KR102247547B1 - CRISPR/Cas9 시스템 기반 현사시나무 유전체 교정용 조성물 및 이의 이용 - Google Patents

CRISPR/Cas9 시스템 기반 현사시나무 유전체 교정용 조성물 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 CRISPR/Cas9 시스템 기반 현사시나무 유전체 교정용 조성물 및 이의 이용에 관한 것이 개시된다. 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 의하면 CRISPR/Cas9 시스템 기반으로 현사시나무의 유전자 교정이 오프-타겟없이 효과적으로 이루어질 수 있으며, 유전자 교정을 통해 스트레스 내성 등의 현사시나무 품종 개량에 이용될 수 있다.

Description

CRISPR/Cas9 시스템 기반 현사시나무 유전체 교정용 조성물 및 이의 이용 {Composition for genome editing of Populus alba × Populus glandulosa based on CRISPR-Cas9 system and its use}
본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템 기반 현사시나무 유전체 교정용 조성물 및 이의 이용에 관한 것으로, 더 상세하게는 현사시나무 PDS 유전자의 녹-아웃 유도 가이드 RNA를 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물, 이를 이용한 현사시나무의 유전체 교정 방법, 및 이 방법으로 제조된 백화 표현형의 현사시나무 돌연변이체에 관한 것이다.
3세대 유전자 가위로 알려진 CRISPR/Cas9 시스템은 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라고도 불리는 게놈 편집 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA(gRNA)와 특정한 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9 절단 효소(nuclease)로 구성된다. CRISPR/Cas9 시스템은 표적 유전자의 염기서열을 찾아가는 가이드 RNA를 제작해 절단 효소인 Cas9 와 짝을 이루어 표적이 되는 DNA 염기서열에 달라붙어 DNA 절단이 일어나고, DNA 복원(수선) 과정에서 돌연변이가 발생하게 되어, 결과적으로 표적 유전자의 기능을 억제할 수 있는 녹-아웃(knock-out)이 가능하다.
CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 유전자 교정은 애기장대와 담배 같은 모델 식물뿐만 아니라 감자, 벼, 옥수수, 토마토 등의 작물에서도 보고되었다(Jaganathan et al. 2018; Ma et al. 2016). 그러나 임목에서의 유전자 교정 사례는 다른 모델식물이나 작물에 비해 매우 적은 편이다. 특히 교잡종의 임목의 경우는 더욱이 찾아보기 힘들다.
한편 CRISPR/Cas9 시스템은 표적 유전자를 확실히 제거하고, 표적 유전자 외의 유전자에는 영향을 미치지 않아야 한다. 이는 CRISPR/Cas9 시스템이 표적 유전자의 염기서열과 유사한 비표적 염기서열에도 변이를 일으킬 가능성이 있기 때문이며 (오프-타겟), 이러한 가능성에 의해 예상치 못한 돌연변이 또는 예상 불가능한 문제가 발생할 수 있는 위험이 제거되어야 함을 의미한다. 따라서 CRISPR/Cas9 시스템을 효용성을 높이기 위해서는 표적 유전자에만 특이적이면서 정교하게 적용될 수 있는 (오프-타겟 없는) 가이드 RNA를 제작하는 것이 매우 중요하다.
현사시나무(Populus alba × Populus glandulosa)는 은백양(P. alba)과 수원사시나무(P. glandulosa)의 교잡종 포플러로서, 국내에 자라는 주요한 포플러 중의 하나로 널리 분포하고 있다. 따라서 현사시나무의 품종 개량에 활용할 수 있는 유전자 편집 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템 기반 현사시나무의 유전자 편집 기술에 관한 연구를 지속한 결과, 오프-타겟(off-target) 없이 현사시나무 유전체(PDS 유전자)를 교정하는 가이드 RNA를 개발하게 되어 본 발명은 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 현사시나무 PDS 유전자의 녹-아웃 유도 가이드 RNA를 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 현사시나무의 유전체 교정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 백화 표현형의 현사시나무 돌연변이체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 현사시나무 PDS 유전자의 녹-아웃 유도 가이드 RNA를 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
PDS (Phytoene desaturase)는 카로테노이드 생합성에 관여하는 핵심 효소 중 하나이다. PDS 유전자가 녹-아웃되면 엽록소와 카로테노이드 생합성을 저해하여 식물의 백화 표현형(albinism)을 유도한다. PDS 유전자는 표현형 조사만으로 돌연변이 생성 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에서는 현사시나무의 PDS 유전자를 클로닝하여 671bp 염기서열을 확인하였으며, PagPDS1 유전자라고 명명하였다. PagPDS1 유전자는 3개의 엑손과 3개의 인트론을 포함하고 있다 (도 1, 서열번호 1, 서열번호 2 (엑손 2)).
