KR102230271B1

KR102230271B1 - 지방감소를 위한 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)를 유효성분으로 포함하는 주사용 제제 및 조성물

Info

Publication number: KR102230271B1
Application number: KR1020190144791A
Authority: KR
Inventors: 이환석; 김경수
Original assignee: 이환석; 이정환
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-03-19

Abstract

본 발명은 지방감소를 부작용이 개선된 위한 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)를 포함하는 주사용 제제 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 글라이코데옥시콜릭산은 지방용해 또는 지방분해능 효과가 우수하며, 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포, 혈관 내피세포 및 피부세포 괴사 또는 염증 반응 없이, 부작용과 안전성이 개선되어, 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하는 방법 등에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

지방감소를 위한 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)를 유효성분으로 포함하는 주사용 제제 및 조성물 {Injectable formulation and composition for reducing of fat comprising Glycodeoxycholic acid}

본 발명은 비수술적 방법으로서, 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)을 포함하는 제제 또는 국소지방 감소용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 글라이코데옥시콜릭산은 지방용해 또는 지방분해능 효과가 우수하며, 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포, 혈관 내피세포 및 피부세포 괴사, 과민반응, 염증 및 암세포 증가 없이, 안전하게 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하는 방법 등에 유용하게 활용할 수 있다.

국소적으로 침착된 지방은 많은 사람들에게 특별한 관심사이다. 이를 극복하기 위해 지방흡입술 (liposuction), 지방성형술 (lipoplastic), 지방조각 흡입 절제술 (liposculpture suction lipectomy)과 같은 수술적 미용성형방법을 이용하여 많은 양의 지방을 제거하는 방법이 있다. 수술적인 지방 제거 방법은 과도한 출혈, 내부 장기 손상, 세균 감염, 흉터, 멍, 종창, 통증과 같은 위험성이 초래된다. 이에 대한 대안으로 비수술적 미용성형 방법으로서 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PPC) 및 데옥시콜레이트 (deoxycholate, DCA) 기반의 약물을 주사하는 시술로 주사 지방용해술 (injection lipolysis)이 있다. 포스파티딜콜린과 담즙산 염을 함유하는 이 제제는 본래 혈액 질환을 치료하기 위한 정맥주사로 지방간에 의해서 유도되는 간 기능상실, 심근혀혈, 뇌혈관 질환 등을 치료하는데 사용되었다. 이후 비만 치료를 위한 지방용해를 위해 도입되어 오프라벨 (off-label)로 사용하던 중 2015년 허가용도 외 사용오남용으로 식약처로부터 허가가 취소된 상황이다.

최근에는 미국에 위치한 사기업인 Kythera Biopharmaceuticals로부터 데옥시콜레이트를 사용한 지방용해 주사가 개발되었다. 데옥시콜레이트는 계면활성 성분으로 데옥시콜레이트를 투여하게 되면, 주사 부위로부터 주변 조직이 파괴되는 현상이 초래되어 지방 세포를 파괴 할 수 있다. 이와 관련하여, 지방세포 뿐만 아니라, 섬유아세포, 골격근세포, 혈관내피세포, 피부세포까지 괴사를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 데옥시콜레이트를 사용한 지방 제거는 염증, 두드러기와 같은 알레르기 염증, 통증, 화상 감작, 저림, 멍, 부종, 부기, 색소 침착 및 경화를 포함하는 유해 사례가 보고되어 있으며 데옥시콜레이트 노출 이후에 발암성, 유방 또는 대장암의 위험성이 증가한다는 점도 보고 되었다. 또한 피하주사시 염증과 부종을 야기하며, 괴사, 궤양이 보고되었다.

