KR102220832B1 - 세포 독성이 감소된 생체흡수성 뼈 지혈제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기존의 생체흡수성 뼈 지혈제의 세포 독성을 감소시키기 위하여 천연고분자인 CMC, 젤라틴, 키토산을 첨가하여 세포 독성이 2등급 이하로 감소된 생체흡수성 뼈 지혈제의 제조방법에 관한 것이다.

Description

세포 독성이 감소된 생체흡수성 뼈 지혈제의 제조방법 {Preparation of bioabsorbable bone hemostatic to reduce cytotoxicity}

본 발명은 뼈 지혈제의 제조방법에 관한 것으로, 자세하게는 기존의 생체흡수성 뼈 지혈제의 세포 독성을 감소시키기 위하여 천연고분자인 CMC, 젤라틴, 키토산을 첨가하여 세포 독성이 2등급 이하로 감소된 생체흡수성 뼈 지혈제의 제조방법에 관한 것이다.

뼈는 사람의 골격을 이루는 가장 단단한 조직으로, 이러한 뼈 내에는 골수가 존재하여, 이곳에서 적혈구, 백혈구 등의 혈구를 생성하고 신체에 있어 무기질 대사에 관여하는 등 중요한 역할을 한다.

이러한 뼈는 골절되거나 외과적 수술 시에 대량의 출혈이 발생하기도 하며, 과도한 출혈은 수술을 진행하는 외과 의사의 시야를 방해하여 어려움을 야기할 수 있고, 출혈이 많음에 따라 수혈이 요구될 수도 있다. 이뿐 아니라 수술 후 감염 반응, 염증 반응 또는 합병증 등이 문제가 발생할 수 있어 뼈 출혈시 효과적인 지혈이 중요하다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 1892년에 Parker와 Horsley에 의해 뼈 왁스(Bone wax)가 처음 등장하였다. 뼈 왁스는 뼈의 표면에 달라붙어 출혈이 발생하는 부분을 즉각적으로 막는 가장 쉽고 일반적인 방법으로, 뼈 왁스에 사용되는 소재는 주로 밀랍으로 구성되어 있다.

그러나 이러한 밀랍은 체내에서 흡수되지 않으며 여러 가지 부작용이 발생하는 것으로 알려졌다. 대표적으로 체내에서 이물질로 남아 뼈의 치유를 방해하고, 염증 반응을 발생시킬 뿐 아니라 감염 반응을 더 강하게 하여 감염률을 증가시키는 부작용이 임상 논문을 통해 보고되고 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 수술 시에 손상된 뼈로부터 출혈을 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 수술 후에 인체 내에서 서서히 용해되어 흡수 가능하며, 정상적인 뼈의 치유과정을 저해하거나 악영향을 끼치지 않고, 뼈의 재생을 촉할 수 있는 생체흡수성 고분자를 사용한 생체흡수성 뼈 지혈제가 각광을 받고 있다.

하지만, 생체흡수성 뼈 지혈제는 세포 독성이 4등급으로 높아 생체적합성이 뛰어나지 못하다는 단점이 지적되어 왔다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0084265호(2014.07.04)

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 창출된 것으로, 본 발명의 목적은 polyethyleneglycol-polypropyleneglycol 공중합체인 폴록사머를 출발물질로 사용하고, 폴록사머의 세포 독성을 감소시키기 위해 생체 친화성을 갖는 천연고분자인 carboxymethyl cellulose(CMC)를 첨가하여 세포 독성이 감소된 생체흡수성 뼈 지혈제의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 위해 본 발명은 뼈 지혈제의 제조방법에 있어서, 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 폴록사머 407 및 폴록사머 403과, 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG과 혼합물에 천연고분자인 카복시메틸셀룰로스를 투여하여 혼합물을 형성하는 단계; 상기 혼합물을 가열하며 교반하는 단계; 교반된 혼합물 몰드에 부어 냉각하는 단계; 로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

이때 상기 혼합물을 형성하는 단계는, 폴록사머 403 100 중량부에 대하여 폴록사머 407 57 ~ 61 중량부를 혼합하고, 폴록사머 407 100중량부에 대하여 PEG-ran-PPG 100 ~ 500 중량부와, 카복시메틸셀룰로스 200 ~ 500 중량부를 혼합하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 교반하는 단계는, 110 ~ 130℃에서 7 ~ 9시간 동안 교반하여 완전히 용해시켜 기포를 제거하여 액상 용액을 만드는 것이 바람직하다.

또한, 상기 냉각하는 단계는, 상온에서 11 ~ 13시간 냉각시키는 것이 바람직하다..

본 발명을 통해 제조된 뼈 지혈제는 반죽성 및 발림성이 뛰어나 절단되거나 금이 간 뼈로부터 출혈을 효과적으로 억제할 수 있고, 인체 내에서 서서히 용해되어 흡수되므로 수술 후 생체 내에 잔존하지 않아 이물반응이 발생하지 않으며, 세포 독성이 적어 생체적합성이 뛰어난 효과를 제공한다.

도 1은 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 공중합체에 CMC 첨가량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 제조 공정도,
도 2는 CMC의 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 사진,
도 3은 CMC 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진,
도 4는 CMC 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진,
도 5는 CMC 첨가량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프,
도 6은 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 공중합체에 gelatin 첨가량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 제조 공정도,
도 7은 gelatin 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 사진,
도 8은 gelatin 함유량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진,
도 9는 gelatin 함유량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진,
도 10은 gelatin 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프,
도 11은 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 공중합체에 Chitosan 첨가량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 제조 공정도,
도 12는 Chitosan 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제 사진,
도 13은 Chitosan 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진,
도 14는 Chitosan 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진,
도 15는 다른 양의 Chitosan 첨가량이 뼈 지혈제의 세포 독성에 미치는 영향을 나타낸 그래프,
도 16은 P403과 P407을 이용한 뼈 지혈제의 제조 공정도,
도 17은 P407의 첨가량 변화에 따라 제조된 뼈 지혈제 사진,
도 18은 P403의 첨가량 변화에 따라 제조된 뼈 지혈제 사진,
도 19는 P403과 P 407의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진,
도 20은 P403과 P407의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진,
도 21은 P403과 P407의 첨가량을 변화시켜 제조한 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프,
도 22는 P407과 PEG-ran-PPG의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 제조 공정도,
도 23은 P407과 PEG-ran-PPG의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 사진,
도 24는 P407과 PEG-ran-PPG의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 사진,
도 25는 PEG-ran-PPG와 P407의 첨가량을 변화시켜 제조한 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진,
도 26은 PEG-ran-PPG와 P407의 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진,
도 27은 PEG-ran-PPG와 P407의 첨가량을 변화시켜 제조한 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프,
도 28은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 제조 공정도,
도 29는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 사진,
도 30은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진,
도 31은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진,
도 32는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프,
도 33은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 관찰한 광학현미경 사진,
도 34는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 제조 공정도,
도 35는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 사진,
도 36은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진,
도 37은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진,
도 38은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프,
도 39는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 지혈제의 세포 독성을 관찰한 광학현미경 사진,
도 40은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 제조 공정도,
도 41은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 사진,
도 42는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진,
도 43은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진,
도 44는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성 그래프,
도 45는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 지혈제의 세포 독성을 관찰한 광학현미경 사진이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명 세포 독성이 감소된 생체흡수성 뼈 지혈제의 제조방법을 구체적으로 설명한다.