본 발명에서 PDS 유전자의 녹-아웃 유도 가이드 RNA (gRNA)는 PagPDS1의 2번 엑손에서 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer-adjacent motif; PAM)를 포함한 23bp 크기의 표적 부위(도 1의 밑줄 부분, 도 3)에 상보적인 23~25개의 연속 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 즉 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열에서 5' 말단으로부터 317 내지 339번째 연속 염기서열(서열번호 3; 표적 부위)과 상보적인 23~25개의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 표적 부위는 서열번호 1의 염기서열 중에서 5' 말단으로부터 317 내지 339번째 연속 염기를 포함하는 것이다. 또한 상기 표적 부위는 서열번호 3의 염기서열이다.
상기 표적 부위는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)을 포함한다. PAM은 구아닌 (guanine : G)이 많은 영역으로서, 유전자 편집이 일어나는 표적 서열을 타깃하는 역할을 한다. 즉 가이드 RNA는 PAM과 인접한 절단된 표적 서열 (프로토스페이서)을 찾아 결합한다. 상기 PAM은 5'-AGG-3', 5'-GGG-3', 5'-CGG-3' 및 5'-TGG-3'로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 표적 부위의 염기서열에 특이적인 RNA로서, Cas9 효소와 결합하여 Cas9 효소를 표적 부위로 인도할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 단일-사슬 가이드 RNA (single-chain guide RNA : sgRNA)일 수 있다. 가장 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열인 5'-GGUUCUGGCCUGGAACUAUUGUG-3' 이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 유전자 가위 (programmable nuclease)의 구성요소일 수 있다. 유전자 가위는 유전체 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 형태의 뉴클레아제를 말한다. 본 발명에서는 바람직하게는 CRISPR/Cas9이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 CRISPR/Cas9를 구성하는 가이드 RNA일 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리뉴클레오티드는 Cas9 절단효소에 의해 PAM 근처에서 PagPDS1 유전자의 표적 서열에 이중 가닥 절단을 유도한다. 상기 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 접합에 의해 복구되는데, 이러한 과정은 PagPDS1 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열에 삽입/결실 부위를 형성하여 구조-이동 변이를 유발할 수 있다. 변이가 유발된 PagPDS1 유전자는 그의 발현이 억제되어 녹-아웃된다.
본 발명에서, PagPDS1 유전자의 변이는 한쌍의 대립유전자(allele)에서 모두가 변이를 갖는 것이다. 상기 변이는 예를 들면, 하나 이상의 염기의 결실, 치환, 삽입, 삽입/결실 또는 그에 의한 구조-이동 돌연변이를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 변이는 예를 들면 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 PagPDS1 표적 부위의 PAM 상위 4번에 위치한 DNA 염기서열에서 1~5 bp의 염기 결실 (즉, 서열번호 2의 염기서열에서 25번째부터 1~5 bp의 염기 결실) 또는 1 bp의 염기 삽입(Adenine/Thymine 또는 Cytosine)된 것 (즉, 서열번호 2의 염기서열에서 25번째에 1 bp의 염기 삽입)일 수 있다. 또한 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 PAM 상위 9번 위치의 DNA 염기서열에서 25~27 bp의 염기가 결실(즉, 서열번호 2의 염기서열에서 30번째부터 25~27 bp의 염기 결실)되거나, 대립유전자 중 하나는 PAM 4번 위치에서 1 bp 염기(A)의 삽입 (즉, 서열번호 2의 염기서열에서 25번째에 1 bp의 염기 삽입)되고 다른 하나는 PAM 상위 9번 위치에서 27 bp의 염기가 결실 (즉, 서열번호 2의 염기서열에서 30번째부터 27 bp의 염기 결실)된 것일 수 있다 (표 2).
본 발명에서 상기 가이드 RNA는 매개체에 포함된 것일 수 있다.
상기 매개체는 현사시나무 세포에 도입되어 상기 가이드 RNA를 생성하는 것일 수 있다. 상기 매개체는 현사시나무 세포에 도입되어 상기 가이드 RNA 및/또는 Cas9 폴리펩티드(절단효소)를 발현하여, 세포 또는 개체 내에서 PagPDS1 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열에 삽입/결실 부위를 형성하여 구조-이동 변이를 유발할 수 있다.
상기 매개체는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 본 발명에서 바람직하게는 상기 매개체는 아그로박테리움(Agrobacterium)일 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 Cas9 절단효소를 암호화하는 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 제2 폴리뉴클레오티드는 미생물 유래일 수 있다. 예를 들면, 스트렙토코커스 속 (예를 들면, Streptococcus pyogens), 네이세리아 속 (예를 들면, Neisseria meningitidis), 파스테우렐라 속 (예를 들면, Pasteurella multocida), 프란시셀라 속 (예를 들면, Francisella novicida), 또는 캄필로박터 속 (예를 들면, Campylobacter jejuni)의 미생물로부터 유래된 것일 수 있고, 재조합된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 가이드 RNA를 포함하는 조성물은 현사시나무의 PagPDS1 유전자의 발현을 저해하여 (녹-아웃을 유도하여) PDS 단백질이 정상적으로 합성되지 않아서 백색 표현형의 돌연변이체를 유발한다 (표 2, 도 5). 또한 본 발명의 가이드 RNA를 포함하는 조성물은 오프-타겟을 발생하지 않는다 (도 6).
