KR102260771B1 - 정상 및 암 오가노이드 미세환경 구현을 위한 코어-쉘 구조체 및 그의 제조방법 - Google Patents

정상 및 암 오가노이드 미세환경 구현을 위한 코어-쉘 구조체 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쉘부 및 코어부를 포함하는 코어-쉘 구조체에 있어서, 상기 쉘부는 외부로부터 내부로 차례로 위치하는 n개의 쉘을 포함하고, 상기 코어부는 상기 쉘부의 내부에 위치하는 코어를 포함하고, n은 1 내지 30의 자연수 중 어느 하나이고, n은 1인 경우, 1번째 쉘의 내부에 인접하여 상기 코어가 위치하고, n은 2 내지 30의 자연수 중 어느 하나인 경우 n-1번째 쉘의 내부에 인접하여 n번째 쉘이 위치하고, 상기 n번째 쉘이 빈 공간이거나, 또는 제n 세포외 기질 및 제n 세포 중 1종 이상을 포함하는 하이드로겔이고, 상기 코어가 빈 공간이거나, 또는 코어용 세포외 기질 및 코어용 세포 중 1종 이상을 포함하는 하이드로겔이고, 상기 코어 및 n개의 쉘 중 서로 접하는 2종은 동시에 빈 공간은 아니고, 상기 코어 및 n개의 쉘 중 서로 접하는 2종의 밀도는 같거나 다른 것인 코어-쉘 구조체에 관한 것이다. 이에 의하여 위, 장, 방광, 폐와 같은 강관 구조를 모사할 수 있다.

Description

정상 및 암 오가노이드 미세환경 구현을 위한 코어-쉘 구조체 및 그의 제조방법{CORE-SHELL STRUCTURE FOR BUILDING NORMAL AND TUMOR ORGANOID MICROENVIRONMENTS AND METHOD OF PREPARING SAME}
본 발명은 유사 장기(organoid)에 사용할 수 있는 코어-쉘 구조체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외부로부터 내부로 차례로 위치하는 n개의 쉘을 포함하는 쉘부 및 상기 쉘부의 내부에 위치하는 코어를 포함하는 코어부를 포함하고, 상기 n번째 쉘 및 상기 코어 중 어느 하나를 빈 공간으로 제조하여 위, 장, 방광과 같이 속이 비어있는 강관 구조 전체를 모사할 수 있는 코어-쉘 구조체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
바이오 프린팅은 세포와 세포외 기질을 모방하는 하이드로젤로 구성된 바이오 잉크를 이용하여 조직 모사체를 제작하는 기술이다.
바이오 잉크에서 세포의 역할을 하는 생물의 종류에는 낱개 단위로 존재하는 세포, 세포 덩어리, 정상 및 암 오가노이드 등의 패턴을 이루고자 하는 세포, 혹은 세포와 세포 외 기질을 함유하고 있는 단위체들이 있다.
정상 오가노이드(Normal Organoid)는 줄기세포에서 유래된 세포들의 군집으로 이루어진 삼차원의 세포 구조체를 의미하며, 오가노이드는 생체 조직 일부분의 구조와 생물적 특성을 반영한다. 장과 방광 오가노이드는 속이 비어있는 구의 형태로 성장하며, 표피층을 모사한다. 오가노이드 구조에서 비어있는 구의 안쪽이 표피세포(Epithelial Cell)의 특성, 밖 쪽이 기저세포(Basal Cell)의 특성을 반영한다. 더 넓은 범위의 조직 모사를 구현하기 위해 해당 조직의 구성요소들을 오가노이드와 함께 배양하는 공배양 방식이 이용된다.
암 오가노이드(Tumor Organoid)는 환자의 암 조직에서 유래된 암 세포에서 유래되었으며 속이 꽉 찬 구의 형태로 자란다. 유래된 암 환자의 유전자 돌연변이 양상, 항암제 반응성, 병리조직학적 특성 등의 특성을 반영한다. 암 조직에는 암세포뿐만 아니라 기질세포, 혈관세포, 면역세포 등 여러 종류의 세포들이 공배양된다.
공배양을 구현하는 기술에는 파이펫, 프린팅, 현적 배양 (Hanging Drop) 등이 있다. 이러한 방법들은 세포들간의 상호작용은 유도하나, 조직의 삼차원적 구조를 구현하지 못한다는 점에서 구조적, 생물학적 의미에 한계를 갖는다.
따라서, 실제 조직의 삼차원 배열을 모사할 수 있는 구조체 및 그의 제조 공정이 필요하다.
한국공개특허 제10-2018-0049712호
본 발명의 목적은 실제 조직의 삼차원 배열을 모사할 수 있는 코어-쉘 구조체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 실제 조직의 삼차원 배열을 모사할 수 있는 코어-쉘 구조체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 쉘부 및 코어부를 포함하는 코어-쉘 구조체에 있어서, 상기 쉘부는 외부로부터 내부로 차례로 위치하는 n개의 쉘을 포함하고, 상기 코어부는 상기 쉘부의 내부에 위치하는 코어를 포함하고, n은 1 내지 30의 자연수 중 어느 하나이고, n은 1인 경우, 1번째 쉘의 내부에 인접하여 상기 코어가 위치하고, n은 2 내지 30의 자연수 중 어느 하나인 경우, n-1번째 쉘의 내부에 인접하여 n번째 쉘이 위치하고, 상기 n번째 쉘이 빈 공간이거나, 또는 제n 세포외 기질 및 제n 세포 중 1종 이상을 포함하는 하이드로겔이고, 상기 코어가 빈 공간이거나, 또는 코어용 세포외 기질 및 코어용 세포 중 1종 이상을 포함하는 하이드로겔이고, 상기 코어 및 n개의 쉘 중 서로 접하는 2종은 동시에 빈 공간은 아니고, 상기 코어 및 n개의 쉘 중 서로 접하는 2종의 밀도는 같거나 다른 것인 코어-쉘 구조체가 제공된다.
