련된다.
본 발명에서 사용된, "대상(subject)" 또는 "환자(patient)"라는 용어는, 본 발명에 따른 조성물에 의한 치료가 제공될 수 있는 영장류(primates)와 같은 포유동물(mammal)을 포함하는, 유기체를 설명한다. 개시된 치료방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 포유류 종은, 이에 제한하지 않으나, 유인원(apes), 침팬지(chimpanzees), 오랑우탄(orangutans), 인간(humans), 원숭이(monkeys); 개, 고양이와 같은 가축(domesticated animals); 말, 소, 돼지(pigs), 양(sheep), 염소(goats), 닭(chickens)와 같은 가축(live stocks); 및 쥐, 토끼, 기니피그(guinea pig) 및 햄스터와 같은 다른 동물을 포함한다.
일 구현예에서, 인간 대상(human subject)은 한 살 미만의 유아 또는 생후 10달, 생후 6달 및 생후 4달과 같은 한 살 보다 더 어린 아이이다. 다른 구현예에서, 인간 대상은 5살 미만의 아동, 또는, 4살, 3살, 및 2살과 같은 5살보다 더 어린 아동이다. 일 구현예에서, 본 발명의 치료가 필요한 대상은 설사에 의해 고통을 겪고 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 설사를 치료하는데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은, 이에 제한하지 않으나, 로타바이러스, 노워크 바이러스(Norwalk virus), 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 및 간염(hepatitis)을 포함하는 바이러스에 의한 감염; 이에 제한하지 않으나, 캄필로박터(campylobacter), 살모넬라(salmonella), 쉬겔라(shigella), 콜레라균(Vibrio cholerae), 및 대장균(Escherichia coli )을 포함하는 박테리아(bacteria) 감염; 이에 제한하지 않으나, 람블편모충(Giardia lamblia) 및 크립토스포리디움(cryptosporidium)을 포함하는 기생충(parasites)를 포함하는 병원성 감염(pathogenic infection)에 의한 설사를 치료하는데 이용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 로타바이러스-유발 설사를 치료하는데 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어, 감염(infection), 독소, 화학물(chemicals), 알콜, 염증, 자가면역질환, 암, 화학요법-, 방사선, 양성자 테라피, 및 위장수술에 의한 소장 상처로 발생된 설사를 치료하는데 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 이에 제한하지 않으나, 크론병 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 포함하는 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases, IBD); 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS); 자가면역 장증(autoimmune enteropathy); 전장염(enterocolitis); 및 소아 지방변증(celiac diseases)을 포함하는 질병에 의해 발생한 설사의 치료에 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 위장수술; 위장의 절제(resection); 소장의 이식; 수술후-외과적 외상(post-surgical trauma); 및 방사선-, 화학요법-, 및 양성자 테라피-유발 장염(proton therpy-induced enteritis)에 의해 발생한 설사의 치료에 이용될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 알콜-관련된 설사를 치료하는데 이용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 식중독에 의해 발생한 설사 및/또는 여행자 설사(traveler's diarrhea)의 치료에 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 소장 점막의 상처에 의해 발생한 설사 치료에 이용될 수 있으며, 예를 들어, 소장에서 점막 표면적의 감소, 융모 높이의 줄어듬 및 예컨대, 융모 부위 및 브러시보더의 부분적으로 또는 완전하게 쇠약해지는, 융모 위축이 있는, 설사 질환이다. 특정 구현예에서, 본 발명은, 십이지장, 빈 창자(jejunum) 및 회장의 점막층을 포함하는, 소장 점막의 상피 세포의 상처(injury)에 의한 설사 치료에 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 분비성 설사를 치료하는데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CFTR 채널 및/또는 CaCC 채널(예컨대, TMEM-16a)에 의해 중재된(mediate) 분비성 설사를 치료하는데 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 급성 및/또는 만성 설사를 치료하는데 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 영양소의 흡수불량(malabsorption of nutrients)에 의한 설사를 치료하는데 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 SGLT-1와 같은 글루코스 수송체의 기능활성(functional activity) 또는 수준의 감소에 의해 유발되는 분비성 설사를 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된, "설사(diarrhea)"라는 용어는 3종류 이상의 형태가 없는 똥, 묽은 똥 또는 물똥이 24시간 이내에 발병하는 질환에 관련된다. "급성설사(Acute diarrhea)"는 4주 이상 진행되지 않는 설사 질환에 관련된다. "만성설사(Chronic diarrhea)"는 4주 이상 진행된 설사 질환에 관련된다.
일 구현예에서, 본 발명은 글루코스, 글루코스 유사체, 글루코스 수송체의 기질(예컨대, SGLT-1), 디-, 올리고-, 또는 다당류; 카보하이드레이트; 또는, 글루코스 수송체(예컨대, SGLT-1)의 기질 또는 글루코스로 가수분해될 수 있는 분자로부터 선택된 하나 이상의 성분의 투여를 포함하지 않는다.
특정 대안적 구현예에서, 본 발명은, 글루코스; 글루코스 유사체; 글루코스 수송체의 기질(예컨대, SGLT-1); 디-, 올리고-, 또는 다당류; 카보하이드레이트; 또는 글루코스 또는 글루코스 수송체(예컨대, SGLT-1)기질로 가수분해될 수 있는 분자로부터 선택된 하나 이상의 성분을 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 이러한 성분의 총 농도는 0.05 mM 미만, 또는 이에 제한하지 않으나, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.008, 0.005, 0.003, 0.001, 0.0005, 0.0003, 0.0001, 10-5, 10-6 또는 10-7 mM 미만을 포함하는 0.05 mM 미만의 임의의 농도이다.