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 상기 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 이용하여 현사시나무의 유전체 교정 방법을 제공한다.
상기 방법은
i) 상기 가이드 RNA를 포함하는 조성물로 현사시나무의 세포를 형질전환하는 단계;
ii) 형질전환된 현사시나무의 세포를 배양하여 형질전환된 캘러스를 얻는 단계; 및
iii) 형질전환된 캘러스를 재분화하여 백화 현상이 유도된 돌연변이 현사시나무를 얻는 단계를 포함한다.
상기 단계 i)에서, 상기 조성물은 Cas9 절단효소를 암호화하는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다.
필요에 따라서, 본 발명의 방법은 단계 iii) 후에, 돌연변이 현사시나무의 유전자 증폭 또는 발현 분석을 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 유전자 분석은 PagPDS1의 표적 서열의 PCR 증폭을 수행한 후 시퀀싱을 통하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 PagPDS1의 표적 서열의 증폭에 최적의 프라이머를 설계하였다: PagPDS1-Forward primer: 5'-CTCTCAAGTTGCCTTGAGATG-3' (서열번호 9),
PagPDS1-Reverse primer: 5'-GCACAATCTCTCAAGAGTACATGC-3'(서열번호 10).
또한 필요에 따라서, 본 발명의 방법은 단계 iii) 후에, 오프-타겟 (off-target) 분석을 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 PagPDS1의 표적부위의 염기서열과 유사한 염기서열을 포함한 DNA 염기서열을 PCR 증폭할 수 있는 프라이머 서열을 설계하였다:
PagPDS2-Forward primer: 5'-TGATGAATCATATTCACCCTCC-3' (서열번호 11)
PagPDS2-Reverse primer: 5'-AGTGCAAGAACACAGCGTG-3' (서열번호 12).
본 발명에서는 PagPDS1의 유전자 발현을 분석하기 위하여 RT-qPCR 증폭할 수 있는 프라이머 서열을 설계하였다.
PagPDS1-qRT-PCR Forward primer: 5'-TGGAAGGTGCTGTTCTATCAG-3' (서열번호 13)
PagPDS1-qRT-PCR Reverse primer: 5'-CTATACAACATTAGCCACAATGC-3' (서열번호 14).
백색 표현형이 유도된 돌연변이 현사시나무의 PDS1 단백질은 두 개의 대립유전자 모두에서 예상 아미노산 서열이 조기 종결되거나, 두 개의 대립유전자의 예상 아미노산 서열 중 하나는 조기 종결되고 다른 하나는 구조-이동되었다 (도 5).
또한 본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 백색 표현형의 현사시나무 돌연변이체를 제공한다.
본 발명에 따른 현사시나무 PDS 유전자의 녹-아웃 유도 가이드 RNA를 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물 및 이를 이용하는 교정 방법에 의하면, 현사시나무에서 PagPDS1 유전자의 기능이 소실된 돌연변이를 74.55%의 매우 높은 변이율로 얻을 수 있고, 현사시나무에서 두 개의 대립유전자 모두에서 변이를 일으켜 백색 표현형을 도출하였다. 모든 표현형의 현사시나무에서 PagPDS1과 상동성이 높은 PagPDS2의 DNA 염기서열을 확인한 결과, 오프-타겟 효과는 나타나지 않았다.
따라서 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 의하면 CRISPR/Cas9 시스템 기반으로 현사시나무의 유전자 교정이 오프-타겟 없이 효과적으로 이루어질 수 있으며, 유전자 교정을 통해 스트레스 내성 등의 현사시나무 품종 개량에 이용될 수 있다.
도 1은 클로닝된 PagPDS1 유전자의 게놈 DNA와 cDNA의 염기서열을 정렬한 것이다 (B). 밑줄은 gRNA-결합부위를 나타내고, PAM 서열은 파란색으로 표기되어 있다. (A)는 PagPDS1 유전자의 엑손과 인트론의 개략도이다.
도 2는 PagPDS1 유전자를 구성하는 대립유전자 염기서열을 정렬한 것이다. PagPDS1.1a는 Populus alba에서 유래한 대립유전자이고, PagPDS1.2a는 Populus glandulosa에서 유래한 대립유전자이다. PagPDS2은 PagPDS1-유사 유전자이다. 표적 서열은 밑줄로 표기되고, PAM 서열은 파란색으로 표기되어 있다.