생체흡수성 뼈 지혈제의 소재로 polyethyleneglycol-polypropyleneglycol 공중합체(PEG-PPG Copolymer)인 폴록사머(Poloxamer)가 주로 사용된다. 폴록사머의 경우 PEG-PPG-PEG 삼중 블록 공중합체로써 [화학식 1]에 나타난 것과 같이 소수성을 갖는 하나의 poly(propyleneglycol)와 친수성을 갖는 두 개의 poly(ethyleneglycol)로 구성되어 있다. 폴록사머는 인체 내에서 흡수되지 않으며, 체내에서 이물 반응이 적고, 체내에서 서서히 용해되어 분해 및 흡수되어 체외로 배출이 이루어진다.

본 발명에서는 세포 독성에 대해 우수한 효과를 보이는 체내 흡수성 뼈 지혈제를 개발하고자 하였으며, polyethyleneglycol-polypropyleneglycol 공중합체인 폴록사머를 출발물질로 사용하였다. 또한, 폴록사머의 세포 독성을 감소시키기 위해 생체 친화성을 갖는 천연고분자인 carboxymethyl cellulose(CMC), gelatin, Chitosan을 첨가하여 세포 독성이 2등급 이하로 감소된 생체 흡수성 뼈 지혈제를 개발하고자 하였다.

1. 제조 방법

1) 제조 재료

뼈 지혈제의 제조를 위한 출발물질로서 위의 그림 1로 나타난 생체흡수성의 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 Poloxamer 407(P407, oxyethylene 71.5-74.9 %, Sigma Aldrich)과 Pluronic^® P-123(P403, average

~5,800, Sigma Aldrich)을 사용하였고, 또한 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG(average

~12,000, Sigma Aldrich)를 사용하였다. 한편 세포 독성을 감소시키기 위한 천연고분자 첨가물로써 아래 [화학식 2]로 나타낸 Carboxymethyl cellulose[CMC, {C₆H₇O₂(OH)_x(OCH₂COONa)_y}_n, n=500, TCI]와 gelatin(G1890, Sigma Aldrich)과 [화학식 3]으로 나타낸 Chitosan(448869, mol wt 50,000-190,000, Sigma Aldrich)을 사용하였다.

2) 제조 방법

뼈 지혈제를 제조하기 위하여 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체와 천연고분자를 혼합한 후 120℃에서 8시간 동안 교반하여 완전히 용해시켜 기포를 제거하여 액상 용액을 제조하였다. 이후 액상 용액을 몰드에 붇고, 상온에서 12시간 냉각시켜 뼈 지혈제를 제조하였다.

3) 분석방법

가. 반죽성 평가

뼈 지혈제의 반죽성을 평가하기 위하여 뼈 지혈제의 일정량을 떼어 구형의 형태로 만들었으며, 구형으로 반죽 정도의 용이성에 따라 3등급(O: 좋음, △: 보통. X: 나쁨)으로 분류하였다.

나. 발림성 평가

뼈 지혈제의 발림성을 평가하기 위하여 구의 형태로 제조된 뼈 지혈제를 기재 위에 얇게 펴 바르고, 이의 용이성에 따라 3등급(O: 좋음, △: 보통. X: 나쁨)으로 분류하여 평가하였다.

다. 현미경 관찰 및 MTT 세포 독성 평가

실험에 사용할 시료를 용출하기 위하여 뼈 지혈제 4g에 20ml의 1XMEM (hyclone)을 넣었다. 대조군 샘플로 시료가 포함되지 않는 1XMEM도 함께 용출한 뒤, 모든 용출액을 진탕 항온수조(BS-21, JEIO TECH)에서 37℃, 24시간 shaking 하였다. 24시간 용출 후 3,000rpm, 3분 동안 원심분리한 뒤 상층 액만 추출하여 실험에 사용하였다.

Sub-culture된 L929 Cell을 counting하고 4.5X10⁴ cells씩 24 well plate에 1㎖씩 분주하였다. Cell seeding 24시간 뒤 준비된 시료 용출 액을 각 well 당 1㎖씩 첨가하였다. 용출액 처리 24시간 후 광학 현미경으로 사진촬영을 하고 MTT reagent를 200㎕(배지의 1/10)씩 분주하였다. 2시간 동안 incubator(37℃)에서 반응시킨 후 cell이 suction되지 않도록 pipet을 이용하여 배지를 제거한 뒤 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 well당 1㎖씩 분주했다. Pipetting 후 각 well당 200㎕씩 96 well로 옮겨 microplate reader(Model 680, BIO-RAD)에서 570㎚ 파장으로 측정하여 대조군과 비교하여 세포 독성을 평가하였다.

2. 제조 결과

1) 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 공중합체에 CMC 첨가 효과

본 실시예에서는 [표 1]과 같이 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 P407과 P403 및 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 CMC를 첨가하였으며, 이때 CMC의 첨가량 변화가 얻어진 뼈 지혈제의 외관, 반죽성, 발림성 및 세포 독성에 미치는 영향을 살펴보았다.

도 1은 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 공중합체에 CMC 첨가량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 제조 공정도로서, 제조 공정은 도 1과 같이 P403, P407, PEG-ran-PPG에 CMC를 첨가하고, 이를 120℃에서 8시간 동안 80 rpm으로 교반시켜 얻어진 액상용액을 몰드에 부은 뒤, 25℃에서 12시간 동안 냉각시켜 고형의 뼈 지혈제를 제조하였다.

Sample Name	P403	P407	PEG-ran-PPG	CMC	조작성	발림성
C-0	11g	6.5g	7.5g	0g	△	△
C-1	11g	6.5g	7.5g	2.5g	△	△
C-2	11g	6.5g	7.5g	5g	△	△
C-3	11g	6.5g	7.5g	15g	○	○
C-4	11g	6.5g	7.5g	25g	○	○

도 2는 CMC의 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 사진으로, (a) C-0, (b) C-1, (c) C-2, (d) C-3, (e) C-4이며, [표 1]과 같이 CMC의 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 외관을 나타낸다. 도 2(a)의 CMC을 첨가하지 않은 뼈 지혈제는 하얀색을 보인 반면, 도 2(b-e)와 같이 CMC를 첨가한 경우에는 연노란색을 나타내었다. 이는 CMC의 고유의 색에 의한 것으로 CMC 첨가량이 증가함에 따라 연노란색이 진해졌다.

도 3은 CMC 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진으로, (a) C-0, (b) C-1, (c) C-2, (d) C-3, (e) C-4로, [표 1]과 같이 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조한 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 결과이다.