또한, n이 1이고, 상기 코어가 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 1번째 쉘이 제1 세포외 기질 및 제1 세포를 포함하고, 상기 코어가 상기 코어용 세포외 기질 및 상기 코어용 세포를 포함하고, 상기 제1 세포외 기질 및 상기 코어용 세포외 기질은 서로 같거나 다르고, 상기 제1 세포 및 상기 코어용 세포는 서로 같거나 다른 것일 수 있다.
또한, n이 2이고, 2번째 쉘이 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 코어가 상기 2번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 1번째 쉘이 제1 세포외 기질 및 제1 세포를 포함하고, 상기 2번째 쉘이 제2 세포외 기질 및 제2 세포를 포함하고, 상기 코어가 상기 코어용 세포외 기질 및 상기 코어용 세포를 포함하고, 상기 코어용 세포외 기질, 상기 제1 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질은 서로 같거나 다르고, 상기 코어용 세포, 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포는 서로 같거나 다른 것일 수 있다.
또한, n이 2이고, 2번째 쉘이 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 코어가 상기 2번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 1번째 쉘이 제1 세포외 기질 및 제1 세포를 포함하고, 상기 2번째 쉘은 빈 공간이고, 상기 코어가 상기 코어용 세포외 기질 및 상기 코어용 세포를 포함하고, 상기 코어용 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질은 서로 같거나 다르고, 상기 코어용 세포 및 상기 제2 세포는 서로 같거나 다른 것일 수 있다.
또한, n이 2이고, 2번째 쉘이 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 코어가 상기 2번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 1번째 쉘이 제2 세포외 기질 및 제2 세포를 포함하고, 상기 2번째 쉘이 제3 세포외 기질 및 제3 세포를 포함하고, 상기 코어가 빈 공간이고, 상기 제2 세포외 기질 및 상기 제3 세포외 기질은 서로 같거나 다르고, 상기 제2 세포 및 상기 제3 세포는 서로 같거나 다른 것일 수 있다.
또한, 상기 n-1번째 쉘의 밀도가 상기 n번째 쉘의 밀도보다 작고, 상기 코어의 밀도가 상기 1번째 쉘의 밀도보다 작은 것일 수 있다.
또한, 상기 코어 및 n개의 쉘 중 1종 이상이 각각 독립적으로 구형, 반구형, 원기둥, 타원기둥, 원뿔, 원뿔대, 타원뿔, 타원뿔대, 다각기둥 다각뿔, 다각뿔대 및 그들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
또한, 상기 코어용 세포외 기질 및 제n 세포외 기질이 각각 독립적으로 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA), 탈세포화 세포외 기질, 알긴산칼슘, 매트리젤, 나노셀룰로스, 히알루론산, 알지네이트 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 코어용 세포 및 제n 세포가 각각 독립적으로 섬유아세포(fibroblast), 줄기세포, 암세포, 혈관세포, 근육세포, 표피세포, 면역세포, 신경세포 및 신경교세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 섬유아세포가 포유류 유래 섬유아세포, 조류 유래 섬유아세포, 파충류 유래 섬유아세포, 양서류 유래 섬유아세포 및 어류 유래 섬유아세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 코어용 세포외 기질 및 제n 세포외 기질이 각각 독립적으로 반데르발스 인력, 이온결합 또는 공유결합에 의해 하이드로겔을 형성한 것일 수 있다.
또한, 상기 제n 세포가 표피 세포를 포함할 수 있다.
또한, 상기 표피 세포가 각질형성세포 및 멜라닌형성세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 코어-쉘 구조체가 유사 장기(organoid)에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 코어를 포함하는 코어부 및 n개의 쉘을 갖는 쉘부를 포함하는 코어-쉘 구조체의 제조방법에 있어서, (a) 제n-1 바이오 잉크를 토출하여 n-1번째 액적을 형성하는 단계; (b) 상기 n-1번째 액적 내부에 제n 바이오 잉크를 토출하여 n번째 액적을 상기 n-1 번째 액적의 내부에 형성하는 단계; (c) 상기 n번째 액적 내부에 코어용 바이오 잉크를 토출하여 코어 액적을 상기 n번째 액적 내부에 형성하는 단계; 및 (d) 상기 코어 액적 및 상기 n번째 액적 중 1종 이상을 경화시켜 상기 코어 및 상기 쉘을 포함하는 하이드로겔을 형성하는 단계;를 포함하고, 단계 (b)가 n회 반복하여 수행되고, n은 1 내지 30의 자연수 중 어느 하나이고, n은 1인 경우, 1번째 액적의 내부에 인접하여 상기 코어 액적이 위치하고, n은 2 내지 30의 자연수 중 어느 하나인 경우, n-1번째 액적의 내부에 인접하여 n번째 액적이 위치하는 것인 코어-쉘 구조체의 제조방법이 제공된다.
