KR102239867B1

KR102239867B1 - 확장 가능한 3-차원 탄성 구조물 제조

Info

Publication number: KR102239867B1
Application number: KR1020157018246A
Authority: KR
Inventors: 안소니 스티븐 바이스; 수잔느 마리에 미티에
Original assignee: 앨러간 파마슈티컬스 인터내셔널 리미티드
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2021-04-13
Also published as: JP6401178B2; ES2860023T3; US20160067741A1; EP3821918A1; DK2928512T3; EP2928512A1; US20200345892A1; KR20160002672A; JP2021072890A; CN105246520A; EP2928512B1; EP3449955A1; DK3449955T3; ES2702602T3; WO2014089610A1; US20210353825A1; JP2016501084A; US11077226B2; CN105246520B; JP2018203768A

Abstract

본 발명은 트로포엘라스틴, 및 탄성 재료를 사용한 조직 복구 및 재생과 관련된다. 트로포엘라스틴의 용액을 가열하여 용액 중에서 트로포엘라스틴으로부터 탄성 재료를 형성하는 단계를 포함하는, 트로포엘라스틴으로부터 탄성 재료를 생산하는 방법이 개시된다. 또한 이 방법에 따라 제조된 탄성 재료 및 이의 응용이 개시된다.

Description

확장 가능한 3-차원 탄성 구조물 제조{SCALABLE THREE-DIMENSIONAL ELASTIC CONSTRUCT MANUFACTURING}

본 발명은 트로포엘라스틴으로부터 탄성 재료의 생산에 관한 것으로, 특히 바람직한 3-차원 형태로의 재료의 형성, 그리고 비록 전용은 아니지만, 특히 조직 치료 및 복구에 사용할 수 있는 재료에 관한 것이다.

본 명세서에서 임의의 선행 기술에 대한 언급은, 이 선행 기술이 호주 또는 임의의 다른 관할 구역에서 통상의 일반적인 지식의 일부를 이룬다거나 이 선행 기술이 당업자에 의해 적절히 확인, 이해 및 간주되는 것으로 합리적으로 예상될 수 있다는 인정이나 어떠한 형태의 시사도 아니며 그렇게 받아들여져서는 안될 것이다.

인간 조직의 복구에 사용될 수 있는 3-차원 구조물에 대한 요구가 상당히 증가하고 있다. (엘라스틴과 같은) 천연의 생체적합물질에 기반을 둔 구조물이 탄성, 자기-조립성, 장-기간 안정성 및 생리적 활성을 포함하는 현저한 특성으로 인해 다양한 조직 공학 응용을 위한 선두적인 후보로서 드러나고 있다

트로포엘라스틴(tropoelastin)은 엘라스틴 및 탄성 섬유의 형성을 위한 기질 재료이다. 엘라스틴은 트로포엘라스틴이 가교되었을 때 트로포엘라스틴으로부터 형성된다.

트로포엘라스틴은 대부분의 수용액에 가용성이고, 실제로 생리적 염 및 pH에서 가용성이다. 트로포엘라스틴은 수용액을 가열하는 것에 의해 수용액으로부터 침전을 형성하도록 유도될 수 있다. 이 과정은 코아세르베이션으로 알려져 있으며, 여기에서 트로포엘라스틴 모노머는 하나의 트로포엘라스틴 모노머의 소수성 영역과 다른 모노머의 유사한 영역의 접촉에 의해 상호 결합한다. 이러한 모노머의 결합은 가역적이고, 코아세르베이트된 트로포엘라스틴에서 트로포엘라스틴 모노머는, 예를 들어 pH, 염 또는 온도 변경에 의해 분리될 수 있어, 코아세르베이트의 트로포엘라스틴 모노머의 용액으로의 용해 및 코아세르베이트의 소실을 유도한다. 이것이 의미하는 것은 트로포엘라스틴의 코아세르베이트가 생리적 조건에서 안정한 바람직한 3-차원 탄성 구조를 형성하도록 충분히 튼튼하지 않다는 것이다.

트로포엘라스틴 모노머의 가교는, 코아세르베이트된 형태이거나 아니거나, 표면적으로는 pH, 염 또는 온도 조정에 의해 분리될 수 없는 트로포엘라스틴 모노머의 결합처럼 보이는 트로포엘라스틴 모노머의 공유 결합을 유도한다. 일반적으로, 가교된 트로포엘라스틴 모노머는 엘라스틴 또는 탄성 섬유에서 관찰되듯이, 천연의 자원으로부터 엘라스틴의 정제를 위한 선행 기술 공정에 기술되어 있는 바와 같이, 모노머가 가수분해되지 않는 한 상호 분리될 수 없다.

엘라스틴 또는 탄성 섬유에서와 같이 가교된 트로포엘라스틴에서 관찰되는 트로포엘라스틴 모노머의 일반적으로 비가역적인 결합을 고려하면, 트로포엘라스틴의 가교는 바람직한 3-차원 탄성 구조의 형성을 가능하게 할 해법으로서 제안되고 있다. 이러한 기술의 예시는 Miyamoto et al. (2009), WO 2008/033847 및 WO 2009/099570에 개시되어 있으며, 이에 의해 전기방사된 재료가 바람직한 안정한 구조로 가교된다. 어떤 가교 기술은 가열 단계를 요구하며, 이에 의해 트로포엘라스틴-함유 조성물이 바람직한 탄성 구조의 형성시 가열된다. 일반적으로, 가열 단계는 용매를 증발시키기 위해, 그리고/또는 가교 반응을 위해 요구되는 온도 조건을 제공하기 위해 요구된다.

가교와 연관되는 공정에서 하나의 문제는 가교제가 가교제의 화학에 대한 조직의 내성에서나, 잔류 미반응 가교제나, 가교된 재료의 탄성 기능의 면에서 생체적합성이 아니라는 점이다. 다른 문제는 가교 후 재료가 바람직한 튼튼한 형태와 부합될 수 없는 종류의 구조로 신속히 고화되기 때문에, 가교된 재료로부터 바람직한 구조를 형성하는 것이 어렵다는 점이다. 따라서, 분무 성형 기술 등에 의해 구조를 형성하는 데 이러한 공정들이 사용될 수 있는 정도에는 제한이 있다.

궁극적으로, 트로포엘라스틴으로부터 안정적인 바람직한 3-차원 구조를 형성하는 데 요구되는 것은, 바람직한 구조 또는 형태의 손실을 야기할 상호 분리를 방지하도록 하는 방식으로 모노머들을 상호 연결하는 것이다. 안정한 탄성의 3-차원 구조물을 형성하는 다른 접근법은, 하나의 트로포엘라스틴 모노머를 다른 것과 연결하기 위한 링커(linker)로서 표면상 작용하는, 다른 분자를 사용하는 것이다. 예로는 일반적으로 WO 2009/099570에 논의된 바와 같은 합성 폴리머가 포함된다. 다른 접근법은 WO 2012/080706, WO2011/127478 및 WO 2007/029913에서와 같이 수 불용성 기질을 가용성 탄성 모노머의 용액으로 분무 또는 코팅하는 것이다. 후자의 접근법에서는, WO 2007/029913에서의 나노-섬유상 웹, 또는 WO2011/127478에서의 튜브와 같은 불용성 기질이 수성 조건에서 분리되지 않도록 표면상 트로포엘라스틴 모노머를 상호 연결한다. 이들 접근법에서의 문제는 바람직한 3-차원 형태를 제공하는 것이 분자 성분이 아니라 불가피하게 불용성 기질이라는 점으로, 이는 구조의 전체 탄성 프로파일에 영향을 주고 3-차원 구조를 만드는 능력을 제한한다.

탄성의 3-차원 구조의 형성을 위한 새로운 접근법에 대한 요구가 있다.

본 발명은 위에 언급된 제한, 요구 또는 문제의 하나 이상을 다루거나 적어도 이에 대한 개선을 제공하고자 한 것으로, 일 구현예에서

- 트로포엘라스틴 모노머의 용액을 제공하는 단계;

- 이 용액을 표면에 도포하는 단계;

- 이 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여, 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 이 용액을 이 표면 위에서 가열함으로써 탄성 재료를 형성하는 단계를 포함하는, 탄성 재료를 형성하는 방법을 제공한다.

다른 구현예에서,

- 트로포엘라스틴 모노머의 용액을 제공하는 단계;

- 이 용액을 표면에 도포하는 단계;

- 최소값 및 최대값으로 정의된 범위 내의 온도까지 이 용액을 이 표면 위에서 가열함으로써, 탄성 재료를 형성하는 단계를 포함하되,

여기에서 최소값은 그 위에서는 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 수용액에서 분리하지 않는 재료를 형성하는 온도이고;

최대값은 그 위에서는 비-탄성 재료가 형성되는 온도인, 탄성 재료를 형성하는 방법을 제공한다.

다른 구현예에서는, 위에 기술된 방법에 의해 형성된 탄성 재료를 제공한다.

다른 구현예에서,

- 위에 기술된 방법에 따라 탄성 재료를 형성하는 단계;

- 이 탄성 재료를 수용액에 접촉시키는 단계를 포함하는, 탄성 하이드로겔을 형성하는 방법을 제공한다.

다른 구현예에서, 위에 기술된 방법에 의해 형성된 탄성 하이드로겔을 제공한다.

다른 구현예에서, 위에 기술된 탄성 재료 또는 하이드로겔을 포함하는 구조물, 임플란트(implant) 또는 기구를 제공한다.

다른 구현예에서, 생물체의 조직을 복구 및/또는 회복시키기 위한, 그리고 분석 응용에서 이 탄성 재료의 사용을 위한, 위에 기술된 탄성 재료, 하이드로겔, 기구, 임플란트 또는 구조물의 용도 및 방법을 제공한다.

본 발명은 이에 첨부된 실시예 및 도면을 참고하여 더욱 구체적으로 기술될 것이다. 그러나, 다음의 설명은 단지 예시적인 것으로 이해되어야 하고 어떠한 방법으로도 위에 기술된 본 발명의 보편성에 대한 제한으로서 취급되어서는 안될 것이다.

도 1은 열-처리된 수~기반의 트로포엘라스틴 용액. A는 160 ℃로 가열한 후. B는 PBS에 습윤시킨 후.
도 2는 열-처리된 HFP~기반의 트로포엘라스틴 용액. A는 160 ℃로 가열한 후. B는 PBS에 습윤시킨 후.
도 3은 열-처리된 70% 에탄올~기반의 트로포엘라스틴 용액. A는 160 ℃로 가열하기 전. B는 160 ℃로 가열한 후. C는 PBS에서의 측면. D는 PBS에 습윤시킨 후.
도 4는 튜브 코팅에 사용된 열-처리된 HFP~기반의 트로포엘라스틴 용액. A는 160 ℃로 가열한 후. B는 PBS에 습윤시킨 후.
도 5는 열-처리된 전기방사된 트로포엘라스틴의 주사 전자 현미경 이미지. A는 160 ℃로 가열한 후. B는 PBS에 습윤시킨 후.
도 6은 열-처리된 전기방사된 트로포엘라스틴에서 배양된 섬유아세포의 주사 전자 현미경 이미지.
도 7은 열-처리된 전기방사된 트로포엘라스틴의 지속성을 보여주는 VVG 염색된 피부 생검의 이미지.
도 8은 열-처리된 수-기반의 트로포엘라스틴 용액으로 만든 필름. A) 37 ℃에서 16 시간 동안 건조한 후. B) 추가로 160 ℃까지 4 시간 동안 가열한 후.
도 9는 열-처리된 수-기반의 트로포엘라스틴 용액으로 만든 미세패턴화된 필름. 홈 패턴은 500 nm 깊이 및 3.5 ㎛ 폭이다.
도 10은 0-105% 및 105-19% 연장에서 모듈러스의 계산.

이하 본 발명의 일부 구현예에 대하여 구체적으로 참고할 것이다. 본 발명은 구현예와 관련하여 기술될 것이지만, 본 의도는 본 발명을 이들 구현예로 제한하지 않는 것임이 이해될 것이다. 반면, 본 발명은 청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변경 및 균등물을 커버하도록 의도된다.

당업자는 본원에 기술된 것과 유사하거나 균등한 많은 방법 및 재료를 인식할 것이고, 이는 본 발명의 실시에 사용될 수 있을 것이다. 본 발명은 어떠한 방법으로도 기술된 방법 및 재료로 제한되지 않는다.

본 명세서에 개시되고 정의된 발명은 본문 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 개개의 특징의 둘 이상의 모든 대안적인 조합까지 확장되는 것임이 이해될 것이다. 이들 다른 조합의 전부는 본 발명의 다양한 대안적인 양태를 구성한다.

본원에 언급된 모든 특허 및 공보는 그 전체가 참조로 포함된다.

본 작업은 강도 및 탄성과 같은 원하는 특성을 갖는 생체적합성 재료가 트로포엘라스틴의 가열을 통한 간단한 공정에 의해 합성될 수 있다는 것을 최초로 보여준다. 따라서, 본 발명은 생체적합성 3-차원 탄성 재료를 제조하기 위한 신뢰성 있고, 확장 가능하고, 저렴한 경로를 제공한다. 본 발명은 높은 처리량 생산과, 치료 및 생체외 분석 응용에 유용한 다목적 범위의 (시트, 튜브 및 섬유와 같은) 생체적합재료를 생산하기 위한 단백질 용도에 용이하다. 본 발명의 공정에 의해 생산된 본 재료는 천연 엘라스틴의 전형적인 특징인 탄성과 강도 특성을 갖지만 가교제의 사용으로부터 형성되는 구조물에서 통상적으로 발견되거나 이와 관련되는 독성 부산물 및 화학적 오염원이 없다.

본 발명의 재료의 유리한 특성은 본 명세서를 통해 논의되고, 특히 실시예에 나타내는데, 이는 본 발명의 재료가 트로포엘라스틴 용액의 가열에 의해 간단한 방법으로 제조될 수 있다는 것, 그리고 형성된 재료는 이들을 조직 공학 응용뿐 아니라 생체외 분석의 구성에 사용되도록 하는 생체적합성, 강도, 회복력, 세포 결합 및 세포외 기질 상호작용의 요구되는 특성을 갖는 것을 보여준다.

위에 언급된 바와 같이, 생체적합재료에 기반을 둔 스캐폴드(scaffold)는 그 생체적합성 및 기계적 특성 때문에 조직 공학 응용에 사용되어왔다. 그러나, 3-차원 생체적합재료-기반의 구조물을 합성하는 선행 기술의 방법은 비효율적이고, 느리고 제한적이며, 대안인 전형적인 조직 공학 기술은 극도로 (구조물을 생산하는 데 수 주일이 걸릴 수 있는) 느리고 값비싼 방법의 사용을 요구하고, 일반적으로 수백 마이크론 두께로 보급-제한되어 있고, 규정 준수를 요구하는 독성 성분 또는 부산물 문제로 인해 정기적으로 부담을 받는다.

따라서, 일 구현예에서,

- 트로포엘라스틴 모노머의 수용액을 제공하는 단계;

- 이 용액을 표면에 도포하는 단계;

- 이 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여, 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 이 용액을 이 표면 위에서 가열함으로써, 탄성 재료를 형성하는 단계를 포함하는, 탄성 재료를 형성하는 방법이 제공된다.