이에 따라 본 발명자는 데옥시콜레이트를 사용한 주사제의 부작용을 개선하기 위한 지방용해 또는 지방분해 관련 제제를 개발하고자 노력한 결과, 글라이코데옥시콜릭산의 안전성과 지방감소 관련 효능을 발견하게 되었다. 데옥시콜레이트의 통증, 염증 및 부종과 같은 부작용은 데옥시콜레이트 주사제의 높은 pH에서 기인한다. 데옥시콜레이트는 pH 8이하에서 불안정하기 때문에 주사제의 pH를 8.2이상으로 조절하여 인체의 pH보다 높게 설정되어 있다. 글라이코데옥시콜릭산은 (glycodeoxycholic acid, GDCA) 데옥시콜레이트와 같은 담즙산 성분으로서 지방을 분해 할 수 있는 계면활성능이 있는 성분이다. 데옥시콜레이트에 글라이신이 접합되어 있는 구조로서, pH 8 이하의 수용액에서도 안정적으로 존재할 수 있어 상기 부작용을 극복 할 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 본 발명은 비수술적 방법으로서, 부작용이 개선된, 안전한 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 제제 또는 국소지방 감소용 조성물을 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양상으로서, 0.1 내지 2% 미만인 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)를 포함하는 국소 지방 제거 또는 감소용 제제를 제공한다.

상기 제제는 비수술적 방법으로, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 부형제 및 담체 둘 다 포함 할 수 있다.

또한 상기 제제는 6.5 내지 8.0의 PH를 갖는 것과 주사가능한 제제인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 제제는 지방세포에 특이적으로 사멸 (apoptosis)과 분해 (lipolysis)을 일으키는 것을 특징이다.

본 발명에 따른 상기 제제는 항염증제, 진통제, 분산제, 스테로이드, 마취제, 근육이완제 및 투과 증강제로 이루어진 군으로부터 하나의 추가적인 활성 성분이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 “ 비수술적” 이란 절개를 요구하지 않는 의료 과정을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 0.1 내지 2% 미만인 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)을 포함하는 이상 지질 제거 또는 감소용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 부형제 및 담체 둘 다 포함할 수 있다. 또한 상기 조성물은 대상에서 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하기 위한 조성물이며, 주사제 조성물인 것과, 지방세포에 특이적으로 사멸 (apoptosis)과 분해 (lipolysis)을 일으키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 용어“조성물”은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.

상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명은 국소화된 지방 침적을 제거하기 위하여, 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 제제 또는 조성물은 국소적 부위에 적용할 수 있고, 그 부위가 이에 한정되지 않지 않지만, 바람직하게는 복부, 턱밑, 허벅지, 허리, 엉덩이, 팔 밑, 종아리, 넓적다리, 발목 눈 밑 등에 침작된 지방, 지방종 부위 등과 목주름 개선에 적용할 수 있다. 또한 상기 제제 또는 조성물은 지방조직 과증식 또는 과축적 장애에 적용될 수 있다. 상기 장애는 당 업계에 병리적으로 지방조직이 과증식 또는 과축적 되는 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예들 들어 비만 (복부 비만 등) 축적은 하안검 지방 헤르니아 (lower eyelid fat herniation), 지방종 (lipomas), 마델릉 목, 더컴병, 지방이상증 (lipodystrophy), 및 셀룰라이트 관련성 지방 축적 (fat deposits associated with cellulite), 하부 눈꺼풀 탈출, 지방이영양증 등과 관련된 지장 축적과 관련된 장애 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 양상에서, 정의된 약제학적 조성물로서, 0.1 내지 2% 미만인 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 부형제 및 담체 외에, 지방 사멸을 야기 하는 분자와 조합될 수 있다.