또한, 상기 단계 (d) 후에, (e) 상기 하이드로겔에 포함된 세포를 배양하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 단계 (d) 후에, (f) 경화 되지 않은 상기 코어 액적 및 n번째 액적 중 1종 이상을 상기 하이드로겔로부터 분리하여 상기 코어 및 n개의 쉘 중 1종 이상을 빈 공간으로 형성하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 경화되지 않은 상기 코어 액적 및 n번째 액적이 각각 독립적으로 콜라젠, 젤라틴, 매트리젤, 알긴화칼슘, 피브린 및 젤라틴 메타크릴레이트 (GelMA) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 바이오 잉크가 미세압출 프린팅, 잉크젯 프린팅, 레이저 프린팅, 밸브타입 프린팅, 스프레이 프린팅, 마이크로 스탬핑 및 마스킹으로 이루어진 군에서 선택된 1종으로 토출되는 것일 수 있다.
또한, 상기 코어용 바이오 잉크의 점도가 1 내지 500cP이고, 제n 바이오 잉크의 점도가 1 내지 500cP인 것일 수 있다.
본 발명의 코어-쉘 구조체는 속이 비어있는 구조를 형성할 수 있어 위, 장, 방광, 폐와 같은 강관 구조를 모사할 수 있다.
또한, 내층을 구성하는 하이드로젤의 밀도를 외층보다 높게 함으로써 내층의 하이드로젤이 프린팅 되는 과정 중에 외층과의 섞임을 최소화할 수 있고, 피부, 위, 장, 방광, 등 외부 표면과 닿아있는 장기는 표면과 가까울수록 세포 외 기질의 물리적 강도가 더 강하다는 특성이 있는데 본 발명을 이용하면 이러한 장기의 특징을 반영하는 구조체를 제작할 수 있다.
또한, 본 발명의 코어-쉘 구조체 제조방법을 이용하여 여러 번의 경화 과정 없이 한 번의 경화로 최종 구조물을 만들 수 있으며, 경화 과정에서 각 층을 구성하는 하이드로젤이 함께 경화하여 분자적 결합을 유도할 수 있으므로 각 층을 구성하는 세포들간의 이동과 상호작용을 저해하지 않을 수 있다.
또한, 움푹 패인 바닥 층에 플라스틱이나 젤라틴의 구조적 지지 없이 바이오 잉크만을 이용하여 다층 구조의 세포 패터닝을 구현할 수 있고, 층 내부에 층을 더하는 공정을 이용하여 직경 5mm 이하의 작은 구조체에 3층 이상의 패턴을 구현할 수 있다.
이 도면들은 본 발명의 예시적인 실시예를 설명하는데 참조하기 위함이므로, 본 발명의 기술적 사상을 첨부한 도면에 한정해서 해석하여서는 아니 된다.
도 1은 본 발명의 코어-쉘 구조체를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 다양한 구조의 코어-쉘 구조체의 제작과정 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에 따라 제조된 코어-쉘 구조체의 단면 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에 따라 제조된 코어-쉘 구조체의 단면 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 3에 따라 제조된 코어-쉘 구조체의 단면 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 4에 따라 제조된 코어-쉘 구조체의 단면 이미지를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하도록 한다.
그러나, 이하의 설명은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 도는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 이하에서 사용될 제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또한, 어떤 구성요소가 다른 구성요소 상에 "형성되어" 있다거나 "적층되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소의 표면 상의 전면 또는 일면에 직접 부착되어 형성되어 있거나 적층되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 더 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
이하, 본 발명의 코어-쉘 구조체 및 그의 제조방법에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
도 1은 본 발명의 코어-쉘 구조체를 나타낸 것이다.
도 1을 참고하면, 쉘부 및 코어부를 포함하는 코어-쉘 구조체에 있어서, 상기 쉘부는 외부로부터 내부로 차례로 위치하는 n개의 쉘을 포함하고, 상기 코어부는 상기 쉘부의 내부에 위치하는 코어를 포함하고, n은 1 내지 30의 자연수 중 어느 하나이고, n은 1인 경우, 1번째 쉘의 내부에 인접하여 상기 코어가 위치하고, n은 2 내지 30의 자연수 중 어느 하나인 경우 n-1번째 쉘의 내부에 인접하여 n번째 쉘이 위치하고, 상기 n번째 쉘이 빈 공간이거나, 또는 제n 세포외 기질 및 제n 세포 중 1종 이상을 포함하는 하이드로겔이고, 상기 코어가 빈 공간이거나, 또는 코어용 세포외 기질 및 코어용 세포 중 1종 이상을 포함하는 하이드로겔이고, 상기 코어 및 n개의 쉘 중 서로 접하는 2종은 동시에 빈 공간은 아니고, 상기 코어 및 n개의 쉘 중 서로 접하는 2종의 밀도는 같거나 다른 것인 코어-쉘 구조체가 제공된다.
