KR102220255B1

KR102220255B1 - 수술 후 부갑상선기능저하증 개선 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 치료 방법

Info

Publication number: KR102220255B1
Application number: KR1020200054814A
Authority: KR
Inventors: 최한석; 임윤성; 김광준
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2021-02-26
Also published as: KR20210020754A

Abstract

본 발명은 목 주변 외과수술에 의해 부갑상선 조직 및 부갑상선 주변 혈관 조직이 손상되어 발생하는 부갑상선기능저하증을 개선 또는 치료하기 위한 약학 조성물 및 이를 이용한 수술 후 부갑상선기능저하증의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 조성물은 칼슘 감지 수용체 길항제를 유효성분으로 포함함으로써 신생혈관 증식과 혈관 형성을 통해 손상된 부갑상선 조직의 회복을 도와 부갑상선 호르몬의 분비를 촉진시키고, 나아가 혈중 부갑상선 호르몬의 농도를 정상 범위의 수준으로 증가시킴으로써 저칼슘혈증, 고인혈증 및 고칼슘뇨증을 개선시킬 수 있다. 이러한 조성물의 투여를 통해 부갑상선기능저하증 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있다.

Description

수술 후 부갑상선기능저하증 개선 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 치료 방법{Pharmaceutical Composition for Improving or Treating of Post-surgical Hypoparathyroidism and Method Using The Same}

본 발명은 목 주변 외과수술에 의해 부갑상선 조직 및 부갑상선 주변 혈관 조직이 손상되어 발생하는 부갑상선기능저하증을 개선 또는 치료하기 위한 약학 조성물 및 이를 이용한 수술 후 부갑상선기능저하증의 치료 방법에 관한 것이다.

수술 후 부갑상선기능저하증(post-surgical hypoparathyroidism)은 갑상선 수술 등 목 주변 부위의 외과수술 중 부갑상선의 일부 또는 전체가 제거되거나 부갑상선에 혈류를 공급하는 혈관이 손상되어 발생되는 것으로, 갑상선 수술 후 나타나는 가장 흔한 합병증이며 다른 목 관련 수술을 받은 환자의 상당 비율에서도 발생된다. 이러한 증상은 감지되지 않거나 적정 수준에 미치지 못할 정도로 부갑상선 호르몬(PTH) 수치가 낮아서 저칼슘혈증, 고인혈증 등이 나타날 수 있고, 소변을 통해 칼슘 배출이 증가하는 특징을 나타낸다. 수술 후 발생하는 부갑상선기능저하증은 대개 일시적인 현상이지만, 수술 후 6개월 이상 또는 1년 이상 상태가 지속되면 영구적인 것으로 간주된다. 통계적 연구를 바탕으로 한 메타 분석(meta-analysis)의 결과에 따르면, 일시적인 부갑상선기능저하증은 갑상선절제술을 받은 환자의 19 ~ 38%에 영향을 미치는 반면 영구적인 부갑상선기능저하증은 갑상선절제술을 받은 환자의 최대 3%에 불과한 것으로 나타났다. 그러나, 다른 연구자들은 정의가 불명확하거나, 지속적인 추적 관찰의 실패, 이해 충돌 등의 이유로 인해 부갑상선기능저하증의 유병률이 과소평가되었을 가능성이 있다고 주장한다. 실제로 일부 연구에서는 수술 후 영구적인 부갑상선기능저하증의 유병률이 최대 12%까지로 보고된 바 있었다.

수술 후 부갑상선기능저하증에 대한 기존 치료 방법은 다량의 칼슘과 비타민 D를 평생 보충하는 것인데, 이는 혈중 칼슘 농도를 정상 또는 정상 범위 보다 약간 낮은 수준으로 유지하며 근육 경련, 마비, 손발저림 등과 같은 저칼슘혈증 증세를 호전시킬 수 있으나 과칼슘뇨증, 신장결석, 이소성 석회화 등의 위험이 증가될 수 있다. 또한, 오히려 과량의 칼슘 및 비타민 D를 보충하는 것은 손상된 부갑상선의 회복에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 칼슘과 비타민 D는 부갑상선 세포에서 각각 칼슘 감지 수용체(CaSR), 비타민 D 수용체와 결합하여 부갑상선호르몬(parathyroid hormone; PTH) 분비를 억제하며, 특히 고농도의 비타민 D는 부갑상선 세포의 사멸을 유발할 수 있다.