본 발명의 중요한 발견은, 가열 단계가 트로포엘라스틴 모노머의 결합에, 집합체가 수용액과 접촉할 때 모노머가 실질적으로 분리되지 않는 친화성을 부여한다는 것이다. 가열은, 생리적 조건에서 개개의 모노머로 분리하지 않는 정도로 코아세르베이트와 다르고, 고체상에서 그 자체를 유지하기 위해, 또는 그것이 형성된 형태의 영속성을 유지하기 위해 글루타르알데하이드와 같은 독성 가교제와 모노머의 가교 또는 염기성 pH를 갖는 용매의 사용을 요구하지 않는다는 점에서, 탄성 섬유 또는 다른 재료와 다른 탄성 집합체, 덩어리 또는 재료를 형성한다. 이 공정이 독성 우려 없이 조직 응용에 사용할 수 있는 영구적인 구조 또는 형태로 생체적합성 모노머를 어느 정도는 영구적으로 조립한다는 장점이 있다.

통상적으로, 이 용액은 트로포엘라스틴 모노머가, 상호 결합하여 재료가 생리적 조건, 특히 인간의 생리적 조건에 노출될 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 가열된다. 특히, 집합체는 온도 및 pH의 생리적 조건 하에서 분리하지 않는다. 유리하게는, 이 집합체는 다음 조건 하에서 분리하지 않는다:

● 온도(약 30 내지 약 45 ℃);

● 염(약 75 mM 내지 약 300 mM의 농도);

● pH(약 6.5 내지 약 8.0).

따라서, 이 재료는 생리적 조건 하에서뿐만 아니라, 더욱 부담되는 다른 조건에 노출될 수 있는 생체외 분석과 같은 다른 응용에도 사용하기 적합하다. 현저하게는, 이 재료는 트로포엘라스틴 모노머의 임의의 가교를 수행할 필요 없이, 그리고 펩티드 조립품이 결합하기 위한 스캐폴드의 사용 없이 달성된다.

본 발명의 공정에 의해 형성되는 이 재료는 많은 장점을 갖는다. 첫째로, 트로포엘라스틴은 집합체로부터 형성된 탄성 재료의 3-차원 형태가 수성 환경에서 유지되도록 상호 결합된 상태를 유지한다. 둘째로는, 트로포엘라스틴을 조직 공학 응용에 그렇게 유용하게 만드는 출발 물질의 특성(예를 들어, 탄성, 강도, 회복력 및 생체적합성)이 최종-산물에 유지된다. 셋째로, 집합체는 수용액에서 물을 흡수하여 하이드로겔을 형성할 수 있는데, 그렇게 함으로써 집합체가 분리하지 않고, 이에 의해 탄성 재료의 3-차원 구조를 유지한다.

일 구현예에서, 이 용액은 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 이 재료가 약 6.5 내지 약 8.0의 pH를 갖는 수용액에 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 가열된다. 본원에서 사용되는, 예를 들어 "1 내지 5"와 같이 길이 범위의 한도를 정의하는 용어는 1 내지 5의 임의의 정수, 즉 1, 2, 3, 4 및 5를 의미한다. 즉, 명백히 언급된 2 개의 정수에 의해 정의되는 임의의 범위는 상기 한도를 정의하는 임의의 정수 및 상기 범위에 포함되는 임의의 정수를 포함하고 개시하는 것을 의미한다. 예를 들어, 이 용액은 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9 또는 약 8.0의 pH를 가질 수 있다.

일 구현예에서, 이 용액은 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 이 재료가 약 30 내지 약 45 ℃의 온도를 갖는 수용액에 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 가열된다. 예를 들어, 이 온도는 약 31 ℃, 약 32 ℃, 약 33 ℃, 약 34 ℃, 약 35 ℃, 약 36 ℃, 약 37 ℃, 약 38 ℃, 약 39 ℃, 약 40 ℃, 약 41 ℃, 약 42 ℃, 약 43 ℃, 약 44℃ 또는 약 45 ℃일 수 있다,

일 구현예에서, 이 용액은 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 이 재료가 약 75 mM 내지 약 300 mM의 염 농도를 갖는 수용액에 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 가열된다. 예를 들어, 이 염 농도는 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 mM, 약 180 mM, 약 190 mM, 약 200 mM, 약 210 mM, 약 220 mM, 약 230 mM, 약 240 mM, 약 250 mM, 약 260 mM, 약 270 mM, 약 280 mM, 약 290 mM 또는 약 300 mM일 수 있다,

일 구현예에서, 이 용액은 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 이 재료가 생리적 조건(예를 들어, 약 7.2 내지 약 7.5 사이의 pH, 약 36 내지 약 37 ℃ 사이의 온도, 그리고 약 150 mM의 염 농도)에 노출될 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 가열된다.

본 공정에 따라, 이 용액은 본 발명의 탄성 재료를 형성하도록 가열된다. 위에 논의된 바와 같이, 가열 단계의 목적은 결합된 트로포엘라스틴 모노머를 함유하는 재료를 형성하는 것, 더욱 구체적으로는, 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 이 재료가 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성하는 것을 가능하게 하는 것이다. 가열 단계는 트로포엘라스틴 모노머가 농축물 중에서 상호 결합하여 트로포엘라스틴 모노머를 포함하는 집합체 또는 재료를 형성하기에 충분한 온도에서 실시된다. 통상적으로, 가열은 약 100 ℃ 또는 이보다 높은 온도, 예를 들어 100 ℃ 내지 160 ℃에서 실시될 것이다. 예를 들어, 가열 단계의 온도는 110 ℃ 또는 이보다 높은 온도, 120 ℃ 또는 이보다 높은 온도, 130 ℃ 또는 이보다 높은 온도, 140 ℃ 또는 이보다 높은 온도, 150 ℃ 또는 이보다 높은 온도, 160 ℃ 또는 이보다 높은 온도, 170 ℃ 또는 이보다 높은 온도, 또는 180 ℃ 또는 이보다 높은 온도일 수 있다. 바람직하게는, 온도는 약 120 ℃ 내지 약 180 ℃ 사이, 약 130 ℃ 내지 약 170 ℃ 사이, 또는 약 140 ℃ 내지 약 160 ℃ 사이이다. 가장 바람직하게는, 온도는 약 160 ℃이다.

다른 구현예에서,

- 트로포엘라스틴 모노머의 용액을 제공하는 단계;

- 이 용액을 표면에 도포하는 단계;

- 최소값 및 최대값으로 정의된 범위 내의 온도까지 이 용액을 이 표면 위에서 가열하는 단계를 포함하는, 탄성 재료를 형성하는 방법이 제공되는데,

여기에서 최소값은 그 위에서는 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 수용액에서 분리하지 않는 재료를 형성하는 온도이고; 그리고

최대값은 그 위에서는 비-탄성 재료가 형성되는 온도이다.

이 구현예에 따라, 최소값 아래에서는 본 발명의 탄성 재료가 형성되지 않는다. 즉, 형성되는 것은 수용액에서, 특히 생리적 조건에서 분리 가능하다. 따라서, 최소값 아래에서는 코아세르베이트와 보다 유사한 것이 형성될 수 있다. 최대값 아래에서는, 이 재료가 본원에서 논의되는 탄성 특성을 유지한다. 최대값 위에서는, 이 재료가 탄성 특성을 잃을 수 있다.

용액의 가열이 실시되어야 하는 적절한 시간 길이는 약 10 분 또는 그 위, 약 20 분 또는 그 위, 약 30 분 또는 그 위, 약 40 분 또는 그 위, 약 50 분 또는 그 위, 약 1 시간 또는 그 위, 약 2 시간 또는 그 위, 약 3 시간 또는 그 위, 약 4 시간 또는 그 위, 또는 약 5 시간 또는 그 위를 포함한다. 그러나, 당업자는 용액이 가열되어야 하는 온도뿐 아니라 용액이 가열되어야 하는 시간이 다음과 같은 다양한 인자에 따라 변화할 것을 이해할 것이다:

● 채용되는 가열 방법의 종류(예를 들어, 건식 가열, 순간 가열 등);

● 용액 중 트로포엘라스틴 모노머의 농도;

● 용액의 용적;

● 트로포엘라스틴 모노머의 조성;

● 집합체 또는 탄성 재료에서 원하는 결합의 정도;

● 가열 중 상대 습도.

어떤 구현예에서는, 보다 결정성이고 여전히 탄성 특성을 유지하는 물질을 제공하기 위해 8 내지 16 시간 가열이 사용될 수 있다.

일반적으로, 가열 중의 습도는 약 20 내지 약 80%, 바람직하게는 약 35, 45, 55, 65 또는 75% 상대습도일 수 있다,

본원에 기술되는 바와 같이, 가열 단계는 색상 변화가 생기는 탄성 재료의 형성을 야기할 수 있다. 따라서, 어떤 구현예에서는, 재료가 색상 변화가 생기는지 여부를 측정하는 것에 의해 탄성 재료의 형성을 시험하거나 가열 단계의 완료를 점검할 수 있다. 색상 변화는 일반적으로 엘라스틴의 정상적인 반투명 외양으로부터 황색 또는 갈색일 수 있는 색상으로의 변화이다. 재료 전체가 색상 변화가 생길 필요는 없다. 일반적으로, 색상 변화는 수화에 의해 탄성 재료에서 감소될 수 있다.

당업자는 또한, 다른 가열 방법을 활용하는 것에 의해 다른 내부 구조를 갖는 집합체가 얻어질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 순간-가열은 농축물이 단지 매우 제한적인 시간 동안 강력한 열원으로 처리되는 것을 포함할 것이다. 따라서, 가열은 모노머가 결합하여 집합체를 형성하기에 충분한 정도의 시간 동안 일어날 것이지만, 너무 빨라서 집합체에 잡힌 모든 용매가 집합체로부터 증발되지는 않을 것이며, 이에 의해 액포-타입 구조를 갖는 집합체가 형성된다. 또한, 집합체는 잡힌 용매가 증발되도록 다시 가열될 수 있을 것이고, 이에 의해 액포가 팽창하게 되어 다공성 집합체의 형성이 야기된다. 당업자는 또한 용매가 집합체 내부에 존재하지 않을 수 있지만, (집합체 내부에 존재하는 용매에 더하여, 또는 이의 대체물로서) 집합체의 외부 표면에 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다.

이 공정의 특히 중요한 하나의 장점은, 어떤 구현예에서는 이 공정에 의해 형성된 재료가, 가열 단계에 의해 유지되는 단백질 분자의 밀접한 정렬로부터 야기되는, 표면상 가스 불투과성일 수 있다는 것이다. 이는 유리 불기(glass blowing) 기술에서 일어나는 것과 동일하게, 재료를 불어 특정 형태로 만들 수 있게 한다.

어떤 가열 방법이 사용되는지에 무관하게, 당업자는 용액의 가열에 의해 형성된 집합체가 이에 따라 물을 다양한 정도로 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 집합체는 상당량의 물(예를 들어, 약 60% w/w 보다 많은 물)을 포함하여, 사실상 하이드로겔이 만들어질 수 있다. 또는, 물이 집합체 내에 단지 약 10% w/w의 양으로 존재할 수 있다. 물 함량은 탄성에 영향을 주기 때문에, 집합체(및 이에 따른 재료)의 탄성은 집합체의 물 함량을 변화시키는 것에 의해 변화시킬 수 있는데, 집합체의 물 함량은 결국 가열 전 농축물에 존재하는 물의 함량뿐 아니라 가열 시간, 방법 및 온도와 같은 다양한 인자를 변경시키는 것에 의해 변화될 수 있다.

일 구현예에서, 탄성 재료는 가열 단계의 완료시 재료의 약 0 보다 크고 약 50%(w/w)까지의 용매 함량을 갖는다. 예를 들어, 탄성 재료는 약 0.5%(w/w), 약 1%(w/w), 약 2%(w/w), 약 3%(w/w), 약 4%(w/w), 약 5%(w/w), 약 10%(w/w), 약 15%(w/w), 약 20%(w/w), 약 25%(w/w), 약 30%(w/w), 약 35%(w/w), 약 40%(w/w), 약 45%(w/w) 또는 약 50%(w/w)의 물 함량을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 용매는 물이다.

용액은 용액을 직접 가열하는 것에 의하거나 그 위에 용액이 놓이는 표면을 가열하는 것에 의해 가열될 수 있다. 후자의 구현예에서, 표면은 용액이 그 위에 도포되기 전에 가열되거나, 용액의 도포시 실온이고 다음에 관련 온도까지 가열될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 표면은 용액의 가열을 위해 가열된다.

또한 위에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 공정의 주된 장점은 공정이 폴리머 형성을 가져오는 가교제와 같은 시약의 사용을 요구하지 않기 때문에 생체적합성 재료가 형성될 수 있다는 것이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 공정은 가교제의 사용을 배제한다.

다른 구현예에서, 본 공정은 트로포엘라스틴-기반의 폴리머 형성을 보조하기 위해 염 또는 다른 코아세르베이션제의 사용을 배제할 수 있다.

다른 구현예에서, 본 공정은 트로포엘라스틴 모노머의 비가역적 집합을 가져오는 pH-조정제의 사용을 배제할 수 있다. 특히, 일 구현예에서 가열 단계는 알칼리 pH가 아닌 pH에서 실시되는데, 예를 들어 pH는 일반적으로 8.5 또는 8.0 보다 낮을 수 있다.

위에 논의된 바와 같이, 본 발명의 재료는 표면 위에서(예를 들어, 형태를 갖는 주형 안에서와 같은) 트로포엘라스틴의 용액을 가열하는 것에 의해 형성된다. 임의의 이론 또는 작용 방식에 구애받지 않고, 본 발명자는 트로포엘라스틴의 농축된 용액에서 트로포엘라스틴 모노머가 밀접하게 패킹되는 것으로 본다. 밀접-패킹은 용액의 가열시 모노머 사이의 결합을 용이하게 하고, 이에 의해 수성 환경에 들어갔을 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리되지 않는 탄성 재료를 생산한다.

트로포엘라스틴 모노머의 용매를 형성하는 용액은 수용액 또는 비-수용액일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "수용액(aqueous solution)"이라는 용어는 물-함유 용액을 말한다. 수용액은 완충액 및 약제학적으로-허용 가능한 부형제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있고, 또한 메탄올, 에탄올 및 헥사플루오로프로판올, 및 이들의 조합과 같은 다른 유기 수-혼화성 용매를 포함할 수 있다. 수용액이 다른 용매를 포함할 때, 당업자는 물이 주된 용매 성분이 되고 다른 용매(들)는 용매 성분의 적은 부분을 구성할 것임을 이해할 것이다. 수용액의 사용은 트로포엘라스틴 농축물, 그리고 이에 따라 재료가 비-생체적합성 또는 독성이거나 체내에서 독성 또는 원치 않는 부산물로 분해될 수 있는 임의의 성분을 함유하지 않는 조성물로부터 형성되는 것을 의미하기 때문에 특히 유리하다. 따라서, 바람직하게는 수용액이 독성 또는 비-생체적합성이고/이거나 재료가 (예를 들어, 체내에서 또는 분석에서) 사용될 때 독성 또는 비-생체적합성 종을 형성하는 임의의 성분(용매, 완충제 등)을 함유하지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "비-수용액(non-aqueous solution)"은 물을 함유하지 않거나 물을 적은 용매 성분으로서 함유하는 용액을 말한다. 비-수용액의 예로는, 예를 들어 본원의 실시예에 예시된 것과 같은 HFP가 포함된다. 비-수용액을 형성하기 위해 비-수성 용매를 사용하는 것의 한 장점은, 일반적으로 용매가 물 보다 낮은 비점을 가질 수 있다는 점이다. 이는 실질적인 열의 부가 없이 용매가 공정 중에 필요에 따라 증발되도록 할 것이다.

일 구현예에서, 이 용액은

- 트로포엘라스틴 모노머의 용액을 제공하고;

- 이 용액에서 트로포엘라스틴 모노머의 농도를 증가시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 형성된다.