또한, n이 1이고, 상기 코어가 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 1번째 쉘이 제1 세포외 기질 및 제1 세포를 포함하고, 상기 코어가 상기 코어용 세포외 기질 및 상기 코어용 세포를 포함하고, 상기 제1 세포외 기질 및 상기 코어용 세포외 기질은 서로 같거나 다르고, 상기 제1 세포 및 상기 코어용 세포는 서로 같거나 다른 것일 수 있다.
또한, n이 2이고, 2번째 쉘이 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 코어가 상기 2번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 1번째 쉘이 제1 세포외 기질 및 제1 세포를 포함하고, 상기 2번째 쉘이 제2 세포외 기질 및 제2 세포를 포함하고, 상기 코어가 상기 코어용 세포외 기질 및 상기 코어용 세포를 포함하고, 상기 코어용 세포외 기질, 상기 제1 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질은 서로 같거나 다르고, 상기 코어용 세포, 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포는 서로 같거나 다른 것일 수 있다.
또한, n이 2이고, 2번째 쉘이 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 코어가 상기 2번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 1번째 쉘이 제1 세포외 기질 및 제1 세포를 포함하고, 상기 2번째 쉘은 빈 공간이고, 상기 코어가 상기 코어용 세포외 기질 및 상기 코어용 세포를 포함하고, 상기 코어용 세포외 기질 및 상기 제2 세포외 기질은 서로 같거나 다르고, 상기 코어용 세포 및 상기 제2 세포는 서로 같거나 다른 것일 수 있다.
또한, n이 2이고, 2번째 쉘이 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 코어가 상기 2번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 1번째 쉘이 제2 세포외 기질 및 제2 세포를 포함하고, 상기 2번째 쉘이 제3 세포외 기질 및 제3 세포를 포함하고, 상기 코어가 빈 공간이고, 상기 제2 세포외 기질 및 상기 제3 세포외 기질은 서로 같거나 다르고, 상기 제2 세포 및 상기 제3 세포는 서로 같거나 다른 것일 수 있다.
또한, 상기 n-1번째 쉘의 밀도가 상기 n번째 쉘의 밀도보다 작고, 상기 코어의 밀도가 상기 1번째 쉘의 밀도보다 작은 것일 수 있다.
또한, 상기 코어 및 n개의 쉘 중 1종 이상이 각각 독립적으로 구형, 반구형, 원기둥, 타원기둥, 원뿔, 원뿔대, 타원뿔, 타원뿔대, 다각기둥 다각뿔, 다각뿔대 및 그들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 구형일 수 있다.
또한, 상기 코어용 세포외 기질 및 제n 세포외 기질이 각각 독립적으로 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA), 탈세포화 세포외 기질, 알긴산칼슘, 매트리젤, 나노셀룰로스, 히알루론산, 알지네이트 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 젤라틴 메타크릴레이트, 탈세포화 세포외 기질, 알긴산칼슘 및 매트리젤, 보다 바람직하게는 콜라겐 및 젤라틴 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 코어용 세포 및 제n 세포가 각각 독립적으로 섬유아세포(fibroblast), 줄기세포, 암세포, 혈관세포, 근육세포, 표피세포, 면역세포, 신경세포 및 신경교세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 섬유아세포를 포함할 수 있다.
또한, 상기 섬유아세포가 포유류 유래 섬유아세포, 조류 유래 섬유아세포, 파충류 유래 섬유아세포, 양서류 유래 섬유아세포 및 어류 유래 섬유아세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 포유류 유래 섬유아세포를 포함할 수 있다.
또한, 상기 코어용 세포외 기질 및 제n 세포외 기질이 각각 독립적으로 반데르발스 인력, 이온결합 또는 공유결합에 의해 하이드로겔을 형성할 수 있다.
또한, 상기 제n 세포가 표피 세포를 포함할 수 있다.
또한, 상기 표피 세포가 각질형성세포 및 멜라닌형성세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 코어-쉘 구조체가 유사 장기(organoid)에 사용하기 위한 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 코어-쉘 구조체의 제조방법에 대해 설명하기로 한다.
도 2는 본 발명의 다양한 구조의 코어-쉘 구조체의 제작과정 모식도를 나타낸 것이다.
도 2를 참고하면, 코어를 포함하는 코어부 및 n개의 쉘을 갖는 쉘부를 포함하는 코어-쉘 구조체의 제조방법에 있어서, (a) 제n-1 바이오 잉크를 토출하여 n-1번째 액적을 형성하는 단계; (b) 상기 n-1번째 액적 내부에 제n 바이오 잉크를 토출하여 n번째 액적을 상기 n-1 번째 액적의 내부에 형성하는 단계; (c) 상기 n번째 액적 내부에 코어용 바이오 잉크를 토출하여 코어 액적을 상기 n번째 액적 내부에 형성하는 단계; 및 (d) 상기 코어 액적 및 상기 n번째 액적 중 1종 이상을 경화시켜 상기 코어 및 상기 쉘을 포함하는 하이드로겔을 형성하는 단계;를 포함하고, 단계 (b)가 n회 반복하여 수행되고, n은 1 내지 30의 자연수 중 어느 하나이고, n은 1인 경우, 1번째 액적의 내부에 인접하여 상기 코어 액적이 위치하고, n은 2 내지 30의 자연수 중 어느 하나인 경우 n-1번째 액적의 내부에 인접하여 n번째 액적이 위치하는 것인 코어-쉘 구조체의 제조방법이 제공된다.