본 발명의 다른 양상에서, 0.1 내지 2% 미만인 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 부형제 및 담체의 치료학적으로 유효한 양 및 약제학적, 수의학적, 또는 미용적 부형제를 포함하는, 피하 주사를 위한 용액 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상에 따르면 상기 조성물을 지방조직 또는 지방세포에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 조성물은 다양한 임상적 상황들에 적용될 수 있다. 본 발명은 제제를 표적 부위에 국소적으로 투여함으로써 포유류에서 피하 지방 축적을 감소시키기 위한 약리학적으로 활성인 0.1 내지 2% 미만인 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)에 관한 것이다. 상기 조성물에 대한 다른 사용은 지방종, 지방의 용해, 메조테라피 (mesotherapy), 조직 분리, 종양 감소, 암 감소, 암 치료, 및 신체의 부분 또는 영역으로부터 왁스, 지방, 단백질, 또는 탄수화물을, 이완, 제거, 또는 신체 소비 또는 용해를 돕는데 사용하는 것을 원할 수 있는 임의의 다른 임상적 상황이 포함된다. 예를 들어, 지방종의 치료에 있어서, 상기 조성물은 지방종과 접촉되어 피하로 주사되어 지방종을 용해시킬 수 있다. 지방종에 대한 다른 적당한 적용 방법 또한 사용될 수 있다.

상기와 같이, 본 발명의 조성물은 육아종 (granulomas), 흉터, 종양, 여드름 낭포 (acne cysts), 피지 낭포 (sebaceous cysts), 피지 과형성 (sebaceous hyperplasia), 피지의 질환, 여드름 관련 피부병, 피하 지방의 질환, 종양, 문신 제거, 감염 및 바이오필름, 셀룰라이트, 지방 침적, 지방 조직, 및 관련된 상태들의 치료에 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 윤곽 결함 (예를 들어, 피부 필러로 과다 교정한 후, 또는 주사에 대한 신체의 과다반응 후 유방 비대칭 또는 입술 비대칭)을 펴는데 (even out) 사용될 수도 있다. 상기 과정은 살아있는 조직 중에서, 신체로부터 분리된 조직에서, 또는 병리적 또는 결함 검사의 보조를 위해서 수행될 수 있다. 상기 과정은 조직, 혈청, 또는 임의의 다른 신체 부분에 대하여 수행될 수 있다. 인간 의료에 더해서, 상기 조성물은 동물 의료에도 또한 적용가능하다.

본 발명에서 “부작용 (Side effect)”은 정상적인 용량에 따라 약물을 투여한 후 발생하는 모든 의도되지 않은 효과를 말하며, 발암성, 암세포 증가, 염증반응, 통증, 부종, 괴사, 궤양 및 하악신경마비, 신경손상, 피부층 괴사, 지방세포 괴사, 섬유아세포 괴사, 골격근세포 괴사, 혈관내피세포 괴사 등을 포함한다.

또한 국소지방 감소용 조성물은 부작용이 개선된 조성물이며, 상기 부작용은 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포 및 혈관내피세포 괴사 인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 부작용은 과민반응, 두드러기, 염증, 암세포 증가 또는 발암성이 포함될 수 있다.

비수술적 방법으로서, 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 부형제 및 담체 둘 다 포함하는 제제 또는 국소지방 감소용 조성물은 제제로써 안전하고 안정적이다. 또한 염증과 지방세포, 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 피부세포 괴사 (necrosis) 없이, 지방세포에 특이적으로 사멸 (apoptosis)과 분해 (lipolysis) 효과가 우수하다. 지방세포에서의 염증 관련 부작을 TNF-α (Tumour necrosis factor)으로 확인 결과 관찰되지 않았다. 상기와 같이 지방용해 또는 지방분해능이 우수하여, 부작용 없이 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하는 방법 등에 유용하게 활용할 수 있다.