도 3(a-c)는 각각 CMC를 첨가하지 않은 경우와 CMC를 2.5g, 5g을 첨가한 경우로서 구형으로 제조하는 동안 끈적이는 현상을 보였으며, 구형 표면이 매끄럽지 않았다. 반면 도 3(d)와 (e)는 CMC를 각각 15g, 25g 첨가한 경우로서 구형으로 제조하는 동안 단단하며, 끈적임이 적어 손에 거의 묻어나지 않아 구의 형태로 반죽이 용이한 우수한 반죽성을 보여주었다. 특히 CMC 25g을 첨가한 경우에는 손에 묻어남이 전혀 없었으며, 구형 표면이 매우 매끄러웠다. 전체적으로 CMC의 첨가량이 증가할수록 단단해져 반죽이 용이해지고, 끈적임이 감소하는 현상을 보였다.

도 4는 CMC 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진으로, (a) C-0, (b) C-1, (c) C-2, (d) C-3, (e) C-4이다.

도 4(a-c)는 CMC를 각각 0g, 2.5g, 5g을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 경우로 기재 위에 얇게 발라졌으나, 발림성 평가 후의 제거 시 기재 위에 밀착되어 제거하기 어려웠다. 반면, 도 4(d-e)는 각각 CMC를 15g, 25g을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 경우로 기재 위에 두껍게 잘 발려졌으며, 발림성 평가 후 기재 위에서 끈적임 없이 잘 제거되었다.

도 5는 CMC 첨가량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프로서, [표 1]과 같이 CMC 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 평가한 그래프이다.

CMC를 첨가하지 않은 경우 세포 생존율은 9.0%의 낮은 수치를 보였다. 또한, CMC를 2.5g, 5g, 15g을 첨가하여 제조하였을 경우에는 각각 8.1%, 8.1%, 11.7%의 낮은 세포 생존율을 보였다.

그러나 CMC를 25g으로 과량 첨가하였을 경우는 세포 생존율이 24.2%로 다소 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는 CMC의 생체친화성이 우수하기 때문으로 CMC 함량이 증가할수록 세포 생존율이 증가하는 것으로 판단된다. 그러나 전반적으로 25% 이하의 낮은 수치를 보여 세포 독성이 높은 것을 알 수 있었다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 P407과 P403 및 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 CMC를 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 CMC를 15∼25g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다. 또한 CMC 첨가량이 증가할수록 얻어진 뼈 지혈제의 세포 생존율은 증가하나 전반적으로 25% 이하의 낮은 수치를 보여 세포 독성이 높은 것을 알 수 있었다.

2) 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 공중합체에 gelatin 첨가 효과

본 실시예에서는 [표 2]와 같이 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 P407과 P403 및 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 gelatin을 첨가하였으며, 이때 gelatin의 첨가량 변화가 얻어진 뼈 지혈제의 외관, 반죽성, 발림성 및 세포 독성에 미치는 영향을 살펴보았다.

도 6은 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 공중합체에 gelatin 첨가량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 제조 공정도로서, 제조 공정은 도 6와 같이 P403, P407, PEG-ran-PPG에 gelatin을 첨가하고, 이를 120℃에서 8시간 동안 80 rpm으로 교반시켜 얻어진 액상 용액을 몰드에 부은 뒤, 25℃에서 12시간 동안 냉각시켜 고형의 뼈 지혈제를 제조하였다.

Sample Name	P403	P407	PEG-ran-PPG	Gelatin	조작성	발림성
G-0	11g	6.5g	7.5g	0g	△	△
G-1	11g	6.5g	7.5g	2.5g	△	△
G-2	11g	6.5g	7.5g	5g	△	△
G-3	11g	6.5g	7.5g	15g	○	○
G-4	11g	6.5g	7.5g	25g	○	○

도 7은 gelatin 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 사진으로, (a)g-0, (b)g-1, (c)g-2, (d)g-3, (e)g-4이며, [표 2]와 같이 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조한 뼈 지혈제의 외관을 나타낸 사진이다. 도 7(a)에서 보듯이 gelatin을 첨가하지 않은 뼈 지혈제는 흰색을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 반면 도 7(b-e)와 같이 gelatin을 첨가한 뼈 지혈제의 경우 전체적으로 연노란색을 보였으며, gelatin의 함량이 증가함에 따라 연노랑색이 더욱 짙어지는 것을 알 수 있었는데 이는 gelatin의 고유한 색에 의한 것으로 추정된다.

도 8은 gelatin 함유량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진으로, (a)g-0, (b)g-1, (c)g-2, (d)g-3, (e)g-4이며, [표 2]와 같이 gelatin 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가를 실시한 사진이다. 도 8(a), (b), (c)는 각각 gelatin을 0g, 2.5g, 5g 첨가하여 제조한 경우로서 구형으로 반죽하는 동안 끈적이는 성질로 인하여 표면이 매끄럽지 못한 것을 확인할 수 있었다.

반면, 도 8(d), (e)는 각각 gelatin을 15g, 25g 첨가하여 제조한 경우로서 끈적임이 적어 구의 형태로 반죽하기에 용이하였다. 전체적으로 gelatin이 첨가되었을 때 젖은 모래와 같은 알갱이가 느껴졌다. 또한 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제보다 단단한 물성을 보였다.

도 9는 gelatin 함유량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진으로, (a)g-0, (b)g-1, (c)g-2, (d)g-3, (e)g-4이며, [표 2]와 같이 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 결과이다.

도 9(a), (b), (c)는 gelatin을 각각 0g, 2.5g, 5g을 첨가하여 제조한 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 사진으로 기재 위에 얇게 발라졌으나, 끈적이는 현상이 커서 발림성 평가 후 기재로부터 제거가 어려웠다. 반면 도 9(d), (e)의 gelatin을 각각 15g, 25g을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제는 전체적으로 균일하며 적당한 두께로 발리며, 발림성 평가 후 기재로부터 쉽게 제거되는 것을 알 수 있었다. 또한, gelatin을 첨가한 모든 뼈 지혈제에서 얇게 바를 때 알갱이가 느껴졌으며, gelatin 첨가량이 증가할수록 알갱이가 더욱 많이 느껴졌다.

도 10은 gelatin 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프로, [표 2]와 같이 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 평가한 그래프이다.

도 10에서 보는 것과 같이 gelatin 2.5g, 5g, 15g, 25g을 첨가하여 제조된 경우 각각 7.5%, 7.3%, 5.5%, 8.5%의 세포 생존율을 보였으며, gelatin을 첨가하지 않은 뼈 지혈제(9%)와 비교하였을 때 큰 차이를 보이지 않고 모두 높은 세포 독성을 보여, gelatin의 첨가는 세포 독성 감소에 좋지 못한 영향을 미침을 알 수 있었다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 P407과 P403 및 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 gelatin을 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 gelatin은 15∼25g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다.

그러나 gelatin이 첨가되어 제조된 뼈 지혈제는 모두 10% 이하의 낮은 세포 생존율을 보여, gelatin의 첨가는 세포 독성 감소에 좋지 못한 영향을 미침을 알 수 있었다.

3) 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 공중합체에 Chitosan 첨가 효과

본 실시예에서는 [표 3]과 같이 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 P407과 P403 및 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 Chitosan을 첨가하였으며, 이때 Chitosan의 첨가량 변화가 얻어진 뼈 지혈제의 외관, 반죽성, 발림성 및 세포 독성에 미치는 영향을 살펴보았다.