또한, 상기 단계 (d) 후에, (e) 상기 하이드로겔에 포함된 세포를 배양하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 단계 (d) 후에, (f) 경화되지 않은 상기 코어 액적 및 n번째 액적 중 1종 이상을 상기 하이드로겔로부터 분리하여 상기 코어 및 n개의 쉘 중 1종 이상을 빈 공간으로 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 경화되지 않은 상기 코어 액적 및 n번째 액적이 각각 독립적으로 콜라젠, 젤라틴, 매트리젤, 알긴화칼슘, 피브린 및 젤라틴 메타크릴레이트 (GelMA) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 젤라틴을 포함할 수 있다.
또한, 상기 바이오 잉크가 미세압출 프린팅, 잉크젯 프린팅, 레이저 프린팅, 밸브타입 프린팅, 스프레이 프린팅, 마이크로 스탬핑 및 마스킹으로 이루어진 군에서 선택된 1종으로 토출될 수 있고, 바람직하게는 미세압출 프린팅 및 잉크젯 프린팅 중에서 선택된 1종, 보다 바람직하게는 미세압출 프린팅으로 토출될 수 있다.
또한, 상기 코어용 바이오 잉크의 점도가 1 내지 500cP이고, 제n 바이오 잉크의 점도가 1 내지 500cP인 것일 수 있다.
상기 코어용 바이오 잉크의 점도가 1cP 미만일 경우 프린트 후 구조를 유지하지 못함으로 바람직하지 않고, 500cP를 초과할 경우 바이오 잉크를 프린팅할 때 프린터의 노즐이 막힐 수 있어 바람직하지 않다.
상기 제n 바이오 잉크의 점도가 1cP 미만일 경우 프린트 후 구조를 유지하지 못함으로 바람직하지 않고, 500cP를 초과할 경우 바이오 잉크를 프린팅할 때 프린터의 노즐이 막힐 수 있어 바람직하지 않다.
도 2를 참고하면, 세포를 포함하는 바이오 잉크 1(Ink 1)을 토출한 후 세포를 포함하는 바이오 잉크 2(Ink 2)까지만 삽입하면 1개의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조체를 제조할 수 있고, 바이오 잉크 1(Ink 1) 내부에 바이오 잉크 2(Ink 2)를 토출하고 상기 바이오 잉크 2(Ink 2) 내부에 세포를 포함하는 바이오 잉크 3(Ink 3)을 토출함으로써 2개의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조체를 제조할 수 있다.
도 2를 참고하면, 바이오 잉크 1(Ink 1) 내부에 바이오 잉크 2(Ink 2)를 토출하고 상기 바이오 잉크 2(Ink 2) 내부에 젤라틴으로 구성된 바이오 잉크 4(Ink 4)를 삽입하고 경화과정을 거쳐 구조체를 제조한다. 이후 배양 과정에서 배양 환경에 24시간동안 상기 구조체를 배치시키면 젤라틴 성분(도면의 분홍색 부분)이 빠져나오며 빈 공간을 형성하게 되므로 2개의 쉘을 가지며 코어가 비어있는 코어-쉘 구조체를 제조할 수 있다.
도 2를 참고하면, 바이오 잉크 1(Ink 1) 내부에 젤라틴으로 구성된 바이오 잉크 4(Ink 4)를 삽입하고, 상기 바이오 잉크 4(Ink 4) 내부에 바이오 잉크 2(Ink 2)를 토출하고 경화 과정을 거쳐 구조체를 제조한다. 이후, 면 후에 배양 과정에서 배양 환경에 24시간동안 상기 구조체를 배치시키면 젤라틴 성분(도면의 분홍색 부분)이 빠져나오며 빈 공간을 형성하게 되므로 2개의 쉘을 가지며 2번째 쉘이 비어있는 코어-쉘 구조체를 제조할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 설명하도록 한다. 그러나 이는 예시를 위한 것으로서 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
바이오 잉크의 제조
제조예 1
1.0w/v%의 중성(pH 7) 콜라겐에 파란색으로 염색한 쥐 유래 섬유아세포(NIH/3T3) 1x107 cells를 고르게 분포하도록 섞어 5x106 cell/ml 밀도, 20cP 점도의 바이오 잉크를 제조하였다.
제조예 2
섬유아세포를 파란색으로 염색한 것 대신에 초록색으로 염색한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 바이오 잉크를 제조하였다.
제조예 3
섬유아세포를 파란색으로 염색한 것 대신에 붉은색으로 염색한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 바이오 잉크를 제조하였다.
실시예 1: 1개의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조체
도 1 및 2를 참고하면, 지름 5mm 정도 크기의 반구 형태로 움푹 파인 파라필름(Parafilm) 상의 정 중앙부에 제1 바이오 잉크를 30μL 토출하여 납작한 구 모양의 1번째 액적을 형성하였다. 이때, 제1 바이오 잉크는 제조예 2에 따라 제조된 바이오 잉크를 사용하였다.
제조예 3에 따라 제조된 제2 바이오 잉크를 코어용 바이오 잉크로 사용하였다. 상기 1번째 액적의 중심 부분에 상기 코어용 바이오 잉크를 10μL 토출하여 코어 액적을 상기 1번째 액적 내부에 형성하였다.