제제 및 투여(Formulations and Administration)
본 발명은 대상 조성물의 치료적으로 유효한 양 및 임의적으로, 약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable) 담체를 포함하는 치료적 또는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 담체는 물과 같은 멸균액(sterile liquids)일 수 있다. 또한, 치료 조성물은, 위장병 및 위장 질환의 치료(일 구현예에서, 설사의 치료), 재수화의 제공, 전해질 및 액 불균형을 교정, 및/또는 소장 기능(function)을 개선하는데 유효하지 않은 부형제, 착향제, 염료, 및 보존제 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에서 포함된 상기 치료 조성물 및 모든 성분은 멸균된다(sterile). 특정 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 드링크로서 제형화되고, 또는 상기 조성물은 드링크로 사용하기 위해 물에서 환원될 수 있고, 분말형상이다.
"담체(carrier)"라는 용어는, 화합물과 함께 투여되는 희석액, 보조제(adjuvant), 부형제, 또는 매제(vehicle)에 관련된다. 적절한 약학적 담체의 예는, "Remington's Pharmaceutical Sciences"(by E. W. Martind)에서 기술된다. 이러한 화합물은 적절한 함량의 담체와 함께, 치료용 조성물의 치료 유효량을 포함하고, 환자에게 알맞은 투여를 위한 형태를 제공한다. 제형은 투여의 경장모드(enteral mode of administration)에 맞출 수 있다.
또한, 본 발명은, 예컨대, 화합물, 담체, 또는 본 발명의 약학적 조성물(pharmaceutical compositions)과 같은, 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기(containers)를 포함하는 약학적 팩(pharmaceutical pack) 또는 키트(kit)를 제공한다. 조성물의 성분(ingredients)은, 개별적으로 포장될 수 있고, 또는 함께 혼합될 수 있다. 상기 키트는 환자에게 조성물을 투여하는 사용설명서(instructions)를 더 포함할 수 있다.
물질 및 방법
동물준비
정상적으로 사육된, 8주, 수컷 NIH 스위스 쥐(NIH Swiss mice)가 CO2흡입으로 희생되고, 다음으로, 경추탈골이 이어진다. 소장은 조심스럽게 제거되고, 세그먼트는 세척되고 아이스-콜드 링거용액(ice-cold Ringer's solution) 내에서 플러쉬된다(flushed). 다음으로, 상기 점막은, 이전에 기술된 바와 같이, 점막하판(submucosal plane)을 통한 스트리핑(striping)에 의해 근육층(muscular layer) 및 장막(serosa)으로부터 분리된다(Zhang et al.(2007) J Physiol 581(3):1221-1233). 체혈(exsanguination)에 이어서, 회장 점막은 맹장에 가까운 10 cm 세그먼트로부터 획득된다. 모든 실험은 "University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee"에 의해 승인되었다.
생체 전기 측정(Bio-electric measurements)
이온 수송(Ion transport) 연구는 회장 시트(ileal sheets) 상에 수행된다. 다음으로, 조직은 0.3 cm2 노출된 표면적으로 유싱형-“Lucite”챔버(Ussing type-Lucite chamber)의 두 개의 하프(halves) 사이에 마운트된다(P2304, Physiologic Instruments, San Diego, CA, USA). 95 % O2으로 버블링된 레귤러 링거 용액(115mM NaCl, 25mM NaHCO3, 4.8mM K2HPO4 , 2.4mM KH2PO4, 1.2mM MgCl2 및 1.2mM CaCl2); 5 % CO2는 조직에 대한 배싱 용액(bathing solution)으로서 양 방향으로 이용되고, 온도는 37 ℃에서 일정하게 유지된다. 상기 챔버는 삼투성 및 정역학적 힘을 제거하도록 균형이 맞추어진다. 흐름으로 인한 저항도 또한 보상된다. 상기 조직은 안정화된다. 기저 단락 전류(basal short-circuit current, Isc)및 관련 전도도(conductance, G)는 컴퓨터 제어 압력/전류 클램프 장치(computer controlled voltage/current clamp device, VCC MC-8, Physiologic Instruments)를 사용하여 기록된다.
흐름 연구(Flux studies)
소듐 동위 원소, 22Na는, 기저 상태(basal conditions)하에서 점막에 걸친 Na 흐름에 잇따르는 글루코스 첨가를 연구하는데 이용된다(Isotope of Sodium, 22Na, is used to study Na flux across the mucosa under basal conditions followed by addition of glucose). 전도도-페어된 조직(Conductance-paired tissues)은 흡수성의 기능을 나타내는 점막에서 장막으로 흐름(mucosal to serosal flux, Jms), 분비기능(secretory function)을 나타내는 장막에서 점막으로 흐름(serosal to mucosal flux, Jsm)을 연구하도록 고안된다. 22Na는 상기 조직의 지정된 측면으로 첨가되고, 500 ㎕ 샘플이 다른 측면으로부터 15 분 마다 수집된다. 조직의 분리세트(separate set) 내 36Cl가 장막 또는 점막면 중 어느 하나에 첨가된다. 8 mM 농도의 글루코스는 전체 자극(full stimulation)을 위해 챔버 내로 첨가되고, I sc 에서 대응 변화(corresponding changes) 및 전도도가 기록된다. 전도도는 Ohm의 법칙에 기초하여 기록된다.
3종류 샘플이 각각의 조건에서 수집된다. 라디오활성도(Radioactvity)는 감마 카운터(gamma counter)를 사용하여 측정된다. 10 % 미만의 전도도 변화를 갖는 조직은 매치되고, 평균 Jnet=Jms-Jsm이 계산된다.
단백질 인산화효소 A(
PKA
) 억제제 연구(Protein
Kinase
A (
PKA
) inhibitor studies)
유사한 전도도 및 전류로 짝지워진 조직은(Tissues paired with similar conductance and current), 비가역적 단백질 인산화효소 A(PKA) 억제제, 100 μM H-89(Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA)없이, 또는 함께 처리된다. 상기 조직은 30 분 동안 H-89로 배양된다. (0.015-8mM)글루코스의 농도 증가는 5분 마다 추가되고, 전류 피크는 기록된다. 포화운동상수(Saturation kinetic constant)는 처리된 및 처리되지 않은 조직에 대한 상응 Km 및 Vmax에 대해 계산된다.
