KR102227147B1

KR102227147B1 - 이오노포어를 유효성분으로 포함하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제

Info

Publication number: KR102227147B1
Application number: KR1020180102980A
Authority: KR
Inventors: 김미현; 고윤영; 신진수; 장예진
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2021-03-12
Also published as: KR20200026390A

Abstract

본 발명은 이오노포어를 유효성분으로 포함하는 항바이러스 활성 보조용 약학 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 살리노마이신은 인플루엔자 바이러스 감염 세포주에서 엔도좀 산성화 및 M2 양성자 채널 활성을 억제하여 항바이러스 활성을 나타내고, 또 다른 폴리에테르 이오노포어인 모넨신 및 니제리신 또한 인플루엔자 바이러스 감염 세포주에서 항바이러스 활성을 나타낸다. 또한, 살리노마이신은 인플루엔자 바이러스 및 OSV 내성 인플루엔자 바이러스에 대한 OSV의 항바이러스 효과를 현저히 상승시키므로, 살리노마이신, 모넨신 및 니제리신을 포함하는 폴리에테르 이오노포어는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료를 위한 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이오노포어를 유효성분으로 포함하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제{Adjuvant for preventing or treating of viral diseases comprising ionophore as an active ingredient}

본 발명은 이오노포어를 유효성분으로 포함하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제에 관한 것이다.

현존하는 많은 감염성 질환은 바이러스에 의한 것으로, 광견병, 천연두, 척수염, 간염, 면역 결핍증, 뇌염 및 에이즈 등 여러 심각한 질병의 원인이 된다. 이러한 바이러스에 의한 감염성 질환은 감기, 홍역, 볼거리 및 수두 등과 같이 매우 전염성이 강하며, 호흡기 또는 소화기 장애를 나타내거나, 홍역의 경우 선천성 이상을 유발하기도 하며, 종양 바이러스는 인체에 종양 및 암을 유발한다.

인플루엔자 바이러스는 사람 및 동물 모두에 영향을 주는 세계적으로 가장 흔하게 존재하는 바이러스 중 하나로, 세계적으로 매년 30 내지 50만 명의 사망 원인이 되며, 심각한 국가 경제적 손실을 야기하고 있다. 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 외피(enveloped) 바이러스로, 지질 이층 구조 및 외부 당단백질을 갖는 바이러스 외피에 의해 둘러싸인 핵단백질(nucleoprotein, NP)과 결합된 리보핵산(RNA)의 내부 뉴클레오캡시드 또는 코어로 구성된다. 바이러스 외피의 내층은 주로 기질 단백질로 구성되며, 외층은 대부분 숙주 유래된 지질 물질로 구성된다.

인체 감염을 일으키는 인플루엔자 바이러스는 A 및 B 형으로 바이러스 표면의 헤마글루티닌(hemaglutinin, HA) 및 뉴라미니다제(neuraminidase, NA)에 의하여 바이러스 항원 변이가 결정되며, 매년 새로운 항원 변이주가 출현한다. 특히 인플루엔자 바이러스 중 최근까지 문제가 되고 있는 조류 인플루엔자 바이러스는 대변이가 일어나 닭, 칠면조, 오리 및 야생조류 등 여러 종류의 조류를 감염시키며 빠른 전파로 인해 닭이 감염되면 80% 이상을 폐사하는 등 전 세계적으로 양계산업에 큰 피해와 위협을 주었으며, 인체에 대한 감염을 일으켜 사람에게 질병을 일으키는 것으로 보고되어 있다(Gubareva, L V et al, Lancet 355, 2000). 1918년 스페인독감(H1N1) 대유행 이후, 1957년 아시아독감(H2N2), 1968년 홍콩독감(H3N2) 등 수십 년 주기로 인플루엔자 바이러스 감염 독감 대유행이 나타났으며, 2009년 발생한 신종 플루로 WHO가 공식적으로 펜더믹(pandemic)을 선포한 바 있다.

이러한 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 방법으로 상피세포로의 흡착 저해, 세포로의 침입 저해, 유전자의 전사 및 복제 저해, 단백질 합성 저해, 세포로부터 방출 억제 등이 항바이러스제의 표적이 되고 있다. 현재 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스제로 미국 FDA에서 승인 받은 약물로 인플루엔자 바이러스 단백질 NA 및 M2를 표적으로 하는 두 분류의 약물이 있다. 양성자 채널 M2 억제제인 아만타딘(amantadine) 및 리만타딘(rimantadine)은 인플루엔자 바이러스 A형에만 효과가 있으며, 40년 동안 사용되는 동안 내성을 가진 바이러스가 발생되고 신경계 및 위장에 심각한 부작용이 나타나는 것으로 보고되고 있다. NA 억제제인 오셀타미비르 인산염(oseltamivir phosphate, OSV-P, 타미플루) 및 자나미비르(zanamivir)는 인플루엔자 바이러스 A 및 B형에 모두 효과가 있으나, 자나미비르의 경우 낮은 생체이용률과 빠른 신장에서의 배출의 단점을 가지고 있으며, OSV-P는 심각한 구토 증세가 나타나는 부작용이 있다.

이오노포어(ionophore)는 지질 이중층 막 내외로 특정 이온을 이동시키는 작은 분자로, 전기발생적(electrogenic) 또는 전기적 중성(electroneutral) 이오노포어로 분류된다. 발리노마이신(valinomycin), CCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) 또는 FCCP(carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)와 같은 전기발생적 이오노포어는 막 내외로 순 전하(net charge)를 수송한다. 반면, 모넨신(monensin), A23187, 니제리신(nigericin) 또는 살리노마이신과 같은 전기적 중성 이오노포어는 양이온과 함께 양쪽성 이온(zwitter ion) 복합체를 형성하여 전기적으로 중성의 양이온 교환 확산(exchange diffusion)을 촉진한다.