도 3은 아그로박테리움-매개 형질전환을 위해 사용되는 CRISPR/Cas9 벡터의 개략적 지도이다.
도 4는 CRISPR/Cas9-유도된 돌연변이체들의 표현형을 보여주는 사진이다. (A) 아그로박테리움-매개 형질전환 후 복수의 발아체 발생을 보여주고, (B) 백색 표현형(Albino), (C) 옅은 녹색 표현형(Pale-green), (D) 야생형과 차이가 없는 녹색 표현형(Green)을 나타낸다.
도 5는 PagPDS1 돌연변이체들의 예측된 단백질 서열을 나타낸다. 표적 서열은 검은색으로, PAM 서열은 파란색으로 표기된다. 치환 또는 결실 아미노산은 붉은색으로 표기된다. 우측 숫자는 아미노산의 위치를 나타낸다.
도 6은 PagPDS2 유전자에서 오프-타겟 분석 결과를 보여준다. 표적 영역의 정렬은 모든 표현형에서 동일한 서열을 나타낸다. PagPDS2 유전자는 POPTR_0002s23630에 유사하다.
도 7는 표현형에 따른 PagPDS1 돌연변이체들에서 PagPDS1 유전자의 발현변화를 나타낸다. A는 표현형에 따른 cDNA의 서열을 보여주고, B는 PagPDS1 돌연변이체인 옅은 녹색 표현형과 백색 표현형에서 PagPDS1 유전자 발현이 감소됨을 보여주는 그래프이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
실시예 1. 현사시나무의 PDS (phytoene desaturase) 유전자의 클로닝
현사시나무의 PDS 유전자(PagPDS1 유전자)를 클로닝하기 위하여 토멘토사 포플러(Populus tomentosa)에서 보고된 PDS 유전자의 염기서열을 바탕으로 프라이머 쌍: PagPDS1-Forward 프라이머 (5'-GTTGAATTTGGTTTTGGAGAAATG-3'; 서열번호 5)과 PagPDS1-Reverse 프라이머 (5'-CATTTAATGGTGCAGGGAGAAC-3'; 서열번호 6)을 제작하여 PCR (polymerase chain reaction) 증폭을 실시하였다. PCR 증폭은 pfu-xDNA polymerase kit (SolGent, Korea)을 사용하여 매뉴얼에 따라 진행하였다. PCR 증폭 산물을 ExPin Combo GP (GeneAll, Korea)를 이용하여 정제하고 염기서열을 분석하였다. 그 결과, PagPDS1 유전자의 개시코돈을 포함하는 671 bp의 염기서열을 확인하였다 (도 1 및 서열번호 1).
도 1에 나타낸 바와 같이, PagPDS1 유전자는 3개의 엑손과 3개의 인트론을 포함하고 있다.
PagPDS1의 DNA 염기서열을 바탕으로 은백양과 수원사시나무로부터 각각 PagPDS1 유전자를 PCR 증폭하여 DNA 염기서열을 분석한 결과, PagPDS1의 두 개의 대립유전자는 각각 PagPDS1.1a(은백양)와 PagPDS1.2a(수원사시나무)에서 유래한 것으로 확인되었다 (도 2).
실시예 2. 현사시나무 PDS 유전자의 돌연변이 유도 표적부위 선발 및 가이드 RNA 설계
PagPDS1 유전자 교정 염기서열을 선정하기 위하여 CRISPR RGEN Tools의 Cas-Designer (www.rgenome.net/cas-designer)를 사용하였다(Park et al. 2015). 서열 비교 대상으로 Populus trichocarpa (v3.1)의 유전체 정보를 활용하여, PagPDS1의 2번 엑손에서 PAM (protospacer adjacent motif)를 포함한 23 bp의 염기서열을 갖는 표적 부위를 선발하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
상기 표적부위에 대한 가이드 RNA는 다음과 같이 설계하였다. PAM 서열에 대해서는 스트렙토코커스 파이로게네스(Streptococcus pyogenes)의 SpCas9의 5'-NGG-3'으로 설정하였다. Single guide RNA 길이는 PAM 서열을 제외하고 20 base pair (bp)로 설정하였다. 서열번호 4의 PagPDS1 단일-가이드 RNA (sgRNA)를 선발하였다. 이 서열에 의한 오프-타겟(off-target) 영향을 피하기 위하여 CRISPR RGEN Tool (www.rgenome.net)을 이용하여 Populus trichocarpa (v3.1)와 in silico 분석을 실시하였다. 그 결과, PagPDS1의 표적 부위의 염기서열과 일치하는 다른 염기서열은 P. trichocarpa 유전체 정보에서 확인되지 않았다.