Caco
-2 세포 배양
Caco-2 세포는 태아회장상피(fetal ileal epithelium)의 기능적 특징을 갖는 세포로 후밀집도로 분화한다. Caco-2 세포는 SGLT1를 포함하는 소장 특이적 수송 단백질(small intestine specific transport proteins)의 증가된 발현을 갖고 미세 융모를 생성하고, 이로써, 장세포 기능을 연구하기 위한 모델 시스템으로서 광범위하게 이용된다.
Caco-2 세포는 ATTC에서 획득되고, 37 ℃ 및 5 % CO2에서 비필수 아미노산(nonessential amino acid) 1 % 및 10 % 태아송아지혈청(fetal calf serum, FCS)이 첨가된 "Dulbecoo's modified Eagle's medium "에서 배양된다. Caco-2 세포는 20-25회 패시지되고(passaged), 5 cm 페트리 디쉬(petri-dishes) 상에(2 x 105 cells/dish)심어지고 FCS 농도이 5 %까지 변화될 때, 80 % 밀집도(confluence)까지 성장된다. 세포는 이들이 기능 연구에 이용되기 전에 추가 10일 동안 성장된다.
공초점
Ca
2
+
형광현미경(Confocal
Ca
2
+
fluorescence microscopy)
25 mm 라운드 커버슬립(round coverslips)에서 성장된 Caco2 세포는 시리즈 20 스테이지 아답터(series 20 stage adapter, Warner Instruments, CT USA)에 부착된 배스 챔버(bath chamber) RC-21BR 상에 마운트 된다. 상기 세포는 싱글 채널 테이블 탑 히터컨트롤러(single channel table top heater controller, TC-324B, Warner Instruments, CT USA)를 사용하여, 37 ℃에서 유지된다. 세포는 실온에서 0.5 μM 농도의 형광칼슘지표 Fluo-8 AM 염료(fluorescent calcium indicator Fluo-8 AM dye)(Cat # 0203, TEFLab, Inc., Austin, TX USA)로 로딩되고, 45분 동안 배양된다. 공초점레이저조사현미경(Confocal laser scanning microscopy)이 "inverted Fluoview 1000 IX 81 microscope(Olympus, Tokyo, Japan)" 및 “U Plan S-Apo 20×대물렌즈(objective)”를 이용하여 수행된다. 형광은 488 nm 여기 및 515 nm 방출(emission)의 아르곤 레이저에 의해 기록된다. 형광 이미지는 주사공초점현미경(scanning confocal microscope)으로 수집된다. 링거, 글루코스-함유 링거 용액 또는 BAPTA-AM-함유 글루코스-링거 용액 중 어느 하나의 용액은, VC-8 밸브 콘트롤러(VC-8 valve controller, Warner instruments, Hamden CT, USA)를 사용하여 조절된 다중 밸브 관류시스템(multi-valve perfusion system, VC-8, Warner instruments, Hamden CT, USA)을 사용하는 배스에 첨가된다. 변화는 기록되고, 형광은 다양한 세포에서 측정된다. 세포는 링거 용액(Ringer's solution)으로 세척되고, 실험은 3-O-메틸글루코스 및 카르베콜(carbechol, 양성 대조)을 이용하여 반복된다.
비색적
cAMP
측정(
Colorimetric
cAMP
measurements)
회장 상피 세포의 신선한 분리된 점막 스크랩핑(Freshly isolated mucosal scrapings)은 37 ℃에서 1.2 mM Ca2 +를 포함하는 링거 용액(Ringer's solution)에서 3회 세척된다. 세척된 세포는 다음으로, 두 개의 그룹으로 나누어지고, 식염수 또는 6 mM 글루코스로 처리되고, 45 분 동안 배양된다. 세포는 0.1 M HCl로 처리되어 내생 포스포디에스테르가수분해효소활성(endogenous phosphodiesterase activity)을 정지시킨다. 다음으로, 용해물은 cAMP 직접면역 분석법 키트(direct immunoassay kit)(Calbiochem, USA)를 사용하여 cAMP평가를 위해 이용된다.
cAMP의 정량 평가(quantitative assay)는 경쟁방식(competitive manner)으로 샘플에서 cAMP에 결합하는 cAMP에 대한 폴리클론성 항체(polyclonal antibody)를 사용한다. 실온에서 동시 배양 이후에, 과량의 약물은 버려지고, 기질이 첨가된다. 단기 배양시간 이후에, 상기 반응은 정지되고, 발생된 노란색은 405 nm에서 읽혀진다. 색의 세기는 표준 및 샘플 cAMP의 농도에 반비례한다. cAMP 수준은 각 분획으로부터 단백질 수준에 표준화되고, pmol(mg protein)-1로 표현된다.
포르스콜린 처리된 세포는 양성대조군으로 이용된다. 글루코스 및 포르스콜린 처리된 세포는 45 분 동안 배양된다. 모든 평가는 3회씩 수행되고, n = 4 다른 쥐까지 반복된다.
실시예
다음에 따른 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 구현예 및 공정을 기술한 것이다. 이러한 구현예는 제한적으로 이해되지 않는다. 모든 백분율은 중량에 따른 것이고, 모든 용매 혼합 비율은 달리 언급하지 않는다면 부피에 따른 것이다.
실시예1
- 회장에서
글루코스
-자극
I
sc
증가(Glucose-stimulated increase in
I
sc
in ileum)
본 실시예는 쥐의 회장에서 Isc상의 증가를 자극하는 것을 보여준다. 구체적으로, 루멘 사이드에 글루코스(8 mM)의 첨가는 이의 기저 수준(basal level, 3.4±0.2 vs 1.1±0.1μEq.h- 1.cm- 2)과 비교 시, I sc상에 상당한 증가를 야기하였다. 표준 유싱 챔버 연구(standard Ussing chamber studies)를 이용하여 획득된 상기 I sc는 상피(epithelium)에 걸친 네트 이온 이동(net ion movement)의 집적(summation)이다(I sc=J netNa++J netCl-+J netHCO3 --J netK+).