도1은 PH에 따른 글라이코데옥시콜리산 용액의 안전성 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도2은 세포독성 또는 암세포 영향을 확인한 것으로, 도2a는 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)의 세포독성 결과를 나타낸 것이고, 도2b는 본 발명의 글라이코데옥시콜리산(GDCA) 의 세포독성 결과를 나타낸 것으로, 물질을 처리하지 않은 (0 농도) 대비 relative population, Cell viability 가 100% 이상으로 세포독성이 없음이 확인되었다. 도2c는 근육세포 (C2C12 cell)에 대한 본 발명의 글라이코데옥시콜리산(GDCA) 의 세포독성 결과를 나타낸 것으로, 물질을 처리하지 않은 (0 농도) 대비 relative population, Cell viability 가 90% 이상으로 세포독성이 없음이 확인되었다.
도2d는 섬유아세포 (Human fibroblast , CCD-986sk; human fibroblast) 에 대한 본 발명의 글라이코데옥시콜리산(GDCA) 의 세포독성 결과를 나타낸 것으로, 물질을 처리하지 않은 (0 농도) 대비 relative population, Cell viability 가 90% 이상으로 세포독성이 없음이 확인되었다.
도2e는 발암성 확인과 관련하여, 암세포에 대한 세포 영향을 확인한 것이다. 암세포인, Human Colorectal Carcinoma cell line인 HCT116에 대하여, 본 발명의 글라이코데옥시콜리산(GDCA) 의 세포독성 또는 세포 영향 결과를 나타낸 것으로, 물질을 처리하지 않은 (0 농도) 대비 relative population, Cell viability 가 90 내지 100% 로, 대조군과 비교하여 세포 증가 현상 (proliferation 현상)이 관찰되지 않아, 세포영향이 없음이 확인되었다.
도2f는 혈관내피세포(HUVEC; human endothelium)에 대한 본 발명의 글라이코데옥시콜리산(GDCA) 의 세포독성 결과를 나타낸 것으로, 물질을 처리하지 않은 (0 농도) 대비 relative population, Cell viability 가 85% 이상으로 세포독성이 없음이 확인되었다.
도2g는 피부세포 (HaCaT cell) 에 대한 본 발명의 글라이코데옥시콜리산(GDCA) 의 세포독성 결과를 나타낸 것으로, 물질을 처리하지 않은 (0 농도) 대비 relative population, Cell viability 가 90% 이상으로 세포독성이 없음이 확인되었다.
도3은 지방세포의 염증 발생 유무를 확인한 것으로, 분화된 지방세포에 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)과 글라이코데옥시콜리산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)를 처리하여 상등액을 염증마커인 TNF-α (Tumour necrosis factor)으로 확인 한 결과, 대조군과 비교하여, 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)에서 염증생성 (TNF-α증가)이 확인되었지만(도3a), 본 발명의 글라이코데옥시콜리산에서는 염증생성 (TNF-α생성)이 확인되지 않았다(도3b).
도4는 In vivo assay를 통하여, 지방감소 효능을 확인한 것으로, 지방조직 무게를 확인 결과를 나타낸 것이다. 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)과 글라이코데옥시콜리산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA) 모두 대조군인 용매처리군 보다 지방무게가 감소된 것으로 확인되었다.
도5은 In vivo assay를 통하여, 지방감소 효능을 확인한 것으로, 지방조직 감소 확인을 육안 평가를 위하 사진으로 기록한 것을 나타낸 것이다. 육안평가 결과, 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)과 글라이코데옥시콜리산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA) 모두 대조군인 용매처리군 보다 지방이 감소된 것으로 확인되었고, 본 발명의 글라이코데옥시콜리산 (GDCA) 처리군이 데옥시콜레이트 (DCA) 보다, 지방조직이 감소된 것으로 확인되었다.
도6은 In vivo assay를 통하여, 지방감소 효능을 확인한 것으로, 지방조직 H&E staining (Hematoxylin and Eosin)으로 지방분해능을 확인한 것이다. 도6a는 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)를 확인한 것이고, 도6b는 본 발명의 글라이코데옥시콜리산 (GDCA)을 확인한 것으로, 모두 대조군인 용매 처리군보다 지방세포 수가 유의하게 감소된 것이 확인되었다. 또한 본 발명의 글라이코데옥시콜리산 (GDCA) 처리군에서 비교군인 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA) 처리군보다 지방세포 크기가 유의하게 감소된 것을 확인하였고, 염증반응 또는 대식세포 침윤 등은 확인이 되지 않아, 본 발명의 글라이코데옥시콜리산 (GDCA) 이 염증반응 또는 부작용 없이 지방세포에 특이적으로 사멸 (apoptosis)과 분해 (lipolysis) 또는 지방조직을 파괴하는 것으로 나타났다.