실시예 3: 벡터 구축
PagPDS1 sgRNA 카세트를 Cas9 절단효소를 암호화하는 염기서열과 함께 현사시나무에서 발현될 수 있도록 식물 바이너리 벡터 pHSE401 (Addgene, USA)에 삽입하였다. sgRNA는 AtU6 프로모터에 의해 발현되게 하였고, 선발마커로는 하이그로마이신 저항성 유전자를 사용하였다 (도 3).
PagPDS1 sgRNA 카세트 삽입을 위하여 PagPDS1 sgRNA-Forward primer (5'-ATTGGTGTTATCAAGGTCCGGTCT-3'; 서열번호 7)와 PagPDS1 sgRNA-Reverse primer (5'-CACAATAGTTCCAGGCCAGACAAA-3'; 서열번호 8) 폴리뉴클레오티드를 설계한 후 Kim et al. (2016)의 방법에 따라 어닐링(annealing) 하였다. PagPDS1 sgRNA 카세트는 BsaI 제한효소로 절단한 후 pHSE401 벡터의 AtU6 프로모터에 연결하였다.
실시예 4: 아그로박테리움을 이용한 현사시나무 형질전환
기내에서 배양 중인 6주령의 현사시나무를 아그로박테리움을 이용한 형질전환에 사용하였다.
현사시나무의 형질전환은 Choi et al. (2005)에 의해 보고된 방법을 사용하였다. 현사시나무 형질전환에는 재조합 벡터 (pHSE/Cas9-PagPDS1 sgRNA)를 포함하고 있는 아그로박테리움(Agrobacteria tumefaciens GV3101)를 사용하였다.
구체적으로는 아그로박테리움은 LB 액상 배지 50 mL에 접종하여 28±1℃에서 2일간 현탁배양하였다. 아세토시링원 (Acetosyringone; 3',5'-D-methoxy-4' -hydroxy-acetopeptone) 100 μL/mL가 첨가된 0.85% NaCl로 아그로박테리움을 현탁한 후 0.5 mm 길이의 절간 조직(줄기)을 20분간 침지시켰다. 새로운 0.85% NaCl로 줄기를 침지시켜 여분의 아그로박테리움를 제거한 후 MS 배지 (Murashige and Skoog, 1962)로 옮겨 2일간, 24±1℃에서 암배양하였다. 형질전환된 캘러스를 선발하기 위하여 2,4-D 1 mg/L, napthaleneacetic acid (NAA) 0.1 mg/L, benzylaminopurin (BAP) 0.01 mg/L 그리고 hygromycin (Hyg) 2 mg/L가 첨가된 MS 배지 (pH 5.8)에서 4주간 배양하였다. 형질전환된 재분화 식물체를 유도하기 위하여 zeatin 1.0 mg/L, BAP 0.1 mg/L, NAA 0.01 mg/L 그리고 Hyg 2 mg/L가 첨가된 WPM 배지 (Woody Plant Medium, Lloyd and McCown, 1981) (pH 5.5)에서 8~13주간 배양하였다. 재분화된 식물체는 indole-3-butyric acid 0.2 mg/L가 첨가된 MS 배지 (pH 5.8)로 옮겨 뿌리를 유도하고 낮은 조도(65.3±2.6 μmol m-2s-1)에서 생육시켰다.
뿌리가 완전히 유도된 식물체를 표현형에 따라 3개의 그룹으로 구분하였다. 즉, 백색 표현형(albino phenotype), 옅은 녹색 표현형(pale-green phenotype) 그리고 녹색 표현형(green phenotype)으로 구분하였다 (도 4). 그룹별 식물체 수 및 돌연변이율은 표 1에 나타냈다.
표현형 Albino Pale-Green Green 총계
개체 수 66 16 28 110
비율 (%) 60 14.5 25.5 100
시퀀싱 수 29 7 4 40
표 1에 나타낸 바와 같이, 110개의 재분화 식물체 중 28개는 녹색, 66개는 백색, 16개는 옅은 녹색의 표현형을 나타내었다. 따라서 백색 표현형은 60%, 옅은 녹색 표현형은 14.55%, 그리고 녹색 표현형은 25.45%이었고 전체 돌연변이율은 74.55%이었다. 생육기간 동안 백색 표현형을 가진 현사시나무는 광에 민감하여 잎이 갈변되면서 고사하는 경향을 보였다.
실시예 5: 현사시나무의 PDS 유전자 돌연변이 분석
현사시나무에서 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 PagPDS1 유전자의 돌연변이를 확인하기 위하여 110개 중 40개체를 무작위로 선발하여 염기서열을 분석하였다. 선발된 돌연변이 현사시나무는 29개의 백색 표현형, 7개의 옅은 녹색 표현형 그리고 4개의 녹색 표현형을 포함하였다 (표 1).
PagPDS1 유전자의 돌연변이 분석은 PCR 증폭을 실시한 후 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)을 통하여 수행하였다.