소장에서 Na+흡수성의(absorptive)(ENaC-mediated) 또는 Na+분비 메카니즘(secretory mechanisms)은 알려져 있지 않다. 상피세포 나트륨 채널 억제제, 10 μM 아밀로라이드(amiloride)로 소장의 점막면(mucosal side)의 치료는, I sc에 대한 효과를 생성하지 않는다.
그러므로, 1.1 ± 0.1 μEq.h- 1.cm-2의 기저 I sc는 대부분 소낭선 및 K+분비 전류(secretory current)로부터 낭성섬유증 막전위 전도도 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 활동에 의한 것이다.
Na+-결합된 글루코스 수송의 포화 역학(saturation kinetics)을 결정하기 위해, 글루코스의 농도의 8 mM까지 증가는 140 mM Na+의 존재에서 루멘 면에 첨가된다. 글루코스의 농도 증가는 글루코스에 대한 3.6±0.19 μeq·h-1·cm-2의 V max 및 0.24±0.03 mM의 Km와 함께, I sc(도 1a)의 포화율의 증대(enhanced but saturable rate of I sc)를 야기한다. 0.5 내지 0.7 mM 범위에 있는 글루코스 농도에서, 글루코스 포화 역학은 초기의 포화도 신호를 보여주고; 그럼에도 불구하고, 글루코스 농도에서 지속적인 증가는 I sc, 상의 지속적인 증가를 야기하여, 0.5 내지 0.7 mM의 글루코스 농도에서 글루코스 포화 곡선(saturation curve)에서 닉(knick)을 산출한다.
실시예
2 - 3-O-
메틸
-
글루코스
-자극
I
sc
의
증가(3-O-methyl-Glucose-stimulated increase in
I
sc
)
본 실시예는 실시예 1에서 측정된 글루코스 포화 역학이 상피 세포에서 글루코스 대사가 아닌 SGLT1-중개 수송(mediated transport)에 의한 것인지 조사하였다. 구체적으로, 3-O-메틸-글루코스(3-OMG), 글루코스의 약하게 대사작용된 형태(poorly metabolized form of glucose)는, Na+-결합된 글루코스 수송의 포화 역학을 연구하기 위해 루멘 면에 첨가되었다.
도 1b는 2.3±0.13 μeq·h-1·cm-2의 Vmax 및 0.22±0.07 mM의 Km와 함께, 3-OMG의 포화 역학을 보여준다. 3-OMG의 첨가는, 글루코스인 것과 비교 시, Na+-결합된(coupled) 글루코스 수송 내에서 Km의 변화 없이 Vmax(2.3±0.13μeq·h-1·cm-2 vs 3.4±0.2μeq·h-1·cm- 2)의 상당한 감소를 야기한다. 글루코스와 유사하게, 닉(knick)은 농도 0.5 내지 0.7 mM에서 3-OMG로 측정되었다(도 1b).
실시예
3 - H-89의 존재에서
글루코스
-자극
I
sc
(
Glucose-stimulated
I
sc
in the presence of H-89)
최근-알려진 수송 메카니즘에 기초하여, I sc내의 글루코스-자극 증가는 전기발생 음이온 분비 또는 전기발생 Na+흡수에 의한 것일 수 있다.
또한, cAMP-의존 단백질 인산화효소으로 알려져 있는 단백질 인산화효소 A(PKA)는 CFTR 채널의 활성화를 요구한다. I sc내의 글루코스-유발 증가에서 PKA에 대한 역할을 연구하기 위해, 조직은 유싱 챔버에 마운트되고, 45분 동안 H-89, PKA 억제제로 배양된다. 결과적으로, 상기 조직은 글루코스 포화 역학을 연구하기 위해 이용된다.
H-89의 존재하에서, 글루코스는 0.8±0.06 μEq.cm- 2.h-1의 Vmax 및 0.58±0.08 mM의 Km를 보여준다. 글루코스 포화 곡선(회장 조직(ileal tissues)이 0.5 내지 0.7 mM의 농도에서 글루코스로 배양될 때 측정된)에서 상기 닉은, 회장 세포(ileal cells)가 H-89로 전처리될때, 상기 포화곡선의 오른쪽으로의 이동으로 완전하게 사라진다(도 1c). 그 결과는 글루코스의 낮은 농도에서 PKA-의존 수송 과정의 억제를 의미한다.
글루코스 포화 곡선과 유사하게, 또한, 3-OMG는 PKA-감지전류(sensitive current)를 보여준다. 상기 3-OMG 포화 곡선(H-89 배양으로)은 글루코스(H-89 배양으로)(도 1a 및 1b)로 측정되는 것과 상당히 다르지 않다.
표 1. H-89 - PKA 억제제의 부재 및 존재에서 글루코스 및 3-O-메틸-글루코스 포화 역학의 변화
*글루코스 및 3-OMG-자극 전류 부분은 PKA의 존재에서 저해된다(abolished). 결과는 n= 8 조직에 의한 것이다.
그 결과는, PKA-억제가능한 전류(inhibitable current)(표 1에서 나타낸)는, 글루코스를 포함하는 (표 1) 다른 세포 내 대사 대신에, Na+-결합된 글루코스 수송체에 의한 것임을 의미한다.
PKA는 cAMP-중재 음이온 분비 및 SGLT1-중재 Na+ 및 글루코스 흡수에서 중대한 역할로 작용한다. H-89-둔감한 전류(H-89-insensitive current)의 존재는, 글루코스가 비-PKA-중재 음이온 분비(세포 내 Ca2 +-중재 분비와 같은)를 자극하는 것을 의미한다.
실시예
4-
프롤리진의
존재에서
I
sc
내
글루코스
-자극 증가의 저해(abolishment of Glucose-stimulated increase in
I
sc
in the presence of phlorizin )
글루코스 수송의 억제(inhibition)가 PKA-감응 전류를 저해하는지를(abolishes) 조사하기 위해, 실험은 프롤리진(Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA), SGLT1의 가역적 경쟁(reversible competitive) 억제제를 사용하여 실시된다. 구체적으로, 유싱 챔버 내에 마운트된 회장 조직은, 루멘 면 상에 100 μM 프롤리진으로 처리되고, 글루코스 포화 역학(saturation kinetic) 연구가 실시된다.
