KR102214804B1 - Method for Sex Determination and Diagnosing Klinefelter Syndrome Using PNA Probe - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍과 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브 및 프라이머 쌍을 이용하면, 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 유전자인 아멜로제닌을 간단하고 신속하게 판별할 수 있으므로 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단에 유용하다.The present invention relates to a method for discriminating gender and diagnosing Klinefelter syndrome using a PNA (Peptide Nucleic Acids) probe, and in more detail, it is possible to amplify amelogenin, a gene for sex identification and Klinefelter syndrome diagnosis. It relates to a method for determining sex and diagnosing Klinefelter syndrome using a primer pair and a PNA probe capable of hybridizing with the gene.
Using a pair of PNA probes and primers for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis according to the present invention, amelogenin, a gene for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis, can be determined simply and quickly, so that gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis Useful for

Description

PNA 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법{Method for Sex Determination and Diagnosing Klinefelter Syndrome Using PNA Probe}Method for Sex Determination and Diagnosing Klinefelter Syndrome Using PNA Probe}

본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍과 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for discriminating gender and diagnosing Klinefelter syndrome using a PNA (Peptide Nucleic Acids) probe, and in more detail, it is possible to amplify amelogenin, a gene for sex identification and Klinefelter syndrome diagnosis. It relates to a method for determining sex and diagnosing Klinefelter syndrome using a primer pair and a PNA probe capable of hybridizing with the gene.

클라인펠터 증후군(Klinefelter Syndrome(KS), 47,XXY 핵형(karyotype) 또는 XXY 핵형)은 염색체 비분리 현상으로 발생하는 성염색체이상 질환으로서 남자의 염색체인 46,XY 핵형에서 염색체가 1개 이상 더 있는 상태로 지적 능력, 생식선(sexual gland) 기능 저하 및 신체 발달 이상 등을 초래한다. 클라인펠터 증후군의 발병률은 남아 500~1000명 당 1명 꼴로 나타나는 것으로 알려져 있으며, 이중 핵형 검사로 나타나는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형인 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형이 80~90%를 차지하며, 나머지 10~20% 정도는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 등의 다양한 모자이크(mosaicism) 핵형이 있을 수 있다. 모자이크 핵형인 경우 신체 일부의 세포는 정상 핵형을 가지고 있으므로 비모자이크 핵형보다 임상적 소견이 경미한 편이다(Visootsak J et al .,Orphanet J Rare Dis 1:42, 2006). Klinefelter syndrome (Klinefelter Syndrome (KS), 47, XXY karyotype or XXY karyotype) is a sex chromosomal abnormality caused by chromosomal non-separation. As a state, intellectual ability, sexual gland function decline and physical development abnormalities are caused. The incidence of Klinefelter's syndrome is known to be 1 out of 500 to 1000 males, and non-mosaicism karyotypes of 47,XXY karyotypes, 48,XXXY karyotypes, 49,XXXXY karyotypes, which are indicated by double karyotyping, are 80 It accounts for ~90%, and the remaining 10-20% is 46,XY/47,XXY karyotype, 46,XX/47,XXY karyotype, 46,XX/46,XY/47,XXY karyotype, 46,XY/48 ,XXXY karyotype, 46,XX/48,XXXY karyotype, 46,XX/46,XY/48,XXXY karyotype, 46,XY/49,XXXXY karyotype, 46,XX/49,XXXXY karyotype, 46,XX/46, There may be a variety of mosaicism karyotypes, such as XY/49, XXXXY karyotypes. In the case of a mosaic karyotype, the cells of the body part have a normal karyotype, so the clinical findings are milder than that of a non-mosaic karyotype (Visootsak J et al . , Orphanet J Rare). Dis 1:42, 2006).