CaSR는 주로 부갑상선 세포에 발현하는 G 단백질 수용체로, 혈중 Ca²⁺ 농도를 감지하여 PTH 분비를 조절한다. 인간의 칼슘 감지 수용체는 1,078개의 아미노산으로 구성되며, 부갑상선 이외에도 신장, 갑상선 C 세포, 뇌, 골수 세포에서의 발현이 보고되어 있다. CaSR와 리간드인 Ca²⁺가 결합하면, G 단백질과 작용하여 포스포리파아제 C를 활성화하여 이노시톨 3인산의 생성, 세포 내 Ca²⁺ 농도의 상승을 가져오고, 그 결과 PTH의 분비가 억제된다. 이러한 CaSR의 작용을 저해하는 CaSR의 조절자 역할을 하는 물질이 CaSR 길항제(antagonist) 또는 칼실리틱(calcilytic)이다. 부갑상선 세포의 표면에서 CaSR와 결합하는 CaSR 길항제는 세포 내 Ca²⁺의 농도를 감소시키고 PTH 분비에 대한 억제 신호를 길항(antagonism)시킴으로써 결과적으로 PTH를 과발현하고 골형성 촉진 효과를 나타낼 것으로 예상되었다. 이러한 CaSR 길항제의 특징을 바탕으로 하여 반감기가 짧은 몇몇 CaSR 길항제들은 골다공증의 치료를 위해 개발되었고, 그 중 일부가 사람을 대상으로 임상실험이 진행되었다. 그러나, CaSR 길항제들은 사람에서 골밀도 개선 효과가 없었고, 고칼슘혈증에 대한 안전성 우려로 인해 성공한 것은 없었다. 또한, CaSR 길항제가 수술 후 부갑상선기능저하증과 같이 인위적으로 손상된 부갑상선 조직에 미치는 영향에 대해서는 알려진 바가 없었다.

이에 따라, 본 발명자들은 인위적인 수술을 통해 부분적으로 부갑상선이 제거된 모델 (부분 부갑상선제거술 모델)과 그 제거된 부갑상선이 다시 이식된 모델 (전체 부갑상선제거술 및 자가이식 모델)을 이용하여 CaSR 길항제에 의한 PTH 분비 증가, 칼슘과 인의 항상성 정상화 등 손상된 부갑상선 조직의 기능 회복 효과를 확인함으로써 CaSR 길항제를 유효성분을 포함하는 수술 후 부갑상선기능저하증 개선 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 수술 후 부갑상선기능저하증의 치료 방법에 관한 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 양상은 칼슘 감지 수용체 길항제를 유효성분으로 포함하는 수술 후 부갑상선기능저하증 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

여기서, 상기 칼슘 감지 수용체 길항제는 화학식 1의 화합물일 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 희석제를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 부갑상선 호르몬의 분비를 증가시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 조성물을 외과수술에 의해 손상된 부갑상선의 기능 회복이 필요한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 수술 후 부갑상선기능저하증의 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

여기서, 상기 투여는 조성물을 1 내지 30 mg/mL의 농도로 경구 투여하는 것일 수 있다.

상기 방법은 혈중 부갑상선 호르몬 농도를 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 칼슘 감지 수용체 길항제를 유효성분으로 포함하는 수술 후 부갑상선기능저하증 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

부갑상선기능저하증의 가장 흔한 원인은 갑상선 수술 시 갑상선 바로 뒤에 위치한 부갑상선의 일부 또는 전체가 함께 제거되어 발생하는 경우이다. 그 밖의 원인은 크게 선천성과 후천성으로 나눌 수 있는데, 선천적인 원인으로는 부갑상선기능저하증만 독립적으로 생기는 경우뿐만 아니라 디죠지(DiGeorge) 증후군 등 다른 여러 선천성 질환과 동반되어 나타나는 경우도 있다. 본 발명에서는 외과수술에 의해 발생된 부갑상선기능저하증을 개선 또는 치료하기 위한 것으로, 손상된 부갑상선의 기능을 회복시키기 위해 칼슘 감지 수용체 길항제를 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기 칼슘 감지 수용체(CaSR) 길항제는 CaSR 활성을 저해하는 CaSR의 조절자로 작용하는 약제로, 부갑상선 세포의 표면에서 CaSR와 결합하여 PTH 분비를 억제하는 신호를 차단함으로써 PTH 과발현을 유도한다. 본 발명에서는 외과수술 중 부갑상선 일부가 제거되거나, 또는 제거된 부갑상선이 다시 이식된 경우 CaSR 길항제가 신생혈관 증식과 혈관 형성을 통해 부갑상선 조직의 회복을 도와 PTH 분비 등 부갑상선의 분비 기능을 정상 수준 또는 그 이상으로 회복시킨다는 것을 실험을 통해 확인하였다.