그 결과는 I sc내 글루코스-자극 및/또는 3-OMG 증가가 프롤리진의 존재에서 완전하게 저해되는 것을 보여준다(도 1c). 그 결과는, SGLT1를 통한 글루코스 수송체 활성이 PKA-감응 및 둔감 전류에 필수적인 것을 의미한다.
실시예
5-소듐의 단일 방향성 흐름 및 네트 흐름에서
글루코스의
효과(effect of glucose on Unidirectional and net flux of sodium)
Na+의 동위 원소흐름(Isotopic flux) 측정은, 점막에서 장막 J ms 또는 장막(serosa)에서 점막 J sm 중 어느 하나로부터 정상 상태의 이송율(steady-state rate of transfer)에서 22Na를 사용하여 수행된다(Isotopic flux measurements of Na+ are performed using 22Na at a steady-state rate of transfer from either mucosa to serosa J ms or serosa to mucosa J sm). Na+의 네트 흐름은 다음의 식 J net = J ms-J sm을 사용하여 계산된다. +J net는 네트 흡수를 의미하고; 반면에, -J net는 네트 분비를 의미한다.
글루코스(0 mM)의 부재에서, 소장의 조직은 네트 소듐 흡수(1.8±0.3 mEq.h-1.cm-2)를 보여준다. Na+흡수는 0.6 mM 글루코스의 존재에서 저해된다(abolished). 그러나, 6 mM 글루코스의 첨가는 네트 소듐 흡수를 의미하고, Jnet Na +(3.2±0.5mEq.h-1cm-2)에서 상당한 증가를 일으킨다. 단일방향성(Unidirectional) Na+흐름(fluxes)은 0, 0.6 및 6 mM 글루코스에서 상당한 차이를 보이지 않는다(도 2b).
실시예
6- 클로라이드의 단일방향 흐름 및 네트 흐름 상에
글루코스의
영향(effect of glucose on Unidirectional and net flux of Chloride)
0.6 mM 글루코스에서 I sc 상의 변화는 1.1 μEq.h- 1.cm-2(2.2±0.3-1.1±0.1μEq.h-1.cm-2)로 계산되고, 6 mM 글루코스에서 I sc 상의 변화는 2.2 μEq.h- 1.cm-2(3.4±0.2-1.1±0.1μEq.h-1.cm-2)으로 계산된다. 글루코스 농도 증가에 따른 I sc의 증가는 J net Na+ 수치(0.6 및 6 mM 글루코스에서 수치를 기초로 한)을 기초로 하여 전체적으로 설명될 수 없다.
Cl-의 동위 원소흐름 측정은 J netNa+에 기인할 수 없는 I sc의 일부분에 대해 설명할 수 있는 지를 결정하기 위해 36Cl를 사용하여 수행된다. 글루코스의 부재에서 계산된 J netCl-는 Cl-흡수(2±0.3μEq.h- 1.cm- 2)를 보여준다. 소듐 흡수(1.8±0.3μEq.h-1.cm-2)의 수준은 글루코스의 부재에서 클로라이드(2.0±0.3μEq.h- 1.cm- 2)의 것과 비교가능하고, 전기적 중성 Na+ 및 Cl-흡수를 의미한다.
점막 면에 0.6 mM 또는 6 mM 글루코스의 첨가는 네트 Cl-분비(도 2a)를 야기한다. 0.6 mM 글루코스(-3.6±0.8μEq.h- 1.cm-2) 및 6 mM 글루코스(-4.0±1.4 μEq.h-1.cm-2)에서 J netCl-가 거의 다르지 않다.
그 결과는, 글루코스의 부재에서 J smCl-와 비교 시(11.9 ± 0.4 μEq.h- 1.cm-2), 글루코스(0.6 및 6 mM 글루코스에서)의 존재에서 J smCl-의 상당한 증가(J smCl-16.9±0.7μEq.h-1.cm-2 및 17±0.7μEq.h- 1.cm-2, 각각)가 있다는 것을 보여준다(도 2a). 상기 결과는, 상당한 Cl-분비는 0.6 mM과 같이 낮은 글루코스 농도에서 발생하는 것을 의미한다. 증가한 글루코스 농도는 Cl-분비 증가를 야기하지 않는다.
실시예
7-
루멘
글루코스의
결핍상태(absence)에서 회장 내의
HCO
3
-
분비(
HCO
3
-
secretion in ileum in the absence of lumen glucose)
상피전위 전기측정(Transepithelial electrical measurements) 및 흐름 연구는, 회장 조직에 글루코스 첨가가 상당한 Cl--분비를 유발하는 것을 보여준다. 0.6 및 6 mM 글루코스에서 J netCl-이 상당한 음이온 분비를 보여주지만, 이는 6 mM 글루코스 6 μEq.h- 1.cm-2(7.5±0.4-1.5±0.1μEq.h- 1.cm-2) 및 0.6 mM에서 I sc 수치들 간에 상당한 차이가 있다는 점에서, 특히, I sc의 모든 변화에 대해 이유가 되지 않는다.
pH 통계 연구는, I sc의 설명되지 않은 부분에 HCO3 -분비가 기여하는지 결정하기 위해 수행된다. 쥐 소장에서 HCO3 -분비의 최소한 두 가지 모드가 본 발명의 발명가에 의해 확인되었다: 1) Cl--의존, 전기적 중성 Cl--HCO3 -교환, 및 2) Cl--비의존, 전기발생 HCO3 -분비.