최종 산물은 "농축물(concentrate)"로 언급될 수 있다. 농축물은 당업자에게 적절한 것으로 알려진 임의의 방법에 의해 얻어질 수 있다. 농축물에서 트로포엘라스틴 모노머는, 가열시 모노머가 집합체 또는 덩어리를 형성할 정도로 상호 밀접하게 접촉하게 되고, 이는 그것이 형성되는 표면의 형상과 일치할 수 있고, 집합체가 수성 환경에 놓일 때 가열 중에 형성된 연결의 상당한 파열을 겪거나 분리하지 않는다고 믿어진다.

농축물은, 예를 들어 용액을 가열하거나 용액 위에 공기 또는 질소를 불어넣는 것에 의해 용액으로부터 용매를 증발시킴으로써 얻어질 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 트로포엘라스틴 모노머의 농도는 용액으로부터 용매를 증발시키는 것에 의해 증가된다.

용매는 용액이 표면에 도포될 때 용액으로부터 증발될 수 있다. 용액이 표면에서 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 재료가 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성하도록 하는 온도까지 가열될 때 용매는 증발될 수 있어 트로포엘라스틴 모노머의 농축을 가능하게 한다.

일 구현예에서, 트로포엘라스틴 모노머의 농도는 트로포엘라스틴 모노머를 용매로부터 분리하는 것에 의해 증가된다. 트로포엘라스틴 모노머는 트로포엘라스틴 모노머의 전기방사에 의해 용매로부터 분리될 수 있다. "전기방사(electrospinning)"는 전기적으로 하전된 용액 또는 용융액을 전위 구배에 걸쳐 구멍을 통해 흐르게 함으로써 섬유가 용액 또는 용융액으로부터 형성되는 공정이다. 일 구현예에서, 용액은 표면에 용액이 도포될 때 약 1% 내지 약 40%(w/v)의 트로포엘라스틴 모노머의 농도를 갖는다. 예를 들어, 용액에서 트로포엘라스틴 모노머의 농도는 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 12%, 약 14%, 약 16%, 약 18%, 약 20%, 약 22%, 약 24%, 약 26%, 약 28%, 약 30%, 약 32%, 약 34%, 약 36%, 약 38% 또는 약 40%(w/v)일 수 있다.

"전기방사된 재료(electrospun material"는 전기방사 공정의 결과로 구조 또는 일군의 구조(섬유, 웹 또는 작은 방울과 같은)를 형성하는 임의의 분자 또는 물질이다. 일반적으로, 이 재료는 천연, 합성 또는 이들의 조합일 수 있으나, 본 발명에서는 트로포엘라스틴이 사용되는 것이 바람직하다.

기질 재료(matrix material)는 전기방사를 사용하여 직물 주형 위에 침착될 수 있다. 이러한 플랫폼 기술은 조직 공학에서 나노- 및 마이크로-섬유 건축물로 구성된 스캐폴드를 제조하기 위해 널리 사용된다(Li et al. (2006) and Li et al. (2005)).

전기방사의 공정은 폴리머 또는 모노머-함유 액체(예를 들어, 폴리머 또는 모노머 용액, 폴리머 또는 모노머 현탁액, 또는 폴리머 또는 모노머 용융액)를 바늘 또는 피펫 팁과 같은 작은 구멍 및 계량 펌프가 구비된 저장소에 넣는 것을 포함한다. 고전압원의 한 전극은 액체 또는 구멍과 전기적 접촉으로 위치하고 다른 전극은 표적(통상적으로 수집 스크린 또는 회전 원통)과 전기적 접촉으로 위치한다. 전기방사 중에 액체는 용액 또는 구멍에 고 전압의 인가에 의해 하전되고(예를 들어, 약 3 내지 약 15 kV) 다음에 계량 펌프에 의해 작은 구멍을 통과하게 되어, 정상 유동(steady flow)을 제공한다. 액체는 구멍에서 정상적으로 표면 장력으로 인해 반구형을 갖게 되지만, 고 전압의 인가는 구멍에서 그렇지 않았다면 반구형일 액체를 늘어나게 하여 테일러 콘(Taylor cone)으로 알려진 원뿔형을 형성하게 된다. 액체 및/또는 구멍에 충분히 높은 전압의 인가로, 하전된 액체의 반발성 정전기력은 표면 장력을 극복하고 하전된 액체의 분사가 테일러 콘의 팁으로부터 분출되고 표적을 향해 가속되는데, 이는 통상적으로 -2 내지 -10 kV 사이로 바이어스된다. 인가된 바이어스(예를 들어, 1 내지 10 kV)를 갖는 초점 링이 하전된 액체 분사의 궤적을 향하도록 선택적으로 사용될 수 있다. 하전된 액체의 분사가 바이어스된 표적을 향해 이동하면서, 복잡한 빠른 움직임(whipping)과 구부러짐 동작을 겪는다. 액체가 모노머 또는 폴리머 용액 또는 현탁액이면, 용매는 통상적으로 비행-중에 증발하여, 바이어스된 표적에 폴리머 또는 모노머 섬유를 남기게 된다. 액체가 폴리머 또는 모노머 용융액이면, 용융된 모노머/폴리머는 비행-중에 냉각되고 고체화되어 바이어스된 표적에 모노머/폴리머 섬유로서 수집된다. 폴리머/모노머 섬유가 바이어스된 표적에 축적되면서 다공성 메쉬가 바이어스된 표적에 형성된다.

전기방사된 기질의 특성은 전기방사 조건을 변경하는 것에 의해 맞추어질 수 있다. 예를 들어, 주형이 비교적 구멍에 가까울 때, 형성되는 전기방사된 메쉬는 섬유의 일부 영역이 "비드-유사(bead-like)" 외양을 갖도록 불균일하게 두꺼운 섬유를 함유하는 경향이 있다. 그러나, 주형이 구멍으로부터 멀어질수록, 메쉬의 섬유는 두께가 보다 균일해지는 경향이 있다. 또한, 주형은 구멍에 대하여 이동할 수 있다. 어떤 구현예에서는, 메쉬의 섬유가 실질적으로 상호 평행하도록 주형이 규칙적 및 주기적인 방식으로 전후 이동한다. 이 경우일 때, 생성된 메쉬는 섬유에 수직인 방향과 비교하여 섬유에 평행한 방향에서 변형에 대하여 더 높은 저항성을 가질 수 있다. 다른 구현예에서는, 유사하거나 다른 가닥 배향, 두께 등을 갖는 하나 이상의 패턴화된 층을 포함하는 메쉬를 생성하기 위해, 바이어스된 표적이 2- 또는 3-차원 패턴으로 구멍에 대하여 이동한다. 다른 구현예에서는, 주형이 구멍에 대하여 무작위로 이동하여, 메쉬의 평면에서 변형에 대한 저항성이 등방성이 된다. 전기방사된 기질의 특성은 또한 전기방사 시스템에 인가되는 전압의 크기를 변경하는 것에 의해 변화될 수 있다. 비-제한적 실시예에서, 전기방사 장치는 20 kV로 바이어스된 구멍을 포함한다. 다른 비-제한적 실시예에서, 전기방사 장치는 -7 kV로 바이어스된 주형을 포함한다. 또 다른 비-제한적 실시예에서, 전기방사 장치는 3 kV로 바이어스된 초점을 포함한다.

일 구현예에서, 용액 중 트로포엘라스틴의 농도는 용액이 표면에 도포될 때 약 10 내지 약 350 mg/mL 사이이다. 예를 들어, 트로포엘라스틴의 농도는 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 35 mg/mL, 40 mg/mL, 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 55 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 65 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 75 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 85 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 95 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 110 mg/mL, 약 120 mg/mL, 약 130 mg/mL, 약 140 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 160 mg/mL, 약 170 mg/mL, 약 180 mg/mL, 약 190 mg/mL, 약 200 mg/mL, 약 210 mg/mL, 약 220 mg/mL, 약 230 mg/mL, 약 240 mg/mL, 약 250 mg/mL, 약 260 mg/mL, 약 270 mg/mL, 약 280 mg/mL, 약 290 mg/mL, 약 300 mg/mL, 약 310 mg/mL, 약 320 mg/mL 또는 약 340 mg/mL이다.

일 구현예에서, 용액 중 트로포엘라스틴의 농도는 트로포엘라스틴이 첨가되는 용매의 온도 및 용매의 종류에 의존할 수 있다.

표면에 도포되는 트로포엘라스틴의 용액 또는 농축물은 일정 범위의 점도를 가질 수 있다. 이는 코아세르베이트와 같은 침전된 비-가교 트로포엘라스틴을 포함할 수 있다.

어떤 구현예에서, 표면에 도포되는 용액은 코아세르베이트된 트로포엘라스틴 모노머를 포함할 수도 있다.

일 구현예에서,

- 트로포엘라스틴 모노머의 용액을 제공하고;

- 용액 중 트로포엘라스틴 모노머의 농도를 증가시켜 트로포엘라스틴의 농축물을 형성하고;

- 이 농축물을 표면에 도포하고;

- 농축물 중의 트로포엘라스틴이 상호 결합하여, 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 이 농축물을 이 표면 위에서 가열하고,

이에 의해 탄성 재료를 형성하는 단계를 포함하는, 탄성 재료를 형성하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 농축물은 최소값 및 최대값으로 정의된 범위 내의 온도까지 가열되되;

최대값은 그 위에서는 비-탄성 재료가 형성되는 온도이고,

이에 의해 탄성 재료를 형성한다. 이 방법은 농축물의 약 1 내지 20% 물(w/w), 바람직하게는 약 15% 물(w/w)의 물 손실이 가능하도록 이 농축물을 이 표면 위에서 가열하는 단계를 포함할 수 있다.

트로포엘라스틴은 엘라스틴(ELN) 게놈 서열(또는 유전자)에 의해 코딩되는 모노머 단백질이다. 트로포엘라스틴 모노머는 크기가 대략 60-70 kDa이다. 트로포엘라스틴에는 약 36 개의 작은 영역이 있고 각각은 무게가 약 2 kDa이다. 엑손 내에, 글리신, 발린, 프롤린, 이소류신 및 류신과 같은 비-극성 아미노산이 풍부한 교차 소수성 영역(이 영역은 종종 GVGVP, GGVP 및 GVGVAP와 같은 3 내지 6 개 펩티드의 반복이 일어남), 그리고 리신 및 알라닌이 풍부한 친수성 영역이 있다. 친수성 영역은 종종 AAAKAAKAA와 같이 2 또는 3 개의 알라닌 잔기로 분리된 리신의 연장으로 구성된다. 추가적으로, 트로포엘라스틴은 그의 단 2 개인 시스테인 잔기를 포함하는 친수성 카복시-말단 서열로 끝난다. 트로포엘라스틴은 조립 중에 분열을 겪지 않고 미소섬유의 형성은 코아세르베이션으로 호칭되는 자기-결합 공정에 의해 달성된다.

트로포엘라스틴은 소수성 영역 사이의 상호작용으로 인해 생리적 온도에서 집합한다. 이 공정은 가역적이고 열역학적으로 제어된다. 코아세르베이트는 리실 옥시다제를 통한 가교에 의해 안정화된다. 다음에 코아세르베이트는 불용성으로 되고 이 공정은 비가역적이다. 이는 다음에 데스모신 또는 이소데스모신에서 2 개 잔기 또는 4 개 잔기의 가교된 구조를 형성하도록 농축된다.

어떤 구현예에서, 본 발명에 사용되는 트로포엘라스틴 모노머는 친수성 및 소수성 영역 둘 다를 포함한다. 친수성 영역은 (예를 들어, 물과 결합하는 것에 의해) 탄성 기능에 기여한다. 이들은 또한 세포 및 세포외 기질에 결합하는 것을 포함하여, 보다 다양한 생물학적 기능에 기여한다. 소수성 영역은 본 발명의 재료의 특성인 탄성을 제공하기 위해 중요한 것으로 믿어진다.

트로포엘라스틴 모노머에 존재할 수 있는 아미노산 서열의 몇 가지 예는 다음과 같다:

GGVPGAIPGGVPGGVFYP

GVGLPGVYP

GVPLGYP

PYTTGKLPYGYGP

GGVAGAAGKAGYP

TYGVGAGGFP

KPLKP

ADAAAAYKAAKA

GAGVKPGKV

TGAGVKPKA

QIKAPKL

VAPGVG

VPGVG

AAAAAAAKAAAK

AAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLV

EAAAKAAAKAAKYGAR

EAQAAAAAKAAKYGVGT

AAAAAKAAAKAAQFGLV

GGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGI

GALAAAKAAKYGAAV

AAAAAAAKAAAKAA

AAAAKAAKYGAA

CLGKACGRKRK.

본 발명에 사용되는 트로포엘라스틴은, 어떤 구현예에서는 위에 기술된 서열 중 임의의 하나를 포함하거나 이로서 구성될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 트로포엘라스틴은 아래 나타낸 서열을 포함하거나 이로서 구성된다:

VXPGVG

여기에서, X는 임의의 아미노산 잔기이거나 잔기가 없는 것이다.

ZXPGZG

여기에서, Z는 지방족 잔기이다.

VXP(I/L/V)V(I/L/V)

여기에서, (I/L/V)는 이소류신, 류신 또는 발린이다.

일 구현예에서, 트로포엘라스틴 모노머는 트로포엘라스틴의 친수성 및 소수성 영역을 포함한다.

다른 적절한 트로포엘라스틴 서열은 본 분야에 알려져 있고 CAA33627(Homo sapiens), P15502(Homo sapiens), AAA42271(Rattus norvegicus), AAA42272(Rattus norvegicus), AAA42268(Rattus norvegicus), AAA42269(Rattus norvegicus), AAA80155(Mus musculus), AAA49082(Gallus gallus), P04985(Bos taurus), ABF82224(Danio rerio), ABF82222(Xenopus tropicalis) 및 P11547(Ovis aries)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용되는 트로포엘라스틴 모노머는 인간 트로포엘라스틴으로부터 유래된다. 일 구현예에서, 이들은 GenBank 항목 AAC98394의 아미노산 잔기 27-724에 상응하는 서열을 갖는다. 본원에 언급한 바와 같이, 본 발명은 또한 트로포엘라스틴의 변종, 예를 들어 종 변종 또는 다형성 변종(polymorphic variants)을 포함한다.

본 발명에 사용되는 트로포엘라스틴 모노머는 재조합 원료(source)로부터 얻어질 수 있다. 이들은 또한 천연 자원으로부터 추출되거나 (예를 들어, 고체-상 합성 기술에 의해) 합성될 수 있다. 트로포엘라스틴 모노머는 또한 상업적으로 입수 가능하다.

트로포엘라스틴의 수많은 동형(isoform)이 있고, 따라서 트로포엘라스틴 폴리펩티드를 구성하는 아미노산의 정확한 수는 변화할 것이다. "폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 사슬"이라는 용어는 보통 아마이드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산의 폴리머를 말한다. 아미노산의 기능적으로-활성인 폴리머는 일반적으로 "단백질"로서 언급된다. 본 발명은 또한 트로포엘라스틴의 변종, 예를 들어 종 변종 또는 다형성 변종을 포함한다. 본 발명은 동일한 활성(즉, 생체적합성 및 탄성)을 나타내는 모든 기능적으로-활성인 트로포엘라스틴의 변종을 포함하는 것으로 의도된다. 이는 또한 트로포엘라스틴의 아포(apo)- 및 홀로(holo)-형태, 번역-후 변형된 형태뿐 아니라, 글리코실화되거나 탈-글리코실화된 유도체도 포함한다. 이러한 기능적으로-활성인 단편 및 변종은, 예를 들어 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 포함한다.

일 구현예에서, 모노머는 인간 트로포엘라스틴 동형의 서열을 갖는 재조합 트로포엘라스틴 모노머이다.