토출이 끝난 뒤 상기 코어 액적 및 상기 1번째 액적을 37℃배양기에 넣어 1시간 동안 경화시켜 상기 코어 및 상기 쉘을 포함하는 하이드로겔을 형성하였다.
경화가 끝난 구조체를 10v/v% 소 유래 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1v/v% 페니실린 및 스트렙토마이신 항생제를 담지한 Dulbecco’s Modified Eagle Media(DMEM) 배지에 넣어 배양하여 1개의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조체를 제조하였다.
실시예 2: 2개의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조체
도 1 및 2를 참고하면, 지름 5mm 정도 크기의 반구 형태로 움푹 파인 파라필름(Parafilm) 상의 정 중앙부에 제1 바이오 잉크를 30μL 토출하여 납작한 구 모양의 1번째 액적을 형성하였다. 이때, 제1 바이오 잉크는 제조예 1에 따라 제조된 바이오 잉크를 사용하였다.
제조예 2에 따라 제조된 바이오 잉크를 제2 바이오 잉크로 사용하였다. 상기 1번째 액적의 중심 부분에 상기 제2 바이오 잉크를 10μL 토출하여 2번째 액적을 상기 1번째 액적의 내부에 형성하였다.
제조예 3에 따라 제조된 제3 바이오 잉크를 코어용 바이오 잉크로 사용하였다. 상기 2번째 액적의 중심 부분에 상기 코어용 바이오 잉크를 2μL 토출하여 코어 액적을 상기 2번째 액적 내부에 형성하였다.
토출이 끝난 뒤 상기 코어 액적, 상기 1번째 액적 및 상기 2번째 액적을 37℃배양기에 넣어 1시간 동안 경화시켜 상기 코어 및 상기 쉘을 포함하는 하이드로겔을 형성하였다.
경화가 끝난 구조체를 10v/v% 소 유래 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1v/v% 페니실린 및 스트렙토마이신 항생제를 담지한 Dulbecco’s Modified Eagle Media(DMEM) 배지에 넣어 배양하여 2개의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조체를 제조하였다.
실시예 3: 2개의 쉘을 가지며 2번째 쉘이 비어있는 코어-쉘 구조체
도 1 및 2를 참고하면, 지름 5mm 정도 크기의 반구 형태로 움푹 파인 파라필름(Parafilm) 상의 정 중앙부에 제1 바이오 잉크를 30μL 토출하여 납작한 구 모양의 1번째 액적을 형성하였다. 이때, 제1 바이오 잉크는 제조예 1에 따라 제조된 바이오 잉크를 사용하였다.
20w/v%, 중성(pH 7), 4℃의 젤라틴 용액을 제2 바이오 잉크로 사용하였다. 상기 제2 바이오 잉크를 10μL 토출하여 2번째 액적을 상기 1번째 액적의 내부에 형성하였다.
제조예 3에 따라 제조된 제3 바이오 잉크를 코어용 바이오 잉크로 사용하였다. 상기 2번째 액적의 중심 부분에 상기 코어용 바이오 잉크를 2μL 토출하여 코어 액적을 상기 2번째 액적 내부에 형성하였다.
토출이 끝난 뒤 상기 코어 액적, 상기 1번째 액적 및 상기 2번째 액적을 37℃배양기에 넣어 1시간 동안 콜라겐으로 구성된 코어 액적 및 1번째 액적을 경화시켰다. 젤라틴으로 구성된 2번째 액적은 경화되지 않았다.
경화가 끝난 구조체를 10v/v% 소 유래 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1v/v% 페니실린 및 스트렙토마이신 항생제를 담지한 Dulbecco’s Modified Eagle Media(DMEM) 배지에 넣어 배양하였다. 상기 배양을 24시간 진행시켜 경화되지 않은 2번째 액적이 빠져 나오도록 하여 2개의 쉘을 가지며 2번째 쉘이 비어있는 코어-쉘 구조체를 제조하였다.
실시예 4: 2개의 쉘을 가지며 코어가 비어있는 코어-쉘 구조체
도 1 및 2를 참고하면, 지름 5mm 정도 크기의 반구 형태로 움푹 파인 파라필름(Parafilm) 상의 정 중앙부에 제1 바이오 잉크를 30μL 토출하여 납작한 구 모양의 1번째 액적을 형성하였다. 이때, 제1 바이오 잉크는 제조예 3에 따라 제조된 바이오 잉크를 사용하였다.
제조예 2에 따라 제조된 바이오 잉크를 제2 바이오 잉크로 사용하였다. 상기 1번째 액적의 중심 부분에 상기 제2 바이오 잉크를 10μL 토출하여 2번째 액적을 상기 1번째 액적의 내부에 형성하였다.
20w/v%, 중성(pH 7), 4℃의 젤라틴 용액을 코어용 바이오 잉크로 사용하였다. 상기 2번째 액적의 중심 부분에 상기 코어용 바이오 잉크를 2μL 토출하여 코어 액적을 상기 2번째 액적 내부에 형성하였다.
토출이 끝난 뒤 상기 코어 액적, 상기 1번째 액적 및 상기 2번째 액적을 37℃배양기에 넣어 1시간 동안 콜라겐으로 구성된 1번째 액적 및 2번째 액적을 경화시켰다. 젤라틴으로 구성된 코어 액적은 경화되지 않았다.