본 발명은 비수술적 방법으로서, 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 부형제 및 담체 둘 다 포함하는 제제 또는 국소지방 감소용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 “ 담즙산 ”(bile acid)"은 스테로이드 산 (및/또는 그 카르복실산 음이온), 및 그 염을 포함하며, 동물 (예를 들어, 인간)의 담즙에서 발견되는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "국소적 투여 (local administration)"는 약제학적 성분을 비전신적 경로에 의해서 환자의 근육 또는 피하 위치 (subdermal location)에, 또는 그 주변에 투여하는 것을 의미한다. 따라서, 국소적 투여는 정맥 또는 구강 투여와 같은 전신적 경로를 통한 투여는 배제한다.

본 발명의 용어 “치료 (treatment)”는 진전될 잠재성을 치료 (cure), 개선 (ameliorate), 향상 (improve) 또는 영향을 주기 위하여, 치료학적 작용제, 즉 본 발명의 화합물 (단독 또는 다른 약제학적 작용제와 조합으로)을 환자에게 적용 또는 투여하는 것으로 정의되거나, 또는 (예를 들어, 진단 또는 엑스 비보 적용을 위해서) 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주에 치료학적 작용제를 적용 또는 투여하는 것을 의미하며, 상기 치료는 약리학 분야로부터 얻어진 지식에 기초하여 구체적으로 맞추어지거나 또는 변형될 수 있다.

본 발명의 용어 “ 효능 (efficacy)은 분석방법 내에서 달성되는 최대 효과 (Emax)를 의미하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, “대상 (subject), “개체 (individual)” 등은 서로 교환 가능하게 사용되며, 인 비트로 (In vitro), 익스 비보 (ex-vivo) 또는 인 비보 (in vivo) 등에서의 임의의 동물 또는 그 세포를 지칭한다. 특정 비제한적인 구현예들에서 대상 또는 개체는 인간이다.

본 발명의 주사제용 조성물의 투여방법은 제한되지는 않으나, 질환의 정도 및 환자의 연령, 성별, 체중 등 기타 조건에 따라 환자에게 적합한 방법으로 투여될 수 있다. 또한 피하주사, 피내주사, 정맥주사, 근육주사, 복강주사 등으로 투여가능하고 이 중에서 피하주사가 가장 바람직하다.

본 발명의 주사제용 조성물에서 글라이코데옥시콜리산 의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예, 비교예, 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 비교예, 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 비교예, 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] PH에 따른 글라이코데옥시콜리산 용액의 안정성 확인

본 발명의 글라이코데옥시콜릭산은 담즙산 성분으로 담즙산인 데옥시콜레이트에 글라이신이 접합되어 있는 구조를 가진 것이다. 상기 담즙산의 안정성은 용액의 PH에 영향을 받는다. 다양한 인산염 완충용액 (10 mM; 25 ℃에서 pH 6.5, 6.7, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.3) 조건 중 1% (w/v) 글라이코데옥시콜리산의 안정성을 시험하기 위해서 실험을 수행하였다. 비교군으로, 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)와, 콜레이트 (Cholate, CA)을 같이 확인하였다. 10 mM 인산염 완충용액 중 1% 농도에서 용해도를 이용하여, PH에 따른 글라이코데옥시콜리산 용액의 안전성 확인결과, 도1과 같이 상기 글라이코데옥시콜리산이 데옥시콜레이트나 콜산보다 더 낮은 pH에서도 안정적임을 확인하였다.