도 11은 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 공중합체에 Chitosan 첨가량을 변화시켜 얻어진 뼈 지혈제의 제조 공정도로서, 제조 공정은 도 11과 같이 P403, P407, PEG-ran-PPG에 Chitosan을 첨가하고, 이를 120℃에서 8시간 동안 80 rpm으로 교반시켜 얻어진 액상 용액을 몰드에 부은 뒤, 25℃에서 12시간 동안 냉각시켜 고형의 뼈 지혈제를 제조하였다.

Sample Name	P403	P407	PEG-ran-PPG	Chtiosan	조작성	발림성
CH-0	11g	6.5g	7.5g	0g	△	△
CH-1	11g	6.5g	7.5g	2.5g	△	△
CH-2	11g	6.5g	7.5g	5g	△	△
CH-3	11g	6.5g	7.5g	10g	○	○
CH-4	11g	6.5g	7.5g	15g	○	○

도 12는 Chitosan 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제 사진으로, (a) CH-0, (b) CH-1, (c) CH-2, (d) CH-3, (e) CH-4이며, [표 3]과 같이 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 외관을 나타낸 사진이다. 도 12에서 보듯이 Chitosan을 첨가하지 않은 경우는 흰색을 보인 반면, Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제는 노란색을 띄는 것을 알 수 있었는데 이는 Chitosan의 고유색에 의한 것으로 판단되며, Chitosan의 첨가량이 증가함에 따라 노란색이 짙어지는 것을 확인할 수 있었다.

도 13은 Chitosan 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진으로, (a) CH-0, (b) CH-1, (c) CH-2, (d) CH-3, (e) CH-4이며, [표 3]과 같이 Chitosan의 첨가량을 달리하여 제조한 뼈 지혈제의 반죽성을 평가한 결과이다. 도 13(a), (b), (c)는 Chitosan을 각각 0g, 2.5g, 5g씩 첨가한 경우로 구형으로 반죽하는 동안 끈적이는 성질을 보여 구형으로 제조하기가 어려웠으며, 구형 표면이 매끄럽지 못하다는 것을 알 수 있었다.

반면 도 13(d), (e)는 Chitosan을 각각 10g, 15g을 첨가하여 반죽한 경우로 끈적이는 성질이 거의 없어 구형으로 만들기 쉬웠으며, 반죽 시 손에 묻어남이 적고 구형 표면이 매우 매끄러운 것을 알 수 있었다.

도 14는 Chitosan 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진으로, (a) CH-0, (b) CH-1, (c) CH-2, (d) CH-3, (e) CH-4이며, [표 3]과 같이 Chitosan 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 결과이다. 도 14(a), (b), (c)는 Chitosan을 각각 0g, 2.5g, 5g을 첨가하여 제조한 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 사진으로 기재 위에 얇게 발라졌으나, 끈적이는 현상이 커서 발림성 평가 후 기재로부터 제거가 어려웠다.

반면 도 14(d), (e)는 Chitosan을 각각 10g, 15g을 첨가하여 제조된 경우로 전체적으로 기재 위에 균일하며 적당한 두께로 발라졌으며, 발림성 평가 후 기재로부터 쉽게 제거되는 것을 알 수 있었다.

도 15는 다른 양의 Chitosan 첨가량이 뼈 지혈제의 세포 독성에 미치는 영향을 나타낸 그래프로, [표 3]과 같이 다른 양의 Chitosan으로 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 평가한 그래프이다. Chitosan을 각각 2.5g, 5g, 10g, 15g을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제는 각각 8.1%, 9.7%, 14.9%, 13.0%로 낮은 세포 생존율을 보였다. Chitosan의 첨가량이 증가할수록 세포 생존율이 약간 증가하는 것을 알 수 있었으나. Chitosan을 첨가하지 경우(9%)와 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 Chitosan의 첨가는 뼈 지혈제의 세포 생존율 향상에 큰 영향을 미치지 못함을 알 수 있었다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 P407과 P403 및 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 Chitosan을 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 gelatin을 10∼15g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다. 그러나 Chitosan이 첨가되어 제조된 뼈 지혈제는 모두 15% 이하의 낮은 세포 생존율을 보였다.

4) P403과 P407의 조성 변화가 미치는 영향

본 실시예에서는 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P403과 P407의 조성을 [표 4]와 같이 변화시켜 뼈 지혈제를 제조한 후, 조성 변화가 뼈 지혈제의 세포 독성 및 기타 물성에 미치는 영향을 살펴보았다. P403은 왁스 타입이며, P407은 분말 타입이다.

도 16은 P403과 P407을 이용한 뼈 지혈제의 제조 공정도로서, 뼈 지혈제의 제조 공정은 도 16와 같이 P403과 P407을 혼합하고, 이를 120℃에서 8시간 동안 80 rpm으로 교반시켜 액상 용액을 제조하였다. 이후 액상 용액을 몰드에 부은 뒤, 25℃에서 12시간 동안 냉각시켜 고형의 뼈 지혈제를 제조하였다.

Sample Name	P403	P407	조작성	발림성
P-1	10g	10g	△	△
P-2	10g	20g	X	X
P-3	10g	30g	X	X
P-4	10g	40g	X	X
P-5	10g	50g	X	X
P-6	20g	10g	△	△
P-7	30g	10g	△	△
P-8	40g	10g	△	△
P-9	50g	10g	X	X

도 17은 P407의 첨가량 변화에 따라 제조된 뼈 지혈제 사진으로, (a) P-1, (b) P-2, (c) P-3, (d) P-4, (e) P-5이며, [표 4]와 같이 P403의 양을 10g으로 고정시키고, P407의 첨가량을 10∼50g으로 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 외관을 나타낸 사진이다(P-1∼P-5).

도 17에서 보이는 것과 같이 모두 흰색을 나타냈으며, P407의 첨가량 증가에도 불구하고 외형적으로 큰 차이를 보이지 않았다.

도 18은 P403의 첨가량 변화에 따라 제조된 뼈 지혈제 사진으로, (a) P-1, (b) P-6, (c) P-7, (d) P-8, (e) P-9이며, [표 4]와 같이 P407의 양을 10g으로 고정시킨 뒤, P403의 첨가량을 10∼50g으로 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 외관을 나타낸 사진이다. P407의 첨가량을 변화시킨 경우와 마찬가지로 모두 흰색을 나타났으며, P403의 첨가량 증가에도 불구하고 외관상으로 큰 차이를 보이지 않았다.

도 19는 P403과 P 407의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진으로, (a) P-1, (b) P-2, (c) P-3, (d) P-4, (e) P-5, (f) P-6, (g) P-7, (h) P-8, (i) P-9이며, [표 4]와 같이 P403과 P407의 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성을 평가하였다.

도 19(a-e)는 P403의 첨가량을 10g으로 고정시키고, P407의 첨가량을 달리하여(10∼50g) 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가를 실시한 사진이다. P407의 첨가량이 10∼30g인 경우에는(P-1, P-2, P-3) 전체적으로 구형의 형태로 반죽이 가능하였다. P407의 첨가량이 10g인 경우에는(P-1) 조작 초기에는 약간의 단단함이 느껴졌지만, 이후 부드러운 반죽성을 보였다. 반면에 P407의 첨가량이 20g, 30g인 경우(P-2, P-3)에는 매우 단단하여 반죽이 용이하지 못하였다.