트로포엘라스틴의 단편 또는 변종과 관련하여 "기능적으로-활성인 (functionally-active)"이라는 용어는, 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이, 탄성 재료를 형성할 수 있는 단편 또는 (유사체, 유도체 또는 변이체와 같은) 변종을 의미한다. 이러한 변종은 천연적으로-발생하는 변종 및 비-천연적으로 발생하는 변종을 포함한다. 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 및 유도체화는 이 변형이 단편 또는 변종의 기능적 활성의 손실을 야기하지 않는 한 고려된다. 기능적으로-활성인 단편은, 예를 들어 엑소펩티다제를 사용하여 아미노산을 단축하는 것에 의하거나, 더 짧은 길이의 아미노산 서열을 합성하고, 다음에 아래의 실시예에 나타낸 방법에 의한 것과 같이 탄성 재료 형성 능력을 시험함으로써 용이하게 결정될 수 있다.

비-천연적인 변형이 일어날 때, 단편은 펩티도미메틱(peptidomimetic)으로 호칭될 수 있고, 이 또한 본 발명의 범위 내이다. 예를 들어, 합성 아미노산 및 이의 유사체는 하나 이상의 천연 아미노산으로 치환되어 아래에서 추가로 기술하는 구조-형성 활성을 제공할 수 있다.

"펩티도미메틱(peptidomimetic)"은 본 발명에 사용되는 트로포엘라스틴과 실질적으로 동일한 구조 및/또는 기능적 특징을 갖는 합성 화학적 화합물이다. 펩티도미메틱은 보통 천연적으로 합성되지 않는 적어도 하나의 잔기를 포함한다. 펩티도미메틱 화합물의 비-천연 성분은 a) 천연 아마이드 결합("펩티드 결합") 연결이 아닌 잔기 연결 그룹; b) 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기 대신의 비-천연 잔기; 또는 c) 2차 구조의 흉내를 유도, 즉 2차 구조, 예를 들어 베타 회전, 감마 회전, 폴리프롤린 회전, 베타 시트, 알파 헬릭스 구조 등을 유도 또는 안정화하는 잔기의 하나 이상에 따를 수 있다.

펩티도미메틱은 과학 및 특허 문헌(예를 들어, Gilman et al., al-Obeidi et al.(1998), Hruby et al. (1997) 및 Ostergaard & Holm (1997))에 기술된 다양한 공정 및 방법론을 사용하여 합성될 수 있다.

바람직하게는, 기능적으로-활성인 단편은 약 100 아미노산 길이이다. 일반적으로, 본 발명에 사용되는 가장 짧은 단편은 약 10 아미노산 길이일 것이다. 따라서, 이 단편은 약 10 내지 약 100 아미노산 길이 사이일 수 있다. 더 짧은 단편은, 예를 들어 고체-상 합성에 의한 긴 단편의 제조가 달성하기 어려울 수 있기 때문에, 예를 들어 단편을 합성 기술로 만들고자 할 때 유리하다. 단편은 일반적으로 매우 순수한 산물을 얻고자 할 때 생체외 합성된다. 더 긴 단편의 장점은 이의 탄성 특성과 같이 단편의 소수성/친수성 성질이 보다 용이하게 미세-조정될 수 있다는 점이다. 바람직하게는, 기능적으로-활성인 단편 또는 변종은 위에 기술된 것과 같은 펩티드에 대하여 적어도 대략 60% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 대략 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 또는 85% 동일성, 한층 더 바람직하게는 90% 동일성, 한층 더 바람직하게는 적어도 대략 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는다. 기능적으로-활성인 단편 또는 변종은 트로포엘라스틴으로부터의 아미노산의 인접 서열과 상응하거나 동일성을 가질 수 있지만, 기능적으로-활성인 단편이 트로포엘라스틴의 3-차원 구조에서 공간적으로 군집한 아미노산 서열과 상응하거나 동일성을 갖는 것도 고려된다.

이러한 기능적으로-활성인 단편 및 변종은, 예를 들어 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 포함한다. 당업자는 비교될 서열의 전체-길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘(아래에 기술되는 비-제한적 실시예)을 포함하는 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 아미노산 서열이 정렬될 때, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에서의, 이와의, 또는 이에 대한 아미노산 서열 동일성 백분율(이는, 주어진 아미노산 서열 B에서의, 이와의, 또는 이에 대한 어떤 아미노산 서열 동일성 백분율을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수도 있음)은 다음과 같이 계산할 수 있다: 아미노산 서열 동일성 백분율 = (X/Y) x 100, 여기에서 X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 또는 알고리즘의 정렬에 의해 동일성 일치로서 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 총 아미노산 잔기의 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않다면, A 대 B의 아미노산 서열 동일성 백분율은 B 대 A의 아미노산 서열 동일성 백분율과 같지 않을 것이다.

동일성 백분율을 계산하는 데 있어서는 정확한 일치를 센다. 두 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 비-제한적 예는 Karlin and Altschul(1993)에서 변경된 Karlin and Altschul(1990)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul et al.(1990)의 BLASTN and BLASTX 프로그램에 포함된다. 비교 목적을 위한 갭트 얼라인먼트(gapped alignments)를 얻기 위해서는, Altschul et al.(1997)에 기술된 Gapped BLAST(in BLAST 2.0)를 이용할 수 있다. 대안으로는, PSI-Blast가 분자 사이의 원연 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하기 위해 사용될 수 있다. Altschul et al. (1997) supra 참조. 바람직한 일 구현예에서, BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램의 이용, 각각의 프로그램(예를 들어, BLASTX 및 BLASTN)의 디폴트 파라미터가 사용된다. 정렬은 또한 검사에 의해 수동으로 시행될 수 있다. 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 비-제한적 예시는 ClustalW 알고리즘(Higgins et al. (1994))이다. ClustalW는 서열을 비교하고 아미노산 또는 DNA 서열의 전체를 정렬하여, 이에 따라 전체 아미노산 서열의 서열 보존성에 대한 데이터를 제공할 수 있다. ClustalW 알고리즘은 Vector NTI Program Suite(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)의 ALIGNX 모듈과 같은 몇 가지 상업적으로 이용 가능한 DNA/아미노산 분석 소프트웨어 패키지에 사용된다. ClustalW로 아미노산 서열의 정렬 후, 아미노산 동일성 백분율이 평가될 수 있다. ClustalW 정렬의 분석에 유용한 소프트웨어 프로그램의 비-제한적 예시로는 GENEDOC™ 또는 JalView(http://www.jalview.org/)가 있다. GENEDOC™은 복수의 단백질 사이에서 아미노산(또는 DNA) 유사성 및 동일성의 평가를 허용한다. 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 비-제한적 예시는 Myers and Miller(CABIOS 1988; 4: 11-17)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version 10(Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA로부터 이용 가능)의 일부인 ALIGN 프로그램(version 2.0)에 포함된다. 바람직한 일 구현예에서, 아미노산 서열의 비교를 위한 ALIGN 프로그램을 이용하는 것은, PAM 120 중량 잔기 테이블, 갭 길이 페널티 12, 및 갭 페널티 4가 동일성 백분율 평가시 사용된다.

"보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitutions)"이라는 용어는 동일 클래스의 다른 하나에 의한 아미노산의 치환을 말하는데, 이 클래스는 다음과 같다:

비-극성: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp

비하전 극성: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln

산성: Asp, Glu

염기성: Lys, Arg, His.

다른 보존적 아미노산 치환은 또한 다음과 같이 만들어질 수 있다:

방향족: Phe, Tyr, His

양성자 공여: Asn, Gln, Lys, Arg, His, Trp

양성자 수용: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gln.

일 구현예에서, 모노머는 적어도 50 연속 아미노산에서 인간 트로포엘라스틴의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다.

일 구현예에서, 모노머는 VPGVG로 구성되는 연속 아미노산 서열에서 인간 트로포엘라스틴의 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다.

한 종류의 트로포엘라스틴 모노머가 본 발명에 사용되거나, 다른 트로포엘라스틴 모노머의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 트로포엘라스틴 모노머의 조합은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 또는 이보다 많은 다른 종류의 트로포엘라스틴 모노머를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서는, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 또는 이보다 많은 다른 트로포엘라스틴 모노머가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는, 1 또는 이보다 많은, 2 또는 이보다 많은, 3 또는 이보다 많은, 4 또는 이보다 많은, 5 또는 이보다 많은, 6 또는 이보다 많은, 7 또는 이보다 많은, 8 또는 이보다 많은, 9 또는 이보다 많은, 또는 10 또는 이보다 많은 다른 종류의 트로포엘라스틴 모노머가 사용될 수 있다.

또한, 다른 구현예에서는, 트로포엘라스틴 모노머가 인간 및/또는 비-인간(예를 들어, 영장류, 소, 말, 양, 염소, 돼지, 개, 고양이 또는 설치류) 트로포엘라스틴 모노머의 조합 또는 임의의 수이다.

추가로, 조합에 존재하는 각각의 트로포엘라스틴 모노머의 비율 및/또는 동일성을 변화시키는 것이 원하는 탄성, 인장 강도 및 형태형성도(shapeability)를 갖는 트로포엘라스틴-기반의 하이드로겔을 발생시킬 수 있다는 것, 그리고 트로포엘라스틴의 다양한 다형을 폴리머 스캐폴드로 도입하는 것에 의해, 트로포엘라스틴 폴리머의 강도, 탄성, 가교 가능성 및 다른 물리적 및 생화학적 행동이 이에 따라 변경될 수 있고, 가능하게는 제어될 수 있다는 것이 인정될 것이다.

또한, 조합에 존재하는 각각의 트로포엘라스틴 모노머의 비율 및/또는 동일성은 복구, 대체 또는 재생될 조직에 존재하는 트로포엘라스틴 모노머와 일치하도록 변화될 수 있다.

일 구현예에서, 용액은 표면 위로 용액을 분무하는 것에 의해 표면에 도포된다.

본원에 사용되는 "표면(surface)"이라는 용어는 상보적 형태의 트로포엘라스틴-기반의 폴리머 구조물을 만들기 위해 사용될 수 있는 임의의 물체 또는 기구를 말한다. 예를 들어, 표면은 집합체가 그 위에 평탄한 필름으로서 형성되는 평탄한 표면일 수 있거나, 주형일 수 있다. 주형은 일반적으로 속이 빈 부분을 포함하는 물체 또는 기구로 이해된다. 이 부분은 농축물이 가열될 때 주형 안에서 경화 또는 굳어서 그 형태를 취하도록 트로포엘라스틴 모노머의 용액으로 채워질 수 있다. 주형은 당업자가 원하는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 주형은 이로부터 형성되는 구조물이 복구 및/또는 대체될 특정 생리적 조직(예를 들어, 연골, 혈관 조직 또는 뼈)의 형태가 되도록 성형되거나, 분석 응용에 사용될 수 있는 패턴(아래에서 추가로 논의되는 바와 같이, 채널, 홈 등)을 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 표면은 공정에 의해 형성되는 탄성 재료가 예정된 형태로 성형되도록 하는 다이, 주형 또는 거푸집의 형태로 제공된다.

일 구현예에서, 탄성 재료는 트로포엘라스틴 모노머의 용액이 위에 기술된 공정에 따라 도포되는 "표면"을 형성할 수 있다. 예를 들어, 1차 도포는 비-단백질성 표면에 탄성 재료의 형성을 야기할 수 있다. 2차 도포는 비-단백질성 표면에 형성된 그 탄성 재료에 이루어질 수 있어, 1차 도포로부터 유래된 탄성 재료 위에 탄성 재료의 형성을 야기한다. 이 공정은 복수 회 반복될 수 있어, 예를 들어 트로포엘라스틴 모노머 용액의 적가 적용에 의해 구조의 적층을 가능하게 한다.

본 발명은 또한

- 트로포엘라스틴 모노머의 용액을 제공하고;

- 이 용액을 이 표면에 도포하고; 그리고

- 용액 중의 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 트로포엘라스틴 모노머의 집합체를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 이 용액을 이 표면 위에서 가열하는 것을 포함하는 공정에 의해 형성되는 탄성 재료와 관련된다.

본 발명은 또한 트로포엘라스틴 모노머의 열-보조된 결합에 의해 형성되는 탄성 재료를 포함하는 구조물과 관련된다.

탄성 재료는 (예를 들어, 수의과 또는 의학적(인간) 적용을 위해) 대상의 천연 조직(의 적어도 일부)을 복구, 증가 또는 대체시키기 위해 사용될 수 있는 3-차원 폴리머 구조일 수 있다. 또한, 탄성 재료는 3-차원 구조물로 도입되거나, 또는 이의 일부를 형성할 수 있다. 예를 들어, 집합체는 연골 복구를 위해 사용되는 구조물 내로, 층으로서 포함되거나, 스텐트(stent) 내로 포함될 수 있다.

가열 단계 이전 용액 중 트로포엘라스틴 모노머 사이의 접촉 정도 역시 재료의 특성에 영향을 미칠 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 가열 전에 (농축물에 존재하는 트로포엘라스틴의 양 면에서) 용액이 더 많이 농축될수록, 트로포엘라스틴 모노머는 더 많이 상호 작용하여 집합체를 형성할 것이고, 생성되는 재료의 탄성은 더 줄어들 것이다. 따라서, 어떤 구현예에서는 용액 중 트로포엘라스틴 모노머의 농도가 중합도에 직접적으로 관련될 수 있다. 다른 인자 또한 재료의 특성에 기여할 수 있고, 여기에는 위에 논의된 바와 같이, 예를 들어 사용되는 트로포엘라스틴 모노머의 종류, 가열 단계가 실시되는 온도, 및 가열이 실시되는 시간이 포함된다.

위에 언급된 바와 같이, 본원에 기술되는 재료는 다공성일 수 있으며, 즉 재료가 다공성을 가질 수 있고, 즉 재료의 일부가 개방된 공간, 예를 들어 기공 또는 다른 구멍으로 구성될 수 있다. 따라서, 다공성은 재료에서 빈 공간으로 측정되고, 0과 100% 사이의 백분율(또는 0 과 1 사이)로서 전체 용적에 걸쳐 공극의 용적 분율이다(예를 들어, Coulson et al. (1978) 참조). 기질 다공성의 측정은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 수은 다공성측정(mercury porosimetry) 및 (질소 흡착과 같은) 가스 흡착과 같은 표준화된 기술을 사용한다. 일반적으로, 재료의 다공성은 0.5 내지 0.99, 약 0.75 내지 약 0.99, 또는 약 0.8 내지 약 0.95 범위일 수 있다. 바람직하게는, 재료의 다공성은 적어도 0.75, 더욱 바람직하게는 적어도 0.8, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 0.9이다.

다공성 재료는 임의의 기공 크기를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 "기공 크기"라는 용어는 기공의 횡-단면의 직경 또는 유효 직경을 말한다. "기공 크기"라는 용어는 또한, 복수의 기공의 측정에 기초하여, 기공의 횡-단면의 평균 직경 또는 평균 유효 직경을 말할 수 있다. 원형이 아닌 횡-단면의 유효 직경은 비-원형 횡단면과 동일한 횡-단면적을 갖는 원형 횡-단면의 직경과 같다. 기공은 물 또는 공기와 같은 유체로 채워질 수 있다. 일부 구현예에서, 재료의 기공은 약 50 nm 내지 약 1000 ㎛, 약 250 nm 내지 약 500 ㎛, 약 500 nm 내지 약 250 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 200 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 150 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 125 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 또는 약 40 ㎛ 내지 약 65 ㎛ 범위의 기공 크기 분포를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 재료는 약 12 ㎛, 약 25 ㎛, 약 45 ㎛, 약 50 ㎛, 또는 약 65 ㎛의 기공 크기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 재료는 11.7±3.3 ㎛, 23.4±5.8 ㎛, 또는 51±9 ㎛의 기공 크기를 가질 수 있다.