[실시예 2] 글라이코데옥시콜리산 (Glycodeoxy cholic acid, GDCA) 제조

인산염 10 mM을 제조하여 0.5% (w/v)의 글라이코데옥시콜릭산가 되도록 녹였다.

[비교예1] 데옥시콜레이트 제조

인산염 10 mM을 제조하여 0.5% (w/v)의 데옥시콜레이트가 되도록 녹였다.

[실험예1] 세포독성 (In vitro cytotoxicity assay) 또는 암세포 영향 확인

1-1. 지방세포 세포독성 확인

3T3-L1 세포를 1X10⁴/well로 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 배양한다. 24시간 배양 후 데옥시콜레이트와 글라이코데옥시콜릭산을 각각 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%이 되도록 0.5%의 stock solution을 10 mM 인산염으로 희석한다. serum free media와 함께 처리하여 1시간 배양 후 MTT solution이 포함된 배지를 넣는다. 3시간 배양 후 배지를 제거하고 DMSO를 넣고 formazan을 용해시켜 540 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 세포독성 확인 결과, 데옥시콜레이트 (DCA) 에서는 0.005% 내지 0.01% 에서는 세포독성이 확인되지 않았지만, 0.05%의 이상 농도부터 세포독성이 확인되었다(도2a). 반면 본 발명의 글라이코데옥시콜릭산 (GDCA) 처리된 모든 농도, 0.005% 내지 0.2%에서, 세포독성이 확인되지 않아, 세포독성이 없는 안전한 물질로 확인되었다(도2b).

1-2. 근육세포 세포독성 확인

근육세포 주인 C2C12 (C2C12; mouse myocyte) 세포를 1X10⁴/well로 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 24시간 배양 후 글라이코데옥시콜릭산을 각각 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%이 되도록 0.5%의 stock solution을 10 mM 인산염으로 희석하였다. serum free media와 함께 처리하여 1시간 배양 후 MTT solution이 포함된 배지를 넣는다. 3시간 배양 후 배지를 제거하고 DMSO를 넣고 formazan을 용해시켜 540 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 확인 결과, 본 발명의 글라이코데옥시콜릭산 (GDCA) 처리된 모든 농도, 0.005% 내지 0.2%에서, 세포독성이 확인되지 않아, 세포독성이 없는 안전한 물질로 확인되었다 (도2c).

1-3. 섬유아세포 세포독성 확인

섬유아세포인 Human fibroblast (CCD-986sk; human fibroblast) 세포를 1X10⁴/well로 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 24시간 배양 후 글라이코데옥시콜릭산을 각각 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%이 되도록 0.5%의 stock solution을 10 mM 인산염으로 희석하였다. serum free media와 함께 처리하여 1시간 배양 후 MTT solution이 포함된 배지를 넣는다. 3시간 배양 후 배지를 제거하고 DMSO를 넣고 formazan을 용해시켜 540 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 확인 결과, 본 발명의 글라이코데옥시콜릭산 (GDCA) 처리된 모든 농도, 0.005% 내지 0.2%에서, 세포독성이 확인되지 않아, 세포독성이 없는 안전한 물질로 확인되었다 (도2d).

1-4. 암세포 영향 확인

암세포인, Human Colorectal Carcinoma cell line인 HCT116 세포를 5A medium(500ml)에 20% FBS(50ml)와 1% penicillin streptomycin이 함유된 배지를 사용하여 배양한 후, 1x10⁵ /well로 12 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 24시간 배양 후 글라이코데옥시콜릭산을 각각 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%이 되도록 0.5%의 stock solution을 10 mM 인산염으로 희석하였다. serum free media와 함께 처리하여 1시간 배양 후 MTT solution이 포함된 배지를 넣는다. 3시간 배양 후 배지를 제거하고 DMSO를 넣고 formazan을 용해시켜 540 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 물질을 처리하지 않은 (0 농도) 대비 relative population, Cell viability 가 90 내지 100% 로, 대조군과 비교하여 세포 증가 현상　（cell proliferation 현상)이 관찰되지 않아, 세포영향이 없음이 확인되었다.