또한, P407의 첨가량이 40g, 50g인 경우에는(P-4, P-5) 고분자들이 서로 뭉치지 못하고, 으스러지는 것을 알 수 있었다.

도 19(f-i)의 경우는 P407의 첨가량을 10g으로 고정시키고, P403의 첨가량을 20∼50g으로 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성을 평가한 사진으로, 모든 경우에서 반죽시 구의 형태를 형성하는 것을 알 수 있었다. 또한 P403의 첨가량이 증가함에 따라 부드러워지나, 끈적임이 증가하는 경향을 보였다.

이는 P403이 왁스 타입이기 때문에 첨가량이 증가할수록 끈적이는 성질이 증가하기 때문으로 판단된다. 그러나 P403의 첨가량이 50g으로 과량인 경우(P-9)에는 끈적이는 현상이 심해 구 형태로의 반죽이 어려웠다.

도 20은 P403과 P407의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진으로, (a) P-1, (b) P-2, (c) P-3, (d) P-6, (e) P-7, (f) P-8, (g) P-9이며, [표 4]와 같이 P403과 P407의 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성을 평가하였다.

도 20(a-c)는 P403의 첨가량을 10g으로 고정시키고, P407의 첨가량을 각각 10g, 20g, 30g으로 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 사진으로, 전체적으로 기재 위에 매끄럽게 발리지 않고, 덩어리로 뭉치는 부분이 형성되었으며, 두껍게 발리는 것을 알 수 있었다. 또한 P407을 40g, 50g 첨가한 경우에는(P-4, P-5) 기재 위에 발릴 때 너무 딱딱하고, 으스러지므로 발림성이 나오지 않았다. 전반적으로 P407의 양이 많아질수록 딱딱해져 발림성이 좋지 않았다.

도 20(d-g)는 P407의 첨가량을 10g으로 고정시키고, P403의 첨가량을 20∼50g으로 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 사진으로 P403의 첨가량이 증가할수록 얇게 발려지며 끈적거림을 확인할 수 있었다. 또한, P403의 첨가량이 50g으로 과량인 경우에는 묽은 상태가 되어 너무 얇게 발려지므로 발림성이 좋지 못했다.

도 21은 P403과 P407의 첨가량을 변화시켜 제조한 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프로, [표 4]와 같이 P403과 P407의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 평가한 그래프이다. P403과 P407의 혼합 비율에 상관없이 모든 조성에서 20 % 이하의 낮은 세포 생존율을 보였다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 삼중 블록공중합체인 왁스 타입인 P403과 분말 타입인 P407의 조성을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제는 반죽성 및 발림성에 있어서 모든 조성에서 좋지 못함을 알 수 있었다.

또한, P403과 P407의 혼합 비율에 상관없이 모든 조성에서 20 % 이하의 낮은 세포 생존율을 보였다.

5) P407과 PEG-ran-PPG의 조성 변화가 미치는 영향

본 실시예에서는 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 첨가량을 [표 5]와 같이 변화시켜 뼈 지혈제를 제조한 후 조성 변화가 뼈 지혈제의 외관, 세포 독성, 반죽성 및 발림성에 미치는 영향을 살펴보았다.

도 22는 P407과 PEG-ran-PPG의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 제조 공정도로서, 제조 공정은 도 22와 같이 P407과 PEG-ran-PPG를 혼합하고, 이를 120℃에서 8시간 동안 80 rpm으로 교반시켜 액상 용액을 제조하였다. 그 후 이 액상 용액을 몰드에 부은 뒤, 25℃에서 12시간 동안 냉각시켜 고형의 뼈 지혈제를 제조하였다.

Sample Name	P407	PEG-ran-PPG	조작성	발림성
Pr-1	10g	10g	○	△
Pr-2	10g	20g	○	○
Pr-3	10g	30g	○	○
Pr-4	10g	40g	△	△
Pr-5	10g	50g	△	△
Pr-6	20g	10g	X	X
Pr-7	30g	10g	X	X
Pr-8	40g	10g	X	X
Pr-9	50g	10g	X	X

도 23은 P407과 PEG-ran-PPG의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 사진으로, (a) Pr-1, (b) Pr-2. (c) Pr-3, (d) Pr-4, (e) Pr-5이며, [표 5]와 같이 P407을 10g으로 고정시킨 뒤, PEG-ran-PPG의 첨가량을 10∼50g으로 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 외관을 나타낸 사진이다.

PEG-ran-PPG의 첨가량이 40g까지는 흰색을 보였으나, 50g으로 과량 첨가한 경우 도 23(e)에서 보는 것과 같이 연노란색을 띄는 것을 알 수 있었다.

도 24는 P407과 PEG-ran-PPG의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제의 사진으로, (a) Pr-1, (b) Pr-6, (c) Pr-7, (d) Pr-8, (e) Pr-8이며, [표 5]와 같이 PEG-ran-PPG를 10g으로 고정시키고, P407의 첨가량을 10∼50g으로 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 외관을 나타낸 사진이다. P407의 첨가량과 상관없이 모든 뼈 지혈제는 흰색을 보였다.

도 25는 PEG-ran-PPG와 P407의 첨가량을 변화시켜 제조한 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진으로, (a) Pr-1, (b) Pr-2, (c) Pr-3, (d) Pr-4, (e) Pr-5, (f) Pr-6, (g) Pr-7, (h) Pr-8, (i) Pr-9이며, [표 5]와 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성을 평가한 사진이다.

도 25(a-e)는 P407의 첨가량을 10g으로 고정시키고, PEG-ran-PPG의 첨가량을 각각 10g, 20g, 30g, 40g, 50g으로 변화시켜 제조된 뼈 지혈제로서 PEG-ran-PPG의 첨가량이 10∼30g으로 적당한 경우에는 구형태로의 반죽이 용이하였으나, PEG-ran-PPG의 첨가량이 40g, 50g으로 과량인 경우에는 끈적임이 증가하여 반죽 시 손에 묻어나기 때문에 표면이 매끄럽지 못한 것을 알 수 있었다.

이는 PEG-ran-PPG이 꿀과 같은 액체 타입이므로 첨가량이 증가할수록 끈적거리기 때문으로 판단된다. 반면 도 25(f-i)는 PEG-ran-PPG의 첨가량을 10g으로 고정시키고, P407의 첨가량을 20∼50g으로 변화시킨 것으로 단단하여 구형으로의 반죽이 어려웠으며, 표면이 울퉁불퉁한 양상을 보였다. 이는 P407이 분말 타입이기 때문에 첨가량이 증가할수록 단단해져 반죽이 어려워지는 것으로 판단된다.

도 26은 PEG-ran-PPG와 P407의 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진으로, (a) Pr-1, (b) Pr-2, (c) Pr-3, (d) Pr-4, (e) Pr-5, (f) Pr-6, (g) Pr-7이며, [표 5]와 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 첨가량을 달리하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 결과이다.

