KR102240042B1 - 상기도 감염 치료용 폴리이노신산-폴리사이티딜산(폴리 (i:c)) 제형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상기도의 바이러스성 감염 또는 보통감기의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 폴리이노신산-폴리사이티딜산(폴리 (I:C)) 및 전분, 알기네이트, 블라노스(blanose) 또는 DPPC(디팔미토일포스파티딜콜린)로부터 선택된 담체 중합체의 마이크로입자들을 포함하는 조성물, 및 감염 또는 보통감기의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 사용하기 위한, 상기 조성물을 포함하는 장치, 바람직하게는 비강 전달 시스템(nasal delivery system)에 관한 것이다.

Description

상기도 감염 치료용 폴리이노신산-폴리사이티딜산(폴리 (I:C)) 제형{POLYINOSINIC-POLYCYTIDYLIC ACID (POLY (I:C)) FORMULATIONS FOR THE TREATMENT OF UPPER RESPIRATORY TRACT INFECTIONS}
본 발명은 감염 또는 보통감기의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 폴리이노신산-폴리사이티딜산(폴리 (I:C)) 및 전분, 알기네이트, 블라노스(blanose) 또는 DPPC(디팔미토일포스파티딜콜린)로부터 선택된 담체 중합체의 마이크로입자들을 포함하는 조성물, 및 감염 또는 보통감기의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 사용하기 위한, 상기 조성물을 포함하는 장치, 바람직하게는 비강 전달 시스템(nasal delivery system)에 관한 것이다.
보통감기(비인두염, 급성 바이러스성 비인두염, 급성 비염, 또는 감기라고도 알려짐)는 주로 바이러스에 의해 야기된 상기도계의 바이러스성 감염성 질병이다.
바이러스
보통감기는 상기도의 바이러스성 감염이다. 가장 흔히 관련되는 바이러스는 99개의 혈청형이 알려진 일종의 피코르나바이러스인 리노바이러스(30 내지 50%)이다. 다른 것에는 코로나바이러스(10 내지 15%), 인플루엔자(5 내지 15%), 사람 파라인플루엔자 바이러스, 사람 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 엔테로바이러스, 및 메타뉴모바이러스가 포함된다.
통틀어 200개를 초과하는 혈청학적으로 상이한 바이러스 유형이 감기를 일으킨다. 코로나바이러스는 성인 감기에 특히 관련된다. 30개를 초과하는 코로나바이러스 중, 3개 또는 4개는 사람에서 감염을 일으키지만, 이들은 실험실에서 성장시키기가 어려우며, 따라서 그들의 중요성이 그다지 충분히 해명되어 있지 않다. 많은 상이한 유형의 바이러스 및 연속 변이에 대한 그들의 경향으로 인해, 보통감기에 대한 완전 면역을 얻는 것은 불가능하다.
임상 징후 및 증상
상기도 바이러스의 제1 적응증은 흔히 아프거나 따끔거리는 인후이다. 다른 일반적인 증상은 콧물, 충혈, 및 재채기이다. 이들은 때때로 결막염(충혈안), 근육통, 피로, 권태감, 두통, 위약감, 또는 식욕 상실이 동반된다. 기침 및 열은 일반적으로, 약 80%의 양성 예측치를 갖고서 상기도 바이러스라기보다는 인플루엔자의 적응증이다. 증상은 영아 및 유아에게서 더 심각할 수 있으며, 이러한 경우에, 이는 열 및 두드러기를 포함할 수 있다. 또한, 상기도 바이러스는 흡연자에게서 더 심각할 수 있다.
바이러스 복제는 초기 접촉 후 2 내지 6시간째에 시작된다. 증상은 통상 초기 감염 후 2 내지 5일째에 시작되지만, 때때로 10시간만큼이나 짧은 시간 내에 일어난다. 증상은 증상 발현 후 2 내지 3일째에 피크이며, 반면 인플루엔자 증상 발현은 일정하며 즉각적이다. 지속시간을 단축시키는 치료는 현재 알려져 있지 않지만, 증상은 통상 자발적으로 7 내지 10일 내에 해소되며, 이때 일부 증상은 경우에 따라 최대 3주 동안 지속될 것이다. 소아에게서, 기침은 그러한 사례의 35 내지 40%가 10일 초과 동안 지속되고 10%가 25일 초과 동안 계속된다. 보통감기는 사람에게서 가장 빈번한 감염성 질병으로, 평균 성인은 일년에 2 내지 4회 감염에 걸리고, 평균 소아는 6 내지 12세 연령에서 연당 수 회 감염에 걸린다. 미국에서, 감기의 발생률은 가을 및 겨울에 더 높은데, 대부분의 감염은 9월 내지 4월에서 일어난다. 이러한 계절성(seasonality)은 바이러스의 전염 기회를 증가시키는, (서로 더 가까이 근접한 상태로) 실내에서 더 많은 시간을 보내는 사람들에 기인될 수 있거나 학년의 시작에 기인될 수 있다.
감염 기간
보통감기는 증상의 처음 2 내지 3일 동안 가장 감염성이 높지만, 또한 이는 증상이 발현되기 전에 수 일 동안 감염성이며 증상이 완전히 해소될 때까지 여전히 다소 감염성일 수 있다.
사람 리노바이러스
사람 리노바이러스는 피코르나바이러스 과(Picornaviridae family)에서의 엔테로바이러스 속(Enterovirus genus)의 구성원이다. HRV 입자는 4개의 폴리펩타이드(VP1, VP2, VP3, 및 VP4)로 이루어진 27 내지 30nm 외피 비보유 캡시드로 이루어진다. 바이러스 캡시드는 대략 7200개 염기의 단일-가닥 RNA 게놈을 포함한다. 바이러스에 의해 암호화된 단백질(VPg)이 RNA 게놈의 5' 말단에 공유 부착된다. 사람 리노바이러스(HRV)에 의한 감염의 임상 과정은 잘 특징규명되어 있다. HRV는 상기도 및 하기도, 비점막, 부비동 및 중이를 감염시킬 수 있으며, 감염은 "보통감기"의 증상(상기 참조)을 초래한다. 감염은 자기-한정성(self-limiting)이며, 전형적으로 상기도로 제한된다. 말초 백혈구수가 감염의 처음 2 내지 3일 동안 상승될 수 있다.
또한, HRV 감염은 하기도의 감염, 중이염(특히, 유아에게서), 및 부비동염으로 이어질 수 있다. 리노바이러스 감염으로부터의 심각한 합병증(예컨대, 폐렴)은 드물며, 영아 및 유아, 특히 기관지폐 이형성증, 선천성 심장병, 조숙, 및 신경학적 질환과 같은 조건에 놓여 있는 아이들, 및 면역억제(골수 이식 수령자) 성인에게서 일어나는 것으로 보고되어 왔다. 피코르나바이러스 과의 다른 구성원(즉, 폴리오바이러스, 엔테로바이러스)이 중추 신경계를 감염시킬 수 있지만, HRV에 의한 사람 중추 신경계의 감염은 보고되어 있지 않다.
치료
리노바이러스 감염의 치료 또는 보통감기의 예방을 위해 시판되는 항바이러스제는 없다. 리노바이러스에 의해 야기된 상기도 감염의 치료는, 전형적으로 처방전 없이 구입할 수 있는(over the counter) 항히스타민제, 아스피린, 기침 억제제, 및 비충혈제거제를 사용하여 증상(재채기, 비충혈, 비루, 눈 자극, 인후통, 기침, 두통, 열, 오한)을 관리하는 것에 기초한다. HRV 감염의 더 심각한 합병증(예를 들어, 폐렴)은 의학적으로 적절한 케어 표준을 사용하여 관리된다.
비용 및 의학적 필요성
세계 보건 기구의 데이터에 따르면, 10억 건이 넘는 보통감기 사례가 지난해에 USA에서 보고되었다. 미국에서, 보통감기는 연간 77억 달러의 보수적 비용 평가에서 매년 7천5백만 내지 1억 회의 병원진찰 횟수에 이르고 있다. 미국인은 일반 의약품(over-the-counter drug)에 대해 29억 달러를 소비하고, 증상 완화를 위한 처방전 의약품에 대해 추가 4억 달러를 소비한다. 감기로 인해 2천2백만 내지 1억8천9백만으로 추산되는 등교일수가 매년 빠진다. 그 결과, 부모는 그들의 자녀를 돌보기 위해 집에 머무르기 위해 1억2천6백만의 작업일수를 빠진다. 감기를 앓는 피고용자에 의해 빠진 1억5천만의 작업일수에 추가되는 경우, 감기-관련 작업 손실의 전체 경제적인 영향은 연당 2백억 달러를 초과한다. 이는 작업으로부터 손실된 시간의 40%를 차지한다.
기도 상피 세포는 리노바이러스 및 코로나 바이러스와 같은 상기도(URT) 감염성 인자의 1차 표적이다. 이들 바이러스에 의한 감염은 증상의 발현(이는 감염된 세포의 면역 시스템 클리어런스를 반영함) 전에 일어나기 때문에, 직접적인 항바이러스 치료학적 중재는 그다지 효과적인 것으로 입증될 것 같지 않다. 게다가, 비점막에서의 직접적인 항바이러스 화합물의 활성 수준의 실현 및 지속은 이의 높은 턴오버(turnover)로 인해 매우 어렵다. 다른 한편으로, 신체 스스로의 방어를 이용하고 코의 상피 세포에서의 항바이러스 상태를 유도함에 의한 예방은 추후의 바이러스 공격에 대한 상당한 보호를 가져올 뿐만 아니라 질병-관련 증상을 낮추는 것으로 이미 밝혀졌다.