1-5. 혈관내피세포(HUVEC; human endothelium) 세포독성 확인

혈관내피세포(HUVEC; human endothelium)를 2% gelatin이 코팅된 배양배지에서 는 2% fetal bovine serum (FBS)와 vascular endothelial growth factor (VEGF)가 포함되어있는 Endothelial Growth Medium-2 (EGMTM-2 Medium)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 계대 배양 하였다. 상기 HUVEC cell은 WST-1으로 세포독성을 확인하였다. 1X10⁴/well로 96 well plate에, 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 24시간 배양 후 글라이코데옥시콜릭산을 각각 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%이 되도록 0.5%의 stock solution을 10 mM 인산염으로 희석하였다. serum free media와 함께 처리하여 1시간 배양 후 각 well당 WST-1용액을 10 μL씩 처리하여 2시간 동안 반응시킨 다음, ELISA reader 450 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 확인 결과, 본 발명의 글라이코데옥시콜릭산 (GDCA) 처리된 모든 농도, 0.005% 내지 0.2%에서, 세포독성이 확인되지 않아, 세포독성이 없는 안전한 물질로 확인되었다 (도2f). 상기와 같이 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포 및 혈관내피세포 괴사와 관련하여 세포독성을 확인한 결과, 세포독성이 확인되지 않아, 본 발명의 글라이코데옥시콜릭산은 부작용이 개선된 것이 증명되었다.

1-6. 피부세포 (HaCaT cell) 세포독성 확인

피부세포주인, HaCaT cell을 10% FBS와 1% antibiotics (100mg/L streptomycin, 100 U/mL penicillin)가 포함된 DMEMmedia (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 배양 한 후, 1x10⁵ /well로 12 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 24시간 배양 후 글라이코데옥시콜릭산을 각각 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%이 되도록 0.5%의 stock solution을 10 mM 인산염으로 희석하였다. serum free media와 함께 처리하여 1시간 배양 후 MTT solution이 포함된 배지를 넣는다. 3시간 배양 후 배지를 제거하고 DMSO를 넣고 formazan을 용해시켜 540 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 물질을 처리하지 않은 (0 농도) 대비 relative population, Cell viability 가 90% 이상으로, 피부세포 독성 또는 피부세포 괴사 없이 안전하다는 것이 확인되었다.

[실험예2] 염증마커 측정

3T3-L1 세포를 지방세포로 분화 한 후, 상기 지방세포를 3×10⁵/ml/well로 6well plate에 분주 한 후, 24시간 배양하였다. 24시간 후, 글라이코데옥시콜릭산을 0.05, 0.1, 0.2%의 농도로 처리 한 후 12시간 동안 배양하였다. 그 후 배양앵액을 수집하여, 3,000 rpm으로 원심분리한 후 상층액을 얻고 염증 마커인 TNF-a을 ELISA kit(BD Biosciences)를 이용하여 측정 결과, 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)에서 염증생성 (TNF-α증가)이 확인되었지만, 본 발명의 글라이코데옥시콜리산에서는 염증생성 (TNF-α생성)이 확인되지 않았다.

[실험예3] In vivo assay를 통한 지방감소 효능 확인

C57BL/6J ob/ob 마우스의 둔부 지방 조직에 시험 물질을 투여 하였다. 상기 C57BL/6J ob/ob 마우스는 렙틴 호르몬이 결여된 돌연변이 개체이자, Homozygous mutant mice로, 빠르게 체중이 증가하는 양상을 보이고, wild type mouse에 비해 3배나 많은 무게를 나타내며, 비만(Obesity)연구에 이용되는 대표적인 동물 모델이다.