본 발명자들은 고속(high-throughput) 스크리닝 방법을 통하여 1가 양이온 이오노포어인 살리노마이신을 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 후보 물질로 도출한 후, 살리노마이신을 포함하는 폴리에테르 이오노포어들이 인플루엔자 바이러스 감염 세포주에서 항바이러스 활성을 나타내고, 살리노마이신이 인플루엔자 바이러스 및 OSV 내성 인플루엔자 바이러스에 대한 OSV의 항바이러스 효과를 현저히 상승시킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 이오노포어를 유효성분으로 포함하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이오노포어를 유효성분으로 포함하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 약제학적으로 치료가능한 양의 살리노마이신을 유효성분으로 함유하는 제1성분; 및 약제학적으로 치료가능한 양의 오셀타미비르 인산염을 유효성분으로 함유하는 제2성분을 포함하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 살리노마이신은 인플루엔자 바이러스 감염 세포주에서 엔도좀 산성화 및 M2 양성자 채널 활성을 억제하여 항바이러스 활성을 나타내고, 또 다른 폴리에테르 이오노포어인 모넨신 및 니제리신 또한 인플루엔자 바이러스 감염 세포주에서 항바이러스 활성을 나타낸다. 또한, 살리노마이신은 인플루엔자 바이러스 및 OSV 내성 인플루엔자 바이러스에 대한 OSV의 항바이러스 효과를 현저히 상승시키므로, 살리노마이신, 모넨신 및 니제리신을 포함하는 폴리에테르 이오노포어는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료를 위한 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 MDCK 세포에서 살리노마이신의 인플루엔자 바이러스 A형 2종(PR8, A/Puerto Rico/8/1934, H1N1; HK, A/Hong Kong/8/1968, H3N2) 및 B형 1종(Lee, B/Lee/1940) 감염에 대한 세포보호 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 2는 PR8이 감염된 MDCK 세포에서 살리노마이신 및 오셀타미비르 카르복실레이트(OSV-C)의 바이러스 단백질(NP, 핵단백질; HA, 헤마글루티닌; M, 매트릭스 단백질(matrix protein)) 발현 억제 효과를 나타낸 결과 도면이다.
도 3은 PR8이 감염된 MDCK 세포에서 살리노마이신 및 오셀타미비르 카르복실레이트(OSV-C)의 바이러스 플라크 수 감소 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 4는 PR8이 감염된 MDCK 세포에서 살리노마이신 또는 EGCG(epigallocatechin gallate)의 처리 시점에 따른 바이러스 플라크 수 감소 효과를 나타낸 결과 그래프이다(A, 바이러스 감염 및 약물 처리 시간; B, 바이러스 플라크 수 측정 결과).
도 5는 PR8이 감염된 MDCK 세포에 살리노마이신, EGCG(epigallocatechin gallate) 또는 리바비린(RBV) 처리 후, 바이러스 핵단백질(NP, 녹색) 및 세포 핵(청색)을 염색한 결과를 나타내는 공초점 형광 현미경 사진이다.
도 6은 MDCK 세포에 살리노마이신, 바필로마이신 A1 또는 클로로퀸 처리 후, 아크리딘 오렌지로 염색한 결과를 나타내는 공초점 형광 현미경 사진이다(적색, 낮은 pH 신호).
도 7은 PR8이 감염된 A549 세포에 살리노마이신 처리 후, EEA1(early endosome antigen 1, 녹색), LAMP1(lysosomal-associated membrane protein 1, 녹색), 바이러스 핵단백질(NP, 적색) 및 세포 핵(청색)을 염색한 결과를 나타내는 공초점 형광 현미경 사진이다(A, NP의 EEA1 내 분포여부 확인 결과 도면; B, NP의 LAMP1 내 분포여부 확인 결과 도면).
도 8은 공 VLPs(바이러스 유사 입자)(A), PR8M2-S VLPs(B) 및 PR8M2-R VLPs(C)의 동적 광 산란(dynamic light scattering) 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 공 VLPs(바이러스 유사 입자), PR8M2-S VLPs 및 PR8M2-R VLPs의 마이크로칩 젤 전기영동(microchip gel electrophoresis) 분석(A) 및 공 VLPs, PR8M2-S VLPs, PR8M2-R VLPs 및 LeeM2 VLPs의 웨스턴 블롯 분석(B) 결과를 나타낸 도면이다(p30(CA), MVL Gag 유래 p30 캡시드).
도 10은 각 VLPs에 아만타딘(AMT) 또는 살리노마이신을 처리한 후, M2 양성자 채널 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(A, 공 VLPs(바이러스 유사 입자); B, FCCP VLPs; C, PR8M2-S VLPs; D, PR8M2-R VLPs; E, PR8M2-S VLPs 및 PR8M2-R VLPs; 및 F, LeeM2 VLPs)
도 11은 PR8이 감염된 Vero E6 세포에 살리노마이신 또는 항-HA(헤마글루티닌) 항체를 처리한 후, 김자로 염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 12는 살리노마이신 및 오셀타미비르 카르복실레이트(OSV-C)의 혼합 비율에 따른 야생형 PR8(A 및 B) 및 H275Y 돌연변이가 유도된 재조합 PR8 바이러스(C 및 D)에 대한 항바이러스 상승 효과를 측정한 결과 그래프이다.
도 13은 인플루엔자 바이러스 A 감염 마우스 모델에서 살리노마이신, 오셀타미비르 인산염(OSV-P) 또는 살리노마이신과 오셀타미비르 인산염의 병용 투여에 의한 항바이러스 효과를 나타낸 결과 그래프이다(A, 약물 투여 일정; B, 마우스 몸무게 변화; 및 C, 마우스의 생존율).
도 14는 OSV 내성 인플루엔자 바이러스 A 감염 마우스 모델에서 오셀타미비르 인산염(OSV-P) 또는 살리노마이신과 오셀타미비르 인산염의 병용 투여에 의한 항바이러스 효과를 나타낸 결과 그래프이다(A, 마우스 몸무게 변화; 및 B, 마우스의 생존율).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 이오노포어(ionophore)를 유효성분으로 포함하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제를 제공한다.

상기 이오노포어는 폴리에테르 이오노포어일 수 있고, 구체적으로, 살리노마이신, 모넨신, 니제리신, 피리티온(pyrithione), 히니키티올(hinikitiol), A23187 또는 이오노마이신(isonomycin)일 수 있다.

상기 살리노마이신은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 1]

.

상기 보조제는 RNA 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 증진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로 인플루엔자 바이러스, 타미플루 내성 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스(adenovirus), 리노바이러스(rhinovirus), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), 폴리오 바이러스(polio virus), 홍역 바이러스(measles virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 콕사키 바이러스(Coxsackie virus), 황열 바이러스(yellow fever virus), 뎅기열 바이러스(Dengue Fever virus), 라사 바이러스(lassa virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus), 쥬닌 바이러스(Junin virus), 마추포 바이러스(machuppo virus), 구아나리토 바이러스(guanarito virus), 한타바이러스(hantavirus), 리프트 계곡열 바이러스(Rift Valley Fever virus), 라 크로세 바이러스(La Crosse virus), 캘리포니아 뇌염 바이러스(California encephalitis virus), 크리미아-콩고 바이러스(Crimean-Congo virus), 마르부르크 바이러스(Marburg virus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 중증 급성 호흡 증후군 (SARS) 바이러스(severe acute respiratory syndrome virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 푼타 토로 바이러스(Punta Toro virus), 타카라이브 바이러스(Tacaribe virus) 및 피키니드 바이러스(Pichinde virus)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 증진시키는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형에 대한 항바이러스 활성을 증진시키는 것일 수 있다.

상기 보조제는 아만타딘(amantadine), 리만타딘(rimantadine), 파비피라비르(favipiravir), 발록사비르(baloxabir marboxil), 오셀타미비르 인산염(oseltamivir phosphate) 및 자나미비르(zanamivir)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항바이러스제의 활성을 증진시키는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 활성 스크리닝을 통하여 살리노마이신을 도출하였고, 인플루엔자 바이러스 감염 세포주에서 살리노마이신이 바이러스 구성 단백질 발현을 억제하고, 바이러스 플라크 수를 감소시킴을 확인하였다(도 1 내지 4 참조).

또한, 살리노마이신 외에 또 다른 폴리에테르 이오노포어인 모넨신 및 니제리신 또한 인플루엔자 바이러스 감염 세포주에서 항바이러스 활성을 나타냄을 확인하였고(표 6 참조), 살리노마이신이 엔도좀 산성화 및 M2 양성자 채널 활성을 억제함으로써 바이러스 단백질의 세포 핵 내로의 이동을 억제함을 확인하였다(도 5 내지 11 참조).

또한, 살리노마이신은 인플루엔자 바이러스 및 OSV 내성 인플루엔자 바이러스에 대한 OSV의 항바이러스 효과를 현저히 상승시킴을 세포 및 마우스 모델에서 확인하였다(도 12 내지 14 참조). 따라서, 살리노마이신, 모넨신 및 니제리신을 포함하는 폴리에테르 이오노포어는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료를 위한 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 보조제는 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 이오노포어를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 보조제는 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 보조제는 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

상기 보조제를 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 보조제는 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.

상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 보조제는 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.

상기 보조제는 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 10 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 내지 수회일 수 있다.

아울러, 본 발명은 약제학적으로 치료가능한 양의 살리노마이신을 유효성분으로 함유하는 제1성분; 및 약제학적으로 치료가능한 양의 오셀타미비르 인산염을 유효성분으로 함유하는 제2성분을 포함하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.

본 발명의 약학적 키트는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료를 위하여, 제1성분 및 제2성분이 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 제1성분 및 제2성분이 순차적으로 투여되는 경우, 제1성분의 투여 30분 내지 180분, 60분 내지 120분, 80분 내지 100분 전후로 제2성분을 투여할 수 있다.

상기 약학적 키트에 포함된 제1성분 및 제2성분을 병용 투여하면 바이러스성 질환에 대한 항바이러스 활성을 증대시킬 수 있다.