경화가 끝난 구조체를 10v/v% 소 유래 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1v/v% 페니실린 및 스트렙토마이신 항생제를 담지한 Dulbecco’s Modified Eagle Media(DMEM) 배지에 넣어 배양하였다. 상기 배양을 24시간 진행시켜 경화되지 않은 코어 액적이 빠져 나오도록 하여 2개의 쉘을 가지며 코어가 비어있는 코어-쉘 구조체를 제조하였다.
[시험예]
시험예 1: 코어-쉘 구조체의 단면 이미지
상기 도 3 내지 6은 실시예 1 내지 4에 따라 제조된 코어-쉘 구조체의 단면 이미지를 형광현미경을 통해 나타낸 것이다.
1개의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조체의 단면 이미지
도 3은 실시예 1에 따라 제조된 코어-쉘 구조체의 단면 이미지를 나타낸 것이다. 도 3을 참고하면, 좌측 형광 이미지에서 뚜렷하게 구분된 코어부와 쉘부를 확인할 수 있으며, 우측 이미지를 통해 구분된 층이 토출된 내부 층과 외부 층 사이의 경계를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
2개의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조체의 단면 이미지
도 4는 실시예 2에 따라 제조된 코어-쉘 구조체의 단면 이미지를 나타낸 것이다. 도 4를 참고하면, 실시예 2에 따라 제조된 코어-쉘 구조체가 붉은색의 코어, 초록색의 2번째 쉘, 파란색의 1번째 쉘을 가진 것을 확인할 수 있고, 따라서 실시예 2에 따라 2개의 쉘을 갖는 코어-쉘 구조체가 형성된 것을 확인할 수 있다.
2개의 쉘을 가지며 2번째 쉘이 비어있는 코어-쉘 구조체의 단면 이미지
도 5는 실시예 3에 따라 제조된 코어-쉘 구조체의 단면 이미지를 나타낸 것이다. 도 5를 참고하면, 외부로부터 내부로 파란색, 검정색, 붉은색의 구조체가 형성된 것을 확인할 수 있다. 상기 붉은색 부분은 코어이고, 상기 파란색 및 검정색 부분은 각각 1번째 쉘 및 2번째 쉘을 나타낸다. 상기 붉은색의 코어와 파란색의 1번째 쉘은 세포가 배치되어 있으며 검은색의 2번째 쉘은 비어있음을 보인다. 따라서, 실시예 3에 따라 2개의 쉘을 가지며 2번째 쉘이 비어있는 코어-쉘 구조체가 형성된 것을 확인할 수 있다.
2개의 쉘을 가지며 코어가 비어있는 코어-쉘 구조체의 단면 이미지
도 6은 실시예 4에 따라 제조된 코어-쉘 구조체의 단면 이미지를 나타낸 것이다. 도 6을 참고하면, 외부로부터 내부로 붉은색, 초록색, 검정색의 구조체가 형성된 것을 확인할 수 있다. 상기 검정색 부분은 코어이고, 상기 붉은색 및 초록색 부분은 각각 1번째 쉘 및 2번째 쉘을 나타낸다. 상기 붉은색의 1번째 쉘과 초록색의 2번째 쉘은 세포가 배치되어 있으며 검은색의 코어는 비어있음을 보인다. 따라서, 실시예 4에 따라 2개의 쉘을 가지며 코어가 비어있는 코어-쉘 구조체가 형성된 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. 코어를 포함하는 코어부 및 n개의 쉘을 갖는 쉘부를 포함하는 코어-쉘 구조체의 제조방법에 있어서,
    (a) n이 2 내지 30인 경우 제n-1 바이오 잉크를 토출하여 n-1번째 액적을 형성하는 단계;
    (b) n이 2 내지 30인 경우 상기 n-1번째 액적 내부에 제n 바이오 잉크를 토출하여 n번째 액적을 상기 n-1 번째 액적의 내부에 형성하거나, n이 1인 경우 제1 바이오 잉크를 토출하여 1번째 액적을 형성하는 단계;
    (c) 상기 n번째 액적 내부 또는 상기 1번째 액적 내부에 코어용 바이오 잉크를 토출하여 코어 액적을 상기 n번째 액적 내부 또는 상기 1번째 액적 내부에 형성하는 단계;
    (d) n이 2 내지 30인 경우 상기 코어 액적; 및 1번째 내지 n번째 액적 중 1종 이상; 중에서 1종 이상의 액적을 경화시켜 상기 코어 및 상기 쉘을 포함하는 하이드로겔을 형성하거나, n이 1인 경우 상기 1번째 액적을 경화시켜 1번째 쉘을 포함하는 하이드로겔을 형성하는 단계; 및
    (f) n이 2 내지 30인 경우 상기 코어 액적; 및 1번째 내지 n번째 액적 중 1종 이상; 중에서 경화되지 않은 1종 이상의 액적을 상기 하이드로겔로부터 분리하여 상기 코어 및 n개의 쉘 중 1종 이상을 빈 공간으로 형성하거나, n이 1인 경우 경화되지 않은 코어 액적을 상기 하이드로겔로부터 분리하여 상기 코어를 빈 공간으로 형성하는 단계;를 포함하고,
    단계 (b)가 n회 반복하여 수행되고, n은 1 내지 30의 자연수 중 어느 하나이고,
    상기 단계 (b)에서,
    n은 1인 경우, 1번째 액적의 내부에 인접하여 코어 액적이 위치하고,
    n은 2 내지 30의 자연수 중 어느 하나인 경우, n-1번째 액적의 내부에 인접하여 n번째 액적이 위치하고,
    상기 단계 (f)에서,
    n은 1인 경우,
    상기 쉘부는 1번째 쉘을 포함하고,
    상기 코어부는 상기 쉘부의 내부에 위치하는 코어를 포함하고,
    1번째 쉘 내부에 인접하여 코어가 위치하고,
    상기 1번째 쉘이 쉘용 세포외 기질 및 쉘용 세포를 포함하는 하이드로겔이고,
    상기 코어가 빈 공간이고,
    n은 2 내지 30의 자연수 중 어느 하나인 경우,
    상기 쉘부는 외부로부터 내부로 차례로 위치하는 n개의 쉘을 포함하고,