그 결과는, 내생(endogenous) HCO3 -분비가 네트 HCO3 -분비에 기여하지 않는 것을 보여준다. 구체적으로, HCO3 --프리(free), 미약하게 완충된 액(poorly buffered solution)은 유싱 챔버(Ussing chamber) 내에 마운트된 조직의 양면에 첨가되고, 상기 조직의 양면은 100 % O2로 버블링된다. 최소 HCO3 -분비(0.1±0.01 mEq.h-1.cm-2, n=12)는 이러한 상태에서 기록된다. 기저외측면(basolateral side)으로 HCO3 --함유 완충액의 다음 첨가 및 상기 측면 상에 95 % O2및 5 % CO2의 버블링은 상당한 HCO3 -분비 3.8±0.2 mEq.h-1.cm-2(n=9)를 발생시킨다.
루멘 Cl--비의존 HCO3 -분비가 HCO3 -분비(루멘 글루코스의 부재에서)에 역할을 하는지 결정하기 위해서, pH 통계 실험이 루멘 Cl-의 부재에서 수행된다. 루멘 Cl-의 부재에서, 최소의 HCO3 -분비가 기록된다(0.4±0.1 μEq.h-1.cm-2)(도 5a). 그 결과는, 루멘 글루코스의 부재에서, 기저 HCO3 -분비가 대체로 Cl--의존, 전기적 중성 Cl--HCO3 -교환에 의한 것임을 의미한다.
실시예
8-회장에서
HCO
3
-
분비에 대한
루멘
글루코스의
효과(Effect of lumen glucose on HCO
3
-
secretion in ileum)
pH 통계 실험은 루멘 Cl--의존 HCO3 -분비 상에 글루코스 효과를 결정하기 위해 수행된다. 루멘 Cl-의 존재에서, 루멘 면에 글루코스의 첨가는 상당한 HCO3 -분비(7.6±μEq.h-1.cm-2)를 발생시킨다.
글루코스의 존재에서 HCO3 -분비는 루멘 Cl--의존, 전기적 중성 Cl-HCO3 -교환 또는 루멘 Cl--비의존 음이온 채널-중재 HCO3 -분비에 의한 것일 수 있다. 글루코스-자극 HCO3 -분비의 메카니즘을 평가하기 위해, 글루코스는 점막면에 첨가된다. 루멘 Cl-의 제거는 6 mM 글루코스(3.2±0.6 μEq.h- 1.cm- 2)로 배양된 조직 내에서 HCO3 -분비를 저해하지 않는다(도 5a). 그 결과는, 글루코스의 존재에서 HCO3 -분비가 대체로 루멘 Cl--비의존 분비에 의한 것이고, 음이온 채널-중재인 것을 의미한다.
다른 실험에서, 100 μM 5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)-벤조산(5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoic acid, NPPB), 비특이성(non-specific) 음이온 채널 블럭커가 루멘 면에 첨가된다. NPPB는 6 mM 글루코스의 존재에서 감지된 루멘 Cl--비의존 HCO3 -분비를 억제한다(도 5b).
그 결과는 글루코스-자극 HCO3 -분비가 음이온 채널(anion channel)을 통해 중재되는 것을 의미한다. 글루코스-유발 HCO3 -분비가 CFTR 채널을 통해 발생하는 것인지 조사하기 위해서, 100 μM 글리벤클라미드(glibenclamide)이 루멘 면에 첨가된다. 글리벤클라미드는 글루코스에 의한 루멘 Cl--비의존 HCO3 -분비-자극을 억제하고, CFTR 채널이 글루코스-자극된 HCO3 -분비를 중재하는 것을 의미한다.
실시예
9-음이온 채널-중재
HCO
3
-
분비에 대한
글루코스
대사의 효과(Effect of glucose metabolism on anion channel-mediated HCO
3
-
secretion)
소장 조직에서 글루코스 대사가 글루코스-중재 HCO3 -분비에 기인하는 지에 대해 평가하기 위해, 소장 조직은 루멘 및 배스 HCO3 -의 부재에서, 글루코스의 약하게 대사된 형태, 3-OMG로 배양된다. HCO3 -분비(0.1±0.03 μEq.h- 1.cm- 2)는 루멘 및 배스 HCO3 -의 부재 및 3-OMG(6 mM)의 존재에서 측정된다.
실시예
10-회장에서 세포 내
cAMP
수준에 대한
글루코스의
효과(Effect of glucose on intracellular cAMP level in ileum)
글루코스의 부재에서, 융모 세포로부터 세포 용해물(lysate)은 소낭선 세포 것과 비교 시, 더 높은 세포 내 cAMP 수준을 보여준다. 포르스콜린 배양은, 융모 및 소낭선 세포(도 3a)에서 [cAMP]i수준의 상당한 증가를 유도한다. 포르스콜린-처리 세포(Forskolin-treated cells)는 양성 대조군(positive control)으로서 사용된다.
세포 내 cAMP 수준에서 글루코스 효과를 연구하기 위해, 융모 및 소낭선 세포는 6 mM 글루코스에서 배양된다. 글루코스로 융모 세포 용해물의 배양은, 소낭선 세포(도 3b)의 것과 비교 시, 세포 내 cAMP 수준에서 상당한 증가를 유도한다. 상기 결과는, 세포 내 cAMP 수준에서 글루코스-중재 증가가 글루코스-자극 음이온 분비를 중재하는 역할을 수행하는 것을 의미한다. 증가된 [cAMP]i이 융모 세포에서 측정되지만, 소낭선 세포에서는 그렇지 않다; 이는, 글루코스 수송 기구(glucose transport machinery)가 단지, 완전히 성숙(fully mature)하고 분화된 융모 상피 세포에서 필요하다는 것을 의미한다.
글루코스 대사(metabolism)가 세포 내 cAMP 수준에 대한 영향을 가지는 지를 결정하기 위해서, 회장으로부터 스크레이핑한(scraping) 점막이 45 분 동안 3-OMG로 전처리되고, 다음으로, 상기 세포 용해물이 세포 내 cAMP 수준 측정을 위해서 사용된다.