도 26(a-e)는 P407의 첨가량을 10g으로 고정시키고, PEG-ran-PPG의 첨가량을 각각 10g, 20g, 30g, 40g, 50g으로 변화시켜 제조한 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 사진으로 PEG-ran-PPG의 첨가량이 10g인 경우에는 잘 발려지나 부분적으로 덩어리가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.

그러나 PEG-ran-PPG의 첨가량이 20g, 30g인 경우에는 뭉치는 부분이 없이 얇게 발리는 것을 확인할 수 있었다.

한편 PEG-ran-PPG의 첨가량이 40g, 50g인 경우에는 너무 얇게 발리는 것을 알 수 있었는데 이는 PEG-ran-PPG 공중합체가 꿀과 같은 액체의 물성을 보이기 때문이다. 도 26(f), (g)는 PEG-ran-PPG의 첨가량을 10g으로 고정시키고, P407을 각각 20g, 30g씩 첨가한 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 사진으로 매우 단단하여 잘 발려지지 않았는데 이는 P407이 가루와 같은 물성을 보이기 때문이다. 또한, P407을 40g, 50g 첨가한 경우에는 너무 단단하여 전혀 발림성이 나타나지 않았다.

도 27은 PEG-ran-PPG와 P407의 첨가량을 변화시켜 제조한 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프로, [표 5]와 같이 PEG-ran-PPG와 P407의 첨가량을 변화시켜 제조한 뼈 지혈제의 세포 독성을 평가한 그래프이다.

PEG-ran-PPG와 P407이 각각 10g씩 첨가된 Pr-1시료는 22.2%의 낮은 세포 생존율을 보였지만, PEG-ran-PPG의 첨가량이 증가할수록 세포 생존율이 증가해 PEG-ran-PPG의 첨가량이 50g인 시료(Pr-5)는 세포 생존율이 68%로 가장 낮은 세포 독성을 보였다.

반면 PEG-ran-PPG의 첨가량을 10g으로 고정시키고, P407의 첨가량을 20∼50g으로 변화시킨 경우에는 세포 생존율이 30% 이하로 높은 세포 독성을 보였다. 따라서 P407 보다는 PEG-ran-PPG의 첨가량 증가가 세포 생존율을 더 향상시키는 것을 알 수 있었다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제는 P407의 첨가량이 10g일 때 PEG-ran-PPG의 첨가량이 20∼30g인 경우가 우수한 반죽성과 발림성을 보임을 알 수 있었다.

또한, P407의 양을 10g으로 고정시킨 경우에는 PEG-ran-PPG의 첨가량이 증가할수록 낮은 세포 독성을 보였다. 반면 PEG-ran-PPG의 첨가량을 10g으로 고정시키고, P407의 첨가량을 변화시킨 경우에는 세포 생존율이 30% 이하로 높은 세포 독성을 보였다.

따라서 P407 보다는 PEG-ran-PPG의 첨가량 증가가 세포 생존율을 더 향상시키는 것을 알 수 있었다.

6) P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 CMC 첨가가 미치는 영향

본 실시예에서는 [표 6]과 같이 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 CMC를 첨가하였으며, 이때 CMC의 첨가량 변화가 얻어진 뼈 지혈제의 외관, 반죽성, 발림성 및 세포 독성에 미치는 영향을 살펴보았다.

도 28은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 제조 공정도로서, 제조 공정은 도 28와 같이 P407, PEG-ran-PPG와 CMC를 혼합한 뒤, 이를 120℃에서 8시간 동안 80 rpm으로 교반시켜 액상 용액을 제조하였다. 제조된 액상 용액을 몰드에 부은 뒤, 25℃에서 12시간 동안 냉각시켜 고형의 뼈 지혈제를 제조하였다.

Sample Name	P407	PEG-ran-PPG	CMC	조작성	발림성
PrC-0	10g	50g	0g	△	△
PrC-1	10g	50g	10g	△	△
PrC-2	10g	50g	20g	○	○
PrC-3	10g	50g	30g	○	○
PrC-4	10g	50g	40g	○	○
PrC-5	10g	50g	50g	○	○

도 29는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 사진으로, (a) PrC-0, (b) PrC-1, (c) PrC-2, (d) PrC-3, (e) PrC-4, (f) PrC-5이며, 이전의 실시예를 통해 68%의 가장 우수한 세포 생존율을 보였던 P407 10g과 PEG-ran-PPG 50g의 혼합물에 [표 6]과 같이 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 사진이다.

도 29(a)에서 보는 것과 같이 CMC를 첨가하지 않은 뼈 지혈제의 경우에는 흰색을 나타내었으나, CMC가 첨가된 뼈 지혈제는 연노란색을 나타내었다. 이는 CMC의 고유의 색에 의한 것으로 보이며, CMC의 첨가량이 증가함에 따라 연노란색이 짙어졌다.

도 30은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진으로, (a) PrC-0, (b) PrC-1, (c) PrC-2, (d) PrC-3, (e) PrC-4, (f) PrC-5이며, [표 6]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성을 평가한 결과다.

도 30에서 보는 것과 같이 CMC가 0g과 10g이 첨가된 경우는 구형으로의 반죽은 가능하나, 표면이 끈적이는 특성으로 인해 반죽 시 손에 묻어나기 때문에 표면이 매끄럽지 못한 반죽성을 보였다.

반면, 도 30(c-f)에서 보이는 것과 같이 CMC를 20g 이상 첨가한 경우는 손에 끈적임이 적어 반죽이 용이하였고, 표면이 매끄러운 것을 확인할 수 있었다. 따라서 반죽성에 있어 CMC는 20g 이상 첨가하는 것이 적합하다고 판단된다.

도 31은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진으로, (a) PrC-0, (b) PrC-1, (c) PrC-2, (d) PrC-3, (e) PrC-4, (f) PrC-5이며, [표 6]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 사진이다.

CMC를 첨가하지 않거나 CMC 10g을 첨가한 뼈 지혈제의 경우에는 너무 얇게 발리는 특성을 보였다. 반면에 도 31(c-f)는 CMC를 각각 20g, 30g, 40g, 50g씩 첨가하여 얻어진 뼈 지혈제로서 전체적으로 고르며 적당한 두께로 발려 좋은 발림성을 보였다. 따라서 발림성에 있어 CMC는 20g 이상 첨가하는 것이 적합하다고 판단된다.

도 32는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프로, [표 6]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 평가한 사진이다.

CMC가 10g, 20g, 30g, 40g, 50g이 첨가된 경우에는 세포 생존율이 각각 46.0%, 45.9%, 50.1%, 63.6%, 87.9%으로 CMC 첨가량에 따라 증가되는 경향을 보여, CMC의 첨가는 뼈 지혈제의 세포 생존율을 향상시킴을 알 수 있었다.

도 33은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 관찰한 광학현미경 사진으로, [표 6]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 CMC를 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 평가한 광학현미경 사진이다.

CMC가 10g, 20g, 30g, 40g, 50g 첨가된 경우에는 각각 2등급, 2등급, 2등급, 1등급, 0등급의 우수한 세포 생존율을 보였다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 CMC를 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 CMC를 20∼50g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다.