기공이 표시된 "크기" 주위의 크기 분포를 나타낼 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 "크기"라는 용어는 기공의 크기 분포 방식, 즉 크기 분포에서 가장 빈번하게 나타나는 값을 말한다.

기공은 실질적으로 둥근 횡-단면 또는 구멍일 수 있다. "실질적으로 둥근"이 의미하는 것은, 가장 긴 것과 가장 짧은 기공 횡-단면의 수직 축의 길이 비율이 약 1.5 보다 작거나 같다는 것이다. 실질적으로 둥근 것은 대칭 선을 요구하지 않는다. 일부 구현예에서, 가장 긴 것과 가장 짧은 기공 횡-단면의 축 사이의 길이 비율은 약 1.5 보다 작거나 같고, 약 1.45 보다 작거나 같고, 약 1.4 보다 작거나 같고, 약 1.35 보다 작거나 같고, 약 1.30 보다 작거나 같고, 약 1.25 보다 작거나 같고, 약 1.20 보다 작거나 같고, 약 1.15 보다 작거나 같고, 약 1.1 보다 작거나 같다.

유리하게는, 본 발명의 재료는 탄성이다. "탄성(elastic)" 재료는 그것에 인가된 (압축 또는 신장과 같은) 힘이 철회된 후 특정 형태 또는 구조로 되돌아가는 것이다. 이는 또한 탄력적으로 압축 가능하거나 신장 가능한, 기계적으로 내구성인, 또는 비교적 낮은 이력(hysteresis)의 유연한 재료로도 언급된다. 이 재료는 연신성, 신장성, 탄력성 또는 반동 가능한 것으로 언급될 수 있다. 예를 들어, 이 재료는 약 20 내지 약 400%의 신장성을 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 이 재료는 약 1 kPa 내지 약 10³ kPa 범위의 탄성 계수를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 "탄성 계수(elastic modulus)"라는 용어는 그것에 힘이 인가될 때 탄성적으로(즉, 비-영구적으로) 변형되는 물체 또는 물질의 경향을 말한다. 일반적으로, 물체의 탄성 계수는 탄성 변형 영역에서 그의 응력-변형 곡선의 기울기로서 정의된다. 방향을 포함하여 어느 정도의 응력과 변형이 측정되는지를 특정하는 것은 많은 종류의 탄성 계수가 정의되도록 한다. 영률(Young's modulus (E))은 인장 탄성, 또는 대립하는 힘이 축을 따라 인가될 때 물체가 축을 따라 변형되는 경향을 기술하고; 인장 응력과 인장 변형의 비율로서 정의된다. 이는 종종 간단히 탄성 계수로서 언급된다. 본 공정에 의해 형성된 탄성 재료는 압축에 대하여 탄성적으로 반응하는 것으로 평가될 것이다. 일부 구현예에서, 재료는 약 1 kPa 내지 약 1000 kPa 범위의 탄성 계수를 가질 수 있다. 일부 구현예에서는, 재료가 약 10 kPa, 약 100 kPa, 또는 약 200 kPa의 탄성 계수를 가질 수 있다.

본 발명에 따라 주어진 재료의 더 높은 영률은 다음 중 임의의 하나에 의해 달성될 수 있다:

● 더 긴 시간, 예를 들어 8 내지 16 시간 동안 가열

● 트로포엘라스틴의 가용화 및 가열 전에 실크의 첨가

● 링커의 첨가

이들 조정은 10 메가 파스칼까지의 영률을 갖는 재료를 생성한다.

본 발명의 재료는 하이드로겔을 형성하기 위해 물에 첨가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 탄성 재료를 포함하는 하이드로겔과 관련되는데, 여기에서 탄성 재료는

- 트로포엘라스틴 모노머의 용액을 제공하고;

- 이 용액을 표면에 도포하고;

- 농축물 중의 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여 트로포엘라스틴 모노머의 집합체를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 이 용액을 이 표면 위에서 가열하고,

이에 의해 탄성 재료를 형성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 형성된다.

하이드로겔은 일반적으로 물이 분산 매질인 (친수성의) 폴리머 사슬의 망으로서 이해된다. 하이드로겔은 고도로 흡수성이고 - 이들은 99.9%가 넘는 물을 함유할 수 있음 - 이들의 상당한 물 함량으로 인해 천연 조직과 매우 유사한 정도의 유연성을 갖는다.

따라서, 본 발명의 탄성 재료 또는 집합체를 포함하는 하이드로겔은 통상적으로 상당량의 물을 함유할 것이다. 그러나, 하이드로겔을 형성하기 위해 그 안으로 집합체가 첨가되거나 함침되는 물의 양은 하이드로겔에서 원하는 탄성의 정도와 같은 인자에 의존할 것이다. 즉, 집합체에 첨가되는 물의 양은 단지 탄성을 부여하기에 충분한 양일 수 있다. 또는 생성되는 하이드로겔을 고도로 탄성으로 만들기 위해 상당량의 물이 첨가될 수 있다. 당업자는 사용되는 물의 양이 또한 집합체 자체의 탄성에 의존할 것이라는 점을 이해할 것이다(즉, 집합체가 이미 상당히 탄성이라면, 집합체가 덜 탄성인 것 보다 더 적은 양의 물이 첨가될 필요가 있을 것이다).

당업자는 본 발명의 재료의 추가 성분(예를 들어 세포, 약제학적으로-활성인 성분 등)뿐 아니라 본 발명의 재료의 형태(예를 들어, 조직 공학 구조물 및 분석)와 관련된 본원의 논의는 본 발명의 탄성 재료를 포함하는 구조물 및 하이드로겔에도 적용되는 것을 이해할 것이다.

본원에서 기술되는 재료는 조직 공학 응용을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조직 공학은 조직 및/또는 기관 기능을 대체, 복구 및/또는 재생하거나, 이식을 위한 인공 조직 및 기관을 생성하는 것을 목표로 한다. 일반적으로, 조직 공학에 사용되는 스캐폴드는 천연 세포외 기질(ECM)을 모방하고 세포 흡착, 이동 및 증식을 위한 지지체를 제공한다. 이상적으로는, 이들은 분화된 기능, 새로운 조직 발생 및 이의 3-차원 구성을 허용한다. 스캐폴드의 원하는 특징에는 기계적 강도 및 분해성과 같은 물리적 파라미터가 포함되는 한편, 생물학적 특성에는 생체적합성 및 생물학적으로 관련된 미소환경을 제공하는 능력이 포함된다. 생분해성 재료는, 조직이 자란 후 생성된 구조가 전체 또는 거의 전체가 생물학적 성분으로 만들어지기 때문에, (조직 재생과 같은) 일부 응용에 유리하다.

일부 구현예에서, 본원에 기술되는 재료는 혈관 조직, 심장 조직, 방광, 피부, 폐, 인대, 힘줄, 내분비선, 간, 신장 조직, 림프절, 췌장, 뼈, 연골 및 다른 조직의 성장 및/또는 대체를 포함하는 많은 조직 공학 응용을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재료는 신호를 세포로 전달하고, 세포 성장 및 기능을 위한 지지 구조로서 작용하고, 그리고 공간 충전을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

탄성 재료의 원하는 형태의 예시에는 시트, 튜브 및 임의의 다른 3-차원 형태를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 시트의 형태로 형성된 탄성 재료는 피부 조직, 치근 도포 공정을 위한 멤브레인, 멤브레인 조직 등의 보수, 대체 및/또는 재생 치료를 제공하기 위한 임플란트, 구조물 및 이식물의 제조에 사용될 수 있다. 튜브의 형태로 형성된 탄성 재료는 동맥, 정맥, 요관, 요도, 신경, 장골 등의 보수, 대체 및/또는 재생 치료를 제공하기 위한 임플란트, 구조물 및 이식물의 제조에 사용될 수 있다. 임의의 다른 3-차원 물체의 형태로 형성된 탄성 재료는 기관 이식, 뼈 재구성 또는 수선, 치과 임플란트를 위한, 또는 근육, 힘줄, 인대 및 연골 이식을 위한 보수, 대체 및/또는 재생 치료를 제공하기 위한 임플란트, 구조물 및 이식물의 제조에 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 탄성 재료는 프리-캐스트(pre-cast) 패치로서의 사용을 가능하게 하는 형상으로 형성될 수 있는데, 이는 다음에 봉합되거나 표면에 부착될 수 있다. 예로는 심장 패치, 피부 패치, 또는 각막에 적합한 패치를 포함한다.

시트의 형상으로 형성, 주조 또는 성형된 생체적합성 탄성 재료는 평탄한 시트, 또는 다치거나, 손상되거나 병든 조직 또는 복구, 대체 또는 재생될 기관의 윤곽에 밀접하게 맞도록 만곡을 갖는 시트일 수 있다. 시트는 사각형, 직사각형, 사다리꼴, 삼각형, 원형, 타원형 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 기하학적 형상의 것일 수 있다.

시트의 예시적인 면적은 약 1 ㎟ 내지 약 1 ㎡, 약 1 ㎟ 내지 약 50 ㎠, 약 1 ㎟ 내지 약 25 ㎠, 약 1 ㎟ 내지 약 10 ㎠, 약 1 ㎟ 내지 약 1 ㎠, 약 1 ㎠ 내지 약 1 ㎡, 약 1 ㎠ 1 ㎠ 내지 약 500 ㎠, 1 ㎠ 내지 약 250 ㎠, 1 ㎠ 내지 약 200 ㎠, 1 ㎠ 내지 약 150 ㎠, 내지 약 100 ㎠, 약 1 ㎠ 내지 약 50 ㎠, 약 1 ㎠ 내지 약 25 ㎠, 약 1 ㎠ 내지 약 10 ㎠, 약 1 ㎠ 내지 약 5 ㎠, 약 1 ㎠ 내지 약 2.5 ㎠, 약 10 ㎟ 내지 약 10 ㎠, 약 0.1 ㎠ 내지 약 10 ㎠, 약 0.1 ㎠ 내지 약 1 ㎠, 또는 이의 임의의 중간 범위의 면적을 포함한다. 예를 들어, 예시적인 시트의 1 ㎠ 내지 100 ㎠의 면적 범위는 약 1 ㎠, 약 5 ㎠, 약 10 ㎠, 약 20 ㎠, 약 30 ㎠, 약 40 ㎠, 약 50 ㎠, 약 60 ㎠, 약 70 ㎠, 약 80 ㎠, 약 90 ㎠, 및 약 100 ㎠의 면적을 포함한다.

시트의 형상으로 형성, 주조 또는 성형된 탄성 재료의 예시적인 두께 정도는 약 0.1 mm 내지 약 10 mm, 약 0.25 mm 내지 약 7.5 mm, 약 0.5 mm 내지 약 5 mm, 약 0.75 mm 내지 약 2.5 mm, 약 1 mm 내지 약 2 mm의 범위, 또는 이의 임의의 중간 범위를 포함한다.

다른 구현예에서, 두께는 약 0.1 mm, 약 0.25 mm, 약 0.5 mm, 약 0.75 mm, 약 1 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 7.5 mm, 또는 약 10 mm 또는 이보다 클 수 있다.

튜브 형상으로 형성, 주조 또는 성형된 탄성 재료는, 스캐폴드의 크기가 다치거나, 손상되거나 병든 조직 또는 기관을 복구, 대체 및/또는 재생시키기에 적합하도록 임의의 원하는 길이, 직경 및 두께를 가질 수 있다. 튜브의 예시적인 길이는 약 0.5 cm, 약 1 cm, 약 2.5 cm, 약 5 cm, 약 10 cm, 약 25 cm, 약 50 cm, 약 100 cm, 약 150 cm, 약 200 cm, 약 250 cm, 약 300 cm, 약 350 cm, 약 400 cm, 약 450 cm, 약 500 cm, 또는 이보다 큰 것을 포함한다. 튜브의 예시적인 직경은 약 0 mm(예를 들어, 솔리드 섬유(solid fiber)), 0.5 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3 mm, 약 3.5 mm, 약 4 mm, 약 4.5 mm, 약 5 mm, 약 5.5 mm, 약 6 mm, 약 6.5 mm, 약 7 mm, 약 7.5 mm, 약 8 mm, 약 8.5 mm, 약 9 mm, 약 9.5 mm, 약 10 mm, 약 11 mm, 약 12 mm 또는 이보다 큰 mm의 직경을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 튜브는 약 1 mm 내지 약 10 mm 직경을 갖는다.

다른 3-차원 물체의 형상으로 형성, 주조 또는 성형된 탄성 재료는 스캐폴드의 크기가 다치거나, 손상되거나 병든 조직 또는 기관을 복구, 대체 및/또는 재생시키기에 적합하도록 임의의 원하는 용적 및/형상을 가질 수 있다.

3-차원 형상 스캐폴드의 예시적인 용적은 약 100 ㎣ 내지 약 5 ㎥, 약 100 ㎣ 내지 약 1000 ㎤, 약 1 ㎤ 내지 약 1000 ㎤, 약 1 ㎤ 내지 약 100 ㎤, 약 1 ㎤ 내지 약 10 ㎤, 약 10 ㎤ 내지 약 1000 ㎥, 약 10 ㎤ 내지 약 100 ㎤, 약 500 ㎤ 내지 약 1000 ㎤, 약 100 ㎣ 내지 약 5 ㎤, 약 100 ㎣ 내지 약 2.5 ㎤, 약 1 ㎤ 내지 약 5 ㎤, 약 1 ㎤ 내지 약 2.5 ㎤, 약 750 ㎤ 내지 약 1250 ㎤, 약 850 ㎤ 내지 약 1150 ㎤, 약 950 ㎤ 내지 약 1050 ㎤, 약 900 ㎤ 내지 약 1000 ㎤, 또는 이의 임의의 중간 범위일 수 있다. 예를 들어, 예시적인 3-차원 형상의 1 ㎤ 내지 약 10 ㎤의 용적 범위는 약 1 ㎤, 약 2 ㎤, 약 3 ㎤, 약 4 ㎤, 약 5 ㎤, 약 6 ㎤, 약 7 ㎤, 약 8 ㎤, 약 9 ㎤, 및 약 10 ㎤의 용적을 포함한다. 일 구현예에서, 스캐폴드는 약 1 내지 약 100 마이크로리터의 용적을 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 탄성 재료는 필름 형태이다. 필름의 두께는 나노미터부터 밀리미터까지의 범위일 수 있다. 예를 들어, 필름 두께는 약 1 nm 내지 약 1000 mm의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 필름 두께는 약 1 nm 내지 1000 nm, 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛, 약 1 mm 내지 약 1000 mm일 수 있다. 일부 구현예에서, 필름 두께는 약 500 nm 내지 약 750 ㎛, 약 750 nm 내지 약 500 ㎛, 약 1000 nm 내지 약 250 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 75 ㎛일 수 있다. 일부 구현예에서, 필름 두께는 약 10 nm 내지 약 1 mm 범위이다. 일부 구현예에서, 필름 두께는 약 50 ㎛일 수 있다.

일부 구현예에서, 탄성 재료는 폼(foam)이다. 폼은, 예를 들어 물이 용매이거나 질소 또는 다른 가스가 각각 발포제인 동결-건조 및 가스 발포를 포함하는 본 분야에 알려진 방법으로부터 만들어질 수 있다.