구체적으로는 야생형과 돌연변이 현사시나무 식물체의 잎으로부터 게놈 DNA를 분리하여 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. PagPDS1의 표적부위를 증폭하기 위하여 프라이머, PagPDS1-Forward 프라이머 (5'-CTCTCAAGTTGCCTTGAGATG-3'; 서열번호 9)와 PagPDS1-Reverse 프라이머 (5'-GCACAATCTCTCAAGAGTACATGC-3'; 서열번호 10)을 사용하였다.
PagPDS1의 표적부위 변이는 상기 PCR 프라이머들을 사용하여 약 553 bp를 PCR 증폭하고 DNA 염기서열을 분석하였고, 그 결과를 표 2에 나타냈다.
Figure 112019118488295-pat00001
상기 표에서, 야생형 서열에서 PAM을 포함한 표적 서열은 밑줄이 그어져 있다. 변이는 붉은색으로 표기되어 있고, 결실 및 블랭크 염기는 붉은색 데쉬 및 검음색 도트로 각각 표시되어 있다. n.d.는 결정되지 않음을 나타낸다. 변이 컬럼은 삽입(+), 결실(-) 및 변경(alt) 염기들의 수를 나타낸다. PagPDS1.1a는 은백양(P. alba) 유래의 PDS1 유전자의 하나의 대립유전자이고 PagPDS1.2a는 수원사시나무(P. glandulosa) 유래의 PDS1 유전자의 나머지 하나의 대립유전자이다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 백색 표현형을 가진 현사시나무는 PagPDS1의 대립유전자의 표적부위 염기서열 변이에 따라 7개 유형으로 구분되었다.
백색 표현형의 유형 3, 6 및 7은 PagPDS1 표적부위 염기서열의 PAM 상위 4번에 위치한 DNA 염기서열에서 1~5 bp의 염기 결실과 1 bp의 염기 삽입(Adenine/Thymine 또는 Cytosine)을 나타내었다. 그리고 백색 표현형의 유형 1과 유형 5번에서는 PAM 상위 9번 위치의 DNA 염기서열에서 25~27 bp의 염기가 결실되었다. 백색 표현형의 유형 2에서 대립유전자 중 하나는 PAM 4번 위치에서 1 bp염기(A)의 삽입이 나타났고 다른 하나는 PAM 상위 9번 위치에서 27 bp의 염기가 결실되었다.
옅은 녹색 표현형은 3개의 유형으로 구분되었다. 옅은 녹색 표현형의 유형 2와 3은 PAM 상위 3번과 4번에 위치한 DNA 염기서열에서 1 bp 염기(C)가 삽입되었다. 그리고 유형 1은 PAM 상위 6번 염기서열에서 5 bp의 염기가 결실되었다.
완전한 녹색 표현형을 보인 현사시나무에서는 야생형의 DNA 염기서열과 차이를 보이지 않았다.
상기 결과로부터 현사시나무에서 PagPDS1-sgRNA-유도 Cas9 절단 이후, 비상동성 조환수복(non-homologous end joining)을 통해 PagPDS1 유전자의 2번 엑손이 손상되어 백색 돌연변이가 유도된 것을 알 수 있다. 또한 CRISPR-Cas9 시스템을 통하여 현사시나무에서 효과적으로 목적하는 유전자의 돌연변이를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
PagPDS1 유전자의 염기서열 변이에 따른 PDS 단백질의 변화(아미노산 서열의 변화) 여부를 확인하기 위하여 ExPAsy (https://web.expasy.org/translate)를 사용하여 예상 아미노산을 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에서, 치환 또는 결실 아미노산은 붉은색으로 표시되어 있고, 오른쪽 숫자는 아미노산 위치를 나타낸다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 백색 표현형의 PDS 유전자 산물에서는 아미노산 치환, 구조이동 또는 종결 코돈이 나타났다. 반면 옅은 녹색 표현형에서 1개의 아미노산 치환이 관찰되었다.
구체적으로는 백색 표현형의 유형 3과 7은 PagPDS1의 두 개의 대립유전자 모두에서 예상 아미노산 서열이 조기 종결되었다. 그리고 백색 표현형의 유형 2와 6은 두 개의 대립유전자의 예상 아미노산 서열 중 하나는 조기 종결되고 다른 하나는 구조이동 되었다 (도 5).
따라서 현사시나무에서 PagPDS1의 DNA 염기서열 변이로 인하여 PDS 단백질이 정상적으로 합성되지 않아 백색 표현형을 가지는 것으로 판단된다.
반면 한 개의 대립유전자에서 염기서열 치환이 일어나 아미노산 서열 변이만 나타나는 유형 3의 경우에는 옅은 녹색의 표현형을 나타냈다.
따라서 교잡종 포플러에서 두 개의 대립유전자를 가진 목적 유전자의 동형접합 돌연변이(homozygotic mutation)를 유도하는데 CRISPR/Cas9 시스템이 매우 효과적임을 알 수 있다.