감기는 단지 1주 또는 2주만 지속될 수 있지만, 심각한 감기는 최대 1개월 동안 지속될 수 있다. 연령 및 노출에 따라, 성인은 연간 평균 2 내지 3회, 그리고 소아는 6 내지 10회 감기에 걸린다. 감기 바이러스의 수백 개의 상이한 혈청형이 있어서, 그들 모두에 대해 효과적인 표준 백신 예방을 개발하는 것은 불가능하다.
증상 치료는 일반적으로 수면-유도 경구 항히스타민제 및/또는 혈관-수축 충혈제거제를 사용하는 것을 포함하는데, 이들은 자극제 부작용을 갖는다. 이는 단지 미미하게 효과적이며, 이들 부작용은 종종 감염 그 자체만큼이나 약화시킨다. 예방이 이상적인 해결책이지만, 상기 언급된 이유로 모든 상이한 혈청형에 대해 광범위하게 효과적인 백신을 가질 가능성은 가까운 미래에는 높지 않을 것 같다. 따라서, 격리되지 않는 한, 사람들은 정기적으로, 특히 "동계" 동안에 이들 감염성 인자에 노출될 것이며, 따라서 광범위하게 효과적이며 편리하고 부작용이 없는 예방약이 공중 위생 및 직장에서의 생산성에 큰 영향을 줄 것이다.
신체에 대한 "조기 경고 시스템"인 선천 면역 반응을 표적으로 하는 것은 상기 언급된 문제점들을 해결할 것이다. 코의 상피 세포에 존재하는 이 시스템은 일단 적절하게 자극되면, 세포들을 그들이 바이러스에 의해 공격되고 있는 것으로 여기게 하고 항바이러스 방어 반응을 촉발시킨다. 일단 이것이 일어나면, 세포들은 추후의 바이어스 공격에 내성을 나타낸다. 선천 면역 반응을 촉발시키기 위해 인터페론과 같은 면역 자극성 분자의 사용을 모색하는 몇몇 초기 연구가 1980년대 말에 행해졌지만, 제조 비용이 많이 들었으며 그들의 효과를 제어하기가 어려웠다.
CN 101 757 018 A (2010-06-30) JP 2009-209086 A (2000-09-17) US 2005/244505 A1 (2005-11-03) US 2004/248837 A1 (2004-12-09)
Wong J. P. et al., "Liposome-mediated immunotherapy against respiratory influenza virus infection using double-stranded RNA poly ICLC", Vaccine, Elsevier Ltd, GB, vol. 17, no. 13-14, pp. 1788-1795 (1999-01-01) Heffernan M. J. et al., "The stimulation of CD8+ T cells by dendritic cells pulsed with polyketal microparticles containing ion-paired protein antigen and poly(inosinic acid)-poly(cytidylic acid)", Biomaterials, Elsevier Science Publishers BV. Barking, GB, vol. 30, no. 5, pp. 910-918 (2009-02-01) Christopher M. E. et al, "Use of toll-like receptor 3 agonists against respiratory viral infections," Anti-inflammatory and anti-allergy agents in medicinal chemistry 2011 Bentham Science Publishers B.V. NLD., vol. 10, no. 5, pp. 327-338 (2011-10)
본 조사의 목적은 선천 면역 시스템을 준비시키고 바이러스성 감염에 대한 보호를 제공하기 위해, 예를 들어 매 수 일마다 또는 심지어는 주 1회로, 측정가능하고 제어가능한 방식으로 사용될 수 있는 촉발성 분자(폴리 (I:C))의 제형을 개발하는 것이었다. 하기에 개략적으로 설명된 접근은, 입증된 효능을 갖지만 비실용적인 현존하는 제제인 폴리 (I:C)를 취하고, 제형 과학을 사용하여 이를 편리하고 효과적이게 한다.
톨-유사 수용체 3(TLR3)는 사람에게서 TLR3 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. TLR3는 선천 면역의 병원체 인식 및 활성화에서 기본적인 역할을 하는 선천 면역 시스템의 패턴 인식 수용체들의 톨-유사 수용체 패밀리의 구성원이다. TLR은 초파리(Drosophila)부터 사람에 이르기까지 고도로 보존되어 있으며, 구조적 및 기능적 유사성을 공유한다. 이들은 감염성 인자 상에서 발현되는 병원체-회합된 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)을 인식하고, 효과적인 면역의 발생에 필요한 사이토카인의 생산을 매개한다. 다양한 TLR은 상이한 발현 패턴을 나타낸다. 또한, 이러한 TLR3 수용체는 기도 상피 세포에 의해 발현되고 백혈구의 수지상 아집단으로 제한된다.
TLR3는 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 인식한다. 이중-가닥 RNA는 바이러스 복제 사이클 동안 형성될 수 있는 2개의 상보적인 가닥을 갖는 RNA이다. 인식시, TLR3는 NF-κB 및 인터페론 조절 인자 3(IRF3)와 같은 전사 인자들의 활성화를 유도하여, 다른 세포들에 신호전달하여 그들의 항바이러스 방어를 증가시키는 제I형 인터페론의 생산을 증가시킨다.
TLR3의 구조는 이웃하는 편자(horseshoe)와 접촉하는 대형 편자 형상을 형성하여, 2개의 편자의 "이량체"를 형성한다. TLR3 단백질 표면의 대부분은 당 분자로 덮여서 당단백질이 되지만, (2개의 편자들 사이의 제안된 계면을 포함하는) 한쪽 전면(face) 상에는 큰 무당(sugar-free) 표면이 있다. 또한, 이 표면은 양으로 하전된 아미노산이 풍부한 2개의 구별되는 패치를 포함하는데, 이들 패치는 음으로 하전된 이중-가닥 RNA를 위한 결합성 부위일 수 있다.
폴리이노신-폴리사이티딜산 (폴리 (I:C))은 MW 분포가 최대 1.000.000 달톤인 이중 가닥 RNA 분자이다. 폴리 (I:C)는 바이러스 RNA를 모방하는 톨 유사 수용체 3(TLR3) 리간드이고, 선천 면역 반응의 공지된 자극제이다. 비강 투여될 때, 이는 코의 상피에서 인터페론 α 및 β와 같은 항바이러스 단백질의 발현을 유도한다. 이는 리노바이러스 감염의 수 및 중증도를 감소시키는 것으로 입증되어 왔다.
폴리 (I:C)는 수용액에서 불안정한 분자이다. 현재, 유효한 치료적 또는 예방적 효과를 달성하기 위해, 폴리 (I:C)는 사용 직전에 재용해되고 매 2시간마다 투여될 필요가 있다. 환자 순응도를 개선하고 투약 빈도를 감소시키기 위하여, 안정적이고 향상된 효능을 나타내는 신규한 제형을 개발하였다.
폴리 (I:C)는, 코의 상피 상에서의 체류 시간을 연장시키고 선천 면역 시스템의 더 효과적이고 제어가능한 자극을 제공할 수 있는 몇몇 생체접착 중합체와 함께 제형화되었다.
본 발명은 실온에서 거의 무기한으로 저장될 수 있고 이의 선천 면역 시스템-자극 활성을 유지하는 특유의 제형의 확인을 제공한다.
게다가, 본 제형은 폴리 (I:C)의 효능을 향상시키고, 더욱 더 큰 TLR3 자극 활성을 갖고서 훨씬 더 적은 빈도의 투약을 허용한다.
따라서, 본 발명은 폴리이노신산-폴리사이티딜산(폴리 (I:C)) 및 전분, 알기네이트, 블라노스 또는 DPPC(디팔미토일포스파티딜콜린)로부터 선택된 담체 중합체의 마이크로입자들을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 마이크로입자들은 평균 입자 크기가 0.1㎛ 내지 100㎛인 입자들이다. 바람직하게는, 담체 중합체는 옥수수, 감자 또는 카사바로부터 수득된 전분이다.
본 조성물 내에 포함된 폴리 (I:C)-담체 중합체 미세구체(또는 이른바 마이크로입자들이라고도 함)는 분무-건조 공정과 같은 입자 형성 공정에 의해 제조된다.
본 발명에 따른 폴리 (I:C) / 전분 비는 1/200 (w/w) 내지 1 / 0.1 (w/w)의 범위이지만, 바람직하게는 1/100 (w/w) 내지 1/1 (w/w), 더욱 더 바람직하게는 1/100 (w/w) 내지 1/5 (w/w)의 범위이며, 1/12 내지 1/9 (w/w)의 폴리 (I:C) / 전분 비가 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 조성물 내의 마이크로입자의 Dv50(= 입자의 50% 누적 언더사이즈(cumulative undersize)에 기초한 부피)은 0.1마이크로미터 내지 200마이크로미터, 바람직하게는 1마이크로미터 내지 50마이크로미터, 더 바람직하게는 2마이크로미터 내지 40마이크로미터, 더욱 더 바람직하게는 2마이크로미터 내지 20마이크로미터, 가장 바람직하게는 10마이크로미터 내지 20마이크로미터의 범위이다.
또한, 본 발명의 조성물은 유기 용매를 포함하는 액체 조성물일 수 있으며, 여기서 유기 용매는 글리세롤 또는 에탄올 또는 이의 조합을 기재로 한다.
본 발명의 조성물은, 바람직하게는 "보통감기"로 지칭되는 것과 같은 상기도의 바이러스성 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약품에 사용될 수 있다.
본 조성물은 천식 및/또는 COPD(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 만성 폐색성 폐병)를 앓는 환자에게, 쉽게 나타날 보통감기 증상을 잠재적으로 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.