상기 약학적 키트는 포유동물, 구체적으로 인간에게 투여될 수 있다. 또한, 가금류 등 조류에 투여될 수 있고, 구체적으로 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추리, 꿩 등에 투여될 수 있다.

상기 바이러스성 질환은 RNA 바이러스 감염에 의한 질환일 수 있고, 구체적으로 인플루엔자 바이러스, 타미플루 내성 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스(adenovirus), 리노바이러스(rhinovirus), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), 폴리오 바이러스(polio virus), 홍역 바이러스(measles virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 콕사키 바이러스(Coxsackie virus), 황열 바이러스(yellow fever virus), 뎅기열 바이러스(Dengue Fever virus), 라사 바이러스(lassa virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus), 쥬닌 바이러스(Junin virus), 마추포 바이러스(machuppo virus), 구아나리토 바이러스(guanarito virus), 한타바이러스(hantavirus), 리프트 계곡열 바이러스(Rift Valley Fever virus), 라 크로세 바이러스(La Crosse virus), 캘리포니아 뇌염 바이러스(California encephalitis virus), 크리미아-콩고 바이러스(Crimean-Congo virus), 마르부르크 바이러스(Marburg virus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 중증 급성 호흡 증후군 (SARS) 바이러스(severe acute respiratory syndrome virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 푼타 토로 바이러스(Punta Toro virus), 타카라이브 바이러스(Tacaribe virus) 및 피키니드 바이러스(Pichinde virus)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스 감염에 의한 질환일 수 있다. 더욱 구체적으로 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형 감염에 의한 질환일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 바이러스의 준비

인플루엔자 바이러스 A형 2종(A/Puerto Rico/8/1934, PR8, H1N1; A/Hong Kong/8/1968, HK, H3N2) 및 B형 1종(B/Lee/1940, Lee)은 ATCC에서 구입하였고, 마우스 적응 PR8(mouse-adapted PR8, maPR8)은 중앙대학교 HJ Kim으로부터 입수하였다. PR8, HK 및 maPR8은 10일 된 SPF 닭 발육란(embryonated SPF chicken eggs)에 감염시켜 37℃에서 3일 동안 감염시킴으로써 증폭시켰다. Lee는 MDCK 세포에 2 ㎍/mL의 TPCK-트립신(tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone-trypsin)을 포함하는 무혈청 MEM(minimum essential medium, Hyclone, 미국) 배지에서 35℃로 3일 동안 감염시켜 증폭시켰다. 바이러스는 요막액(allantoic fluid) 또는 세포 배양 배지를 1,300 ×g에서 10분간 원심분리하여 수득하였고, -70℃에서 보관하였다.

실험예 1. 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 활성 스크리닝을 통한 살리노마이신의 도출

인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 후보 물질 도출을 위해 2,000 개의 화합물의 인플루엔자 바이러스 A형 2종(PR8 및 HK) 및 B형 1종(Lee)에 대한 항바이러스 효과를 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltertrazolium) 분석법으로 조사하였다.

구체적으로, MDCK(Madin-Darby canin kidney) 세포(American Type Culture Collextion(ATCC), 미국)를 96-웰 플레이트에 3 × 10⁴ 개/웰로 배양하고, 인플루엔자 바이러스 PR8, HK 또는 Lee를 0.001의 MOI(multiplicity of infection, 접종바이러스양/세포수)로 35℃에서 1시간 동안 감염시켰다. 인산염 완충액(phosphste-buffered saline, PBS)으로 세척 후, 2 ㎍/mL의 TPCK-트립신이 포함된 MEM에 최종 농도 20 μM로 희석한 2,000개의 화합물을 각각 처리하였다. 3일 동안 배양한 후, 2.5 mg/mL의 MTT를 첨가하여 세포생존율을 측정하였으며, 바이러스를 감염시키지 않은 정상세포의 생존율에 대한 비율로 세포생존율을 계산하였다. 80% 이상의 세포생존율을 나타낸 9개의 화합물을 농도별로 처리하여, 상기와 동일하게 항바이러스 효과를 측정하였다. 50% 세포독성 농도(CC₅₀) 및 50% 효과 농도(EC₅₀)는 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어(GraphPad Prism 6 software, GraphPad, 미국)로 계산하였다.

아토바큐온, 에반스블루 및 살리노마이신의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효과

화합물	MDCK 세포에 대한 CC₅₀ ^a (μM)	인플루엔자 바이러스에 대한 EC₅₀ ^b (μM) (선택지수^c)
화합물	MDCK 세포에 대한 CC₅₀ ^a (μM)	PR8^d	HK^e	Lee^f
아토바큐온	> 100.0	2.4 ± 0.2 (> 41.7)	2.1 ± 0.1 (> 47.6)	2.0 ± 0.1 (> 50.0)
에반스블루	> 100.0	10.6 ± 1.9 (> 9.4)	5.4 ± 0.5 (> 18.5)	1.5 ± 0.2 (> 66.7)
살리노마이신	35.6	0.7 ± 0.1 (48.3)	0.4 ± 0.1 (84.5)	0.8 ± 0.1 (42.3)
아만타딘^*	> 100.0	> 100.0 (n.d.ⁱ)	0.9 ± 0.2 (> 111.1)	> 100.0 (n.d.)
리바비린^g*	> 100.0	18.8 ± 1.8 (> 5.3)	12.8 ± 3.2 (> 7.8)	13.5 ± 0.5 (> 7.4)
OSV-C^h*	> 100.0	0.02 ± 0.01 (> 5,000)	< 0.005 (> 20,000)	0.13 ± 0.03 (> 769)

^a세포생존율이 50%까지 감소되는 농도

^b인플루엔자 바이러스에 감염된 세포의 생존율을 50%까지 회복시키는데 필요한 농도

^cCC₅₀/EC₅₀의 비율(selectivity index)

^dA/Puerto Rico/8/1934

^eA/Hong Kong/8/1968

^fB/Lee/1940

^gribavirin

^h오셀타미비르 카르복실레이트(oseltamivir carboxylate)

ⁱ검출되지 않음(not detected)

^*양성 대조군

스크리닝 결과, 80% 이상의 세포생존율을 나타낸 9개의 화합물 중 농도의존적인 항바이러스 활성을 보이는 3종의 화합물(아토바큐온(atovaquone), 에반스블루(Evans blue) 및 살리노마이신)이 도출되었다. 상기 3종의 화합물 중 살리노마이신(Sigma-Aldrich, 미국)의 경우 실험한 모든 바이러스에 대하여 EC₅₀은 0.4 내지 0.8 μM, CC₅₀은 35.6 μM로 나타나 가장 강력한 항바이러스 활성을 나타냈다(표 1 및 도 1). 따라서, 살리노마이신을 항바이러스 후보 물질로 도출하였다.

실험예 2. 살리노마이신의 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 광범위 항바이러스 활성 확인

상기 실험예 1에서 확인한 살리노마이신의 항바이러스 효과가 보다 다양한 인플루엔자 바이러스에 대하여도 나타나는지를 확인하고자, 인플루엔자 바이러스 A형 13종 및 B형 4종에 대한 항바이러스 효과를 MTT 분석법으로 조사하였다.

구체적으로, 하기 표 2의 인플루엔자 바이러스 총 17종을 ATCC, 대한민국 질병관리본부 및 농림축산검역본부에서 수득하였다. 인플루엔자 바이러스를 하기 표 2의 바이러스들을 사용하고, 항바이러스 활성을 측정할 화합물을 살리노마이신, 아만타딘, 리바비린 및 OSV-C를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 각 화합물의 항바이러스 활성을 측정하였다.