상기 CaSR 길항제는 당업계에 알려진 물질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 일례로 선택적 에스트로겐 수용체 변형체(SERM), 비스포스포네이트, 부갑상선 호르몬(PTH) 및 이의 분절 및 유사체, 에스트로겐, 칼시토닌, 합성 스테로이드, 합성 이소플라본, 비타민 D 유도체, 비타민 K 유도체, 스트론튬 염, 카뎁신 K 저해제, αvβ3 인테그린(비트로넥틴) 길항제, 프로스타글란딘(PGE2) 수용체 작용제 및 핵 인자 κB 리간드의 수용체 활성제(RANKL) 저해제 등일 수 있다. 본 발명에서는 CaSR 길항제로 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용하는 것을 특징으로 한다. 하기 화학식 1의 화합물은 골다공증 치료용 CaSR 길항제로서 마이크로에멀젼 사전농축(microemulsion preconcentrate)시 우수한 용해성을 갖는다.

이러한 CaSR 길항제를 포함하는 조성물은 약제학적으로 통상으로 사용되는 담체, 희석제, 기타 약제학적으로 통상으로 허용되는 보조제 등과 혼합하고, 약제학적으로 통상으로 허용되는 제제 형태로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 상기 담체, 희석제 및 보조제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다.

상기 제제의 형태는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형이거나, 또는 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태일 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.

상기 조성물을 투여하는 방법은 약학적으로 유효한 양을 투여하는 것으로, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물의 치료 효과를 증진하기 위해, 일일 투여량은 0.5 내지 50 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 30 mg/kg일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여하거나, 또는 수회 나누어 투여할 수 있다. 투여 경로는 모든 방식으로 가능하며, 일례로 경구 투여하거나, 또는 피하, 동맥, 정맥, 근육내, 복막내, 흉골내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 수술 후 부갑상선기능저하증의 치료 방법을 제공하는 것으로, 구체적으로는 상기 조성물을 외과수술에 의해 손상된 부갑상선의 기능 회복이 필요한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.