글루코스와 유사하게, 0.6 및 6 mM의 농도에서 3-OMG로 융모 세포의 배양은, 세포 내 cAMP 수준에서 상당한 증가를 유도한다(도 3c). 6 mM에서 3-OMG로 융모 세포의 배양은, 6 mM 글루코스(P < 0.01)(도 3c)의 것과 비교 시, 상당히 더 높은 세포 내 cAMP 수준을 일으킨다. 그 결과는, 세포 내 cAMP 수준의 측정된 증가는 소장 조직 내에서 글루코스 대사에 의해 일어난 것이 아님을 보여준다.
실시예
11 -
Caco2
세포 라인에서 세포 내
Ca
2
+
에 대한
글루코스
효과(Effect of glucose on intracellular Ca
2+
in Caco2 cell lines)
PKA 억제제(inhibitor)(H-89)는 cAMP-자극 음이온 분비 및 SGLT1-중재 글루코스 수송 둘 다를 억제한다. H-89-둔감(insensitive) I sc(도 1a 및 1b)의 존재는 PKA-비의존 메카니즘이 글루코스-유발 분비에도 기여하는 것을 의미한다. cAMP로서, 세포 내 Ca2 +는 음이온 분비를 포함하는 최고 세포 내 제2 전령물질(chief intracellular second messengers) 중 하나이다.
글루코스-자극 I sc 증가에서 세포 내 Ca2 +의 역할을 결정하기 위해, 세포 내 Ca2+수준은 상이한 농도의 각각의 글루코스 및 3-OMG의 존재 하에서 및 BAPTA-AM(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid) - 세포 내 칼슘-특이적(specific) 킬레이터의 존재 하에서 측정되었다. Ca2 +인디케이터(indicator) fluo 8로 로딩된 배양 Caco2 세포 내에서 글루코스 및 3-OMG에 대한 Ca2 +반응이 공초점 현미경 레이저 주사(laser scanning confocal microscopy)에 의해 감지되었다. 배스 배지(bath medium)에 0.6 mM 글루코스의 첨가는 세포 내 Ca2 +오실레이션(도 4b)를 개시한다. 오실레이션의 진폭은 시간으로 감소한다. 0.6 mM 글루코스를 사용한 칼슘 형광(calcium fluorescence, F/Fo)의 평균 피크 진폭은 1.32 ±0.1(n=10)인 것으로 계산된다.
글루코스-유발 Ca2 +오실레이션은, 0.6 mM 3-OMG 글루코스가 유사한 Ca2 +오실레이션(1.2 ± 0.1 (n=10))를 유발하는 것처럼 글루코스의 세포 내 대사에 관련되지 않는다(도 4a). 글루코스-자극 Ca2 +오실레이션(oscillation)은, 45 분 동안(1 .01 ± 0.1)(n=10) 세포 내 Ca2 +킬레이터 BAPTA-AM으로 상기 세포를 전배양하여 저해된다(도 4a).
글루코스는 증가된 글루코스 농도가 Ca2 +오실레이션의 진폭을 증가시키는 것인지 결정하기 위해 더 높은 농도(6 mM)에서 첨가된다. Ca2 +오실레이션은, 0.6 mM 글루코스 또는 3-OMG(도 4a)것과 비교 시, 배싱 배지(bathing medium)에 6 mM에서 글루코스(1.85 ± 0.2 vs 1.32 ± 0.1) 또는 3-OMG(1.5 ± 0.1 vs 1.2 ± 0.2)의 첨가로 상당히 더 높아진다. Ca2 +오실레이션에서 글루코스-자극 증가는 BAPTA-AM(도 4a)로 세포를 전배양하여 완전하게 저해된다. 이는 세포 내 Ca2 +이 글루코스-유발 음이온 분비에 관련된다는 것을 의미한다.
실시예
12-설사의 치료를 위한 치료용 조성물(therapeutic compositions for treatment of diarrhea)
특정 구현예에서, 본 실시예는 로타바이러스-유발 설사와 같은 설사를 치료하기 위한 제형(formulations)을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 제형은 글루코스, 글루코스 유사체, 글루코스 수송체의 기질, 또는 당분자를 포함하지 않는다.
공개물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참조는, 본 발명에 인용된 것이, 각 참조가 개별적으로 구체적으로 참조로서 결합되는 것임을 나타내고, 본 발명에서 이의 전체로서 제시하는 것처럼, 동일한 범위로 참조로 본 발명에 결합된다.
본 발명에서 기술된 문맥에서 사용된 단수형 용어 및 유사한 참조는, 문맥에서 달리 지적되고, 명확하게 모순되지 않는다면, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 수치의 범위의 나열은, 단지 달리 지적되지 않고, 상기 범위 내로 들어간 각 분리적 수치를 개별적으로 관련되는 속기방법의 역할을 하는 것으로 의도되고, 개별적으로 본 명세서에서 인용되는 것처럼, 상세한 설명 내로 각 분리적 수치가 결합된다(예컨대, 특정 인자 또는 측정치에 관련하여 제공되는 모든 정확한 예시적 수치는, 적절한 "약"으로 수식되고, 상응하는 대략적 측정치를 제공하는 것으로 의도된다.). 달리 언급되지 않는다면, 본 명세서에 제고된 정확한 수치는 상응하는 대략적 수치를 대표한다((예컨대, 특정 인자 또는 측정치에 대한 본 명세서에 제공된 모든 정확한 예시적 값은, 적절할 수 있는 "약"으로 수식되고, 상응하는 대략적 측정치를 제공하는 것으로 고려될 수 있다.)
본 명세서에서 제공된 임의의 및 모든 실시예 또는 예시적 표현(예컨대, "와 같은")의 사용은, 달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 범위의 제한을 제기하지 않고, 대부분 본 발명을 더 좋게 설명하기 위한 것으로 의도된다. 상세한 설명에서 임의의 구성 요소를 의미하는 것으로 구성될 수 있는 표현은, 명쾌하게 나타내지 않는 한 본 발명의 실현에 필수적이지 않다.