상기도 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 바람직한 방법이 비강 투여에 의해 수행된다.
폴리이노신산-폴리사이티딜산(폴리 (I:C)) 및 전분, 알기네이트, 블라노스 또는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 선택된 담체 중합체의 마이크로입자들을 포함하는 본 발명의 조성물은 (바이러스성) 감염 또는 보통감기의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있으며, 여기서 상기 조성물은 1일 내지 1개월 범위, 더 바람직하게는 매 수 일마다 또는 심지어는 주 1회의 시간 간격으로 비강 적용에 의해 투여된다.
폴리 (I:C) / 전분 비가 1/200 (w/w) 내지 1 / 0.1 (w/w)의 범위이지만, 바람직하게는 1/100 (w/w) 내지 1/1 (w/w), 더욱 더 바람직하게는 1/100 (w/w) 내지 1/5 (w/w)이며,　1/12 내지 1/9 (w/w)인 폴리 (I:C) / 전분 비가 가장 바람직한 상기 언급된 조성물이, 조성물 내의 마이크로입자 크기가 0.1마이크로미터 내지 200마이크로미터, 바람직하게는 1마이크로미터 내지 50마이크로미터, 더 바람직하게는 2마이크로미터 내지 40마이크로미터, 더욱 더 바람직하게는 2마이크로미터 내지 20마이크로미터, 가장 바람직하게는 10마이크로미터 내지 20마이크로미터 범위인 것과 조합하여, (바이러스성) 감염 또는 보통감기의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있으며, 여기서 상기 조성물은 1일 내지 1개월 범위, 더 바람직하게는 매 수 일마다 또는 심지어는 주 1회의 시간 간격으로 비강 적용에 의해 투여된다.
또한, 본 발명의 일부는 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 장치, 특히 비강 전달 시스템이다.
본 발명에 따르면, 폴리 (I:C)는 비강 투여용 건조 분말로서 제형화된다. 안정성을 개선하기 위하여, 폴리 (I:C)는 드럼 건조된 찰옥수수 전분 및 폴리 (I:C)를 함유하는 수성 혼합물로부터 분무 건조된다.
전분은 이중 기능을 갖는 것으로 여겨지는데, 이는 (1) 코 안에서 생체접착제로서 작용하고, (2) 찰옥수수 전분 내에 고농도로 존재하는 아밀로펙틴은 코 안에서 아밀라제에 의해 분해되어 폴리 (I:C)를 방출한다.
비강 투여는 바람직하게는 단일 용량 비강 분말 장치(독일 소재의 Aptar Pharma사로부터 공급되는 단위 용량 장치)를 사용하여 달성된다. 단위 용량 장치는 능동적 전달 시스템인데, 이는 환자가 흡입할 필요가 없고 수행이 환자 독립적으로 이루어짐을 의미한다. 투약은 액츄에이션에 의해 수행되는데, 이러한 액츄에이션은 과압(overpressure)에 의해 제어된다. 퍼프(puff)당 용량은 분무 건조된 분말 내의 폴리 (I:C)의 농도 및 분말의 방출 중량에 의해 결정된다. 분말은 각각의 퍼프에 대해 새로운 장치를 사용하여 매번 콧구멍 내로 투여될 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 폴리 (I:C)는 이노신산 및 사이티딜산 소듐 염의 역평행 폴리뉴클레오티드 가닥들로 이루어진 합성 이중-가닥 RNA이다. 이들 가닥은 이노신 염기와 사이토신 염기 사이에 형성된 수소 결합에 의해 비공유적으로 결합된다.
폴리 (I:C)에 대한 평균 쇄 길이는 300 내지 6,000개의 염기 쌍의 범위이며, 이는 대략 180,000 내지 3,600,000 달톤에 상응한다. 분자식은 (C10H10N4NaO7P)x·(C9H11NaN3O7P)x이다.
Figure 112014097198003-pct00001
상기 폴리 (I:C)는 구매가능하지만, 또한 선택적으로, 예를 들어 하기의 절차를 사용하여 내부적으로 제조될 수 있다.
이중(duplex) 생성물 폴리 (I:C)는 폴리 이노신(I)과 폴리 사이티딘(C)의 개별 동종중합체들로부터 제조된다. 폴리 I 및 폴리 C는 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제(PNPase)의 존재 하에서 뉴클레오시드 이인산염인 이노신과 사이티딘을 개별적으로 중합함으로써 합성된다. 각각의 뉴클레오시드 이인산염은, 생성된 리보핵산 중합체의 길이를 제어하기 위해 20 내지 24시간 동안 PNPase에 의해 개별적으로 중합한다. 이어서, 효소인 단백질 키나제를 첨가하여 중합 반응을 종결시킨다. 생성된 동종중합체(즉, 단일 가닥 RNA 분자)를 가수분해하여 각각의 중합체 생성물의 분자량 범위를 지정된 범위 내로 제어한다. 가수분해된 생성물을 에탄올로 처리하여 용액으로부터 단일 가닥 RNA 분자(ssRNA)를 침전시킨다. 침전물을 상층액으로부터 분리하고 물 중에 용해시킨다. 이어서, ssRNA의 용액을 여과하여 미립자를 제거하고, 한외여과하여 저분자량 오염물을 제거하고, 이어서 동결건조시킨다. 동결건조된 ssRNA 생성물을 개별적으로 순도, 분자량, 및 다른 품질 속성에 대해 시험하여 생성물이 규격 내에 있음을 보장한다.
개별 단일 가닥 동종중합체(폴리 I 및 폴리 C)를 0.015M 염화나트륨 중에 개별적으로 용해시키고, 이어서 조합하여 이들 가닥을 어닐링하여, 이중 가닥 이중 생성물(폴리 I : 폴리 C)을 형성한다. 혼합 후에, 생성된 용액을 여과한다. 여과액을 한외여과하여 저분자량 오염물을 제거한다. 이어서, 한외여과된 생성물을 동결건조시킨다. 생성된 이중 생성물을 -20℃에서 저장한다. 동결건조된 dsRNA 생성물을 순도, 분자량, 및 다른 품질 속성에 대해 시험하여 생성물이 규격 내에 있음을 보장한다.
재료 및 방법
폴리이노신산-폴리사이티딜산 소듐 염(폴리 (I:C)), Midland Certified Reagent Company Inc사(미국 텍사스주 소재), 로트 020905; 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분, Stada AG사(독일 바트 비벨 소재), 로트 93301-9628; 소듐 카르복시메틸셀룰로스(블라노스 7MF), Ashland Aqualon사(미국 델라웨어주 윌밍턴 소재), 로트 3-30172; 디팔미토일포스파티딜콜린(Lipoid PC 16:0/16:0), Lipoid GmbH사(독일 루드빅샤펜 소재), 로트 563098-01/049; 락토스 1수화물(#316 Fast Flo), Foremost사(미국 위스콘신주 바나부 소재), 로트 8509052261; 소듐 알기네이트(Protanal LF10/60LS), FMC Biopolymer사(노르웨이 드람멘 소재), 로트 S19616; 절대 에탄올 Chem-Lab(벨기에 지델젬 소재), 로트 17.2712904.400.
폴리 (I:C)의 시험관내 생물학적 활성
폴리 (I:C) 감수성 A549 세포(암종성 사람 폐포 상피 세포)를, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 레닐라 루시페라제 작제물(B1L-GAR5 작제물)에 결합된, 긴 IFN-β1 프로모터(위치 21069463로부터 21067869까지 염색체 9)를 함유하는 벡터로 감염시켰다. 폴리 (I:C)에 의한 자극시, IFN 경로가 활성화되어 그 결과 B1L-GAR5 리포터 작제물의 활성화 및 GFP 및 루시페라제 리포터 유전자의 발현을 가져온다. 고도로 반응성인 세포 클론을 수득하기 위해, 폴리 (I:C) 자극된 세포들을 FACS Aria 유세포 측정기(Becton Dickinson사)를 사용하여 높은 GFP 발현에 대해 분류하고, 200개 초과의 클론으로부터, 폴리 (I:C) 반응성 세포의 %에 기초하여 H10 클론을 선택하였다. 조직-배양액 플라스크가 세포들로 합류될 때까지 A549-B1L-GAR5-H10 세포들을 성장시켰으며, 이후에 배지를 새로 공급하고 세포들을 추가 4일 동안 배양하였다. 이어서, 표준 트립신 처리를 사용하여 세포들을 수거하고, 계수하고, 96웰 편평 바닥 플레이트 내에서 웰당 50.000 세포수로 평판배양하였으며, 100㎕에서 인터페론 β(75U/㎖)로 하룻밤 자극하였다. 다음날, 100㎕ 폴리 (I:C) - 담체 중합체 혼합물을 폴리 (I:C):중합체 = 1:5의 비로 세포들에 첨가하여 최종 부피가 200㎕가 되게 하였으며, 이들 세포들을 추가 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 세포들을 (트립신-매개 탈착에 의해) 수거하고, BD-Calibur 유세포 측정기에서 분석하였다.
담체 중합체와 함께 폴리 (I:C)의 분무 건조
알기네이트, CMC(블라노스) 및 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분 분무 건조 공정을 B90 나노 분무 건조기 및 Buchi B290 미니 분무 건조기(Buchi사, 스위스 플라윌 소재)에서 수행하였다. 일반적으로, B90 나노 분무 건조기에 의한 분무 건조 실험은 이들 용액의 고점도로 인해 불량한 수율을 가져왔다. 0.2마이크로미터 셀룰로스 아세테이트 필터(Whatman FP30/0.2 CA-S)를 사용하여 탈염수를 여과하고, 유리 비커에 첨가하였다. 자기 교반기를 사용하여 교반하면서 부형제를 첨가하였다. 완전히 용해되었을 때, 폴리 (I:C)를 용액에 첨가하였다. 0.5% (w/w)의 총 고형물 농도 및 1/9 (w/w)의 폴리 (I:C) / 부형제 비를 모든 콘셉트(concept)에 대해 적용하였다. 공급 용액의 조성이 표 1A에 열거되어 있다.