상기 포유동물은 인간을 포함하는 포유동물이며, 외과수술 중 부갑상선 일부가 제거되거나, 또는 제거된 부갑상선이 이식되어 부갑상선의 기능이 정상적으로 작동되지 않아 부갑상선 호르몬이 정상 범위로 분비되지 않는 상태이다. 포유동물에 대한 상기 조성물의 투여는 조성물을 1 내지 30 mg/mL의 농도로 경구 투여할 수 있다. 이러한 포유동물에 상기 조성물을 투여할 경우에는 부갑상선 기능이 회복되어 부갑상선 호르몬의 분비가 촉진됨으써 혈중 부갑상선 호르몬 농도가 증가될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 칼슘 감지 수용체 길항제를 유효성분으로 포함함으로써 신생혈관 증식과 혈관 형성을 통해 손상된 부갑상선 조직의 회복을 도와 부갑상선 호르몬의 분비를 촉진시키고, 나아가 혈중 부갑상선 호르몬의 농도를 정상 범위의 수준으로 증가시킴으로써 저칼슘혈증, 고인혈증 및 고칼슘뇨증을 개선시킬 수 있다. 이러한 조성물의 투여를 통해 부갑상선기능저하증 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 조성물의 실험 일정을 나타낸 개략도이다; (a) 실험 일정 1은 부분 부갑상선절제술 모델에서의 AXT914 투여에 관한 것이다. 부분 부갑상선절제술 1주일 후 랫트에게 AXT914 (5 mg/kg 또는 10 mg/kg) 또는 부형제(vehicle)를 2주 동안 매일 경구 투여하였다. 약물 투여 전 (0일; 기준일)과 약물 투여 시작 후 14일째 0, 30, 120, 240, 360, 720분 간격으로 혈액을 채취하였다. 약물 투여 시작 후 13일째 소변을 채취하였다. (b) 실험 일정 2는 전체 부갑상선제거술 및 자가이식 모델에서의 AXT914 투여에 관한 것이다. 전체 부갑상선제거술 및 자가이식 1주일 후 랫트에게 AXT914 (10 mg/kg) 또는 부형제를 3주 동안 매일 경구 투여하였다. 약물 투여 전 (0일; 기준일)과 약물 투여 시작 후 21일째, 28일째 혈액을 채취하였다. (c) 실험 일정 3은 전체 부갑상선제거술 및 자가이식 모델에서의 AXT914 투여에 관한 것이다. 전체 부갑상선제거술 및 자가이식 6일 후 랫트에게 AXT914 (10 mg/kg 또는 20 mg/kg) 또는 부형제를 18일 동안 매주 5일씩 경구 투여하였다. 약물 투여 전 (0일; 기준일)과 약물 투여 시작 후 18일째 혈액을 채취하였다. 약물 투여 시작 후 18일째, 랫트를 죽여 부갑상선이 이식된 흉쇄유돌근(SCM)을 적출하여 조직학적 분석을 수행하였다.
도 2는 실험 일정 1의 부분 부갑상선제거술 모델에서 약물 투여 0일 (기준일), 14일째 측정된 혈중 (a) PTH, (b) 칼슘, (c) 인 수치를 비교한 그래프이다. 결과 값을 평균±SEM으로 나타냈고, one-way ANOVA 및 Fisher's LSD 방법으로 비교하였다; 가짜 수술군 대비 *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, 부형제 투여군 대비 #: P < 0.05, ##: P < 0.01, ###: P < 0.001.
도 3은 실험 일정 1의 부분 부갑상선제거술 모델에서 약물 투여 13일째 측정된 소변 내 칼슘 배출 (칼슘/크레아티닌 비율)을 비교한 그래프이다. 결과 값을 평균±SEM으로 나타냈고, one-way ANOVA 및 Fisher's LSD 방법으로 비교하였다; 가짜 수술군 대비 *: P < 0.05, 부형제 투여군 대비 #: P < 0.05.
도 4는 실험 일정 2의 전체 부갑상선제거술 및 자가이식 모델에서 약물 투여 0일 (기준일), 21일, 28일째 측정된 혈중 (a) PTH, (b) 칼슘, (c) 인 수치를 비교한 그래프이다. 결과 값을 평균±SEM으로 나타냈고, one-way ANOVA 및 Fisher's LSD 방법으로 비교하였다; 가짜 수술군 대비 *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, 부형제 투여군 대비 #: P < 0.05, ##: P < 0.01.
도 5는 실험 일정 3의 전체 부갑상선제거술 및 자가이식 모델에서 적출된 SCM에 대한 H&E 염색 결과이다. 염색된 부갑상선 면적(%)에 대한 결과 값을 평균±SEM으로 나타냈고, one-way ANOVA 및 Turkey's Multiple Comparison 방법으로 비교하였다; 부형제 투여군 대비 *: P < 0.05.
도 6a는 실험 일정 3의 전체 부갑상선제거술 및 자가이식 모델에서 적출된 SCM에 대한 H&E 염색 및 PTH, VEGFA, CD31, FGF2, MCL1, Ki67의 면역조직화학적 염색 결과이다. 도 6b는 염색된 PTH, VEGFA, CD31, FGF2, MCL1, Ki67의 강도(%) 또는 세포 수에 대한 결과 값을 평균±SEM으로 나타냈고, one-way ANOVA 및 Turkey's Multiple Comparison 방법으로 비교하였다; 부형제 투여군 대비 *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001.

이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명의 수술 후 부갑상선기능저하증에 대한 개선 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 용도를 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

1. 재료 및 방법

1-1. 실험동물

9주령 암컷 Wistar 랫트를 ㈜코아텍 (한국)으로부터 구매하였고, 표준 케이지를 사용하여 온도 21 ~ 23℃, 습도 40 ~ 60%인 SPF 공간에서 12시간 명암 조건으로 사육하였다. 랫트에 표준 실험실 사료를 급여하면서 1주일 동안 사육실에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 모든 실험동물 관리 및 실험은 동국대학교 한국동물의학연구소의 규정에 따라 수행되었고, 실험 일정은 동물생명윤리위원회의 승인을 받았다 (AIRB no. 2016-04149, AIRB no. 2019-07188).