일부 구현예에서, 재료는 정밀하게-정의된 방출 프로파일이 가능한 복합 전달 기구를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 이는 약물 또는 약물 전달 기구(즉, 나노입자 또는 마이크로입자)를 본원에서 기술된 재료와 조합하고 이를 이용하여 보다 복잡한 약물 전달 시스템을 구성하는 것을 통해 달성될 수 있다. 단지 하나의 예를 들면, 본원에 기술되는 재료는 전달될 치료제(예를 들어, 작은 분자, 핵산, 단백질, 지질 및/또는 탄수화물 약물)를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 재료는 약물을 조직 재생을 위해 표적으로 하는 영역으로 전달하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 새로운 뼈를 재생하는 목적을 위해 대상에 투여되는 뼈 유도성 세포를 포함하는 재료는, 방출시 새로운 뼈의 성장을 추가로 자극하는 것을 도울 수 있는 하나 이상의 뼈 형성 단백질(BMPs)을 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 기술되는 탄성 재료는 복합 재료를 형성하기 위해 다른 재료, 예를 들어 생체적합물질(biomaterial)과 조합될 수 있다. 본원에서 사용되는 “생체적합물질(biomaterial)”이라는 용어는 일반적으로 생체 적합성이며 천연에 존재하는 재료를 말한다. 예시적인 생체적합물질은 생물고분자(biopolymer), 스펀지, 실크, 탈세포화된 조직 및 젤라틴을 포함하지만 이들만으로 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 “생물고분자(biopolymer)”라는 용어는 천연적으로 존재하는 폴리머 또는 생물학적 시스템에 적합하거나 천연적으로 존재하는 폴리머를 모방하는 합성 폴리머를 말한다. 예시적인 생물고분자는 올리고사카라이드, 글리코사미노글리칸과 같은 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 폴리케타이드, 펩토이드, 하이드로겔, 폴리(에틸렌글리콜)과 같은 폴리(글리콜), 콜라겐, 실크 및 폴리락테이트를 포함하지만 이들만으로 제한되지는 않는다.

일 구현예에서, 탄성 재료는 염과, 또는 폴리비닐 피롤리돈과 조합될 수 있다.

본 발명의 탄성 재료는 또한, 표적 조직의 복구 및/또는 재생을 보조하고/하거나 생물학적으로 활성인 화합물의 표적 전달을 달성하는 방법을 제공하기 위해, 약제학적으로-허용 가능한 부형제 및 생물학적으로 활성인 약제(예를 들어, 비타민 및 미네랄)와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 (이들이 탄성 재료가 형성되면서 그 안으로 포함되도록) 가열 전에 트로포엘라스틴 용액으로 첨가되거나, 또는 이들은 탄성 재료가 형성된 후 그 안에 위치될 수 있다. 또한, 이들 성분은 탄성 재료로부터 하이드로겔을 형성하는 데 사용되는 수용액 중에 존재할 수 있다. 당업자는 첨가되는 성분이 탄성 재료를 형성하기 위해 요구되는 조건 하에서 안정하지 않다면, 이들 성분은 탄성 재료가 이미 형성된 후에 첨가되어야 한다는 것을 이해할 것이다.

질병의 진단, 치료 또는 예방에 유익한 것으로 당업자에게 알려진 임의의 생물학적으로 활성인 약제는 본 발명과 관련하여 치료제로 고려된다. 치료제에는 호르몬, 성장 인자, 효소, DNA, 플라스미드 DNA, RNA, siRNA, 바이러스, 단백질, 지질, 전-염증성 분자, 항체, 항생제, 항-염증제, 안티-센스 뉴클레오타이드 및 형질전환 핵산 또는 이들의 조합이 포함된다. 임의의 치료제는 이러한 조합이 생물학적으로 적합한 정도까지 조합될 수 있다.

적절한 성장 인자 및 사이토카인은 줄기세포 인자(SCF), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 자극 인자(GM-CSF), 기질 세포-유래 인자-1, 스틸 인자(steel factor), VEGF, TGFβ, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 안지오포이에틴(Ang), 상피 성장 인자(EGF), bFGF, HNF, NGF, 뼈 형성 단백질(BMP), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 간세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1), 인터류킨(IL)-3, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, 및 IL-13, 콜로니-자극 인자, 트롬보포이에틴, 에리스로포이에틴, fit3-리간드 및 종양 괴사 인자 α(TNFα)를 포함하지만 이들만으로 제한되지 않는다. 다른 예는 Dijke et al. (1989); Mulder et al.(1998); Ziegler et al. (1997)에 기술되어 있다. 적절한 호르몬으로는 항뮬러리안 호르몬(또는 뮬러리안 저해 인자 또는 호르몬), 아디포넥틴, 부신피질자극 호르몬(또는 코르티코트로핀), 안지오텐시노겐 및 안지오텐신, 항이뇨 호르몬(또는 바소프레신, 알기닌 바소프로신), 심방성-나트륨이뇨 펩티드(또는 아트리오펩틴), 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀-분비 호르몬, 에리스로포이에틴, 난포-자극 호르몬, 가스트린, 그렐린(ghrelin), 글루카곤, 성선자극호르몬-분비 호르몬, 성장 호르몬-분비 호르몬, 인간 융모성 성선자극호르몬, 인간 태반성 락토겐, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자 1, 인슐린-유사 성장 인자(또는 소마토메딘), 렙틴, 황체형성 호르몬, 멜라닌세포 자극 호르몬 MSH, 오렉신(orexin), 옥시토신, 부갑상선 호르몬, 프로락틴, 렐락신(relaxin), 세크레틴(secretin), 소마토스타틴, 트롬보포이에틴, 갑상선-자극 호르몬(또는 티로트로핀) 및 티로트로핀-분비 호르몬을 포함하지만 이들만으로 제한되지 않는다.

예시적인 약제학적으로 활성인 화합물(예를 들어, 치료제)은 Harrison et al., Physicians Desk Reference, Pharmacological Basis of Therapeutics(1990), 미국 약전, Goodman and Oilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics 최신판; 및 The Merck Index 최신판에서 발견되는 것을 포함하지만 이들만으로 제한되지 않는다.

다른 구현예에서, 탄성 재료(또는 이로부터 형성된 하이드로겔)는 (아래에서 논의되는) 다분화능 또는 다능성 줄기세포의 집단, 및 호르몬, 성장 인자, 사이토킨, 형태형성물질(morphogens)(예를 들어, 레티노산 등), 세포외기질 물질(예를 들어, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 등) 또는, 일단 탄성 재료 또는 하이드로겔이 환자에게 이식되면 특정 발달 경로를 따라 세포 군집의 분화를 용이하게 하는 다른 물질(예를 들어, DNA, 바이러스, 다른 세포 타입 등)을 포함한다. 대안으로서, 또는 추가로, 세포는 탄성 재료 또는 하이드로겔과 함께 배양하는 동안 생체외 분화될 수 있다.

생리활성 약제는 링커를 통해 탄성 재료와 공유적으로 연결될 수 있다. 링커는 응용에 따라 절개 가능 링커이거나 비-절개 가능 링커일 수 있다. 본원에서 사용되는 “절개 가능 링커(cleavable linker)”는 다양한 조건 하에서 절개될 수 있는 링커를 말한다. 절개에 적절한 조건은 pH, UV 조사, 효소적 활성, 온도, 가수분해, 제거 및 치환 반응, 산화환원 반응, 및 연결의 열역학적 특성을 포함하지만 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 많은 경우에, 컨주게이션(conjugation) 또는 커플링 상호작용의 의도된 성질 또는 원하는 생물학적 효과가 링커 그룹의 선택을 결정할 것이다.

약제학적으로-허용 가능한 부형제는, 원하는 특정 제형에 적합하도록, 임의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 계면 활성제, 등장화제, 점증 또는 유화제, 보존제, 고형 결합제, 윤활제 등을 포함한다. Gennaro(2006)는 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지의 기술을 개시한다. 임의의 통상적인 부형제가 임의의 원치 않는 생물학적 효과를 생성하는 것, 또는 그렇지 않으면 하이드로겔의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용하는 것에 의한 것과 같이 물질 또는 이의 유도체와 부적합한 것을 제외하면, 이의 사용은 본 발명의 범위 내로 고려된다.

약제학적 조성물의 제조에 사용되는 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 불활성 희석제, 분산 및/또는 과립화제, 계면활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제 및/또는 오일을 포함하지만 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 이러한 부형제는 선택적으로 트로포엘라스틴-함유 용액에 포함될 수 있다. 착색제, 코팅제, 감미제, 풍미제 및 향미제와 같은 부형제는 제조자의 판단에 따라 용액 중에 존재할 수 있다. 약제학적 제제의 제조 및/또는 제형화에서의 일반적인 고려 사항은, 예를 들어 Gennaro(2006)에서 발견될 수 있다.

재료 중에 존재하는 트로포엘라스틴 및 생물학적으로 활성인 약제의 함량은 특정 약물 및 처리될 조건에 필수적으로 의존할 것이다. 당업자는 증상을 치료하는 데 사용되는 적절한 약제 및 함량을 인지할 것이다.

본 발명의 재료의 치료적으로 유효한 양은 질병, 장애 및/또는 질환의 진단 이전, 동시 및/또는 이후에 환자 및/또는 유기체로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재료의 치료적으로-유효한 양은 질병, 장애 및/또는 질환의 증상 개시 이전, 동시 및/또는 이후에 환자 및/또는 유기체로 전달된다.

본원에서 사용되는 “치료적으로-유효한 양”이라는 용어는 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생을 치료, 경감, 완화, 제거, 개시를 지연, 진행을 억제, 심한 정도를 감소 및/또는 저하시키는 데 충분한, 본 발명의 재료의 양을 말한다.

위에 언급한 바와 같이, 본 발명의 재료는 조직 공학 응용을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조직 공학은 조직 및/또는 기관 기능을 대체, 복구 및/또는 재생하는 것, 또는 이식을 위한 인공 조직 및 기관을 생성하는 것을 목표로 한다. 일반적으로, 조직 공학에 사용되는 스캐폴드(예를 들어, 하이드로겔 스캐폴드)는 천연 ECM을 모방하고 세포 부착, 이동 및 증식을 위한 지지체를 제공한다. 이상적으로, 이들은 분화된 기능, 새로운 조직 발생 및 이의 3-차원적 구성을 허용한다. 탄성 스캐폴드의 원하는 특징은 기계적 강도 및 분해가능성과 같은 물리적 변수를 포함하는 한편, 생물학적 특성에는 생체적합성 및 생물학적으로 관련된 미세환경을 제공하는 능력이 포함된다. 생분해성 재료는 조직이 성장한 후 생성된 구조가 전적으로 또는 거의 전적으로 생물학적 성분으로부터 만들어지기 때문에 유리하다.

일부 구현예에서, 약물 전달에 활용될 재료는 증진된 체류 시간, 지속적인 약물 전달 및/또는 표적화된 약물 전달을 야기하는 방식으로 변경될 수 있다. 투과성(예를 들어, 지속적-방출 응용), 환경-반응성(예를 들어, 박동형-방출 응용), 표면 기능성(예를 들어, 은폐형 방출(stealth release)을 위한 PEG 코팅), 생분해성(예를 들어, 생체흡수성 응용), 및 표면 생체인식 영역(예를 들어, 표적화된 방출 및 생체부착 응용)과 같은 재료 특성은 제어된 약물-방출 응용을 위해 변경 및/또는 최적화될 수 있다. 예를 들어, 트로포엘라스틴 사슬 길이, 트로포엘라스틴 조성물 및/또는 트로포엘라스틴 농도를 제어하는 것에 의해, 재료의 밀도를 제어하는 것이 가능하다. 밀도의 제어는, 다른 것들보다도, 생성된 재료의 지속적-방출 특성의 제어를 제공한다.

일부 구현예에서는, 생물학적 분석물에 반응성인 약물 전달 시스템을 생성하기 위해 효소가 재료 안으로 캡슐화될 수 있다.

본원에서 기술되는 탄성 재료는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가제는 분해성(생분해성) 폴리머, 만니톨, 전분 당, 이노시트, 솔비톨, 포도당, 유당, 사카로스, 염화나트륨, 염화칼슘, 아미노산, 염화마그네슘, 구연산, 아세트산, 하이드록실-부탄디오산, 인산, 글루쿠론산, 글루콘산, 폴리-솔비톨, 아세트산나트륨, 구연산나트륨, 인산나트륨, 스테아린산아연, 스테아린산알루미늄, 스테아린산마그네슘, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 수산화나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜, 카복시메틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 전분, 마이크로-입자, 나노-입자, 아프로티닌, 인자 XIII, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 이론에 구애되지 않고, 재료 중 하나 이상의 첨가제는 재료의 분해 속도를 변경(예를 들어, 감소 또는 증가)시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에서 기술되는 재료는 생체외 조직 배양 응용을 위해 활용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 기술된 재료는 약물 발견 및 생물학적 연구(예를 들어, 높은-처리율의 약물 스크리닝을 위한 명확한 재료의 조립 배열)를 위해 유용한 분석 개발에 활용될 수 있다. 예를 들어, 기능성 세포(예를 들어, 간세포)의 존재 중 배양 보조 세포(예를 들어, 내피 세포 또는 섬유아세포)의 존재는 기능성 세포 타입의 유지를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 약물 발견 및/또는 진단 분석에 이어서 사용될 수 있는 기능성 기관의 원래 구조를 모방하는 3-차원 구조의 생성이 가능하다.

당업자는 탄성 재료 내로 포함될 세포가 탄성 재료를 형성하는 데 요구되는 조건 하에서 불안정하다면, 탄성 재료가 이미 형성된 이후 이들 세포가 첨가되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 세포는 탄성 재료로부터 하이드로겔을 형성하기 위해 사용되는 수용액 중에 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에서 기술되는 재료는 시험 물질(예를 들어, 간세포가 캡슐화되는 이용 물질)의 독성을 시험할 수 있는 독성 분석을 위해 이용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에서 기술되는 재료는 미세유체 채널과 같은 다양한 구조를 만들고 코팅하는 데 사용될 수 있다. 이러한 접근에서, 미세채널의 벽은 폴리스티렌, 유리 및 PDMS와 같은 보다 통상적으로-사용되는 재료 대신에 구조물 조립체로부터 만들어질 수 있다. 구조물 조립체로부터 만들어진 미세유체 채널은 많은 목적, 예를 들어 세포를 유인하고 결합시키기 위한 미세유체 채널의 벽을 원하는 응용에서 유용할 수 있을 것이다.

일부 구현예에서, 본원에서 기술되는 재료는 진단 응용을 위해 사용될 수 있다. 단지 하나의 예시를 들자면, 세포-함유 재료는 하나 이상의 특정 미생물의 존재를 시험하는 분석에 사용될 수 있는 조직-유사 재료 및/또는 재료 조립체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 미생물(예를 들어, 세균, 바이러스, 진균 등)이 특정 조직에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있다면, 조직-유사 재료가 샘플 중 미생물의 존재를 시험하도록 제작될 수 있을 것이다.

본원에서 기술되는 재료는 패턴화될 수 있다(예를 들어, 미세패턴화된 탄성 재료). 미세패턴화된 재료는, 예를 들어, 탄성 재료의 적어도 하나의 표면에 배치되고 이와 통합되는 예정된 미세패턴의 3-차원 네가티브 구조를 적어도 이의 한 표면에 포함하는 주형의 표면에 트로포엘라스틴 용액을 접촉시키고, 이 용액을 주형의 미세패턴화된 표면과 접촉시키면서 가열하여, 이에 의해 미세패턴화된 탄성 재료를 제공하는 것을 포함하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 방식으로 제조된 탄성 재료는 재료의 적어도 하나의 표면에 예정되고 고안된 미세패턴을 포함하는데, 이 패턴은 세포 정렬, 조직 복구, 성장 또는 재생을 용이하게 하는 데 유용하거나, 단백질 또는 치료제의 전달을 제공하는 데 유용하다. 미세패턴 기하학은 적절한 패턴 또는 크기의 주형을 사용하여 제어될 수 있다. 또한, 미세패턴은 필드 방사 주사형 전자 및 원자력 현미경과 같은 공지 기술에 의해 표면 형태학으로 특징화될 수 있다.