데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA) 처리군과 글라이코데옥시콜릭산 ((Glycodeoxycholic acid, GDCA) 처리군으로 나누고 각 군마다 시험 마우스는 4마리로 하였다. 10 mM 인산염을 용매로 1% (w/v)의 데옥시콜레이트와 글라이코데옥시콜릭산을 시험물질로 하였고, 각 군마다 둔부지방조직 (gluteal fat pad)에 시험물질을 주사하되 왼쪽 지방조직은 시험물질 오른쪽 지방조직에는 용매 (10 mM 인산염)을 투여하였다. 시험 시작일로부터 1, 3, 5일에 투여하였으며 매 투여시마다 고정용량으로 200 μL를 투여하였다. 시험물질 투여로부터 20일째에 마우스를 안락사 시킨 후, 육안평가를 위해, 사진으로 기록하고, 그 후 지방조직을 적출하여 무게를 측정하고 H&E 염색법을 통해 조직을 관찰하였다.

도3과 같이 지방조직 무게를 확인 결과, 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)과 글라이코데옥시콜리산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA) 모두 대조군인 용매처리군 보다 지방무게가 감소된 것으로 확인되었다. 또한 도4와 같이 육안평가 결과, 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA)과 글라이코데옥시콜리산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA) 모두 대조군인 용매처리군 보다 지방이 감소된 것으로 확인되었고, 본 발명의 글라이코데옥시콜리산 (GDCA) 처리군이 데옥시콜레이트 (DCA) 보다, 지방조직이 감소된 것으로 확인되었다.

지방조직 H&E staining (Hematoxylin and Eosin)으로 지방분해능을 확인한 결과, 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA), 본 발명의 글라이코데옥시콜리산 (GDCA)을 처리한 군 모두 대조군인 용매 처리군보다 지방세포 수가 유의하게 감소된 것이 확인되었다. 또한 본 발명의 글라이코데옥시콜리산 (GDCA) 처리군에서 비교군인 비교군인 데옥시콜레이트 (Deoxycholate, DCA) 처리군보다 지방세포 크기가 유의하게 감소된 것을 확인하였고, 염증반응 또는 대식세포 침윤 등은 확인이 되지 않아, 본 발명의 글라이코데옥시콜리산 (GDCA) 이 염증반응 또는 부작용 없이 지방세포에 특이적으로 사멸 (apoptosis)과 분해 (lipolysis) 또는 지장조직을 파괴하는 것으로 나타났다.

Claims

국소 지방 제거 또는 감소용 주사용 제제에 있어서, 6.5 내지 8.0의 pH를 갖고 0.1 내지 2% (w/v)인 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)을 포함하는 국소 지방 제거 또는 감소용 주사용 제제.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 제제는 지방세포에 특이적으로 사멸 (apoptosis)과 분해 (lipolysis)을 일으키는 것을 특징인 제제.
이상 지질 제거 또는 감소용 주사용 조성물에 있어서, 6.5 내지 8.0의 pH를 갖고 0.1 내지 2% (w/v)인 글라이코데옥시콜릭산 (Glycodeoxycholic acid, GDCA)을 포함하는 이상 지질 제거 또는 감소용 주사용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 조성물은 대상에서 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하기 위한 조성물.
삭제
제 5항에 있어서, 상기 조성물은 지방세포에 특이적으로 사멸 (apoptosis)과 분해 (lipolysis)을 일으키는 것을 특징으로 하는 국소지방 감소용 주사제 조성물.
제 5항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 지방조직 또는 지방세포에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 조성물은 부작용이 개선된 국소지방 감소용 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 부작용은 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포, 혈관내피세포 및 피부세포 괴사 인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 부작용은 과민반응, 두드러기, 염증 또는 암세포 증가 (발암성)인 것을 특징으로 하는 조성물.