1-2. 수술 후 부갑상선기능저하증 랫트 모델 형성

수술 후 부갑상선기능저하증 모델을 구축하기 위해, 1주일간 적응시킨 10주령 랫트를 사용하였다.

부갑상선을 식별하기 위해, 5-ALA(5-aminolevulinic acid hydrochloride)를 이용한 감광 방법을 수행하였다. 간략하게는, 0.9% NaCl 용액에 5-ALA powder (Sigma-Aldrich Korea, 5-Aminolevulinic acid, #A3785, purity ≥ 98%)를 현탁하여 5-ALA 용액 50 mg/mL을 준비하였다. 랫트에 준비된 5-ALA 용액 500 mg/kg을 복강 내 주사하고 2시간 후 졸레틸 (Zoletil 50; Virbac Laboratories, France) (0.1 mL/체중 kg) 및 럼푼 (Rompun®; Bayer, Germany) (0.1 mL/체중 kg)을 근육 내 주사하여 랫트를 마취시켰다. 마취된 랫트를 바로 눕히고 앞목과 가슴 부위를 포비돈-요오드(povidone-iodine)로 소독하였다. 수술 과정은 목의 중간선에서 세로 방향으로 피부를 절개하여 기관과 갑상선을 노출시켰다. 405±3 nm 파장의 블루 라이트 (Ergonomic LED Light Sources, Ocean Optics Inc., #LLS-405, USA)를 이용하여 빨간 형광색을 나타내는 양쪽 부갑상선을 식별하였다. 부분 부갑상선절제술 모델의 경우에는 부갑상선 쌍 중 하나만을 제거하였다. 전체 부갑상선절제술 및 자가이식 모델의 경우에는 두 개의 부갑상선을 모두 제거한 후 작게 조각 내어 우측 흉쇄유돌근(sternocleidomastoid muscle; SCM)에 만든 작은 포켓에 넣고 흡수되지 않는 단섬유 Vicryl 5-0로 봉합하였다.

1-3. AXT914 준비

AXT914는 Novartis Pharma AG (Switzerland)에서 공급받았다. AXT914를 다음과 같은 방법에 따라 마이크로에멀션 형태로 준비하였다. 간략하게는, 크레모퍼(cremophor) RH40를 저으며 65℃로 가열한 후 크레모퍼 RH40 34.6%, 캅물(Capmul) MCM 42%, 트라이에틸 시트레이트(triethyl citrate) 8.4% 및 에탄올 앱솔루트(ethanol absolute) 10%를 중량비로 혼합하였다. 혼합물을 1시간 동안 저어 얻은 맑은 용액을 부형제(vehicle)로 사용하여 AXT914 (5%의 중량비)와 혼합한 후 주위 온도(ambient temperature)에서 8 ~ 12시간 동안 저었다. 최종적으로 얻어진 마이크로에멀션 사전농축물을 DW로 10배 희석하고, 투여 전에 강하게 혼합하였다.

1-4. 실험 일정

동물 실험은 다음과 같은 실험 일정으로 각각 부분 부갑상선절제술 모델과 전체 부갑상선절제술 및 자가이식 모델을 수행하였다.

① 실험 일정 1: 부분 부갑상선절제술 모델에서의 AXT914 투여

도 1의 a를 참조하면, 부분 부갑상선절제술을 받은 랫트를 부형제 투여군 (n=11), AXT914 투여군 1 (n=10), AXT914 투여군 2 (n=11)으로 나눴다. 가짜로 수술을 받은 가짜(sham) 수술군 (n=9)도 준비하였다. 수술 1주일 후 랫트에 1-3.에서 준비된 AXT914를 2주 동안 매일 1일 1회로 zonde needle 를 이용하여 경구 투여하였다. AXT914 투여군 1 및 2에는 각각 5 mg/kg, 10 mg/kg를 투여하였다. 부형제 투여군 및 가짜 수술군에는 부형제 (1-3.에서 AXT914와 혼합되는 혼합물)를 투여하였다. 약물 투여 시작 후 13일째 24시간 동안 랫트의 소변을 채취하였다. 약물 투여 전 랫트의 꼬리에서 혈액을 채취하고 (기준값), 약물 투여 시작 14일째 투여 후 0, 30, 120, 240, 360, 720분에 랫트의 꼬리에서 혈액을 채취하였고, 랫트를 죽였다.