번호	분류	바이러스 명
1	인플루엔자 A/H1N1 바이러스	A/Brisbane/59/2007
2		A/California/7/2009
3		A/Korea/01/2009
4		rgA/Korea/09/2009Δ53-60(H275Y)^a
5		A/Korea/2785/2009^b
6		rgA/Puerto Rico/8/1934(H275Y)^c
7		A/Taiwan/1/1986
8	인플루엔자 A/H3N2 바이러스	A/Brisbane/10/2007
9		A/Perth/16/2009
10		A/Seoul/11/1988
11		A/Victoria/361/2011-like
12	조류 인플루엔자 바이러스	A/duck/Korea/GJ79/2007(H3N8)
13	조류 인플루엔자 바이러스	A/chicken/Korea/MS96/1996(H9N2)
14	인플루엔자 B 바이러스	B/Florida/4/2006
15		B/Panama/45/1990
16		B/Taiwan/2/1962
17		B/Wisconsin/1/2010-like

^a53번째 및 60번째 아미노산 사이에 절단(truncation)이 있고, rgA/Korea/09/2009Δ53-60의 뉴라미니다제에 H275Y의 점 돌연변이(point putation)를 가지도록 역 유전학(reverse genetics)에 의해 발생되고, 마우스-적응된(mouse-adapted), OSV-내성 균주

^b한국 환자에서 분리한 OSV-내성 균주

^cPR8의 뉴라미니다제에 H275Y의 점 돌연변이를 가지도록 역 유전학에 의해 발생된 OSV-내성 균주

화합물	인플루엔자 바이러스에 대한 EC₅₀ ^a (μM) (선택지수^b)
화합물	A/Brisbane/59/2007	A/California/7/ 2009	A/Korea/01/2009	rgA/Korea/09/2009Δ53-60 (H275Y)	A/Korea/2785/2009	rgA/Puerto Rico/8/ 1934 (H275Y)	A/Taiwan/1/1986
살리노마이신	1.4±0.3 (41.6)	1.9±0.2 (30.3)	1.2±0.0 (48.8)	1.1±0.2 (53.4)	1.7±0.0 (34.0)	0.7±0.1 (86.3)	3.5±0.1 (16.3)
아만타딘	0.1±0.0 (>90.0)	>100.0 (N.D.)	100.0 (N.D.)	100.0 (N.D.)	100.0 (N.D.)	100.0 (N.D.)	10.5±2.6 (>9.6)
리바비린	28.2±6.9 (>3.6)	19.3±0.3 (526.3)	13.1±2.0 (>7.6)	6.5±2.5 (>15.5)	38.7±4.5 (>2.6)	24.6±0.2 (>4.1)	50.2±1.9 (>2.0)
OSV-C	0.14±0.02 (>740.7)	0.19±0.06 (>526.3)	<0.005 (>20,000)	4.45±1.97 (>22.5)	2.95±0.55 (33.9)	1.41±0.03 (>70.9)	0.99±0.21 (101.5)

^a인플루엔자 바이러스에 감염된 세포의 생존율을 50%까지 회복시키는데 필요한 농도

^bCC₅₀/EC₅₀의 비율(selectivity index), CC₅₀ 값은 표 1에 기재된 값으로 계산

화합물	인플루엔자 A/H3N2 바이러스에 대한 EC₅₀ ^a (μM) (선택지수^b)				조류 인플루엔자 바이러스에 대한 EC₅₀ ^a (μM) (선택지수^b)
화합물	A/Brisbane/10/2007	A/Perth/16/2009	A/Seoul/11/1988	A/Victoria/361/2011-like	A/duck/Korea/GJ79/2007 (H3N8)	A/chicken/Korea/MS96/1996 (H9N2)
살리노마이신	2.5±0.1 (22.4)	2.6±0.1 (21.6)	1.3±0.4 (43.2)	1.7±0.3 (34.0)	1.6±0.5 (36.2)	4.2±0.1 (13.5)
아만타딘	>100.0 (N.D.)	>100.0 (N.D.)	0.1±0.0 (>1,000)	>100.0 (N.D.)	0.5±0.1 (>200.0)	0.6±0.3 (>181.8)
리바비린	6.8±0.8 (>14.7)	53.5±1.0 (>1.9)	12.5±3.5 (>8.0)	17.3±3.0 (>5.8)	18.5±0.7 (>5.4)	76.8±4.7 (>1.3)
OSV-C	0.28±0.10 (>357.1)	0.02±0.01 (>5,714)	0.01±0.00 (10,000)	<0.005 (>20,000)	0.01±0.00 (>13,333)	0.27±0.01 (>377.4)

화합물	인플루엔자 B 바이러스에 대한 EC₅₀ ^a (μM) (선택지수^b)
화합물	B/Florida/4/2006	B/Panama/45/1990	B/Taiwan/2/1962	B/Wisconsin/1/ 2010-like
살리노마이신	0.4±0.1 (160.3)	0.9±0.1 (29.5)	2.5±0.1 (22.9)	3.8±0.4 (15.0)
아만타딘	>100.0 (N.D.)	>100.0 (N.D.)	>100.0 (N.D.)	>100.0 (N.D.)
리바비린	6.7±2.7 (>15.0)	14.6±2.2 (>6.8)	16.3±1.1 (>6.2)	8.3±0.1 (>12.0)
OSV-C	0.11±0.04 (>909.1)	0.03±0.01 (>4,000)	0.28±0.04 (>357.1)	0.19±0.01 (>540.5)

그 결과, 살리노마이신은 아만타딘 또는 OSV에 내성이 있는 인플루엔자 바이러스를 포함한 총 17종의 인플루엔자 바이러스에 대하여 항바이러스 효과를 나타냈으며, EC₅₀은 0.4 내지 4.3 μM이었다(표 3 내지 5).

실험예 3. 폴리에테르 이오노포어의 항바이러스 효과 확인

살리노마이신 외의 다른 폴리에테르 이오노포어에 속하는 화합물인 모넨신 및 니제리신의 항바이러스 효과를 MTT 분석법으로 조사하였다.

구체적으로, 모넨신(Cat. #. M5273, Sigma-Aldrich) 및 니제리신(Cat. #. N7143, Sigma-Aldrich)을 처리한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 항바이러스 효과를 측정하였다.

화합물	MDCK 세포에 대한 CC₅₀ ^a(μM)	인플루엔자 바이러스에 대한 EC₅₀ ^b (μM) (선택지수^c)
화합물	MDCK 세포에 대한 CC₅₀ ^a(μM)	PR8^d	HK^e	Lee^f
모넨신	>100.0	2.0±1.1 (>50.0)	1.6±0.9 (>64.5)	29.0±4.3 (>3.4)
니제리신	18.8	0.04±0.02 (470.0)	<0.005 (>3,760)	0.37±0.03 (51.5)

^a세포생존율이 50%까지 감소되는 농도

^cCC₅₀/EC₅₀의 비율(selectivity index)

^dA/Puerto Rico/8/1934

^eA/Hong Kong/8/1968

^fB/Lee/1940

그 결과, 모넨신 및 니제리신도 인플루엔자 바이러스에 대해 우수한 항바이러스 효과를 나타냈으며, 모넨신의 EC₅₀은 2.0 내지 29.0 μM, CC₅₀은 100 μM 이상, 니제리신의 EC₅₀은 0.005 μM 이하에서 0.37 μM, CC₅₀은 18.8 μM로 확인되었다(표 6). 이는 살리노마이신을 포함한 폴리에테르 이오노포어에 속하는 화합물들이 전반적으로 항바이러스 효능이 있음을 제시한다.

실험예 4. 인플루엔자 A 바이러스 감염 세포주에서 살리노마이신의 항바이러스 효과 확인

상기 실험예 1에서 도출된 살리노마이신의 항바이러스 효과를 검증하기 위하여 PR8을 MOI 0.001로 감염시킨 MDCK 세포에서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

4-1. 살리노마이신의 바이러스 구성 단백질 발현 억제 효과 확인

살리노마이신의 바이러스 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. PR8에 감염된 MDCK 세포에 살리노마이신(0.1, 1.0 또는 10.0 μM) 또는 0.1 μM의 OSV-C(OSV-P의 프로드러그, US Biological, 미국)를 처리하고, 1일 뒤에 세포를 수득하여 용해시켰다. 세포 용해물(lysate)을 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 젤에 웰 당 30 ㎍씩 로딩하여 전기영동 후, 분리된 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인으로 이동시켰다. 이후, 항-NP(Cat. #. 11675-MM03, Sino Biological, 중국) 항-HA(Cat. #. 86001-RM01, Sino Biological), 항-M1(Cat. #. sc-57881, Santa Cruz Biotechnology, 미국), 항-M2(Cat. #. sc-32238, Santa Cruz Biotechnology) 또는 항-β-액틴(β-actin, Cat. #. A1987, Sigma-Aldrich)과 반응시키고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이후, SuperSignal West Pico 화학발광 기질(Pierce, 미국)을 이용하여 HRP 접합체를 검출하였고, LAS-4000 이미지 분석장비(Fujifilm, 일본)로 블롯 이미지를 분석하였다.