[표 1A] 알기네이트 , CMC 및 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분 콘셉트의 공급물 조성
Figure 112014097198003-pct00002

DPPC-폴리 (I:C) 콘셉트의 경우, 상이한 에탄올/물 혼합물 중 DPPC(디팔미토일포스파티딜콜린)의 용해도를 결정하였다. 순수한 DPPC를 분무 건조시켰을 때, 수득된 수율은 약 25%로 낮았다. 따라서, 담체 재료의 첨가를 고려하였다. 에탄올의 첨가시 Na-CMC, Na-알기네이트, 찰옥수수 전분 및 말토-덱스트린의 침전 때문에, DPPC와 함께 폴리 (I:C)를 분무 건조시키기 위한 담체로서 락토스를 선택하였다. 0.2마이크로미터 셀룰로스 아세테이트 필터(Whatman FP30/0.2 CA-S)를 사용하여 탈염수를 여과하고, 유리 비커에 첨가하였다. 자기 교반기를 사용하여 교반하면서 락토스를 첨가하였다. 일단 용해되었으면, 양쪽 용액을 혼합하고 60℃로 가열하였다. 완전히 용해되었을 때, 용액을 실온으로 냉각시키고, 폴리 I:C를 첨가하였다. 0.28 % (w/w)의 총 고형물 농도 및 1/2.25/6.75 (w/w/w)의 폴리 (I:C) / 락토스 / DPPC 비를 적용하였다. 공급 용액의 조성이 표 1B에 나타나 있다.
[표 1B] DPPC 콘셉트의 공급물 조성
Figure 112014097198003-pct00003

이들 용액의 분무 건조를 실험실 규모의 분무 건조기인 타입 B 290 불활성 루프(type B 290 inert loop)(Buchi사, 스위스 플라윌 소재) 내에서 수행하였다. 이들 용액을 연동 펌프인 타입 520U(Watson Marlow사, 영국 콘월 소재)에 의해 분무 건조기의 상부에서 2-유체 노즐(직경: 0.7 mm)에 공급하였다. 이 분무 건조기는 병류 질소 유동 모드에서 작동하였다. 분무 건조된 입자들을 사이클론에 부착된 저장소 내에 수집하였다. 입자들을 수집한 후에, 사이클론을 실온으로 냉각시켰다. 수집된 분말을 바이오해저드(biohazard) 캐비넷 내의 앰버 유리 바이알로 이송하였다. 이들 바이알을 질소로 플러싱하고, 폐쇄시키고, 5℃에서 저장하였다. 공정 파라미터가 표 2에 열거되어 있다.
[표 2] 공정 조건
Figure 112014097198003-pct00004

추가 폴리 (I:C) - 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분 콘셉트의 분무 건조
Buchi B290 미니 분무 건조기(Buchi사, 스위스 플라윌 소재)에서 분무 건조 공정을 수행하였다. 뉴클레아제 무함유 물을 유리 비커에 첨가하고, 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분을, 그 전분이 완전히 분산될 때까지, Ultra Turax T25(Janke & Kunkel사)를 사용하여 혼합하면서 첨가한다. 폴리 (I:C)를 뉴클레아제 무함유 물 중에 용해시키고, 폴리 (I:C)가 완전히 용해될 때까지 자기 교반기 상에서 교반하였다. 용해된 폴리 (I:C)를 분산된 전분에 첨가하고 실온에서 교반하며, 이 폴리 (I:C) 용액은 분무 건조 직전에 제조한다. 10% (w/w)　또는 0.45%의 총 고형물 농도 및 1/200 - 1/100 - 1/50 - 1/24 - 1/9 (w/w)의 폴리 (I:C) / 전분 비를 적용하였다. 이들 제형의 공급물 조성이 표 3A에 나타나 있다.
[표 3A] 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분 콘셉트의 공급물 조성
Figure 112014097198003-pct00005

이들 용액을 연동 펌프에 의해 분무 건조기의 상부에서 2-유체 노즐(직경: 0.7mm)에 공급하였다. 이 분무 건조기는 병류 질소 유동 모드에서 작동하였다. 분무 건조된 입자들을 사이클론에 부착된 저장소 내에 수집하였다. 입자들을 수집한 후에, 유리 실린더 및 사이클론을 실온으로 냉각시켰다. 수집된 분말을 앰버 유리병으로 이송하고, 이 병을 알루미늄 증기 락 백 내에 넣는다. 이들 바이알을 실온에서 저장하였다. 공정 파라미터가 표 3B에 열거되어 있다.
[표 3B] 공정 조건
Figure 112014097198003-pct00006

주사 전자 현미경법
샘플에 직경이 +/- 30 내지 50nm인 금 입자를 스퍼터링하였다. Everhart Thornley 검출기를 갖는 FEI 주사 전자 현미경- 타입 Quanta 200F를 사용하여 이미지를 생성하였다.
물 함량- 카를 피셔( Karl Fischer ) 적정
직접 정량 카를 피셔 적정에 의해 이들 콘셉트의 물 함량을 결정하였다. KF TITRATOR V30(Mettler Toledo사, 미국 소재)을 사용한다. 분말(50 내지 100mg)을 Hydranal® 건조 메탄올(Sigma Aldrich사)이 들어있는 적정 용기로 이송하고 300초 동안 교반하였다. 5㎖ 뷰렛을 사용하여 2mg/㎖ 농도의 Hydranal® 복합물 2(Sigma Aldrich사)에 의해 적정을 수행하였다. 종결을 위하여, 15㎍/min의 스톱 드리프트(stop drift)를 적용하였다. 샘플을 3회 반복하여 분석하였다.
입자 크기의 결정
단지 관심 대상 생성물의 부피 분포에 기초하여 입자 크기 분포 데이터를 평가하려는 경향이 존재한다. 그럼으로써, Dv10, Dv50 및 Dv90 누적 언더사이즈의 비교로 가치평가를 종종 제한한다.
그러나, dvx 누적 언더사이즈를 비교하는 것은, 상이한 기술 및 기구가 곧바로 상이한 결과로 이어진다는 사실로 인해 항상 직결될 수 있는 것은 아니다.
게다가, 데이터에 대해 상이한 관점에서 살펴봄으로써(즉, 다른 파라미터를 사용함으로써) 입자 크기(또는 형상) 분포 데이터로부터 더 많은 정보를 얻을 수 있다.
입자 크기 분포를 결정하기 위해, 레이저 회절 시험 방법을 사용하였다.
Hydro2000S 습식 분산 모듈(또는 등가의 시스템)을 구비한 Malvern Mastersizer 2000 레이저 회절계에서 분석을 수행하였다. 이 기구는 20nm 내지 2mm의 크기 범위에서 청색 광 ON 검출 모드에서 사용한다.
인플루엔자 마우스 모델에서의 제형의 생체내 시험
모든 동물 연구는 윤리위원회에 의해 승인되었으며, 국내외 지침에 따라 수행하였다. 8 내지 12주령 암컷 스위스 마우스(Janvier사)를 사용하였다. 이소플루란 마취 하에서 비강내 치료를 수행하였다. 소정량의 액체를 투여하기 위하여, 콧구멍의 상부 상에 소적(droplet)을 직접 적용하고, 입을 닫음으로써, 소적이 콧구멍을 통해 비강 내로 들어가도록 하였다. 분무 건조된 폴리 (I:C)-담체 분말을 각각의 실험 직전에 새로 제조하였으며, 15㎕ 액체 중 상태로 투여하였다. 비제형화된 폴리 (I:C)를 인산염 완충 식염수(PBS) 중 1mg/㎖의 농도로 투여하였다. 전형적으로, 시험 2일 또는 3일 전에 전처리를 수행하였다. 마우스는 일수 0에서 25㎕(고부피 시험) 중 10 x LD90 마우스 적합(mouse adapted) H1N1 PR(FLU PR 1600517)로 또는 15㎕(저부피 시험) 중 1x LD90으로 시험하였다. 시험 후, 마우스를 14일 동안 매일 체중 및 거동을 측정함으로써 모니터링하였으며, 체중 손실이 시험일에 비하여 20%초과했을 때, 또는 그들의 거동이 심각한 병의 징후를 보여주었을 때 마우스를 안락사시켰다.
결과
담체 중합체의 선택.