② 실험 일정 2: 전체 부갑상선절제술 및 자가이식 모델에서의 AXT914 투여

도 1의 b를 참조하면, 전체 부갑상선절제술 및 자가이식을 받은 랫트를 부형제 투여군 (n=8), AXT914 투여군 (n=8)으로 나눴다. 가짜로 수술을 받은 가짜 수술군 (n=6)도 준비하였다. 수술 1주일 후 랫트에 1-3.에서 준비된 AXT914를 3주 동안 매일 1일 1회로 zonde needle 를 이용하여 경구 투여하고, 투여가 끝난 1주일 후 랫트를 죽여 분석에 이용하였다. AXT914 투여군에는 10 mg/kg를 투여하였다. 부형제 투여군 및 가짜 수술군에는 부형제를 투여하였다. 약물 투여 전 랫트의 꼬리에서 혈액을 채취하고 (기준값), 약물 투여 시작 후 21일, 28일째 랫트의 꼬리에서 혈액을 채취하였다.

③ 실험 일정 3: 전체 부갑상선절제술 및 자가이식 모델에서의 AXT914 투여

도 1의 c를 참조하면, 전체 부갑상선절제술 및 자가이식을 받은 랫트를 부형제 투여군 (n=11), AXT914 투여군 1 (n=11), AXT914 투여군 2 (n=11)으로 나눴다. 가짜로 수술을 받은 가짜 수술군 (n=7)도 준비하였다. 수술 6일 후 랫트에 1-3.에서 준비된 AXT914를 18일 동안 매주 5일씩 1일 1회로 zonde needle 를 이용하여 경구 투여하고, 투여가 끝난 18일째 랫트를 죽여 분석에 이용하였다. AXT914 투여군 1 및 2에는 각각 10 mg/kg, 20 mg/kg를 투여하였다. 부형제 투여군 및 가짜 수술군에는 부형제를 투여하였다. 약물 투여 전 랫트의 꼬리에서 혈액을 채취하고 (기준값), 약물 투여가 끝난 18일째 랫트의 꼬리에서 혈액을 채취하였다. 랫트를 희생시켜 부갑상선이 자가이식된 SCM을 적출하여 조직학적 분석을 수행하였다.

1-5. 생화학적 분석

혈액이 담긴 BD Microtainer SSTTM (prod. no. REF 365967, Becton Dickinson)를 원심분리하여 얻은 혈청 시료를 -80℃ 급속 냉동고에서 보관하였다. 부갑상선호르몬(PTH) 수치는 PTH ELISA 키트 (rat intact PTH ELISA kit, Immutopics, Inc., #60-2500, USA)를 사용하여 분광측정기로 측정되었다. 혈중 칼슘, 인 수치는 cobas c 702 (Roche Diagnostics, IN)를 이용하여 각각 5-nitro-5'-methyl-BAPTA 방법, molybdate UV 방법으로 측정되었다. 소변 내 칼슘, 크레아티닌(creatinine) 수치는 cobas c 702 (Roche Diagnostics, IN)를 이용하여 각각 5-nitro-5'-methyl-BAPTA 방법, rate-blanked compensated kinetic Jaffe 방법으로 측정되었다.

1-6. 조직학적 분석

AXT914 투여군 및 부형제 투여군으로부터 SCM 조직을 적출하여 4% 중성 완충 포르말린에 24시간 동안 고정하였다. 조직을 파라핀에 넣고 4 um의 두께로 절단한 후 Hematoxylin (Sigma-Aldrich, #HHS32, USA) 및 Eosin Y (Sigma-Aldrich, #E6003, USA) 염색을 수행하였다. 각 슬라이드를 200배, 400배 확대하여 사진을 촬영하였다.