그 결과, 살리노마이신은 농도의존적으로 바이러스 단백질인 NP, HA, M1 및 M2의 발현을 억제하였고, 살리노마이신 10.0 μM 처리 시, 양성 대조군인 OSV-C 0.1 μM을 처리한 경우와 동등한 효과를 보였다(도 2).

4-2. 살리노마이신의 바이러스 플라크 감소 효과 확인

PR8에 감염된 MDCK 세포에 살리노마이신(0.1, 1.0 또는 10.0 μM) 또는 OSV-C(0.1 μM)를 처리하고, 1 또는 2일 뒤에 세포 배양액을 수득하였다. 감염된 바이러스 입자들을 적정(titration)하기 위하여, MDCK 세포를 48-웰 플레이트에 배양하고, 다음 날, 상기 수득한 바이러스 감염 세포 배양액을 10^-1에서 10^-6 배까지 연속희석하여 1시간 동안 처리하였다. 상기 세포를 PBS로 세척한 후, 세포 단층(monolayers)에 중층 배지(overlay medium)로서 0.5% CMC(carboxymethylcellulose) 및 2 ㎍/mL TPCK-트립신을 포함하는 MEM 배지를 첨가하여 33℃에서 3일 동안 배양하였다. 바이러스 플라크는 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 시각화하였다. 이후, 플레이트의 한 웰에서 육안으로 관찰되는 플라크의 수를 측정하였다.

그 결과, 살리노마이신 처리에 의해 감염 후 1 및 2일째의 세포 배양액 내 감염성 인플루엔자 바이러스 입자들의 수가 감소하였으며, 상기 효과는 살리노마이신의 농도의존적으로 나타났다. 또한, 살리노마이신 1.0 내지 10.0 μM의 효과가 양성 대조군인 OSV-C 0.1 μM의 효과와 유사한 수준으로 나타났다(도 3).

실시예 2. PR8M2 바이러스 유사 입자(virus-like particles, VLPs)의 제조

2-1. 플라스미드의 준비

2개의 아만타딘 저항성 아미노산 서열인 A27 및 N31을 암호화하는 PR8M2 cDNA(complementary DNA)(GenBank accession No. EF467824)를 합성하고(Bioneer Corp. 대한민국), 이를 pcDNA 3.1/myc-His(-) A(Invitrogen, 미국)의 NheI 및 BamHI 부위로 복제하여 pcDNA-PR8M2-R로 명명하였다. 상기 아미노산 서열 대신 V27 및 S31의 아미노산 서열을 갖는 아만타딘 민감성 PR8M2를 발현하는 pcDNA-PR8M2-S를 상기와 같은 방법으로 준비하였다. 또한, LeeM2 cDNA(GenBank accession No. DQ79290)를 합성하여(Bioneer Corp.), 상기와 동일한 방법으로 플라스미드를 제작하였다. MLV(murine leukemia virus) Gag-Pol을 발현하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드(retrovirus packaging plasmid)인 pCgp는 서던캘리포니아 대학교의 Paula M. Cannon으로부터 입수하였다.

2-2. VLPs의 제조

MLV Gag와 함께 PR8M2-S또는 PR8M2-R을 포함하는 VLPs를 제조하였다. 구체적으로, HEK293T 세포(human embryonic kidney, ATCC)를 150 mm 세포 배양 디쉬에 배양하고, 플라스미드 pCgp 15 ㎍과 pcDNA-PR8M2-S, pcDNA-PR8M2-R 또는 pcDNA-LeeM2 45 ㎍를 공-형질전환(co-transfection)시켰다. 대조군으로 공 VLPs(null VLPs)는 상기 세포에 pCgp만을 형질전환시켜 동일하게 제조하였다. 형질전환 2일 후, 총 80 mL의 세포 배양액을 20% 수크로오즈 쿠션(sucrose cushion)으로 4℃에서 16,500 ×g로 2시간 동안 원심분리하였다(SW-32Ti rotor, Beckmann Instruments, 미국). 펠렛을 1 mL의 PBS로 다시 현탁한 후, 4℃에서 82,000 ×g로 1시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하였다(SW-60Ti rotor, Beckmann Instruments). 펠렛을 10 mM의 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 완충액(pH 7.5) 150 ㎕에 다시 현탁시킨 후, 이후 분석에 사용하였다.

실험예 5. 인플루엔자 바이러스 감염 세포주에서 살리노마이신의 항바이러스 기전 확인

상기 실험예 1 내지 4에서 확인한 살리노마이신의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효과의 작용 기전을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

5-1. 살리노마이신의 처리 시점에 따른 항바이러스 활성 비교

살리노마이신이 바이러스 생명 주기 중 어느 단계에 작용하는지 조사하기 위하여, PR8으로 감염된 MDCK 세포에서 살리노마이신의 처리 시점에 따른 바이러스 플라크 수 감소 효과를 비교하였다.

구체적으로, MDCK 세포를 48-웰 플레이트에 배양한 후, PR8으로 4℃에서 1시간 동안 감염시키고, PBS로 세척 후, 4시간 동안 35℃에서 더 배양하였다. 10 μM 살리노마이신 또는 30 μM EGCG(epigallocatechin gallate, Sigma-Aldrich)를 바이러스 감염과 동시에 처리하거나 감염 후 1, 2 또는 4시간 뒤에 처리하였다(도 4A). 바이러스 감염 후 5시간 째에, 세포 단층을 PBS로 세척 후, 중층 배지를 첨가하여 상기 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 바이러스 플라크를 정량하였다. 각 약물 처리군의 바이러스 플라크 수는 약물을 처리하지 않은 대조군의 플라크 수에 대한 백분율로 나타냈다.

그 결과, 4℃에서 바이러스를 감염시키는 1시간 동안 약물을 처리한 경우, 바이러스 침입 차단제(entry blocker)인 EGCG는 바이러스 감염을 92.3%까지 억제한 반면, 살리노마이신은 항바이러스 효과가 없었다. 그러나, 35℃에서 바이러스의 생명 주기가 시작된 이후까지 살리노마이신을 처리한 경우에는 항바이러스 효과를 보였으며, 감염 시작 후 0-5시간, 1-5시간, 2-5시간 또는 4-5시간까지 처리한 경우의 바이러스 플라크 수 감소 효과가 각각 83.2%, 79.5%, 60.8% 또는 53.4%로 나타났다(도 4B). 이는 살리노마이신이 바이러스의 숙주 세포에 대한 부착 단계에는 작용하지 않고, 바이러스의 생명 주기 중 초기 단계에 작용함을 의미한다.

5-2. 살리노마이신에 의한 바이러스 단백질의 핵 내로의 이동 억제 효과 확인

바이러스의 리보뉴클레오프로테인(viral ribonucleoprotein, vRNP)은 감염 후 4시간 뒤에 핵 내로 완전히 이동한다. 살리노마이신의 바이러스 생명 주기 중 초기 단계에 작용하는 항바이러스 기전을 조사하기 위하여, 바이러스 감염 후 4시간 뒤에 vRNP를 구성하는 대표적인 바이러스 단백질인 NP의 세포 내 분포를 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscope)으로 사진을 찍어 관찰하였다.