보통의 코감기를 예방하기 위한 성공적인 콘셉트의 요건은 폴리 (I:C)의 생물학적 활성이 최종 제형에서 보존되어야 한다는 것이다. 따라서, 분무-건조 공정을 위한 담체 중합체의 선택에서의 제1 단계는 폴리 (I:C)의 인터페론 자극 능력을 억제하지 않는 중합체를 확인하는 것이었다. 여기서는, 다수의 담체-중합체들을 5:1 (w:w) 비로 폴리 (I:C)와 혼합하고, 적정된 양(titrated amount)으로 폴리 (I:C)-반응성 인터페론-프로모터- GFP-리포터(A549-IFN-GAR5, 클론 H10) 세포주에 첨가하였다(상세한 내용에 대해서는 재료 및 방법을 참조한다). 세포들을 37℃ 및 5% CO2 에서 24시간 동안 인큐베이션하였으며, 이후에 GFP+ 세포들의 백분율을 유세포 측정기에서 측정하였다. 폴리 (I:C)의 농도 증가는 더 높은 백분율의 GFP+ 세포들을 생성하며, 이에 따라 이를 시험관내 모델에서 사용하여 폴리 (I:C)-담체 혼합물의 생물학적 활성을 평가할 수 있게 한다(도 1). 시험된 상이한 담체들 중, Na-알기네이트, 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분, DPPC 및 블라노스가 폴리 (I:C)의 인터페론 자극 능력을 억제하지 않았다. 대조적으로, 카르보폴, κ-카라기난, 키토산, 및 폴리에틸아민은 폴리 (I:C)의 인터페론 자극 능력을 억제하거나 완전히 차단하였다. 이들 결과에 기초하여, 폴리 (I:C)에 영향을 주지 않는 담체인, Na-알기네이트(Protanal LF10/60LS, FMC Biopolymer사), 드럼 건조된 찰옥수수 전분(Cargill, Stada사를 통함), DPPC(Lipoid PC 16:0/16:0, Lipoid사), 및 Na-CMC(블라노스 7MF)를 제형 개발의 다음 단계를 위해 선택하였다.
Na-알기네이트는 만누로닉(M) 블록 및 굴루론(G) 블록으로 구성된 겔-형성 다당류이다. 겔의 강도 및 유연성은 G/M 비에 의해 규정된다. Na-CMC는 카르복시메틸 기를 갖는 셀룰로스 유도체이다. 이는 비강 제형에서 자주 사용된다. 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분은 점막 조직에 비자극성인 아밀로펙틴계 전분이다. Na-알기네이트, Na-CMC 및 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분의 3개의 부형제는 우수한 생체접착 특성을 나타낸다. DPPC는 인지질이며, 폐 계면활성제의 주요 성분이다. 이는 비강 흡수를 향상시킬 수 있다.
도 1: 폴리 (I:C) 및 폴리 (I:C)- 담체 혼합물의 생물학적(인터페론) 자극 능력. 인터페론-β-프로모터 하에서 발현된 GFP-리포터 작제물을 갖는 폴리 (I:C) 반응성 세포들을 폴리 (I:C)-담체 혼합물과 함께 (1:5 비로) 24시간 동안 인큐베이션하였으며, 이어서 GFP-발현에 대해 분석하였다. Y축 상의 숫자는 샘플에서의 전체 살아 있는 세포들 중 GFP+ 세포들의 백분율을 나타낸다. x축 상의 숫자는 혼합물 중 폴리 (I:C)의 농도를 나타낸다. 2개의 실험의 대표적인 결과가 나타나 있다.
콘셉트들의 분무-건조 공정 및 생물학적 활성 및 안정성
분무 건조 공정을 B90 나노 분무 건조기 및 Buchi B290 미니 분무 건조기(Buchi사, 스위스 플라윌 소재)에서 수행하였다. 일반적으로, B90 나노 분무 건조기에 의한 분무 건조 실험은 이들 용액의 고점도로 인해 불량한 수율을 가져왔다.
각각의 공정 후에, 저장소 내에 수집된 분말의 양을, 공급물의 제조를 위해 칭량된 분말의 이론량으로 나눈 값으로서 수율을 계산하였다. 결과가 표 4에 열거되어 있다. 콘셉트 4에 대한 더 낮은 수율은 사이클론 내의 분말 축적의 관찰에 의해 설명할 수 있는데, 이러한 분말 축적은 분무 건조 동안 사이클론 내의 국소 온도에서의 DPPC의 점착성에 의해 잠재적으로 야기된 것이다.
[표 4] 수집된 분말의 중량 대 이론량인 수율
Figure 112014097198003-pct00007

주사 전자 현미경법
분무 건조된 분말의 SEM 이미지가 도 2에 도시되어 있다.
콘셉트 3(부분 사전젤라틴화 옥수수 전분)의 분말은 붕괴된 구체로 이루어졌다. 상응하는 플라세보 분말에 대한 레이저 회절 측정 결과, 입자 크기는 Dv50이 4.5마이크로미터였다.
도 2: 분무-건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분- 폴리 (I:C) 마이크로입자의 주사 전자 현미경 사진.
물 함량.
분무 건조된 분말의 물 함량을 결정하였다. 잔류 물은 환경으로부터 물 흡수 및 분무 건조 공정에 사용된 물로부터 기원된다.
[표 5] 분무 건조 후의 콘셉트들의 물 함량
Figure 112014097198003-pct00008

부분 사전젤라틴화 옥수수 전분, NaCMC 및 Na-알기네이트는, 겔 형성 및 팽윤을 통한 생체접착에 필요한 특성을 갖는 흡습성 부형제이다. 이는 표 5에 열거된 결과에 반영되어 있다. 콘셉트 4의 경우, 물 함량이 콘셉트 1 내지 콘셉트 3보다 더 낮은 것으로 입증되었는데, 이는 아마도 콘셉트 4로부터의 분말이 에탄올/물 혼합물로부터 분무 건조되었기 때문일 가능성이 가장 높다. 게다가, 락토스는 흡수성이 아니며, 이 콘셉트에서의 DPPC의 친유성 성질로 인해 물 흡수가 제한된다.
실온에서의 폴리 (I:C) 콘셉트들의 안정성
항-보통감기 제형에 대한 한 가지 중요한 특성은 저장을 용이하게 하고 제품의 활성 성분의 활성을 보장하기 위하여 콘셉트가 실온(RT)에서 안정적이어야 한다는 것이다. 그러나, 폴리 (I:C)는 가수분해에 의해 또는 RNase 효소에 의해 분해되기 때문에 용매를 함유하는 물 중에 용해될 때 매우 불안정하다. 특히, RNase 효소는 도처에 존재하는 것으로 알려져 있으며, RNase 오염은 폴리 (I:C) RNA 분자의 급속한 분해를 가져올 것이다.
안정성을 시험하기 위하여, 4개의 콘셉트를 실온에서 저장하였다. RT 또는 -20℃에서 저장된 PBS 중 폴리 (I:C)를 대조군으로서 사용하였다. 1개월 저장 후에, 폴리 (I:C) 반응성 세포주에 대한 콘셉트들의 인터페론-리포터 반응을 측정함으로써 콘셉트들 및 대조군들의 생물학적 활성을 평가하였다. 모든 분무-건조된 폴리 (I:C) 콘셉트들은 -20℃에서 저장된 폴리 (I:C)에 대비하여, 폴리 (I:C) 감수성 세포주에 대해 변경되지 않은 활성을 나타내었다(도 3). 대조적으로, RT에서 저장된 PBS 중 폴리 (I:C)는 그의 인터페론-자극 활성을 완전히 상실하였다. 이들 결과는 분무 건조된 제형이 실온에서 저장될 때 매우 안정적임을 나타내는데, 이는 액체를 함유하는 물 중 폴리 (I:C)와는 대조적이다.
도 3: 실온에서 1개월 저장 후의 폴리 (I:C) 콘셉트들의 안정성. GFP-리포터 작제물을 갖는 폴리 (I:C) 반응성 세포들을 폴리 (I:C)-담체 혼합물과 함께 24시간 동안 인큐베이션하였으며, 이어서 GFP-발현에 대해 분석하였다. Y축 상의 숫자는 샘플에서의 전체 살아 있는 세포들 중 GFP+ 세포들의 백분율을 나타낸다. x축 상의 숫자는 혼합물 중 폴리 (I:C)의 농도를 나타낸다. 2개의 실험의 대표적인 결과가 나타나 있다.
마우스 인플루엔자 시험투여 모델을 사용한 생체내 예방
폴리 (I:C)는 그의 항바이러스 효과에 대해 문헌에 알려져 있다. 그러나, 마우스 인플루엔자 모델에서의 생체내 효능을 보여주기 위하여, 이는 연속된 일수로 제공되거나 물/리포좀 제형으로 제공되어야만 했다. 1972년 경에, 폴리 (I:C)는 지원자들에게 사람 리노 바이러스(HRV) 또는 인플루엔자 바이러스를 시험한 인체 시험에서 항바이러스 예방 치료제로서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러나 이 연구에서, 폴리 (I:C)는 매 2시간마다 제공되어야만 했다. 본 발명자들의 분무 건조된 콘셉트들은 PBS 중 폴리 (I:C)에 비하여 증가된 RT 안정성 및 시험관내 생물학적 활성에서의 유사성을 나타내었기 때문에, 본 발명자들은 상이한 콘셉트들의 항바이러스 활성을 시험하기 위하여 생체내 시험에 착수하였다. 이 목적을 위해, 일수 0에서 고부피(25㎕) 인플루엔자를 시험하기 수 일 전에, (분무-건조된) 폴리 (I:C) 제형의 단일 비강내 용량으로 마우스를 처리하였다. 입자들의 해리를 예방하기 위하여, 작은 부피(15㎕)의 유기 담체 용매(에탄올 또는 에탄올/글리세롤 1/1 w/w)를 사용하여 분무-건조된 콘셉트들을 적용하였다. (일수 0에 대한) 체중 손실, 일반적 거동 및 생존율을 14일 동안 모니터링하였다(더 상세한 내용에 대해서는 재료 및 방법을 참조한다). 흥미롭게도, 본 발명자들은 PBS 중 폴리 (I:C)뿐만 아니라 PBS 중 분무-건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C)에 의한 단일 처리가, 체중 손실 및 생존율의 관점에서 마우스의 유의하지 않은 보호에 의해 나타난 바와 같이, 인플루엔자 시험에서 단지 매우 미소한 예방 효과를 가졌음을 관찰하였다(표 6). 이에 대한 한 가지 설명은 분무-건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분 (I:C)이 PBS 중에 용해되어서 폴리 (I:C)와 유사한 반응을 제공하였다는 것이다. PBS 중 폴리 (I:C)는 연속 2일로 제공했을 때 약간 더 효과적이었지만, 플라세보 대조군 마우스와의 차이는 크지 않았다. 놀랍게도, 에탄올 중 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C) 콘셉트는 인플루엔자 시험에 대한 상당한 보호를 제공하기 위하여 단지 단일 치료를 필요로 하였으며, 그 결과 월등한 생존율로 이어졌다. 명백하게, 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C)의 미세구체 입자 형태는 인플루엔자에 대한 월등한 보호를 가져오는 작용의 메커니즘의 결정적인 부분이다.