구성 요소 또는 구성 요소들에 관련하여 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 또는 "포함하는(containing)"과 같은 용어를 사용하는 본 발명의 임의의 양상 또는 구현예의 설명은, 달리 언급되거나 또는 문맥 상에서 명확하게 모순되지 않으면, 특정한 구성 요소 또는 구성 요소들 "로 이루어진(consists of)", "로 필수적으로 이루어진(consists essentially of)" 또는 "실질적으로 포함하는(substantially comprises)" 것과 유사한 본 발명의 양상 또는 구현예에 대한 지원을 제공하는 것으로 의도된다(예컨대, 특정 구성 요소를 포함하는 것으로 본 명세서에 기술된 조성물은 또한, 문맥상 명확하게 모순되지 않고, 달리 언급되지 않는다면, 이러한 구성 요소로 이루어진 조성물을 기술하는 것으로 이해될 수 있다.)
본 발명에 기술된 실시예 및 구현예는 단지 설명의 목적이고, 이들에 관련해서 다양한 변형 또는 변화는 본 기술 분야의 당업자에 의해 제시될 수 있고, 본 출원의 이해 범위 및 본질 내에 포함되는 것으로 이해될 수 있다.
Claims (21)
- 대상(subject)에서 설사를 치료하기 위한 멸균 치료용 조성물에 있어서,
상기 조성물은, 장관 투여용으로 제형화되고, 100 mosm 내지 250 mosm의 총오스몰 농도를 갖고,
상기 조성물은,
라이신, 글리신, 트레오닌, 발린, 타이로신, 아스파르트산, 이소류신 및 세린으로 필수적으로 이루어지는 프리 아미노산으로서, 선택적으로 트립토판을 추가한, 프리 아미노산;
전해질; 및
물
을 포함하고,
글루코스 수송체의 기질 및/또는 글루코스 수송체의 기질로 가수분해될 수 있는 화합물이, 만약 상기 조성물 내 존재한다면, 0.01 mM 미만의 농도로 존재하고,
상기 글루코스 수송체의 기질 및/또는 글루코스 수송체의 기질로 가수분해될 수 있는 화합물은 글루코스, α-메틸-D-글루코피라노사이드(AMG), 3-O-메틸글루코스(3-OMG), 데옥시-D-글루코스 또는 α-메틸-D-글루코스이고,
상기 대상은 5살 이하의 인간인,
멸균 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
프리 아미노산이 라이신, 글리신, 트레오닌, 발린, 타이로신, 아스파르트산, 이소류신 및 세린으로 필수적으로 이루어지는, 멸균 치료용 조성물. - 대상에서 설사를 치료하기 위한 멸균 치료용 조성물에 있어서,
상기 조성물은, 장관 투여용으로 제형화되고, 100 mosm 내지 250 mosm의 총오스몰 농도를 갖고,
상기 조성물은,
라이신, 글리신, 트레오닌, 발린, 타이로신, 아스파르트산, 이소류신 및 세린으로 필수적으로 이루어지는 프리 아미노산으로서, 선택적으로 트립토판을 추가한, 프리 아미노산;
전해질; 및
물
을 포함하고,
글루코스 수송체의 기질 및/또는 글루코스 수송체의 기질로 가수분해될 수 있는 화합물이, 만약 상기 조성물 내 존재한다면, 0.01 mM 미만의 농도로 존재하고,
상기 글루코스 수송체의 기질 및/또는 글루코스 수송체의 기질로 가수분해될 수 있는 화합물은 글루코스, α-메틸-D-글루코피라노사이드(AMG), 3-O-메틸글루코스(3-OMG), 데옥시-D-글루코스 또는 α-메틸-D-글루코스인,
멸균 치료용 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
글루코스를 함유하지 않는 멸균 치료용 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
α-메틸-D-글루코피라노사이드(AMG), 3-O-메틸글루코스(3-OMG), 데옥시-D-글루코스 또는 α-메틸-D-글루코스를 함유하지 않는 멸균 치료용 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
임의의 카보하이드레이트를 함유하지 않는 멸균 치료용 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
2.9 내지 7.3의 pH를 갖는 멸균 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
장관 투여를 통하여 대상에게 투여되는 멸균 치료용 조성물. - 제3항에 있어서,
장관 투여를 통하여 대상에게 투여되는 멸균 치료용 조성물. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 대상이 로타바이러스-유발 설사(rotavirus-induced diarrhea)를 갖는, 멸균 치료용 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 대상이 인간인 멸균 치료용 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 대상이 5살 이하인 멸균 치료용 조성물. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
경구 투여용으로 제형화된 멸균 치료용 조성물. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
글루코스를 함유하지 않는 멸균 치료용 조성물. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
α-메틸-D-글루코피라노사이드(AMG), 3-O-메틸글루코스(3-OMG), 데옥시-D-글루코스 또는 α-메틸-D-글루코스를 함유하지 않는 멸균 치료용 조성물. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
임의의 카보하이드레이트를 함유하지 않는 멸균 치료용 조성물. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
라이신, 글리신, 트레오닌, 발린, 타이로신, 아스파르트산, 이소류신 및 세린으로 필수적으로 이루어지는 프리 아미노산으로서, 선택적으로 트립토판을 추가한, 프리 아미노산; 및
Na+, K+, HCO3 -, CO3 2- 및 Cl-로부터 선택된 하나 이상의 전해질
을 포함하는 멸균 치료용 조성물. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
라이신, 글리신, 트레오닌, 발린, 타이로신, 아스파르트산, 이소류신 및 세린으로 필수적으로 이루어지는 프리 아미노산으로서, 선택적으로 트립토판을 추가한, 프리 아미노산;
Na+, K+, HCO3 -, CO3 2- 및 Cl-로부터 선택된 하나 이상의 전해질; 및
물
로 필수적으로 이루어지고,
선택적으로, 하나 이상의 담체, 완충제, 보존제 및/또는 착향제를 추가한, 멸균 치료용 조성물. - 특정 함량의 물과 혼합될 때 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 분말, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 설사를 치료하기 위한 패키지.
- 제19항에 있어서,
분말 형태인 패키지. - 제19항에 있어서,
설사병 있는 대상에게 상기 조성물을 투여하기 위한 설명서를 더 포함하는, 패키지.
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