이식된 부갑상선 조직에서 PTH, VEGFA(vascular endothelial growth factor A), CD31, FGF2(basic fibroblast growth factor), MCL1, Ki67의 발현을 확인하기 위해, 각 특정 항원에 대한 항체 PTH (Cloud-Clone Corp., #PAA866Ra01, USA), VEGFA (abcam®, #ab1316, UK), CD31 (abcam®, #ab182981), FGF2 (Santa Cruz, #sc-74412, USA), MCL1 (abcam®, #ab32087), Ki67 (abcam®, #ab15580)와 2차 항체 anti-Mouse-HRP (abcam®, ab205719), anti-Rabbit-HRP (abcam®, ab205718), 그리고 3, 3'-diaminobenzidine(DAB) 발색 시약 (Liquid DAB ß Substrate Chromogen System, Dako North America Inc., #K3468, USA)을 사용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 각 슬라이드를 Olympus BX53F (Olympus, Japan)으로 200배, 400배 확대하여 사진 촬영하고, 디지털 이미지 작업 및 분석 소프트웨어 LEICA Qwin V3 (Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd., UK)를 사용하여 항체를 검출하였다.

1-7. 통계학적 분석

모든 통계학적 분석은 SPSS version 20.0 (SPSS Inc., IL)로 수행되었다. 실험 결과 데이터는 평균±표준오차(SEM)로 나타냈다. 혈액에 대한 생화학적 분석에서, 투여군 간의 비교는 one-way ANOVA 및 Fisher's least significant difference(LSD)로 수행되었다. 면역조직화학적 분석에서, 투여군 간의 유의한 차이를 측정하기 위해 반복적인 분석 ANOVA를 수행한 후 복합적인 비교를 Turkey's Multiple Comparison 방법으로 도출하였다. 결과 값에서 P < 0.05 일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

2. 결과

2-1. 부분 부갑상선절제술 모델에서 AXT914의 효과 (실험 일정 1)

약물 투여 전에 채취된 랫트 혈액을 기준값으로 하여 약물 투여 시작 후 14일째 가짜 수술군, 부형제 투여군 및 AXT914 투여군의 혈중 PTH, 칼슘, 인 수치를 비교하였고, 그 결과를 도 2에 나타냈다.

AXT914 투여군 1의 PTH 수치는 120분에서 부형제 투여군에 비해 높았으나, 가짜 수술군과 통계적 차이가 없었다. 반면, AXT914 투여군 2의 PTH 수치는 모든 시간대에서 다른 군에 비해 유의적으로 높았다.

AXT914 투여군 1 및 2는 모든 시간대에서 부형제 투여군에 비해 칼슘 수치가 유의적으로 높았다. 그러나 AXT914 투여군 1의 칼슘 수치는 0, 30, 720분에서, AXT914 투여군 2의 칼슘 수치는 0, 30분에서 가짜 수술군과 통계적 차이가 없었다.

AXT914 투여군 1 및 2는 대부분의 시간대에서 인 수치가 감소하였으나, 가짜 수술군과 통계적 차이가 없었다. AXT914 투여군 1의 인 수치는 30, 120, 360분에서, AXT914 투여군 2의 인 수치는 30, 240, 360, 720분에서 부형제 투여군에 비해 인 수치가 유의하게 낮았다.

소변 내 칼슘 배출을 약물 투여 13일째 24시간 동안 측정하여 가짜 수술군, 부형제 투여군 및 AXT914 투여군의 칼슘/크레아티닌 비율을 비교하였고, 그 결과를 도 3에 나타냈다.

부형제 투여군은 가짜 수술군 및 AXT914 투여군에 비해 소변 내 칼슘/크레아티닌 비율이 유의적으로 높은 반면, 가짜 수술군 및 AXT914 투여군 간에는 차이가 없었다.

2-2. 전체 부갑상선절제술 및 자가이식 모델에서 AXT914의 효과 (실험 일정 2)

약물 투여 전에 채취된 랫트 혈액을 기준값으로 하여 약물 투여 시작 후 21일째, 28일째에서 가짜 수술군, 부형제 투여군 및 AXT914 투여군의 혈중 PTH, 칼슘, 인 수치를 비교하였고, 그 결과를 도 4에 나타냈다.