구체적으로, MDCK 세포를 4-웰 챔버 슬라이드에서 PR8을 2.5 MOI로 감염시키고, 살리노마이신 10 μM, EGCG 100 μM 또는 리바비린 100 μM을 처리하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고, 0.1% 트리톤 X-100(triton X-100)으로 투과성을 증가시켰다. PBS에 용해시킨 1% BSA(Bovine serum albumin) 및 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 블로킹(blocking)한 후, 슬라이드를 항-인플루엔자 A NP 항체(Cat. #. sc-80481, Santa Cruz Biotechnology)와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, 알렉사 플루오르 488(Alexa Fluor 488)이 접합된 항-마우스 항체(Invitrogen, 미국)로 1시간 동안 상온에서 반응시키고, DAPI가 포함된 마운팅 미디엄(Vectashield mounting medium containing DAPI, Vector Laboratories, 미국)으로 대조염색하였다. 염색한 세포를 공초점 형광 현미경(Zeiss LSM 700 confocal microscope)으로 사진을 찍어 관찰하였다.

그 결과, 살리노마이신 처리군은 NP가 세포질에서만 발현되었고, 양성 대조군인 EGCG 처리군은 NP가 전혀 발현되지 않았으며, 리바비린 처리군은 핵 내에서 NP가 약하게 발현되었다(도 5). 이는 EGCG는 바이러스의 세포 내 유입을 억제하고, 리바비린은 바이러스 RNA의 합성을 억제할 뿐, vRNP의 이동에는 관여하지 않으며, 살리노마이신은 vRNP의 핵 내로의 이동을 억제하여, 상기 약물들과는 다른 작용 기전을 나타냄을 제시한다.

5-3. 살리노마이신에 의한 엔도좀-리소좀의 산성화 억제 효과 확인

살리노마이신은 1가 양이온의 이오노포어(ionophore)로서, 공포성 에이티피아제(vacuolar ATPase, V-ATPase)의 양성자 구배(proton gradients) 형성을 억제할 것으로 예측된다. 이에, 전기적 중성 이오노포어인 살리노마이신이 세포 내에서 리소좀, 엔도좀 또는 골지체와 같은 산성을 띄는 기관들을 중화시킬 수 있는지 확인하기 위하여, MDCK 세포를 아크리딘 오렌지(acridine orange)로 염색하여 공초점 형광 현미경을 사진을 찍어 관찰하였다.

구체적으로, MDCK 세포를 35 mm 유리 바닥 디쉬(glass-bottom dishes, Greiner Bio-One, 독일)에 8 × 10⁴ 개/웰로 분주하여 37℃에서 배양하였다. 다음날, 살리노마이신 100 μM, 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, V-ATPase 억제제, Sigma-Aldrich) 100 nM 또는 클로로퀸(chloroquine, 리소좀 내 pH 중화제, Sigma-Aldrich) 100 μM을 1시간 동안 처리하였다. 이후, 아크리딘 오렌지를 최종 농도 4 ㎍/mL로 첨가하여 10분 동안 반응시키고, 들뜸 파장(excitation wavelength) 488 mm, 방출 파장(emission wavelength) 493/560 nm (녹색) 및 590/720 nm (적색) 조건에서 세포를 공초점 형광 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.

그 결과, 대조군에서는 낮은 pH를 나타내는 적색 형광이 나타난 반면, 살리노마이신 처리군은 양성 대조군인 바필로마이신 A1 처리군과 유사하게 적색 형광이 나타나지 않았으며, 클로로퀸 처리군은 황색/녹색의 형광이 나타났다(도 6). 이는 살리노마이신이 세포질 내 소기관들의 pH를 증가시킴을 의미하며, 살리노마이신이 세포 양성자 채널의 경쟁적 저해제로서 작용하여 결과적으로 엔도좀-리소좀의 산성화를 억제할 수 있음을 제시한다.

5-4. 살리노마이신에 의한 엔도좀에서의 vRNP 방출 억제 효과 확인

상기 실험예 3-3에서 확인한 살리노마이신의 엔도좀-리소좀 산성화 억제 효과에 의하여 엔도좀에서의 vRNP 방출이 억제되는지 확인하기 위하여, PR8을 감염시킨 A549 세포(human lung adenocarcinoma, ATCC)의 NP를 염색하여 공초점 형광 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.

구체적으로, A549 세포를 4-웰 챔버 슬라이드에 8 × 10⁴ 개/웰로 분주하여 배양한 후, PR8을 10 MOI로 4℃에서 30분 동안 감염시켰다. PBS로 세척 후, 프로테인 합성 억제제인 CHX(cycloheximide, Sigma-Aldrich)가 10 ㎍/mL로 포함된 MEM에 살리노마이신을 용해시켜 10 μM로 상기 세포에 37℃에서 8시간 동안 처리하였다. 세포 용해액을 NP 및 EEA1(early endosome antigen 1, 초기 엔도좀 마커)에 대한 항체(Cat. #. sc-33585, Santa Cruz Biotechnology) 또는 NP 및 LAMP1(lysosomal-associated membrane protein 1, 후기 엔도좀 마커)에 대한 항체(Cat. #. 9691, Cell Signaling Technology)로 반응시켰다. NP는 알렉사 플루오르 633(Alexa Fluor 633)이 접합된 항-마우스 항체(Invitrogen, 미국)로 검출하고(적색), EEA1 및 LAMP1은 알렉사 플루오르 488이 접합된 항-토끼 항체로 검출하였다(녹색). 핵은 DAPI로 대조염색하였다(청색).

그 결과, 대조군에서는 NP가 핵 내로 모두 이동한 반면, 살리노마이신 처리군에서는 세포질에서 NP가 나타났고, 핵 주변의 초기 또는 후기 엔도좀에 NP가 존재하는 것으로 나타났다(도 7). 이는 CHX에 의해 바이러스의 복제는 억제되어 있으므로, 세포질에서 나타난 NP가 복제된 바이러스의 NP가 아닌 세포 내로 들어온 바이러스의 NP임을 의미한다. 따라서, 이 결과는 살리노마이신 처리에 의해 vRNP가 엔도좀에서 방출되지 못하여 핵 내로 이동하지 못하게 됨을 의미한다.

5-5. 살리노마이신의 바이러스 양성자 채널(proton channel) M2 활성 억제 효과 확인

상기 실험예 3-4에서 확인한 결과에 따라, 살리노마이신이 vRNP의 엔도좀으로부터의 방출에 관여하는 바이러스 단백질 M2에 기능에 미치는 영향을 조사하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 VLPs를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

5-5-1. VLPs의 특성 확인 (1)

상기 실시예 1에서 제조한 VLPs의 동종성(homogeneity)을 확인하기 위하여 동적 광 산란(dynamic light scattering) 분석을 수행하였다(Zetaxizer Nano series, Malvern Instruments).

그 결과, 공 VLP, PR8M2-S VLP 및 PR8M2-R VLP의 평균 지름은 각각 268.3 ± 8.3 nm, 256.8 ± 2.5 nm 및 238.3 ± 5.9 nm로 나타났으며, 크기뿐 아니라 모양에 있어서도 동종성이 있는 것으로 확인되었다(도 8).

5-5-2. VLPs의 특성 확인 (2)

상기 실시예 1에서 제조한 VLPs에서 MVL Gag 유래 p30 캡시드(MVL Gag-derived p30 capsid, CA) 단백질 및 M2 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 마이크로칩 젤 전기영동(microchip gel electrophoresis) 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 VLPs 2 ㎕를 마이크로칩에 로딩하고 전기영동하여 Agilent 2200 TapeStation 시스템(P200 Screen Tape 포함, Agilent Technologies, 미국)으로 분석하였다. 또한, 상기 실시예 1에서 제조한 VLPs를 2 ㎕/웰로 12% SDS-PAGE 젤에 로딩하고 전기영동하였다. CA 단백질은 항-Gag 1차 항체(Cat. #. R187, ATCC)로 반응시킨 후, HRP가 접합된 항-랫드 2차 항체로 검출하였고, myc-His 택(taq)과 융합된 M2 단백질은 항-6× His 택 항체(Cat. #., ab8184, Abcam) 및 HRP가 접합된 항-마우스 2차 항체로 검출하였다.