일부 구현예에서, 미세패턴은 홈 또는 채널의 형태이다. 홈 크기(폭)는 약 500 nm 내지 약 500 ㎛ 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 홈 크기는 약 1 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 또는 약 20 ㎛ 내지 약 75 ㎛ 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 홈 크기는 약 50 ㎛ 또는 약 20 ㎛이다.

홈 사이의 간격은 또한 원하는 용도를 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 홈 사이의 간격은 약 500 nm 내지 약 500 ㎛ 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 홈 사이의 거리는 약 1 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 또는 약 20 ㎛ 내지 약 75 ㎛ 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 홈 사이의 거리는 약 50 ㎛ 또는 약 20 ㎛이다.

홈 두께 깊이는 약 250 nm 내지 약 500 ㎛ 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 홈 두께는 약 500 nm 내지 약 250 ㎛, 또는 약 750 nm 내지 약 1000 nm 범위일 수 있다.

위에 언급한 바와 같이, 본원에서 기술되는 탄성 재료는 조직 공학 및 복구에 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 “복구(repair)”라는 용어는 기능을 회복하는 임의의 수정, 강화, 재조정, 치료, 보충, 정상화, 재생, 수리, 부분 보수 등을 말한다. 따라서, “복구”라는 용어는 또한 다르게는 기능을 회복시키기 위해 수정, 강화, 재조정, 치료, 보충, 정상화, 재생, 수리 또는 부분 보수 등을 하는 것을 말한다.

본 발명의 탄성 재료로부터 형성된 하이드로겔이 조직 공학 및 복구에 마찬가지로 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 탄성 재료가 이와 관련하여 언급될 때, 적절하게는 본 재료로부터 형성된 하이드로겔이 탄성 재료 자체에 첨가하여, 또는 이의 대체물로서 활용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 하이드로겔은 주위 환경으로부터 물을 흡수하는 탄성 재료로 인해 탄성 재료를 생리적 조건에 접촉시키는 것에 의해 탄성 재료로부터 간단히 형성될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.

“치료”, “예방”, 또는 “경감”은 질병 또는 장애와 관련된 증상의 개시를 지연 또는 예방, 역전, 완화, 경감, 저해, 및 진행, 악화, 쇠퇴 또는 심한 정도의 진행을 지연 또는 저지시키는 것을 의미한다.

본 발명의 탄성 재료는 치료에 효과적인 임의의 양 및 임의의 투여 경로로 투여될 수 있다. 요구되는 정확한 양은 대상마다, 종, 연령 및 대상의 일반적인 상태, 감염의 심한 정도, 특정 하이드로겔, 이의 투여 방식, 이의 활성 방식 등에 따라 변화될 것이다.

다른 구현예에서, 본원에 기술되는 탄성 재료는 두개안면, 치아 및 치주에의 응용을 포함하지만 이로써 한정되지 않는 정골 응용을 위한 재생 의학에 사용된다. 일 구현예에서, 탄성 재료(또는 탄성 재료로부터 형성된 하이드로겔)를 포함하는 구조물 또는 기구는 구강 및 두개안면 조직의 복원 및 재생에 사용하기 위해 제공된다.

특정 구현예에서, 탄성 재료(또는 탄성 재료로부터 형성된 하이드로겔)는 하나 이상의 트로포엘라스틴, 그리고 인간 콜라겐을 포함한다. 생성된 재료 및 하이드로겔은 원하는 표면 지형, 다공성, 강도 및 탄성을 위해 조작된다. 일부 구현예에서, 탄성 재료 또는 하이드로겔은 트로포엘라스틴 이외의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하지 않는다.

일 구현예에서, 탄성 재료는 시트 형태로 주조되고 다양한 임상적 응용, 예를 들어 안내된 조직 재생(guided tissue regeneration, GTR) 또는 치근 피개 공정(root coverage procedures)에서 재생성 멤브레인으로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 탄성 재료는 시트로 주조되고 치주 인대 세포(periodontal ligament cells, PDL)로 시딩되어 치근 피개 공정에 사용하기에 적절한 임플란트 또는 이식물을 형성한다. 일단 임플란트가 형성되면, 외과의가 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 치근 피개 공정에서 임플란트를 이식한다.

다른 구현예에서, 탄성 재료는 뼈 충전 재료로서 사용하기 위한 3-차원 형상으로 주조된다. 예열된 용액이 형상가공 가능한 형태이기 때문에 사실상 어떠한 형상이라도 달성될 수 있다. 일단 주형 또는 원하는 표면에 놓여지면, 용액은 가열에 의해 “경화”될 수 있다. 또한, 재료는 안내된 뼈 재생(guided bone regeneration, GBR) 공정을 위한 치주용 의약품에서 독특한 임상적 응용을 보조할 수 있고, 뼈 이식물을 함유하기 위한 멤브레인 및 뼈 충전물의 필요성을 제거할 수 있다.

특정 구현예에서, 탄성 재료(또는 재료로부터 형성된 하이드로겔), 또는 탄성 재료나 재료로부터 형성된 하이드로겔을 포함하는 임플란트는 원하는 형상으로 주조되고, 하나 이상의 세포 집단을 포함한다.

일반적으로, 본 발명에 따라 사용되는 세포는 임의 타입의 세포이다. 세포는 본 발명의 탄성 재료(또는 탄성 재료로부터 형성된 하이드로겔) 내에 포함되었을 때 생존 가능해야 한다. 일부 구현예에서, 적절한 세포는 포유류 세포(예를 들어, 인간 세포, 영장류 세포, 포유류 세포, 설치류 세포 등), 조류 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 세균 세포 및 하이브리드 세포를 포함하지만, 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 예시적인 세포로는 줄기 세포, 분화전능성 세포, 다분화능 세포 및/또는 배아 줄기 세포가 포함된다. 어떤 구현예에서, 예시적인 세포로는 영장류 세포 및/또는 임의 조직으로부터의 세포주를 포함하지만, 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 심근세포, 근세포, 간세포, 각질세포, 멜라닌세포, 신경세포, 성상세포, 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 세포(예를 들어, 단핵구, 호중구, 대식세포 등), 법랑모세포, 섬유아세포, 연골세포, 골아세포, 파골세포, 신경세포, 정자 세포, 난 세포, 간 세포, 폐로부터의 상피 세포, 소화관으로부터의 상피 세포, 장, 간으로부터의 상피 세포, 피부 등으로부터의 상피 세포 및/또는 이들의 하이브리드가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

예시적인 포유류 세포로는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 헬라(HeLa) 세포, Madin-Darby 개의 신장(MDCK) 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK 세포), NS0 세포, MCF-7 세포, MDA-MB-438 세포, U87 세포, A172 세포, HL60 세포, A549 세포, SP10 세포, DOX 세포, DG44 세포, HEK 293 세포, SHSY5Y, 주르카트(Jurkat) 세포, BCP-1 세포, COS 세포, 베로(Vero) 세포, GH3 세포, 9L 세포, 3T3 세포, MC3T3 세포, C3H-10T1/2 세포, NIH-3T3 세포 및 C6/36 세포를 포함하지만, 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

어떤 구현예에서, 하나 이상의 세포 집단은 조직 또는 뼈 재생을 용이하게 하기 위하여 골수 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 또는 전-조골세포를 포함한다. 추가적으로, 재료/하이드로겔/임플란트의 골형성 가능성은 단독 요법으로서, 또는 최근 이용 가능한 상업적 뼈 충전재 상품 또는 1차적 자가 유래의 뼈 수확물과 조합하여 사용할 수 있다. 당업자는 앞서의 기술을 사용하여 임의 타입의 뼈가 복구, 대체 또는 재생될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

일부 구현예에서, 세포가 탄성 재료(또는 이로부터 형성되는 하이드로겔)에 함유되는 조건은 세포 생존율을 최대화하기 위하여 변경된다, 일부 구현예에서, 주위 환경의 조건(예를 들어 pH, 이온 강도, 영양소 이용도, 온도, 산소 이용도, 삼투압 등)은 세포 생존율을 최대화하기 위하여 조절 및/또는 변경될 필요가 있을 수 있다.

세포 생존율은 세포 생존율의 많은 지표 중 하나를 모니터링하는 것에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 생존율의 지표는 세포내 에스테라제 활성, 혈장 멤브레인 통합성, 대사 활성, 유전자 발현 및 단백질 발현을 포함하지만, 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 단지 하나의 예를 들면, 세포가 형광원 에스테라제 기질(예를 들어 칼세인 AM)에 노출될 때, 살아있는 세포는 에스테라제 기질을 녹색 형광 산물로 가수분해하는 세포내 에스테라제 활성의 결과로서 녹색 형광을 낸다. 다른 예를 들면, 세포가 형광 핵산 염료(예를 들어, 에디티움 호모다이머-1)에 노출될 때, 죽은 세포는 이들의 혈장 멤브레인이 손상되고, 이에 따라 고-친화성 핵산 염료에 투과성이 되기 때문에 적색 형광을 낸다.

일반적으로, 재료(또는 이로부터 형성된 하이드로겔) 중 세포의 백분율은 본 발명에 따른 탄성 재료 및/또는 하이드로겔의 형성을 허용하는 백분율이다. 일부 구현예에서, 적절한 세포의 백분율은 약 0.1% w/w 내지 약 80% w/w 사이, 약 1.0% w/w 내지 약 50% w/w 사이, 약 1.0% w/w 내지 약 40% w/w 사이, 약 1.0% w/w 내지 약 30% w/w 사이, 약 1.0% w/w 내지 약 20% w/w 사이, 약 1.0% w/w 내지 약 10% w/w 사이, 약 5.0% w/w 내지 약 20% w/w 사이, 또는 약 5.0% w/w 내지 약 10% w/w 사이의 범위에 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 탄성 재료를 형성하기에 적절한 용액 중 세포의 백분율은 대략 5% w/w이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 하이드로겔을 형성하기에 적절한 수용액 중 세포의 농도는 약 1 x 10⁵세포/mL 내지 1 x 10⁸세포/mL 사이 또는 약 1 x 10⁶세포/mL 내지 1 x 10⁷세포/mL 사이의 범위에 있다. 일부 구현예에서, 단일 탄성 재료 또는 이로부터 형성된 하이드로겔은 동일한 세포 및/또는 세포 타입의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 탄성 재료 또는 이로부터 형성된 하이드로겔은 동일하지 않은 세포 및/또는 세포 타입의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 탄성 재료 또는 이로부터 형성된 하이드로겔은 적어도 2 개의 다른 타입의 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 탄성 재료 또는 이로부터 형성된 하이드로겔은 3, 4, 5, 10 또는 이보다 많은 타입의 세포를 포함할 수 있다.

복합 배지 및/또는 무혈청 배양 배지를 포함하는, 하나 이상의 세포 타입 또는 세포주의 성장을 보조할 수 있는 임의의 다양한 세포 배양 배지가 세포를 성장 및/또는 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 통상적으로, 세포 배양 배지는 완충액, 염, 에너지원, 아미노산(예를 들어, 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 등), 비타민 및/또는 미량원소를 함유할 수 있다. 세포 배양 배지는 탄소원(예를 들어, 천연 당, 비-천연 당 등), 보조인자(cofactor), 지질, 당, 뉴클레오사이드, 동물-유래의 성분, 가수분해물, 호르몬, 성장 인자, 계면활성제, 지시약, 미네랄, 특정 효소의 활성화제, 특정 효소의 활성 저해제, 효소, 유기물 및/또는 작은 분자 대사물을 포함하지만, 이들만으로 제한되지 않은 임의의 다양한 다른 성분을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기에 적절한 세포 배양 배지는 다양한 제조원, 예를 들어 ATCC(Manassas, Va.)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 어떤 구현예에서, 다음 배지의 하나 이상이 세포를 성장시키기 위해 사용된다: RPMI-1640 배지, 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle), F-12K 배지, 이스코브 수정 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium).

위에 논의된 바와 같이, 본 발명의 하나의 중요한 장점은 자체로서 독특한 특성을 갖는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 이보다 많은 개개의 트로포엘라스틴 동형(isoform)을 조합하는 것에 의해 생성되는, 독특한 특성, 예를 들어 인장 강도, 탄성 및 신축성/강성이 있는 재료(및 상응하는 하이드로겔)의 개발이다. 이러한 독특한 재료(및 상응하는 하이드로겔)는 이들의 독특한 특성이 가장 유리한 신체의 위치에서 사용되도록 맞추어질 수 있다. 예를 들어, 가장 강한 섬유는 근육을 복구하기 위해 사용될 수 있고, 가장 탄성인 섬유는 방광 및 다른 신축성 있는 기관(예를 들어, 혈관 및 심장 조직)을 구성하기 위해 사용될 수 있고, 그리고 가장 뻣뻣한 섬유는 연골 복구에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 생물학적 조직을 복구 및/또는 회복시키는 방법과 관련되는데, 이 방법은 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 탄성 재료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한, 생물학적 조직을 복구 및/또는 회복시키기 위한, 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 탄성 재료의 용도와 관련된다.

일 구현예에서, 본 발명은 생물학적 조직을 복구 및/또는 회복시키는 방법에서 사용시, 본 발명의 탄성 재료를 제공한다.

본 발명은 또한 생물학적 조직의 복구 및/또는 회복을 위한, 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 탄성 재료의 용도와 관련된다. 본 발명은 또한 생물학적 조직의 복구 및/또는 회복을 위한 약제의 제조를 위한 본 재료의 용도를 포함한다.

위에 언급한 바와 같이, 이들 구현예에서, 그것이 다음에 하이드로겔을 형성하도록 적절히 처리된다면(예를 들어, 물에 노출시킴으로써), 탄성 재료의 대안으로서 본 발명의 탄성 재료로부터 형성된 하이드로겔이 사용될 수 있다는 것이 인정될 것이다.

본 발명은 또한

- 조직 손상을 갖는 대상을 확인하고; 그리고

- 본 발명의 탄성 재료의 치료적으로 유효한 양을 이 대상에게 투여,

- 본 발명의 탄성 재료로부터 형성된 하이드로겔의 치료적으로 유효한 양을 이 대상에게 투여, 또는

- 치료적으로 유효한 양의 하이드로겔을 형성시키기 위한 본 발명의 탄성 재료의 치료적으로 유효한 양을 이 대상에게 투여하고, 이어서 하이드로겔을 형성하도록 본 발명의 탄성 재료를 처리하는 단계를 포함하는, 생물학적 조직을 복구 및/또는 회복시키는 방법과 관련된다.

본 발명은 또한

- 본 발명의 탄성 재료의 치료적으로 유효한 양,

- 본 발명의 탄성 재료로부터 형성된 하이드로겔의 치료적으로 유효한 양,또는

- 이어서 하이드로겔을 형성하도록 탄성 재료를 처리함으로써, 치료적으로 유효한 양의 하이드로겔을 형성시키기 위한 본 발명의 탄성 재료의 양을, 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 생물학적 조직을 복구 및/또는 회복시키는 방법과 관련된다.

본 발명의 탄성 재료, 및 이로부터 형성된 하이드로겔은 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 통상적으로 단위 제형으로 제형화된다. 그러나, 본 발명의 재료 및/또는 하이드로겔의 총 1일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 담당 의사에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다.

임의의 특정 대상 또는 유기체를 위한 특정의 치료적으로 유효한 용량 수준은 치료될 장애 및 장애의 심한 정도; 채용되는 특정 활성 성분의 활성; 채용되는 특정 폴리머 및/또는 세포; 대상의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이; 채용되는 특정 활성 성분의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도; 치료 기간; 채용되는 특정 활성 성분과 조합하거나 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사한 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다.