[표 6] ( 제형화된 ) 폴리 (I:C)에 의해 처리된 인플루엔자 시험투여된 마우스의 생존율
Figure 112014097198003-pct00009
*= 집단당 5마리의 마우스, 2개의 실험의 대표적인 결과가 나타나 있음, P 값은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 로그 순위 통계학을 사용하여 계산됨. N.S. = 유의하지 않음.
다음 실험에서, 본 발명자들은 담체 용매로서의 에탄올이 인플루엔자 시험투여의 중증도에 대해 어떠한 효과를 가졌는지를 비교하였다. 표 7에는, 에탄올 대 PBS 플라세보 처리된 마우스의 결과가 나타나 있다. 이 실험에서, 인플루엔자 시험투여는 표 6의 실험에서 사용된 시험투여와 비교하여 약간 덜 공격적이었는데, 이는 본 발명자들이 인플루엔자 시험투여 후의 생존율에 대한 에탄올 전처리의 긍정적 또는 부정적 효과를 관찰할 수 있게 하였다. 본 발명자들은 에탄올 처리된 마우스가 PBS 전처리 마우스와 비교하여 인플루엔자 시험투여에 대해 매우 유사한 감수성을 경험하였음을 관찰하였다. 따라서, 본 발명자들은 에탄올이 항바이러스 효과에 능동적으로 기여하지 않으며, 이에 따라 이들 콘셉트의 미세구체 입자 형태를 보존하는 비강내 투여 담체 용매로서 사용될 수 있는 것으로 결론지었다. 주목할 것은, 비제형화된 폴리 (I:C)는 에탄올 중에 적용될 수 없었다는 것인데, 이는 폴리 (I:C)가 에탄올 중에서 침전되었으며, 이에 따라 폴리 (I:C)의 제어된 적용을 방해했기 때문이다.
[표 7] 인플루엔자 시험투여 후의 에탄올- 및 PBS- 플라세보 처리된 마우스의 생존율
Figure 112014097198003-pct00010
*= 집단당 6마리의 마우스, P 값은 카플란-마이어 로그 순위 통계학을 사용하여 계산됨. N.S. = 유의하지 않음.
다음 단계에서, 본 발명자들은 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C)의 입자들을 생성하기 위해 콘셉트를 분무-건조시키는 것 또는 성분들을 단지 혼합하는 것이 항바이러스 효과를 관찰하는 데 필요/충분한지에 대한 질문을 다루었다. 여기서, 본 발명자들은 건조 분말 폴리 (I:C)를 건조 분말 전분과 혼합하고(혼합된 폴리 (I:C)-전분), 이를 분무-건조된 전분-폴리 (I:C) 및 플라세보와 비교하였다. 본 발명자들은 혼합된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C)는 인플루엔자 시험투여에 대한 상당한 보호 효과를 갖지 않았으며, 이와 대조적으로 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C)의 분무-건조된 제형은 역시 인플루엔자 시험투여에 대한 월등하고 상당한 보호를 가져왔음을 관찰하였다(표 8).
[표 8] 인플루엔자 시험투여 후의 혼합된- 대 분무 건조된-부분 사전젤라틴화 옥수수 전분- 폴리 (I:C) 처리된 마우스의 생존율
Figure 112014097198003-pct00011
*= 집단당 6마리의 마우스, **= 4마리의 마우스, P 값은 카플란-마이어 로그 순위 통계학을 사용하여 계산됨. N.S. = 유의하지 않음.
분무-건조된 마이크로입자들이 또한 다른 유기 용매 중의 상태로 투여될 수 있는지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 폴리 (I:C) 마이크로입자들에 대한 담체 용매로서 글리세롤의 사용을 시험하였다. 이 담체의 사용 또한 가능하였으며 상당한 보호를 가져왔지만, 글리세롤의 고점도는 비강내 점비제의 적용을 오히려 어렵게 하는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명자들은 마이크로입자들을 적용하기 위해 에탄올/글리세롤의 1/1 혼합물을 시험하였다. 표 9에, 이 실험의 결과가 나타나 있으며, 이는 에탄올/글리세롤 중 마이크로입자들의 단일 투여가 플라세보(에탄올/글리세롤 단독)와 비교하여 인플루엔자 시험투여로부터 상당히 개선된 생존율을 가져온다는 것을 명백히 나타낸다.
[표 9] 담체 용매로서 에탄올/글리세롤을 사용한 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분- 폴리 (I:C) 처리된 마우스의 생존율
Figure 112014097198003-pct00012
*= 집단당 9마리의 마우스, P 값은 카플란-마이어 로그 순위 통계학을 사용하여 계산됨.
다음 단계에서, 본 발명자들은 폴리 (I:C)의 분무-건조된 제형에서의 상이한 담체 중합체의 사용을 시험하였다. 여기서, 본 발명자들은 플라세보 처리된 마우스를, 폴리 (I:C) 처리된 마우스와, 그리고 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C) 또는 분무 건조된 Na-알기네이트-폴리 (I:C) 중 어느 하나와 비교하였다. 본 발명자들은 단지 폴리 (I:C)의 분무-건조된 마이크로입자들만이 이후의 인플루엔자 시험투여에 의해 야기된 심각한 체중 손실로부터 마우스를 보호하였음을 관찰하였다(표 10 참조). 폴리 (I:C) 단독은 체중 손실에 대해 보호하지 않았다. 이들 결과는 분무-건조된 마이크로입자에서의 폴리 (I:C)와 담체 중합체의 조합이 바이러스성 병원체에 대한 충분한 보호를 제공하는 데 필요함을 나타낸다. 담체 중합체의 성질은 마이크로입자 구조가 보존되는 한 덜 중요하다(표 6 참조, 분무-건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C)가 PBS 중에 용해될 때에는 효과적이지 않음).
[표 10] 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분- 폴리 (I:C) 및 Na - 알기네이트 -폴리 (I:C) 처리된 마우스의 체중 손실
Figure 112014097198003-pct00013
*= 집단당 12마리의 마우스, P 값은 비대응 양측 T-검정 통계학을 사용하여 계산됨. N.S. = 유의하지 않음.
마지막으로, 본 발명자들은 제형에 필요한 폴리 (I:C)의 농도뿐만 아니라, 제형에 필요한 마이크로입자 크기를 확인하기 위하여, 상이한 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C) 제형들을 서로, 그리고 PBS 중 비제형화된 폴리 (I:C)와 비교하였다. 여기서, 본 발명자들은 50/1 및 100/1 및 200/1의 비의 추가의 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분/폴리 (I:C)뿐만 아니라, 입자 크기가 각각 (Dv50) 9㎛ (1/9, 0.45%) 및 (Dv50) 17㎛ (1/9, 10%)인 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분/폴리 (I:C)를 제조하였다. 이들 제형과 비제형화된 폴리 (I:C)의 비교 결과가 표 11에 나타나 있다. 본 발명자들은 1/100 내지 1/9의 폴리 (I:C)의 농도가 인플루엔자에 대한 우수한 보호를 가져옴을 관찰하였다. 전분 중 폴리 (I:C)의 더 많은 희석은 덜 효율적이고 유의하지 않은 보호로 이어졌다. 게다가, 본 발명자들은 상이한 입자 크기를 갖는 2개의 배치(batch)에서 주요한 차이를 관찰하지 못했는데, 이는 9㎛ 내지 18㎛의 입자 크기(Dv50)가 폴리 (I:C) 마이크로입자들에 의해 효과적인 보호를 제공하는 데 충분함을 나타낸다.
[표 11] 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분- 폴리 (I:C)의 추가 콘셉트들로 처리된 인플루엔자 시험투여된 마우스의 체중 손실
Figure 112014097198003-pct00014
*= 집단당 8마리의 마우스, P 값은 비대응 양측 T-검정 통계학을 사용하여 계산됨. N.S. = 유의하지 않음.
결론
폴리 (I:C)의 비강 전달을 위해 분무 건조함으로써 4개의 분말 콘셉트를 제조하였다. Na-알기네이트(콘셉트 1), Na-CMC(콘셉트 2), 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분(콘셉트 3) 및 DPPC(콘셉트 4)를 갖는 콘셉트들을 생체활성 스크린 및 가공성에 기초하여 선택하였다. 4개의 모든 콘셉트를 시험관내에서 시험하여 제형으로의 폴리 (I:C)의 생물학적 활성 및 안정성을 결정하였다. 본 발명자들의 결과는 분무 건조 공정이 폴리 (I:C)의 생체활성에 대해 부정적 효과를 갖지 않음을 나타낸다. 게다가, 이 제형은 PBS 중에 용해된 폴리 (I:C)와 대조적으로 실온에서 안정적이다.