그 결과, 각 VLPs에서 동일하게 CA 단백질이 발현되었고, 공 VLPs를 제외한 PR8M2-S, PR8M2-R 및 LeeM2 VLPs에서 M2 단백질이 발현되었다(도 9).

5-5-3. 살리노마이신의 바이러스 양성자 채널 M2 활성 억제 효과 확인

상기 실시예 1에서 제조한 각각의 VLPs를 1% FMP-Blue 염료를 포함하는 10 mM HEPES (pH 7.0) 및 150 mM 염화나트륨 완충액에 용해시켜 준비하였다. 양성 대조군으로 공 VLPs를 막에서 양성자를 수송하는 이오노포어인 FCCP(Sigma-Aldrich) 5 μM과 혼합하여 FCCP VLPs를 제조하였다. 양성자 채널 활성을 측정하기 위하여, 상기 각 혼합물들을 단백질 양이 1 ㎍이 되도록 96-웰 블랙 플레이트에 넣고, 아만타딘 100 μM 또는 살리노마이신 100 μM을 상온에서 1시간 처리하였다. 150 mM의 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, pH 4.5, Sigma-Aldrich) 20 ㎕를 첨가하여 각 VLPs를 산성 조건에 노출시킨 후, 형광을 총 5분 동안 6초 간격으로 SpectraMax M3 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, 미국)로 들뜸 파장 530 nm 및 방출 파장 565 nm에서 측정하였다.

그 결과, 산성 조건에서 공 VLPs는 막에서 양성자를 천천히 이동시키는 것으로 나타났으며, 약물 처리에 의한 영향은 없었다(도 10A). 양성 대조군으로 FCCP를 첨가하여 제조한 VLPs는 산성 조건 노출 후 36초에 양성자 채널의 활성이 급격히 증가하였으며, 점점 감소하여 평형을 이루었고, 아만타딘 처리에 의한 영향은 없었으나, 살리노마이신을 처리한 경우에는 상기 FCCP VLPs의 급격한 양성자 채널 활성 증가가 완화되었다(도 10B). 이는 전기적 중성인 이오노포어와 전기발생적 이오노포어가 동시에 존재하는 경우, 전기적 중성인 이오노포어의 작용이 더 우세함을 의미한다.

PR8M2-S VLPs 및 PR8M2-R VLPs에서도 산성 조건에 노출 후 양성자 채널의 활성이 급격히 증가하였으며, PR8M2-S VLPs의 양성자 채널 활성 증가는 아만타딘 처리에 의해 완화되었으나, PR8M2-R VLPs의 양성자 채널 활성 증가는 아만타딘 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 또한, 살리노마이신의 처리는 PR8M2-S VLPs 및 PR8M2-R VLPs 모두의 양성자 채널 활성 증가를 완화시켰으며(도 10C 및 10D), 살리노마이신의 상기 각 VLPs의 양성자 채널 활성 억제 효과는 산성 조건 노출 후 5분째에 각각 54% 및 72%로 확인되었다(도 10E). 이는 살리노마이신이 아만타딘에 대한 내성 여부와 무관하게 M2 양성자 채널 활성을 억제할 수 있음을 의미한다.

또한, LeeM2 VLPs에서도 산성 조건에 노출후 양성자 채널의 활성이 급격히 증가하였으며, 아만타딘 처리에 의한 영향은 없었으나, 살리노마이신 처리에 의해 양성자 채널 활성 증가가 완화되었다(도 10F).

결론적으로, 살리노마이신은 인플루엔자 바이러스 A 및 B에 대한 VLPs의 양성자 채널 활성을 억제할 수 있음을 확인하였다.

5-6. 살리노마이신이 막 융합 활성에 미치는 영향 확인

살리노마이신이 vRNP의 엔도좀으로부터의 방출에 관여하는 또 다른 타겟인 HA2에 작용하는지 확인하기 위하여, PR8에 감염된 Vero E6 세포(African green monkey kidney epithelial cells, ATCC)의 막 융합 활성을 측정하였다.

구체적으로, Vero E6 세포를 12-웰 플레이트에 3 × 10⁵ 개/mL로 배양한 후, PR8을 0.5 MOI로 37℃에서 TPCK-트립신 처리 없이 감염시켰다. 다음날, 바이러스에 감염된 세포에 TPCK-트립신을 DMEM에 용해시켜 5 ㎍/mL 농도로 37℃에서 15분 동안 처리한 후, 살리노마이신 2 μM 또는 항-HA2 항체(Sino Biological) 0.5 ㎍/mL을 DMEM에 용해시켜 처리하고 15분간 더 배양하였다. 1 mM 염화마그네슘(MgCl₂) 및 0.1 mM 염화칼슘(CaCl₂)이 포함된 PBS(PBS-CM)로 세척한 후, 산성(pH 5.6) 또는 중성(pH 7.0)의 PBS-CM에 용해시킨 각 약물을 처리하여 15분간 더 배양하였으며, 상기 산도는 시트르산(citric acid)으로 조절하였다. 3시간 동안 세포간 융합이 일어나도록 한 후, 세포를 96% 에탄올로 고정시키고, 김자(Giemsa, Sigma-Aldrich)로 염색하여 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.

그 결과, 산성 조건에서 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 다수의 핵이 결합한 큰 융합세포가 관찰되었고, 양성 대조군인 항-HA 항체 투여군에서는 세포간 융합이 억제된 반면, 살리노마이신 처리는 세포간 융합에 영향을 주지 않았다(도 11). 이는 세포간 융합 단백질로서 기능하는 HA2는 살리노마이신의 타겟이 아님을 의미한다.

실험예 6. 인플루엔자 바이러스 A 감염 세포주에서 살리노마이신 및 OSV-C의 항바이러스 상승 효과 확인

살리노마이신 및 OSV-C의 항바이러스 상승 효과를 확인하기 위하여, 아이소볼로그램(isobologram) 분석(Quinton L. Fivelman et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004:4097-4102, 2004)을 수행하였다.

구체적으로, 살리노마이신 및 OSV-C의 야생형 PR8 및 뉴라미니다제의 H275Y 점 돌연변이가 유도된 재조합 PR8 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정하여 EC₅₀ 값을 계산하였다. 살리노마이신 및 OSV-C의 야생형 PR8 바이러스에 대한 EC₅₀은 각각 1.81 및 0.07 μM이었고, 재조합 PR8 바이러스에 대한 EC₅₀은 각각 2.37 및 3.52 μM이었다. 이후, 살리노마이신 및 OSV-C를 5:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4, 및 0:5의 비율로 혼합하여 준비하고, 각 혼합물을 2배씩 연속 희석(serial dilutions)하여 준비하였으며, 각 혼합물 별 농도는 각 단일 화합물의 EC₅₀ 값이 농도 범위 중 중간 정도에 위치하도록 하였다. 상기 준비한 혼합 비율별 6종 혼합물의 농도별 시료를 이용하여 상기 각 단일 화합물의 경우와 동일하게 항바이러스 활성에 대한 EC₅₀ 값을 측정하였으며, 하기 식으로 FIC₅₀(50% 분할 저해 농도, fractional inhibitory concentraion 50) 값의 합을 계산하고, 이를 각 화합물의 혼합 비율에 따른 그래프로 나타내었다:

∑FIC₅₀ = (혼합물 속 살리노마이신의 EC₅₀)/(살리노마이신 단독의 EC₅₀) + (혼합물 속 OSV-C의 EC₅₀)/(OSV-C 단독의 EC₅₀).

그 결과, 살리노마이신 및 OSV-C 혼합물의 야생형 PR8 바이러스에 대한 평균 ∑FIC₅₀ 값은 0.79, 재조합 PR8 바이러스에 대한 평균 ∑FIC₅₀ 값은 0.63으로 모두 기준치인 0.8 이하로 나타나 두 화합물을 혼합하면 상기 바이러스들에 대하여 상승된 항바이러스 효과가 나타남을 확인하였다(도 12).