    상기 코어부는 상기 쉘부의 내부에 위치하는 코어를 포함하고,
    n-1번째 쉘의 내부에 인접하여 n번째 쉘이 위치하고,
    상기 n-1번째 쉘이 쉘용 세포외 기질 및 쉘용 세포를 포함하는 하이드로겔이고,
    상기 n번째 쉘이 빈 공간이거나, 또는 쉘용 세포외 기질 및 쉘용 세포를 포함하는 하이드로겔이고,
    상기 코어가 빈 공간이거나, 또는 코어용 세포외 기질 및 코어용 세포를 포함하는 하이드로겔이고,
    상기 코어 및 2번째 내지 n번째 쉘 중 어느 하나가 빈 공간이고,
    상기 코어용 세포외 기질 및 상기 쉘용 세포외 기질이 각각 독립적으로 반데르발스 인력, 이온결합 또는 공유결합에 의해 하이드로겔을 형성하고,
    상기 코어 및 1번째 내지 n번째 쉘이 각각 구형이고,
    상기 코어용 세포외 기질 및 쉘용 세포외 기질이 각각 독립적으로 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA), 탈세포화 세포외 기질, 매트리젤, 나노셀룰로스, 히알루론산 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    n이 1이고,
    상기 코어가 1번째 쉘의 내부에 위치하고,
    상기 1번째 쉘이 제1 쉘용 세포외 기질 및 제1 쉘용 세포를 포함하고,
    상기 코어가 빈 공간인 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    n이 2이고,
    2번째 쉘이 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 코어가 상기 2번째 쉘의 내부에 위치하고,
    상기 1번째 쉘이 제1 쉘용 세포외 기질 및 제1 쉘용 세포를 포함하고,
    상기 2번째 쉘은 빈 공간이고,
    상기 코어가 상기 코어용 세포외 기질 및 상기 코어용 세포를 포함하고,
    상기 코어용 세포외 기질 및 상기 제1 쉘용 세포외 기질은 서로 같거나 다르고,
    상기 코어용 세포 및 상기 제1 쉘용 세포는 서로 같거나 다른 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    n이 2이고,
    2번째 쉘이 1번째 쉘의 내부에 위치하고, 상기 코어가 상기 2번째 쉘의 내부에 위치하고,
    상기 1번째 쉘이 제2 쉘용 세포외 기질 및 제2 쉘용 세포를 포함하고,
    상기 2번째 쉘이 제3 쉘용 세포외 기질 및 제3 쉘용 세포를 포함하고,
    상기 코어가 빈 공간이고,
    상기 제2 쉘용 세포외 기질 및 상기 제3 쉘용 세포외 기질은 서로 같거나 다르고,
    상기 제2 쉘용 세포 및 상기 제3 쉘용 세포는 서로 같거나 다른 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 n-1번째 쉘의 밀도가 상기 n번째 쉘의 밀도보다 작고, 상기 코어의 밀도가 상기 1번째 쉘의 밀도보다 작은 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 코어용 세포 및 쉘용 세포가 각각 독립적으로 섬유아세포(fibroblast), 줄기세포, 암세포, 혈관세포, 근육세포, 표피세포, 면역세포, 신경세포 및 신경교세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 섬유아세포가 포유류 유래 섬유아세포, 조류 유래 섬유아세포, 파충류 유래 섬유아세포, 양서류 유래 섬유아세포 및 어류 유래 섬유아세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    상기 쉘용 세포가 표피 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 표피 세포가 각질형성세포 및 멜라닌형성세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 코어-쉘 구조체가 유사 장기(organoid)에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  15. 삭제
  16. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (d) 후에, (e) 상기 하이드로겔에 포함된 세포를 배양하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서,
    상기 경화되지 않은 상기 코어 액적; 및 1번째 내지 n번째 액적; 중에서 1종 이상의 액적이 각각 독립적으로 젤라틴, 매트리젤, 알긴화칼슘, 피브린 및 젤라틴 메타크릴레이트 (GelMA) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 잉크가 미세압출 프린팅, 잉크젯 프린팅, 레이저 프린팅, 밸브타입 프린팅, 스프레이 프린팅, 마이크로 스탬핑 및 마스킹으로 이루어진 군에서 선택된 1종으로 토출되는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 코어용 바이오 잉크의 점도가 1 내지 500cP이고, 제n 바이오 잉크의 점도가 1 내지 500cP인 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조체의 제조방법.
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