또한, CMC 첨가량이 많아짐에 따라 뼈 지혈제의 세포 독성은 감소해 50g이 첨가된 경우에 0등급의 우수한 세포 생존율을 보였다.

7) P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 gelatin 첨가가 미치는 영향

본 실시예에서는 [표 7]과 같이 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 gelatin을 첨가하였으며, 이때 gelatin의 첨가량 변화가 얻어진 뼈 지혈제의 외관, 반죽성, 발림성 및 세포 독성에 미치는 영향을 살펴보았다.

도 34는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 제조 공정도로, 제조 공정은 도 34과 같이 P407, PEG-ran-PPG와 gelatin을 혼합한 뒤, 이를 120℃에서 8시간 동안 80 rpm으로 교반시켜 액상 용액을 제조하였다. 그 후 얻어진 액상 용액을 몰드에 부은 뒤, 25℃에서 12시간 동안 냉각시켜 고형의 뼈 지혈제를 제조하였다.

Sample Name	P407	PEG-ran-PPG	Gelatin	조작성	발림성
PrG-0	10g	50g	0g	△	△
PrG-1	10g	50g	10g	△	△
PrG-2	10g	50g	20g	○	○
PrG-3	10g	50g	30g	○	○
PrG-4	10g	50g	40g	○	○
PrG-5	10g	50g	50g	○	○

도 35는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 사진으로, (a) PrG-0, (b) PrG-1, (c) PrG-2, (d) PrG-3, (e) PrG-4, (f) PrG-5이며, [표 7]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 외관 사진이다.

도 35에서 보는 것과 같이 gelatin이 첨가되지 않은 경우는 흰색을 나타내었으나, gelatin이 첨가된 뼈 지혈제의 경우에는 연노란색을 띄었으며 gelatin의 첨가량이 증가함에 따라 연노란색이 진해짐을 알 수 있었다.

도 36은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진으로, (a) PrG-0, (b) PrG-1, (c) PrG-2, (d) PrG-3, (e) PrG-4, (f) PrG-5이며, [표 7]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성을 평가한 결과다.

도 36(a-b)에서 보는 것과 같이 gelatin이 0g과 10g 첨가된 경우에는 끈적이는 특성으로 인해 반죽 시 손에 붙으므로 구의 형태로 반죽이 어려웠다.

그러나 도 36(c-f)에서 보는 것과 같이 gelatin이 20g 이상 첨가된 뼈 지혈제는 끈적이는 특성이 거의 없어 손에 달라붙지 않으므로 구형으로의 반죽이 용이하고, 표면이 매끄러웠다. 따라서 반죽성에 있어서 gelatin은 20g 이상으로 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단된다.

도 37은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진으로, (a) PrG-0, (b) PrG-1, (c) PrG-2, (d) PrG-3, (e) PrG-4, (f) PrG-5이며, [표 7]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 결과이다.

도 37에서 보는 것과 같이 gelatin을 첨가하지 않은 경우(PrG-0)와 gelatin 10g을 첨가한 경우(PrG-1)는 너무 얇게 발리는 것을 알 수 있었다.

반면, 도 37(c-f)는 각각 gelatin을 20g, 30g, 40g, 50g을 첨가한 뼈 지혈제로서 전체적으로 고르며 적당한 두께로 발려 좋은 발림성을 보였으며, 이는 CMC를 첨가한 뼈 지혈제의 특성과 비슷한 경향을 보였다. 따라서 발림성에 있어 gelatin은 20g 이상 첨가하는 것이 적합하다고 판단된다.

도 38은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 그래프로, [표 7]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성 평가 사진이다.

gelatin을 10g, 20g, 30g, 40g, 50g씩 첨가한 뼈 지혈제는 각각 26.9%, 32.4%, 45.7%, 29.5%, 47.7%의 세포 생존율을 보여 gelatin을 첨가하지 않은 경우의 68%보다 더 좋지 못한 세포 생존율을 보였다. 따라서 gelatin의 첨가는 뼈 지혈제의 세포 독성에 더 나쁜 영향을 주는 것을 알 수 있었다.

도 39는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 지혈제의 세포 독성을 관찰한 광학현미경 사진으로, [표 7]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 gelatin을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 평가한 광학현미경 사진이다.

gelatin이 10g, 20g, 30g, 40g, 50g 첨가된 경우에는 모두 3등급의 좋지 못한 세포 생존율을 보였다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 gelatin을 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 gelatin을 20∼50g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다.

그러나 gelatin이 첨가된 경우에 얻어진 뼈 지혈제는 모두 3등급의 좋지 못한 세포 생존율을 보였다.

8) P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 Chitosan 첨가가 미치는 영향

본 실시예에서는 [표 8]과 같이 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 Chitosan을 첨가하였으며, 이때 Chitosan의 첨가량 변화가 얻어진 뼈 지혈제의 외관, 반죽성, 발림성 및 세포 독성에 미치는 영향을 살펴보았다.

도 40은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 제조 공정도로, 제조 공정은 도 40과 같이 P407, PEG-ran-PPG와 Chitosan을 혼합한 뒤, 이를 120℃에서 8시간 동안 80 rpm으로 교반시켜 액상 용액을 얻었다. 그 후 액상 용액을 몰드에 부은 뒤, 25℃에서 12시간 동안 냉각시켜 고형의 뼈 지혈제를 제조하였다.

Sample Name	P407	PEG-ran-PPG	Chitosan	조작성	발림성
PrCh-0	10g	50g	0g	△	△
PrCh-1	10g	50g	5g	△	△
PrCh-2	10g	50g	10g	○	○
PrCh-3	10g	50g	15g	○	○
PrCh-4	10g	50g	20g	○	△

도 41은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 사진으로, (a) PrCh-0, (b) PrCh-1, (c) PrCH-2, (d) PrCh-3, (e) PrCh-4이며, [표 8]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 외관 사진이다.

도 41에서 보는 것과 같이 Chitosan을 첨가하지 않은 경우는 흰색을 나타내었으나 Chitosan이 첨가됨에 따라 뼈 지혈제는 전체적으로 연노란색을 나타내었는데 이는 Chitosan의 고유의 색에 의한 것으로 판단되며, Chitosan의 첨가량이 증가함에 따라 색이 진해지는 것을 확인할 수 있었다.

도 42는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성 평가 사진으로, (a) PrCh-0, (b) PrCh-1, (c) PrCh-2, (d) PrCh-3, (e) PrCh-4이며, [표 8]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 반죽성을 평가한 결과이다.

Chitosan을 첨가하지 않거나 Chitosan이 5g 첨가된 뼈 지혈제의 경우 끈적이는 성질이 있어 반죽하는데 있어 어려움이 있었으며, 표면이 깨끗하지 못한 것을 확인할 수 있었다.

반면, 도 42(c-e)에 나타난 것과 같이 Chitosan이 10∼20g 첨가된 뼈 지혈제의 경우 Chitosan의 첨가량이 증가함에 따라 끈적임이 적어지며, 반죽이 매우 용이하였다. 따라서 반죽성에 있어서 Chitosan의 첨가량은 10∼20g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단된다.