실시예 6: 오프-타겟 분석
현사시나무에서 pHSE/Cas9-PagPDS1 sgRNA의 오프-타겟 (off-target) 분석을 위하여 Bae et al. (2014)의 방법에 따라 Cas9-offinder (www.reenome.net/cas-offinder)를 이용하여 P. trichocarpa (v3.1)에서 표적이탈 가능성이 있는(오프-타겟 가능성이 있는) 염기서열을 확인하였다. 그 결과 PagPDS1 sgRNA 염기서열에 1개의 염기 차이를 보인 P. trichocarpa의 POPTR_0002s23630.1을 선발하였다. 한편 PagPDS1 sgRNA 염기서열과 2개 또는 3개 이상의 차이를 보인 서열은 존재하지 않았다. POPTR_0002s23630.1과 유사한 DNA 염기서열을 PagPDS2로 명명하였다.
PagPDS2 염기서열을 PCR 증폭할 수 있는 프라이머 PagPDS2-F (5'-TGATGAATCATATTCACCCTCC-3'; 서열번호 11)와 PagPDS2-R (5'-AGTGCAAGAACACAGCGTG-3'; 서열번호 12)를 제작하였다. 이 프라이머를 이용하여 표현형에 따른 pHSE/Cas9-PagPDS1의 오프-타겟을 분석하기 위하여 백색, 옅은 녹색, 그리고 녹색 표현형을 가진 현사시나무와 야생형 대조구에서 PagPDS2 유전자를 PCR 증폭하였다. PCR 증폭은 pfu-xDNA polymerase kit (SolGent, Korea)를 사용하여 매뉴얼에 따라 진행하였다. DNA 염기서열을 분석하여 그 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 현사시나무의 표현형에서 PagPDS2의 DNA 염기서열이 일치하였다. 즉 모든 표현형에서 PagPDS1과 상동성이 높은 PagPDS2의 DNA 염기서열을 확인한 결과, 오프-타겟 효과는 나타나지 않았다. 결과적으로 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 현사시나무의 유전자 교정이 효과적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있다.
실시예 7: PagPDS1 유전자의 발현 분석
PagPDS1이 교정된 현사시나무에서 PagPDS1의 발현을 확인하기 위하여 real-time quantitative PCR (RT-qPCR)을 실시하였다.
구체적으로는 Total RNA는 Qiagen RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 분리하였다. 그리고 RNA to cDNA EcoDry premix (Oligo dT) (Takara, USA)를 이용하여 1ug의 total RNA로부터 cDNA를 합성하였다. RT-qPCR 분석에는 PagPDS1에 특이적으로 발현하는 프라이머 PagPDS1-qRT-PCR Forward primer(5'-TGGAAGGTGCTGTTCTATCAG-3'; 서열번호 13) 및 PagPDS1-qRT-PCR Reverse primer(5'-CTATACAACATTAGCCACAATGC-3'; 서열번호 14)를 제작하였다. 그리고 PCR 증폭산물의 정량을 위해 Actin 유전자를 내부표준으로 사용하였으며, Actin-qRT-PCR Forward primer (5'-GCCATCTCTCATCGGAATGGAA-3'; 서열번호 15) 및 Actin-qRT-PCR Reverse primer (5'-AGGGCAGTGATTTCCTTGCTCA-3'; 서열번호 16)를 제작하였다.
PCR 증폭반응을 위해 1 ㎕의 cDNA, 10 ㎕의 PCR Master Mix (2 × SYBRGreen, BioRad, USA), 1 ㎕의 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM) 그리고 7 ㎕의 nuclease-free water를 혼합하였다. 증폭반응은 CFX96 Touch™Real-Time PCR (BioRad, USA)을 사용하여 95℃에서 3분간 1회, 95℃ 15초의 변성, 57℃ 15초의 결합 그리고 72℃ 20초의 중합 과정을 40회 반복하였다. 그리고 72℃에서 10분간 1회 실시하였다. 분석은 3반복으로 수행하였고, 각 시료에서의 유전자 발현량을 2-△△Ct법에 따라 상대정량하였고, 그 결과를 도 7에 나타냈다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 야생형 대조구에 비해 옅은 녹색 표현형(PG-type)과 백색 표현형(A-type)을 가진 현사시나무에서 PagPDS1의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 7). 또한 PagPDS1의 발현은 백색 표현형(A-type)이 옅은 녹색 표현형(PG-type)에 비해서도 낮았다(도 7).