부형제 투여군은 가짜 수술군에 비해 PTH 및 칼슘 수치가 낮고, 인 수치가 높았다. AXT914 투여군은 약물 투여 21일째 PTH 수치가 가짜 수술군에 비해 낮았으나, 부형제 투여군에 비해 유의하게 높았다. AXT914 투여군은 약물 투여 21일째 칼슘 수치가 부형제 투여군에 비해 유의하게 높았고, 가짜 수술군과는 차이가 없었다. 28일째 (약물 중단 7일 후) AXT914 투여군의 칼슘 수치는 가짜 수술군에 비해 낮았으나, 부형제 투여군에 비해 여전히 높았다. AXT914 투여군은 약물 투여 21일째 인 수치가 부형제 투여군에 비해 유의하게 낮았고, 가짜 수술군과는 차이가 없었다. 28일째 (약물 중단 7일 후) AXT914 투여군의 인 수치는 부형제 투여군에 비해 낮았으나, 통계적 차이는 없었다.

2-3. 전체 부갑상선절제술 및 자가이식 모델에서 AXT914의 효과 (실험 일정 3)

부형제 투여군 및 AXT914 투여군의 SCM 근육에 이식된 부갑상선 조직을 H&E 염색 및 면역조직화학적으로 관찰하였다.

H&E 염색 결과, AXT914 투여군 1 및 2는 부형제 투여군에 비해 이식된 부갑상선 조직의 면적이 증가하였다. AXT914 투여군 1은 36%의 면적 증가를 보였고, AXT914 투여군 2는 약 3배 정도로 유의적인 면적 증가를 보였다 (도 5). 이러한 결과는 AXT914 투여가 이식된 부갑상선 조직의 성공적인 생착에 의미 있게 기여한다는 것으로 볼 수 있다.

면역조직화학 염색 결과, AXT914 투여군 1 및 2는 부형제 투여군에 비해 부갑상선 조직에서 PTH, VEGFA, CD31의 발현이 유의적으로 증가하였다 (도 6a 및 b). AXT914 투여군 1 및 2는 부형제 투여군에 비해 PTH의 발현 양이 약 2배 정도 증가하였다. 혈관의 형성 및 혈관투과성 등을 확인하기 위해 VEGFA, CD31. FGF2의 발현을 확인한 결과에서, VEGFA의 발현은 AXT914 투여군 1에서 6배, AXT914 투여군 2에서 10배 정도 유의적인 증가를 보여주었다. CD31 양성 세포의 수는 부형제 투여군에 비해 AXT914 투여군 1에서 3배, AXT914 투여군 2에서 4.5배 가량 증가하였다. 혈관 형성에 관여하는 성장인자인 FGF2 양성 세포는 통계적 유의성이 없었으나, AXT914 투여군에서 증가하는 양상을 보였다. 이러한 결과는 부갑상선 조직의 손상 및 이식 후에 AXT914 투여가 신생혈관의 증식과 혈관의 형성, 혈관 투과성을 높이는데 상당히 기여하는 것으로 볼 수 있다. 세포 생존을 촉진하는 기능을 하는 MCL1의 발현은 AXT914 투여군 2에서 통계적 유의성이 없었으나, 증가하는 양상을 보였다. 세포 증식의 표지자인 Ki67이 발현은 투여군 간에 차이를 보이지 않은 것으로 보아, AXT914가 세포 증식에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 볼 수 있다.

위 결과를 통해, AXT914 투여는 이식된 부갑상선 조직의 혈관신생(angiogenesis)을 자극, 촉진하여 부갑상선 조직의 기능을 의미 있게 회복시킨다는 것으로 볼 수 있다.

종합적으로, 부갑상선이 손상되고 일부 제거되거나, 또는 제거된 부갑상선이 다시 이식된 경우에는 AXT914와 같은 CaSR 길항제 투여에 의해 부갑상선 조직의 기능이 회복되어 PTH 분비 기능이 개선된다는 것을 알 수 있다.

Claims

이식된 부갑상선 조직의 생착 촉진용 약학 조성물로서,
상기 약학 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 칼슘 감지 수용체 길항제를 유효성분으로 포함하며, 투여 용량이 10 내지 30 mg/kg인 것인 약학 조성물.
[화학식 1]
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 희석제를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
삭제
청구항 1 또는 3의 약학 조성물을 부갑상선 조직이 이식된 인간을 제외한 포유동물에게 10 내지 30 mg/kg의 용량으로 투여하는 단계를 포함하는 이식된 부갑상선 조직의 생착을 촉진하는 방법.
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