도 43은 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성 평가 사진으로, (a) PrCh-0, (b) PrCh-1, (c) PrCh-2, (d) PrCh-3, (e) PrCh-4이며, [표 8]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 발림성을 평가한 결과이다.

Chitosan을 첨가하지 않거나 5g 첨가한 경우에는 너무 얇게 발라짐을 확인할 수 있었다. 반면 Chitosan을 10g, 15g 첨가한 경우에는 균일하며 적당한 두께로 발려짐을 알 수 있었다.

또한, Chitosan이 20g 첨가된 경우에는 도 43(e)에서 보이는 것과 같이 균일하게 발라지지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 발림성에 있어서 Chitosan은 10∼15g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단된다.

도 44는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성 그래프이다.

Chitosan을 첨가하지 않고 제조된 뼈 지혈제는 68 %의 높은 세포 생존율을 보인 반면에 Chitosan을 첨가한 뼈 지혈제는 전체적으로 30 % 이하의 낮은 세포 생존율을 보였다. 따라서 Chitosan의 첨가는 뼈 지혈제의 세포 생존율 향상에 있어서 적합하지 않은 것으로 판단된다.

도 45는 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 지혈제의 세포 독성을 관찰한 광학현미경 사진으로, [표 8]과 같이 P407과 PEG-ran-PPG의 혼합물에 서로 다른 양의 Chitosan을 첨가하여 제조된 뼈 지혈제의 세포 독성을 평가한 광학현미경 사진이다.

Chitosan이 5g, 10g, 15g, 20g 첨가된 경우에는 모두 4등급의 좋지 못한 세포 생존율을 보였다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 Chitosan을 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 gelatin을 20∼50g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다. 그러나 Chitosan이 첨가된 경우에 얻어진 뼈 지혈제는 모두 4등급의 좋지 못한 세포 생존율을 보여 Chitosan의 첨가는 뼈 지혈제의 세포 독성에 나쁜 영향을 주는 것을 알 수 있었다.

3. 결론

본 발명에서는 세포 독성에 대해 우수한 효과를 보이는 체내 흡수성 뼈 지혈제를 개발하고자 하였으며, polyethyleneglycol-polypropyleneglycol 공중합체인 폴록사머를 출발물질로 사용하였다. 또한, 폴록사머의 세포 독성을 감소시키기 위해 생체 친화성을 갖는 천연고분자인 carboxymethyl cellulose(CMC), gelatin, Chitosan을 첨가하여 세포독성이 2등급 이하로 감소된 생체 흡수성 뼈 지혈제를 개발하고자 하였다. 이 과정 중 뼈 지혈제의 조성 변화에 따른 반죽성, 발림성 및 세포 독성을 발명하여 다음과 같은 결론을 도출하였다.

1. 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 P407과 P403 및 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 CMC를 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 CMC를 15∼25g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다. 또한 CMC 첨가량이 증가할수록 얻어진 뼈 지혈제의 세포 생존율은 증가하나 전반적으로 25% 이하의 낮은 수치를 보여 세포 독성이 높은 것을 알 수 있었다.

2. 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 P407과 P403 및 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 gelatin을 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 gelatin은 15∼25g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다. 그러나 gelatin이 첨가되어 제조된 뼈 지혈제는 모두 10% 이하의 낮은 세포 생존율을 보여, gelatin의 첨가는 세포 독성 감소에 좋지 못한 영향을 미침을 알 수 있었다.

3. 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록 공중합체인 P407과 P403 및 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 Chitosan을 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 gelatin을 10∼15g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다. 그러나 Chitosan이 첨가되어 제조된 뼈 지혈제는 모두 15% 이하의 낮은 세포 생존율을 보였다.

4. 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 삼중 블록공중합체인 왁스 타입인 P403과 분말 타입인 P407의 조성을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제는 반죽성 및 발림성에 있어서 모든 조성에서 좋지 못함을 알 수 있었다. 또한 P403과 P407의 혼합 비율에 상관없이 모든 조성에서 20 % 이하의 낮은 세포 생존율을 보였다.

5. 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 첨가량을 변화시켜 제조된 뼈 지혈제는 P407의 첨가량이 10g일 때 PEG-ran-PPG의 첨가량이 20∼30g인 경우가 우수한 반죽성과 발림성을 보임을 알 수 있었다. 또한 P407의 양을 10g으로 고정시킨 경우에는 PEG-ran-PPG의 첨가량이 증가될수록 낮은 세포 독성을 보였다. 반면 PEG-ran-PPG의 첨가량을 10g으로 고정시키고, P407의 첨가량을 변화시킨 경우에는 세포 생존율이 30% 이하로 높은 세포 독성을 보였다. 따라서 P407 보다는 PEG-ran-PPG의 첨가량 증가가 세포 생존율을 더 향상시키는 것을 알 수 있었다.

6. 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 CMC를 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 CMC를 20∼50g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다. 또한 CMC 첨가량이 많아짐에 따라 뼈 지혈제의 세포 독성은 감소해 50g이 첨가된 경우에 0등급의 우수한 세포 생존율을 보였다.

7. 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 gelatin을 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 gelatin을 20∼50g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다. 그러나 gelatin이 첨가된 경우에 얻어진 뼈 지혈제는 모두 3등급의 좋지 못한 세포 생존율을 보였다.

8. 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 P407과 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG의 혼합물에 천연고분자인 Chitosan을 첨가한 경우에는 반죽성 및 발림성에 있어서 gelatin을 20∼50g 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다. 그러나 Chitosan이 첨가된 경우에 얻어진 뼈 지혈제는 모두 4등급의 좋지 못한 세포 생존율을 보여 Chitosan의 첨가는 뼈 지혈제의 세포 독성에 나쁜 영향을 주는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

Claims (4)

1. 뼈 지혈제의 제조방법에 있어서,
   폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜-폴리에틸렌글리콜 삼중 블록공중합체인 폴록사머 407 및 폴록사머 403과, 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 이중 랜덤 공중합체인 PEG-ran-PPG과 혼합물에 카르복시메틸셀룰로스, gelatin, Chitosan으로 구성되는 천연고분자를 투입하여 혼합물을 형성하되,
   상기 천연고분자가 투여된 혼합물은 폴록사머 403 100중량부에 대하여 폴록사머 407 57 ~ 61중량부를 혼합하고, 상기 폴록사머 407 100중량부에 대하여 PEG-ran-PPG 100 ~ 500중량부와, 카복시메틸셀룰로스 200 ~ 500중량부 또는 gelatin 100 ~ 200중량부, Chitosan 100~150중량부를 투입하는 단계(S 110);
   상기 혼합물을 110 ~ 130℃에서 7 ~ 9시간 동안 80rpm으로 교반하여 완전히 용해시켜 기포를 제거하여 액상 용액을 만드는 교반 단계(S 120); 및
   상기 교반된 혼합물을 몰드에 부어 상온에서 냉각시키는 냉각단계(S 130); 로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 독성이 감소된 생체흡수성 뼈 지혈제의 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제

Images