본 발명의 재료(및 이로부터 형성되는 하이드로겔)는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재료는 병소로의 직접 투여를 포함하는 다양한 경로에 의해 투여된다. 예를 들어, 본 재료(및/또는 이로부터 형성되는 하이드로겔)는 조직 재생이 필요한 부위 근처에 국소적으로 투여될 수 있다.

어떤 구현예에서, 본 발명의 탄성 재료(및/또는 이로부터 형성되는 하이드로겔)는 원하는 치료적 효과를 얻기 위해, 포함되는 세포 및/또는 전달되는 치료제가 1일 당 대상 체중에 대하여 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg 범위의 농도로 방출되도록, 1일 1회 또는 이보다 많은 회수로 투여될 수 있다. 원하는 투여량은, 예를 들어 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일에 1회, 3일에 1회, 1주 1회, 2주 1회, 3주 1회, 또는 4주 1회 전달될 수 있다. 어떤 구현예에서, 원하는 투여량은 다중 투여(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 이보다 많은 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.

일부 구현예에서 본 발명은, 본 발명의 탄성 재료(및/또는 이로부터 형성되는 하이드로겔)를 포함하는 “치료 칵테일(therapeutic cocktails)”을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 재료는 단일 세포 타입 및, 선택적으로 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 재료는 복수의 다른 세포 타입 및, 선택적으로 치료제를 포함한다.

본 발명에 따라 세포-적재된 탄성 재료(및 이로부터 형성되는 하이드로겔)가 복합 치료법에 채용될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 복합 요법에 채용되기 위한 치료법(치료제 또는 방법)의 특정 조합은 원하는 치료제 및/또는 방법의 공존 가능성, 그리고 달성되기를 원하는 치료 효과를 고려할 것이다. 채용되는 치료법은 동일한 목적을 위해 원하는 효과를 달성할 수 있거나(예를 들어, 조직 성장을 촉진하기 위해 사용되는 어떤 세포 타입을 포함하는 하이드로겔은 동일 조직의 성장을 자극하기 위해 사용되는 다른 치료제와 동시에 투여될 수 있음), 또는 다른 효과(예를 들어, 염증, 감염 등과 같은 임의의 부작용의 제어)를 달성할 수 있음이 인정될 것이다.

본 발명은 하나 이상의 본 발명의 재료를 포함하는 다양한 키트를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 탄성 재료 및 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 복수의 다른 탄성 재료를 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 트로포엘라스틴 모노머, 트로포엘라스틴 모노머의 농축된 용액, 관련된 트로포엘라스틴 모노머, 생물학적으로-활성인 화합물 등을 포함할 수 있다. 키트는 임의의 많은 추가의 성분 또는 시약을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 이러한 다양한 조합 모두가 명확하게 개시되지는 않지만, 각각의 조합은 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에 따라 제공되는 몇 가지 예시적인 키트는 다음 문단에서 기술된다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 키트는 예를 들어 (i) 트로포엘라스틴 모노머의 용액; (ii) 주형; 및 (iii) 용액으로부터 탄성 재료를 형성 및 가열하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.

키트는 또한, 예를 들어 (i) 트로포엘라스틴 모노머의 농축물; (ii) 주형; 및 (iii) 농축물로부터 탄성 재료를 형성하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.

키트는 추가로, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하는, 상업적 및 사용자 입장에서 원하는 다른 재료를 포함할 수 있다.

키트는 통상적으로 본 발명의 재료의 사용을 위한 설명서를 포함한다. 설명서는, 예를 들어 계획서를 포함하고/하거나 탄성 재료의 생산을 위한 조건, 필요로 하는 대상으로의 재료의 투여, 재료 조립품의 생산 등을 기술할 수 있다. 키트는 일반적으로 일부 또는 모든 개별 성분 및 시약이 분리 수용될 수 있도록 하나 이상의 통 또는 용기를 포함할 것이다. 키트는 또한 상업적 판매를 위해 개별 용기가 비교적 근접하여 고정되도록 둘러싸기 위한 수단, 예를 들어 플라스틱 박스를 포함하며, 그 안에 설명서, 스티로폼 등과 같은 포장 재료가 동봉될 수 있다.

키트 또는 “제조품(article of manufacture)”은 용기 및 용기 위에, 또는 용기와 관련하여 라벨 또는 포장 부속물을 포함할 수 있다. 적절한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 블리스터 팩 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 라벨 또는 포장 부속물은 구조물 또는 조성물이 선택된 증상의 치료를 위해 사용되는 것을 표시한다. 일 구현예에서, 라벨 또는 포장 부속물은 사용 설명서를 포함하고, 치료용 조성물이 조직 복구 또는 재생을 위해 사용될 수 있다는 것을 표시한다.

실시예

실시예 1 - 트로포엘라스틴을 위한 용매로서 물의 사용

100 mg 트로포엘라스틴을 333 μL의 물에 4 ℃에서 용해시켰다. 1 mL 31 게이지 시린지를 사용하여 트로포엘라스틴 용액 1 방울을 유리 슬라이드에 떨어뜨렸다. 160 ℃에 1 분 동안 방치하였다. 추가로 트로포엘라스틴 1 방울을 적가하고; 추가로 1 방울을 적가하기 전에 1 분 동안 방치하였다. 대략 10 회 반복하였다. 160 ℃에서 4 시간 동안 방치하였다. 재료가 유리질의 암갈색으로 변화하였다(A). PBS 중에 놓고 - 천천히 습윤, 용해되지 않고 상당히 탄성으로 되었다(B).

실시예 2 - 트로포엘라스틴을 위한 용매로서 HFP의 사용

100 mg 트로포엘라스틴을 500 μL의 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFP)에 실온에서 밤새 용해시켰다. 1 mL 31 게이지 시린지를 사용하여 트로포엘라스틴 용액의 방울들을, 70 ℃에 맞춘 가열 블록 상단에 놓인 유리 슬라이드에 떨어뜨렸다. 160 ℃에 4 시간 동안 방치하였다. 재료가 오븐에서 거품을 보이고 유리질의 암갈색으로 변화하였다(A). PBS 중에 놓고 - 천천히 습윤, 연질 탄성으로 되고 재료 안에 가스 거품이 포집된 것으로 보였다(B).

실시예 3 - 트로포엘라스틴을 위한 용매로서 70% EtOH의 사용

100 mg 트로포엘라스틴을 650 μL의 70% EtOH에 용해시켰다(154 mg/mL). 1 mL 31 게이지 시린지를 사용하여 트로포엘라스틴 용액의 방울들을, 85 ℃에 맞춘 가열 블록 상단에 놓인 유리 슬라이드에 떨어뜨렸다. 각각의 방울 적가 사이에 약 1 분 기다림으로써 방울 위에 방울의 3D 구조가 형성될 수 있었다. 160 ℃ 오븐에서 4 시간 동안 방치하였다. 재료가 오븐에서 거품을 보이고 유리질의 암갈색으로 변화하였다.

실시예 4 - 무생물체 코팅

HFP 중의 20% w/v 트로포엘라스틴을 사용하여, 용액으로 반복적 침지시킴으로써 타이곤(Tygon) 관의 조각을 코팅하였다. 코팅된 관을 160 ℃에서 4 시간 동안 방치하였다. 트로포엘라스틴 용액은 경질의 유리 같이 되고 관으로부터 제거될 수 없었다. PBS로 습윤시켰다. 재료는 연질의 탄성으로 되어, 관으로부터 벗겨낼 수 있었고 용해되지 않았다.

실시예 5 - 전기방사

HFP 중의 20% (w/v) 트로포엘라스틴을 1 mL/h, 시린지 팁으로부터 수집기로 약 17 cm, 20 kV(+)/접지, 0.1 mL 용액, 수집기-정렬된 와이어는 2 cm 떨어져 4 cm 길이로 전기방사하였다. 160 ℃에서 24 시간 동안 방치하였다. PBS로 습윤시키면 용해되지 않고 겔-유사하게 되어 형태를 유지하였다. SEM으로 검사하였다.

실시예 6 - 열-처리된 전기방사 트로포엘라스틴에서 인간 피부 섬유아세포의 생체외 성장

HFP 중의 20% (w/v) 트로포엘라스틴을 위에 기술한 것과 같이 전기방사하였다. 인간 신생아 피부 섬유아세포(NHF8909; 5 x 10⁵세포/웰)를 플라스틱 커버슬립에 고정된 열-처리된 전기방사 정렬된 섬유에 6 웰 플레이트 이내로 접종하였다. DMEM + 10% FBS + Pen/Strep에서 5% CO₂중 37 ℃로 48 시간 배양한 다음 샘플을 SEM 분석을 위해 준비하였다. 샘플을 0.1 M 카코딜산염 나트륨/0.1 M 슈크로스 중의 2% 글루타르알데히드로 고정하고, 1% 오스뮴으로 후-고정하여, 증가되는 농도의 고정된 에탄올 및 코팅된 금에서 탈수시켰다. 열-처리된 전기방사 트로포엘라스틴은 세포 부착, 전파 및 증식을 보조하였다.

실시예 7 - 마우스에 열-처리된 전기방사 트로포엘라스틴의 피하 이식

HFP 중의 20% 트로포엘라스틴을 사용하여 비-정렬 전기방사 트로포엘라스틴 구조물을 제조하였다. 샘플을 1 mL/hr 속도로, 17 cm 거리의 둥근 수집기(비-정렬)로 20 kV에서 방사하였다. 구조물 당 0.2 mL 용액을 사용하였다. 160 ℃에서 22 시간 동안 방치하였다.

각각의 마우스에 하나의 열-처리된 비-정렬 전기방사 트로포엘라스틴 구조물 및 하나의 Integra 대조물을 이식하였다. 1 주, 3 주 및 6 주에 각 시점마다 2 마리의 마우스. 피하 이식은 각각의 마우스 등에 만들어 피하 파우치를 생성하도록 절개한 2 개의 10 mm 절개로 수행하였다. 전기방사 스캐폴드 또는 외부 실리콘 층이 없는 Integra 스캐폴드(Integra LifeSciences Corporation)를 각각의 파우치에 삽입하였다. 다음에 이 상처를 6-0 실크 봉합사로 봉합하고 IV3000 상처 드레싱(Smith & Nephew)으로 5 일 동안 덮어두었다. 카프로펜(5 mg/kg)을 마취 시와 다음 날 수술 후 진통을 위해 투여하였다. 수술 후, 처음 2일은 각각의 마우스를 개별 케이지에 넣고 이후에는 케이지 당 2 마리의 마우스를 넣어 물과 음식을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 조직학적 분석을 위해 이식 후 1, 3 및 6 주에 피부 생검을 수집하였다. 외식된 스캐폴드 및 주위 피부를 Verhoeff-Van Gieson(VVG)으로 염색하여, 임플란트의 탄성 특성을 입증하였다.

열-처리된 전기방사 트로포엘라스틴은 이식후 최소 6 주 동안 마우스에서 지속되었다.

실시예 8 - 열-처리된 물-기반의 트로포엘라스틴 필름

100 mg 트로포엘라스틴을 1 mL 물에 4 ℃에서 용해시켰다. 용액을 피펫으로 8-웰 유리 챔버 슬라이드의 웰로 옮겼다. 용액을 농축하고 37 ℃에 16 시간 동안 방치하여 건조시켰다. 샘플을 160 ℃에서 4 시간 동안 추가로 가열하였다. 37 ℃에서 가열한 후 스캐폴드는 반투명하고 밝은 갈색으로 되었다. 이어지는 160 ℃ 가열에도 샘플은 여전히 반투명했지만 색상이 어두워졌다.

실시예 9 - 마이크로패턴화된 열-처리된 물-기반의 트로포엘라스틴 필름

70 mg 트로포엘라스틴을 1 mL 물에 4 ℃에서 용해시켰다. 용액을 피펫으로 3.5 μm 폭 및 500 nm 깊이의 융기(ridge)를 갖는 PDMS(폴리디메틸실록산) 주형에 옮겼다. 용액을 농축하고 37 ℃에 16 시간 동안 방치하여 건조시켰다. 샘플을 160 ℃에서 4 시간 동안 추가로 가열하였다. 20x 및 40x 대물렌즈를 갖는 광학 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다.

참고문헌

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Claims

- 트로포엘라스틴 모노머를 제공하는 단계;
- 상기 트로포엘라스틴 모노머를 표면에 도포하는 단계;
- 상기 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여, 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 60 내지 200 °C 의 온도까지 상기 트로포엘라스틴 모노머를 상기 표면 위에서 가열함으로써, 탄성 재료를 형성하는 단계를 포함하는, 탄성 재료를 형성하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여, 생리적 조건에 노출될 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 60 내지 200 °C 의 온도까지 상기 트로포엘라스틴 모노머가 가열되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여, 6.5 내지 8.0의 pH를 갖는 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 상기 트로포엘라스틴 모노머가 가열되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여, 30 내지 45℃의 온도를 갖는 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 상기 트로포엘라스틴 모노머가 가열되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여, 75 mM 내지 300 mM의 염 농도를 갖는 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하기에 충분한 온도까지 상기 트로포엘라스틴 모노머가 가열되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 모노머가 용액으로 제공되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 표면이 상기 트로포엘라스틴 모노머의 가열을 위해 가열되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 탄성 재료가 가열 단계의 종료시 재료의 0 보다 높고 50%(w/w)까지의 용매 함량을 갖는 방법.
제6항에 있어서, 트로포엘라스틴 모노머 용액이
- 트로포엘라스틴 모노머의 용액을 제공하는 단계;
- 상기 용액에서 트로포엘라스틴 모노머의 농도를 증가시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 형성되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 모노머의 농도가 상기 용액으로부터 용매를 증발시키는 것에 의해 증가되는 방법.
제10항에 있어서, 상기 용액이 상기 표면에 도포될 때 상기 용액으로부터 상기 용매가 증발되는 방법.
제11항에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 모노머가 상호 결합하여, 수용액과 접촉할 때 트로포엘라스틴 모노머로 분리하지 않는 탄성 재료를 형성할 수 있도록 하는 온도까지 상기 용액이 상기 표면 위에서 가열됨에 따라, 상기 트로포엘라스틴 모노머의 농축이 가능하도록 상기 용매가 증발되는 방법.
제9항에 있어서, 용매로부터 트로포엘라스틴 모노머를 분리시키는 것에 의해 상기 트로포엘라스틴 모노머의 농도가 증가되는 방법.
제13항에 있어서, 상기 트로포엘라스틴 모노머의 전기방사에 의해 상기 용매로부터 상기 트로포엘라스틴 모노머가 분리되는 방법.
제6항에 있어서, 상기 용액이 상기 표면에 도포될 때 상기 용액이 1 내지 40%(w/v)의 트로포엘라스틴 모노머의 농도를 갖는 방법.
제6항에 있어서, 상기 용액이 코아세르베이트된 트로포엘라스틴 모노머를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 모노머가 트로포엘라스틴의 친수성 및 소수성 영역을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 모노머가 적어도 50 개의 연속 아미노산에 걸쳐 인간 트로포엘라스틴의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성이 있는 서열을 갖는 방법.
제1항에 있어서, 상기 모노머가 인간 트로포엘라스틴 동형의 서열을 갖는 재조합 트로포엘라스틴 모노머인 방법.
제6항에 있어서, 상기 용액을 상기 표면에 분무하는 것에 의해 상기 용액이 상기 표면에 도포되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 표면이, 상기 방법에 의해 형성되는 상기 탄성 재료가 예정된 형태로 성형되도록 하는 다이, 주형 또는 거푸집의 형태로 제공되는 방법.
제6항에 있어서, 상기 용액이 수용액인 방법.
- 제1항의 방법에 따라 탄성 재료를 형성하는 단계;
- 상기 탄성 재료를 수용액에 접촉시키는 단계를 포함하는, 탄성 하이드로겔을 형성하는 방법.