<110> National Institute of Forest Science <120> Composition for genomic editing of Populus alba x Populus glandulosa based on CRISPR-Cas9 system and its use <130> P10344 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 671 <212> DNA <213> Populus alba x Populus glandulosa <220> <221> exon <222> (299)..(437) <400> 1 atgagtgcat tgaacttgag ctggcatagt aatcattaga ctctcaagtt gccttgagat 60 gtggcgctta tcctacttgt tctcaccaaa cgaatgcact agcttttaga ggcagtgaat 120 caatgggcta tcctacttgt tctcaccaaa cgaatgcact agcttttaga ggcagtgaat 180 caatgggcca ttctttgaaa ttcccatttg cgggtgcgta gttctctacc ctacagggta 240 attattagtt gccaatcaat acgtgaaaat ttggggtgat cttttgtcta cgctgtaggt 300 tgtctgtatg gactatccaa gaccggacct tgataacacg gtgaatttct tagaggctgc 360 cttgttatct tcatcctttc gttcttctcc gcgtccagct aaaccattaa atgttgtcat 420 tgtcattgct ggtgcaggtg atgaaatctt atcctttttt tgtatgggaa aaaactgtgt 480 tgattattta gattgatttc tatctatgtg taaaactttt tctttgaaat attgccctcg 540 cgtttaatta ataattttga caaattttcc ttattttttc aggtttggcg ggtttatcga 600 ctgcaaaata cttggcagat gcgggccata agcctatatt gcttgaagca agagatgttt 660 taggtggaaa g 671 <210> 2 <211> 139 <212> DNA <213> Populus alba x Populus glandulosa <220> <221> exon <222> (1)..(139) <223> exon 2 of PagPDS1 <400> 2 gttgtctgta tggactatcc aagaccggac cttgataaca cggtgaattt cttagaggct 60 gccttgttat cttcatcctt tcgttcttct ccgcgtccag ctaaaccatt aaatgttgtc 120 attgtcattg ctggtgcag 139 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Populus alba x Populus glandulosa <220> <221> gene <222> (1)..(23) <223> target site <400> 3 ccaagaccgg accttgataa cac 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> guide RNA <400> 4 gguucuggcc uggaacuauu gug 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 gttgaatttg gttttggaga aatg 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 catttaatgg tgcagggaga ac 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PagPDS1 gRNA-Forward primer <400> 7 attggtgtta tcaaggtccg gtct 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PagPDS1 gRNA-Reverse primer <400> 8 cacaatagtt ccaggccaga caaa 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PagPDS1-Forward primer <400> 9 ctctcaagtt gccttgagat g 21 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PagPDS1-Reverse primer <400> 10 gcacaatctc tcaagagtac atgc 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PagPDS2-Forward primer <400> 11 tgatgaatca tattcaccct cc 22 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PagPDS2-Reverse primer <400> 12 agtgcaagaa cacagcgtg 19 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PagPDS1-qRT-PCR Forward primer <400> 13 tggaaggtgc tgttctatca g 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PagPDS1-qRT-PCR Reverse primer <400> 14 ctatacaaca ttagccacaa tgc 23 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-qRT-PCR Forward primer <400> 15 gccatctctc atcggaatgg aa 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-qRT-PCR Reverse primer <400> 16 agggcagtga tttccttgct ca 22

Claims (14)

  1. 현사시나무 PDS 유전자의 녹-아웃 유도 가이드 RNA를 포함하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물로,
    상기 가이드 RNA는 서열번호 4의 염기서열을 갖고,
    현사시나무 PDS 유전자를 돌연변이율 74.55%로 변이시키고
    오프-타겟이 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일-사슬 가이드 RNA(single-chain guide RNA: sgRNA)인 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 아그로박테리움 매개체에 포함된 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, Cas9 절단효소를 암호화하는 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 변이는 서열번호 2의 염기서열에서 25번째부터 1~5 bp의 염기 결실, 서열번호 2의 염기서열에서 25번째에 1 bp의 염기 삽입, 또는 서열번호 2의 염기서열에서 30번째부터 25~27 bp의 염기 결실인 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 변이는 대립유전자 중 하나는 서열번호 2의 염기서열에서 25번째에 1 bp의 염기가 삽입되고 다른 하나의 대립유전자는 서열번호 2의 염기서열에서 30번째부터 27 bp의 염기가 결실된 것을 특징으로 하는 현사시나무의 유전체 교정용 조성물.
  10. i) 제 1항에 따른 조성물로 현사시나무의 세포를 형질전환하는 단계;
    ii) 형질전환된 현사시나무의 세포를 배양하여 형질전환된 캘러스를 얻는 단계; 및
    iii) 형질전환된 캘러스를 재분화하여 백화 현상이 유도된 돌연변이 현사시나무를 얻는 단계; 를 포함하는 현사시나무의 유전체 교정 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 10항에 따른 방법으로 제조된 백색 표현형의 현사시나무 돌연변이체.
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Di Fan 등. SCIENTIFIC REPORTS. Vol. 5, No. 12217, 페이지 1-7 (2015.07.20.)* *
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