다음 단계에서, 본 발명자들은 뮤린 인플루엔자 시험투여 모델을 사용하여 인플루엔자의 예방에 대해 콘셉트 1 및 콘셉트 3을 시험하였다. 문헌에 기초하여, 콘셉트 1 및 콘셉트 3이 (PBS 중) 비제형화된 폴리 (I:C)와 유사한 보호 효과를 가져야 한다는 의도 하에 실험을 시작하였다. 놀랍게도, 콘셉트 1 및 콘셉트 3은 이후의 인플루엔자 시험투여에 대해 마우스를 보호하는 데 있어서 폴리 (I:C)보다 월등하다는 것을 확인하였다. 단일 용량의 비제형화된 폴리 (I:C)는 마우스를 보호하는 데 그다지 효율적이지 않고, 폴리 (I:C)가 더 효과적이기 위하여 수 회 투여될 필요가 있는 것으로 보였다. 그러나, 제형화된 폴리 (I:C)(콘셉트 1 및 콘셉트 3)의 단일 투여는 마우스를 상당히 보호하였다. 더욱이, (PBS 용해 마이크로입자들은 생체내에서 활성을 상실하였지만(표 6) 시험관 내에서는 그렇지 않았기(도 1 및 도 2) 때문에) 마이크로입자 구조가 결정적임을 보여주었다. 입자 크기를 보존하기 위하여, 본 발명자들은 마이크로입자들을 에탄올 또는 에탄올/글리세롤 담체 용매 중의 상태로 투여하였다. 9마이크로미터 내지 17마이크로미터의 입자 크기(DV50)가 효과적이었다. 폴리 (I:C)는 100/1 내지 9/1(전분/폴리 (I:C))의 희석에서 효과적이었다.
결론적으로, 본 발명자들은 이후의 인플루엔자의 치사량 시험에 대한 예방적 보호를 제공하기 위하여 단일 용량의 비강내 폴리 (I:C) 투여의 생체내 효능을 개선하는 새로운 콘셉트를 확인하였다.
분무-건조된 마이크로입자들이 또한 다른 유기 용매 중의 상태로 투여될 수 있는지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 폴리 (I:C) 마이크로입자들에 대한 담체 용매로서 글리세롤의 사용을 시험하였다. 이 담체의 사용 또한 가능하였으며 상당한 보호를 가져왔지만, 글리세롤의 고점도는 비강내 점비제의 적용을 오히려 어렵게 하는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명자들은 마이크로입자들을 적용하기 위해 에탄올/글리세롤의 1/1 혼합물을 시험하였다. 표 9에, 이 실험의 결과가 나타나 있으며, 이는 에탄올/글리세롤 중 마이크로입자들의 단일 투여가 플라세보(에탄올/글리세롤 단독)와 비교하여 인플루엔자 시험투여로부터 상당히 개선된 생존율을 가져온다는 것을 명백히 나타낸다.
[표 9] 담체 용매로서 에탄올/글리세롤을 사용한 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C) 처리된 마우스의 생존율
Figure 112014097198003-pct00015
*= 집단당 9마리의 마우스, P 값은 카플란-마이어 로그 순위 통계학을 사용하여 계산됨.
다음 단계에서, 본 발명자들은 폴리 (I:C)의 분무-건조된 제형에서의 상이한 담체 중합체의 사용을 시험하였다. 여기서, 본 발명자들은 플라세보 처리된 마우스를, 폴리 (I:C) 처리된 마우스와, 그리고 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C) 또는 분무 건조된 Na-알기네이트-폴리 (I:C) 중 어느 하나와 비교하였다. 본 발명자들은 단지 폴리 (I:C)의 분무-건조된 마이크로입자들만이 이후의 인플루엔자 시험투여에 의해 야기된 심각한 체중 손실로부터 마우스를 보호하였음을 관찰하였다(표 10 참조). 폴리 (I:C) 단독은 체중 손실에 대해 보호하지 않았다. 이들 결과는 분무-건조된 마이크로입자에서의 폴리 (I:C)와 담체 중합체의 조합이 바이러스성 병원체에 대한 충분한 보호를 제공하는 데 필요함을 나타낸다. 담체 중합체의 성질은 마이크로입자 구조가 보존되는 한 덜 중요하다(표 6 참조, 분무-건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C)가 PBS 중에 용해될 때에는 효과적이지 않음).
[표 10] 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C) 및 Na-알기네이트-폴리 (I:C) 처리된 마우스의 체중 손실
Figure 112014097198003-pct00016
*= 집단당 12마리의 마우스, P 값은 비대응 양측 T-검정 통계학을 사용하여 계산됨. N.S. = 유의하지 않음.
마지막으로, 본 발명자들은 제형에 필요한 폴리 (I:C)의 농도뿐만 아니라, 제형에 필요한 마이크로입자 크기를 확인하기 위하여, 상이한 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분-폴리 (I:C) 제형들을 서로, 그리고 PBS 중 비제형화된 폴리 (I:C)와 비교하였다. 여기서, 본 발명자들은 50/1 및 100/1 및 200/1의 비의 추가의 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분/폴리 (I:C)뿐만 아니라, 입자 크기가 각각 (Dv50) 9㎛ (1/9, 0.45%) 및 (Dv50) 17㎛ (1/9, 10%)인 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분/폴리 (I:C)를 제조하였다. 이들 제형과 비제형화된 폴리 (I:C)의 비교 결과가 표 11에 나타나 있다. 본 발명자들은 1/100 내지 1/9의 폴리 (I:C)의 농도가 인플루엔자에 대한 우수한 보호를 가져옴을 관찰하였다. 전분 중 폴리 (I:C)의 더 많은 희석은 덜 효율적이고 유의하지 않은 보호로 이어졌다. 게다가, 본 발명자들은 상이한 입자 크기를 갖는 2개의 배치(batch)에서 주요한 차이를 관찰하지 못했는데, 이는 9㎛ 내지 18㎛의 입자 크기(Dv50)가 폴리 (I:C) 마이크로입자들에 의해 효과적인 보호를 제공하는 데 충분함을 나타낸다.
[표 11] 분무 건조된 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분- 폴리 (I:C)의 추가 콘셉트들로 처리된 인플루엔자 시험투여된 마우스의 체중 손실
Figure 112014097198003-pct00017
*= 집단당 8마리의 마우스, P 값은 비대응 양측 T-검정 통계학을 사용하여 계산됨. N.S. = 유의하지 않음.
결론
폴리 (I:C)의 비강 전달을 위해 분무 건조함으로써 4개의 분말 콘셉트를 제조하였다. Na-알기네이트(콘셉트 1), Na-CMC(콘셉트 2), 부분 사전젤라틴화 옥수수 전분(콘셉트 3) 및 DPPC(콘셉트 4)를 갖는 콘셉트들을 생체활성 스크린 및 가공성에 기초하여 선택하였다. 4개의 모든 콘셉트를 시험관내에서 시험하여 제형으로의 폴리 (I:C)의 생물학적 활성 및 안정성을 결정하였다. 본 발명자들의 결과는 분무 건조 공정이 폴리 (I:C)의 생체활성에 대해 부정적 효과를 갖지 않음을 나타낸다. 게다가, 이 제형은 PBS 중에 용해된 폴리 (I:C)와 대조적으로 실온에서 안정적이다.
다음 단계에서, 본 발명자들은 뮤린 인플루엔자 시험투여 모델을 사용하여 인플루엔자의 예방에 대해 콘셉트 1 및 콘셉트 3을 시험하였다. 문헌에 기초하여, 콘셉트 1 및 콘셉트 3이 (PBS 중) 비제형화된 폴리 (I:C)와 유사한 보호 효과를 가져야 한다는 의도 하에 실험을 시작하였다. 놀랍게도, 콘셉트 1 및 콘셉트 3은 이후의 인플루엔자 시험투여에 대해 마우스를 보호하는 데 있어서 폴리 (I:C)보다 월등하다는 것을 확인하였다. 단일 용량의 비제형화된 폴리 (I:C)는 마우스를 보호하는 데 그다지 효율적이지 않고, 폴리 (I:C)가 더 효과적이기 위하여 수 회 투여될 필요가 있는 것으로 보였다. 그러나, 제형화된 폴리 (I:C)(콘셉트 1 및 콘셉트 3)의 단일 투여는 마우스를 상당히 보호하였다. 더욱이, (PBS 용해 마이크로입자들은 생체내에서 활성을 상실하였지만(표 6) 시험관 내에서는 그렇지 않았기(도 1 및 도 2) 때문에) 마이크로입자 구조가 결정적임을 보여주었다. 입자 크기를 보존하기 위하여, 본 발명자들은 마이크로입자들을 에탄올 또는 에탄올/글리세롤 담체 용매 중의 상태로 투여하였다. 9마이크로미터 내지 17마이크로미터의 입자 크기(DV50)가 효과적이었다. 폴리 (I:C)는 100/1 내지 9/1(전분/폴리 (I:C))의 희석에서 효과적이었다.
결론적으로, 본 발명자들은 이후의 인플루엔자의 치사량 시험에 대한 예방적 보호를 제공하기 위하여 단일 용량의 비강내 폴리 (I:C) 투여의 생체내 효능을 개선하는 새로운 콘셉트를 확인하였다.

Claims (34)

  1. 폴리이노신산, 폴리사이티딜산, 하나 이상의 담체 중합체 및 물로 구성된 마이크로입자로서, 상기 각각의 담체 중합체가 전분, 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 및 디팔미토일포스파티딜콜린으로부터 선택되는 것인, 마이크로입자.
  2. 제1항에 있어서, 분무-건조 입자 형성 방법에 의해 제조된 마이크로입자.
  3. 제1항에 있어서, 폴리이노신산 및 폴리사이티딜산 각각의 평균 사슬 길이가 300 내지 6,000 염기인 마이크로입자.