실험예 7. 인플루엔자 바이러스 A 감염 마우스 모델에서 살리노마이신 및 OSV-P 병용 투여에 의한 항바이러스 효과 확인

상기 실험예들에서 확인한 세포 수준에서의 살리노마이신의 항바이러스 효과를 동물 모델에서 검증하고, 살리노마이신 및 OSV-P의 병용 투여에 의한 항바이러스 상승 효과를 확인하고자, 인플루엔자 바이러스 A 감염 마우스 모델을 이용하였다.

7-1. 인플루엔자 바이러스 A 감염 마우스 모델 제작 및 약물 투여 일정

6주령에서 7주령의 암컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오사(대한민국)에서 구입하여 군당 5마리씩 분류하여 비강 내로 50%의 마우스 치사량(50% mouse lethal doses, MLD₅₀)의 5배(마리당 90 플라크 형성 단위(plaque forming units, PFU)에 해당)로 maPR8을 투여하였다. 항바이러스 약물로 OSV-P(0.1 또는 10 mg/kg, 한미약품, 대한민국), 살리노마이신(10 mg/kg) 및 두 약물의 혼합물(OSV-P 0.1 mg/kg 및 살리노마이신 10 mg/kg)을 0.5% CMC에 용해시켜 준비하였다. 상기 약물을 바이러스 감염 4시간 전, 감염 4시간 후에 경구투여한 후, 다음 5일 동안 하루에 2번씩 경구투여하였다(도 13A).

7-2. 살리노마이신 및 OSV-P 병용 투여에 의한 마우스의 몸무게 회복 효과 확인

마우스의 몸무게 변화를 바이러스 감염 후 14일까지 관찰하였으며, 마우스 몸무게가 30% 이상 감소된 개체는 한국화학연구원의 동물실험윤리위원회에서 승인받은 가이드라인에 따라 안락사시켰다.

마우스의 몸무게 변화를 측정한 결과, 바이러스 감염 후 마우스의 몸무게가 계속 감소하여 8일째에 70%까지 감소하였고, OSV-P 고농도 투여군에서는 감염 3일째부터 음성 대조군에 비하여 유의한 회복을 보였으나, OSV-P 저농도 투여군 및 살리노마이신 투여군에서는 몸무게 회복 효과가 없었다. OSV-P 및 살리노마이신의 병용 투여군에서는 감염 4일째부터 음성 대조군에 비하여 유의한 회복을 보였다(도 13B).

7-3. 살리노마이신 및 OSV-P 병용 투여에 의한 마우스의 생존율 증가 효과 확인

마우스의 생존율을 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어를 이용하여 Kaplan-Meier 생존곡선을 작성하여 나타내었다.

마우스의 생존율을 측정한 결과, 음성대조군은 감염 6일째부터 생존율이 감소하기 시작하여 감염 9일째에 모두 사망하였고, OSV-P 저농도 투여군 및 살리노마이신 투여군에서도 감염 9일째에 생존율이 0%에 이르렀다. 반면, OSV-P 고농도 투여군은 생존율이 100%로 유지되었으며, OSV-P 및 살리노마이신의 병용 투여군에서는 최종 생존율이 80%로 나타났다(도 13C).

결론적으로, 살리노마이신 및 OSV-P 저농도 투여군에서는 항바이러스 효과가 나타나지 않았으나, 동일한 농도로 살리노마이신 및 OSV-P를 병용 투여한 경우에는 시너지 효과에 따른 우수한 항바이러스 효과를 보였다. 이는 살리노마이신이 OSV-P와 같은 항바이러스제의 유효 용량을 낮출 수 있는 보조제로 사용될 수 있음을 제시한다.

실험예 8. OSV-P 내성 인플루엔자 바이러스 A 감염 마우스 모델에서 살리노마이신 및 OSV-P 병용 투여에 의한 항바이러스 효과 확인

상기 실험예 8에서 확인한 살리노마이신 및 OSV-P 병용 투여에 의한 항바이러스 상승 효과가 OSV-P 내성 인플루엔자 바이러스 A 감염 마우스 모델에서도 재현되는지 확인하고자, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

8-1. OSV-P 내성 인플루엔자 바이러스 A 감염 마우스 모델 제작 및 약물 투여 일정

maPR8 바이러스 대신 OSV-P 내성 인플루엔자 바이러스 A인 rgA/Korea/09/2009Δ53-60 바이러스를 MLD₅₀의 5배(마리당 1.5 ×10⁵ PFU에 해당)로 투여하고, 약물을 OSV-P(10 mg/kg 또는 100 mg/kg), OSV-P(10 mg/kg 또는 100 mg/kg) + 살리노마이신(10 mg/kg), 또는 살리노마이신(10 mg/kg)으로 투여한 것을 제외하고는 상기 실험예 7-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 마우스 모델을 제작하고 약물을 투여하였다.

8-2. 살리노마이신 및 OSV-P 병용 투여에 의한 마우스 몸무게 회복 효과 확인

마우스의 몸무게 변화를 측정한 결과, 바이러스 감염 후 마우스의 몸무게가 계속 감소하여 8일째에 70%까지 감소하였고, OSV-P 저농도 투여군에서는 살리노마이신과의 병용 투여 여부에 따른 유의한 차이가 없었으나, OSV-P 고농도 투여군에서는 OSV-P 단독 투여에 비하여 살리노마이신 병용 투여에 의해 유의한 몸무게 회복 효과를 보였다(도 14A).

8-3. 살리노마이신 및 OSV-P 병용 투여에 의한 마우스의 생존율 증가 효과 확인

마우스의 생존율을 측정한 결과, 음성대조군은 감염 7일째부터 생존율이 감소하기 시작하여 감염 8일째에 모두 사망하였고, OSV-P 고농도 단독, 또는 OSV-P 및 살리노마이신 병용 투여군은 100%의 생존율을 보였으나, OSV-P 저농도 단독 투여군에서는 최종 생존율이 60%인 반면, OSV-P 저농도 및 살리노마이신 병용 투여군에서는 100%의 생존율을 보여 살리노마이신 병용 투여에 의한 마우스 생존율 증가 효과를 확인하였다(도 14B).

결론적으로, OSV-P 내성 인플루엔자 바이러스 A 감염 마우스 모델에서는 상기 실험예 7의 결과와 달리 OSV-P가 항바이러스 효과를 나타내기 위해 더 높은 농도가 필요했으며, 살리노마이신 단독 투여에 의해서는 본 모델에서는 항바이러스 효과가 없었다. 그러나, OSV-P 단독 투여에 비하여 OSV-P 및 살리노마이신의 병용 투여에 의하여 마우스 몸무게 회복 효과 및 생존율 증가 효과가 더욱 증가함을 확인하였다. 이는 살리노마이신이 OSV-P 내성 인플루엔자 바이러스 A에 대해서도 OSV-P와 같은 항바이러스제의 유효 용량을 낮출 수 있는 보조제로 사용될 수 있음을 제시한다.

Claims

살리노마이신(salinomycin)을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제로서,
상기 보조제는 오셀타미비르(oseltamivir)의 활성을 증진시키는, 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형인, 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제.
제1항에 있어서, 상기 오셀타미비르는 오셀타미비르 카르복실레이트(oseltamivir carboxylate, OSV-C) 또는 오셀타미비르 인산염(oseltamivir phosphate, OSV-P)인, 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 보조제.
약제학적으로 치료가능한 양의 살리노마이신을 유효성분으로 함유하는 제1성분; 및
약제학적으로 치료가능한 양의 오셀타미비르를 유효성분으로 함유하는 제2성분을 포함하는 인플루엔자 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
제8항에 있어서, 상기 제1성분 및 제2성분이 순차 또는 동시로 투여되는, 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
제8항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형인, 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
제8항에 있어서,
상기 오셀타미비르는 오셀타미비르 카르복실레이트(oseltamivir carboxylate, OSV-C) 또는 오셀타미비르 인산염(oseltamivir phosphate, OSV-P)인, 바이러스성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 키트.