  4. 제1항에 있어서, 폴리이노신산 및 폴리사이티딜산이 각각 소듐 염으로서 존재하는 마이크로입자.
  5. 제1항에 있어서, 하나의 담체 중합체, 물, 폴리이노신산 및 폴리사이티딜산으로 구성된 마이크로입자.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 담체 중합체는 전분인 마이크로입자.
  7. 제6항에 있어서, 전분 담체 중합체가 부분적으로 사전 젤라틴화된 전분인 마이크로입자.
  8. 제6항에 있어서, 전분 담체 중합체는 옥수수 전분, 감자 전분 또는 카사바 전분인 마이크로입자.
  9. 제7항에 있어서, 전분은 부분적으로 사전 젤라틴화된 옥수수 전분인 마이크로입자.
  10. 제6항에 있어서, 폴리이노신산 및 폴리사이티딜산의 배합물 대 전분의 비가 1/200 (w/w) 내지 1/0.1 (w/w)의 범위인 마이크로입자.
  11. 제10항에 있어서, 폴리이노신산 및 폴리사이티딜산의 배합물 대 전분의 비가 1/12 (w/w) 내지 1/9 (w/w)인 마이크로입자.
  12. 제1항에 있어서, 하나 이상의 담체 중합체가 알기네이트이고, 알기네이트는 알긴산소듐인 마이크로입자.
  13. 제1항에 있어서, 하나 이상의 담체 중합체가 디팔미토일포스파티딜콜린인 마이크로입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 복수의 마이크로입자를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, Dv50이 0.1 ㎛ 내지 200 ㎛인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, Dv50이 0.1 ㎛ 내지 100 ㎛인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, Dv50이 1 ㎛ 내지 50 ㎛인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, Dv50이 2 ㎛ 내지 40 ㎛인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, Dv50이 2 ㎛ 내지 20 ㎛인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, Dv50이 10 ㎛ 내지 20 ㎛인 조성물.
  21. 제14항에 있어서, 액체인 조성물.
  22. 제14항에 있어서, 유기 용매를 포함하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 유기 용매가 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 조합인 조성물.
  24. 제14항에 있어서, 건조 분말인 조성물.
  25. 제14항에 있어서, 비강 투여에 적합한 조성물.
  26. 제14항에 있어서, 선천 면역 반응의 활성화 방법에 사용하기 위한 조성물.
  27. 제14항에 있어서, 의약품에 사용하기 위한 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 조성물의 비강 투여에 의해 상기도 감염을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 호흡기의 바이러스 감염을 치료 또는 억제하거나, 호흡기 바이러스를 예방하는데 사용하기 위한 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 바이러스 감염이 인간 리노바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 감염인 조성물.
  31. 복수의 마이크로입자를 포함하는, 비강 투여에 의해 상기도 감염을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물로서,
    상기 마이크로입자는 폴리이노신산, 폴리사이티딜산, 하나 이상의 담체 중합체 및 물을 포함하고, 상기 각각의 담체 중합체는 전분, 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 및 디팔미토일포스파티딜콜린으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 복수의 마이크로입자로 구성된 조성물.
  33. 제14항의 조성물을 포함하는 비강 전달 장치.
  34. 복수의 마이크로입자를 포함하는 조성물을 포함하는 비강 전달 장치로서,
    상기 마이크로입자는 폴리이노신산, 폴리사이티딜산, 하나 이상의 담체 중합체 및 물을 포함하고, 상기 각각의 담체 중합체는 전분, 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 및 디팔미토일포스파티딜콜린으로부터 선택되는 것인, 비강 전달 장치.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2866230C (en) 2012-05-03 2020-08-18 Janssen R&D Ireland Polyinosinic-polycytidylic acid (poly (i:c)) formulations for the treatment of upper respiratory tract infections
JP6629216B2 (ja) * 2013-11-06 2020-01-15 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー 上気道感染症の治療のためのポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリ（ｉ：ｃ））製剤
GB201415381D0 (en) * 2014-08-29 2014-10-15 Algipharma As Inhalable powder formulations of alginate oligomers
WO2016181226A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Janssen Sciences Ireland Uc Polyinosinic-polycytidylic acid (poly(i:c)) pea starch formulation for the prevention and/or treatment of upper respiratory tract infections
DE112016003047B4 (de) 2015-11-17 2022-10-27 Highlight Therapeutics, S.L. Neue pharmazeutische zusammensetzung umfassend partikel umfassend einen komplex eines doppelsträngigen polyribonukleotids und eines polyalkylenimins
WO2017095905A1 (en) * 2015-11-30 2017-06-08 Flesher Gregory J Compositions and methods for otologic prophylaxis and treatment
WO2018091965A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Janssen Sciences Ireland Uc Formulation of polyinosinic acid and polycytidylic acid for the prevention of upper respiratory tract infections
EP3448363B1 (en) 2017-05-17 2022-05-11 Highlight Therapeutics, S.L. Novel pharmaceutical composition comprising particles comprising a complex of a double-stranded polyribonucleotide and a polyalkyleneimine

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8723846D0 (en) 1987-10-10 1987-11-11 Danbiosyst Ltd Bioadhesive microsphere drug delivery system
US5707644A (en) * 1989-11-04 1998-01-13 Danbiosyst Uk Limited Small particle compositions for intranasal drug delivery
DE69220317T2 (de) 1991-10-01 1997-10-16 Takeda Chemical Industries Ltd Mikropartikeln-Zusammenfassung zur verlängerten Freigabe und Herstellung derselbe
GB9606188D0 (en) * 1996-03-23 1996-05-29 Danbiosyst Uk Pollysaccharide microspheres for the pulmonary delivery of drugs
MY118835A (en) 1997-04-18 2005-01-31 Ipsen Pharma Biotech Sustained release compositions and the process for their preparation
CA2203843C (en) 1997-04-28 2013-07-23 Her Majesty The Queen, In Right Of Canada, As Represented By The Ministe R Of National Defence Liposome-encapsulated poly iclc
MA25590A1 (fr) * 1998-09-14 2002-12-31 Inhale Therapeutic Syst Agent actif de delivraison de poudre seche
WO2002028370A1 (en) * 2000-10-06 2002-04-11 Jagotec Ag Biodegradable microparticles for controlled release administration, with purified amylopectin-based starch of reduced molecular weight
AU2003287332A1 (en) * 2002-11-01 2004-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of treating pulmonary fibrotic disorders
WO2004073729A1 (ja) 2003-02-21 2004-09-02 Translational Research Ltd. 薬物の経鼻投与用組成物
WO2005014038A1 (ja) 2003-08-11 2005-02-17 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University 粘膜免疫誘導アジュバントを含む新規ワクチン
US20050244505A1 (en) * 2003-12-11 2005-11-03 Higbee Russell G Immunotherapy compositions, method of making and method of use thereof
CN101229378A (zh) 2005-05-05 2008-07-30 国家淀粉及化学投资控股公司 用于送递活性剂的组合物
PL1898948T3 (pl) 2005-06-08 2012-06-29 Yisheng Biopharma Singapore Pte Ltd Adiuwant na bazie kwasu poliinozynowego i policytydylowego
US20070166239A1 (en) * 2006-01-13 2007-07-19 Haixiang Lin Mucosal immunogenic substances comprising a polyinosinic acid - polycytidilic acid based adjuvant
GB0607534D0 (en) 2006-04-13 2006-05-24 Univ London Pharmacy Colonic drug delivery formulation
DK2046740T3 (da) 2006-07-22 2012-08-20 Oxagen Ltd Forbindelser med CRTH2-antagonistisk virkning
CL2007002218A1 (es) 2006-08-03 2008-03-14 Celgene Corp Soc Organizada Ba Uso de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina 2,6-diona para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de linfoma de celula de capa.
AR067997A1 (es) * 2007-08-24 2009-10-28 Novartis Ag Compuestos organicos
JP2009209086A (ja) 2008-03-04 2009-09-17 Masami Moriyama 粘膜投与型ワクチン
UA90013C2 (ru) * 2008-03-19 2010-03-25 Давид Анатолійович Нога Фармацевтическая композиция, содержащая инсулин, и способ его получения
EP2116602A1 (en) 2008-05-07 2009-11-11 Institut Gustave Roussy Combination products for treating cancer
WO2010066203A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-17 Anhui Zhongren Technology Co., Ltd. Controlled releasing composition
CN101491503A (zh) 2008-12-17 2009-07-29 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种用于宠物的聚肌胞滴丸及其制备方法
CA2748125A1 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Alexander Levitzki Egfr-homing double-stranded rna vector for systemic cancer treatment
CN101757018A (zh) * 2008-12-24 2010-06-30 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种用于畜禽的聚肌胞干粉及其制备方法
WO2010114169A1 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Japan As Represented By The Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases Method for prophylaxis of influenza using vaccine for intranasal administration
EP2598145A1 (en) 2010-07-28 2013-06-05 Boehringer Ingelheim International GmbH Pharmaceutical composition for treatment of respiratory and inflammatory diseases
US8431155B1 (en) 2012-04-30 2013-04-30 Veroscience Llc Bromocriptine formulations
CA2866230C (en) 2012-05-03 2020-08-18 Janssen R&D Ireland Polyinosinic-polycytidylic acid (poly (i:c)) formulations for the treatment of upper respiratory tract infections
JP6629216B2 (ja) 2013-11-06 2020-01-15 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー 上気道感染症の治療のためのポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリ（ｉ：ｃ））製剤

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Publication number Publication date
WO2013164380A1 (en) 2013-11-07
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