클라인펠터 증후군의 진단은 고환 기능의 저하 및 이차 성징의 이상과 관련된 성염색체에 포함된 유전자를 이용하여 염색체 검사를 수행하게 된다. 이때, 상기 염색체 검사는 핵형 검사를 주로 수행한다. 핵형 검사는 생물의 종, 개체, 세포 고유의 염색체 구성. 염색체의 수 및 형태로 나타내는 것으로, 염색체 각각의 길이와 굵기, 그 수와 위치, 동원체의 위치, 부수체 및 2차 협착의 유무, 응축부가 다른 부분 및 이질염색질부와 진정염색질부, 염색소립, 말단소체의 형태, 크기, 분포, 각종 분염법에 의한 띠모양(band)의 형태와 수, 위치 등을 기준으로 하여 결정한다. 핵형을 도식화한 것은 핵형도라고 한다. 사람의 핵형은 남성은 46,XY, 여성은 46,XX로 나타내며, 염색체 이상이 있는 세포에서는 이상염색체의 번호와 이상의 종류를 기호로 부기한다(파리회의, 1971).In the diagnosis of Klinefelter syndrome, a chromosome test is performed using a gene included in a sex chromosome associated with a decrease in testicular function and an abnormality in secondary sexual characteristics. At this time, the chromosome test is mainly performed by karyotype test. Karyotyping is the composition of chromosomes specific to a species, individual, or cell of an organism. Indicated by the number and shape of chromosomes, the length and thickness of each chromosome, the number and location of the chromosomes, the location of the homogenate, the presence or absence of a concomitant body and secondary stenosis, the condensation part and other parts of the heterochromatin and the chromosomes, the chromosomes, It is determined based on the shape, size, distribution of telomeres, and the shape, number, and location of bands by various methods of disinfection. The schematic diagram of the karyotype is called a karyotype. Human karyotype is represented by 46,XY for males and 46,XX for females. In cells with chromosomal abnormalities, the number of abnormal chromosome and the type of abnormality are added as symbols (Paris Conference, 1971).

클라인펠터 증후군은 사춘기 이후(일반적으로 만 13세 이상)에 관찰되는 신체적 이상소견으로, 클라인펠터 증후군의 특징인 고환의 기능저하 및 신체의 이상 여부로 진단하므로 다운 증후군 및 터너 증후군에 비해 진단되는 연령이 조금 높다. Klinefelter syndrome is a physical abnormality observed after puberty (generally 13 years of age or older), and is diagnosed as a characteristic of Klinefelter's syndrome, such as testicular deterioration and abnormality in the body, so the age at which it is diagnosed compared to Down syndrome and Turner syndrome. This is a little high.

한편, 클라인펠터 증후군을 가지는 환자는 다른 염색체 이상의 질환과 달리 정기적인 검진 및 약물 치료만으로도 정상적으로 살아갈 수 있으므로 태아의 조기 검진이 필수적이다. 상기 증후군에 대한 조기 진단 및 관리가 이뤄지지 않을 경우 미세한 학습장애, 정자 생성의 불능, 심장 질환 유발 등과 같은 질환에 대한 증상 및 합병증을 유발할 수 있다.On the other hand, unlike other chromosomal disorders, patients with Klinefelter syndrome can live normally only with regular checkups and drug treatments, so early examination of the fetus is essential. If early diagnosis and management for the syndrome is not performed, symptoms and complications for diseases such as minor learning disabilities, inability to produce sperm, and inducing heart disease may occur.

클라인펠터 증후군의 진단은 세포유전학적 검사(말초혈액 염색체 검사로 47,XXY 핵형 확인), 호르몬 검사(FSH, LH, 에스트라디올(estradiol) 등의 농도 확인) 및 고환 생검(고환의 위축, 무정자증 여부 확인)을 이용한다. 또한, 최근 산전검사법을 이용하여 클라인펠터 증후군 검사를 수행하고 있지만, 정확도가 낮고, 검사 비용이 매우 비싸다. The diagnosis of Klinefelter's syndrome is a cytogenetic test (peripheral blood chromosome test to confirm 47,XXY karyotype), hormone test (to check the concentration of FSH, LH, estradiol, etc.), and testicular biopsy (testicular atrophy, atrophic). OK). In addition, although the Klinefelter syndrome test is recently performed using the prenatal test method, the accuracy is low and the test cost is very high.

구강점막상피 유래인 에나멜아(芽) 세포에 의해 형성되는 치아 상아질(齒牙象牙質) 표면을 덮는 경(硬)조직인 에나멜(enamel)은 사기질이라고도 한다. 94~98%가 무기성분이고, 나머지는 단백질 및 수분으로 구성되어 있다. 에나멜 형성(amelogenesis)의 초기 단계에서, 에나멜을 구성하는 단백질의 주성분은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 단백질인 아멜로제닌(amelogenin)과 에나멜린(enamelin)이고 그 후, 아멜로제닌은 거의 탈각하여 최종적으로 성숙된 에나멜질로 변화한다. 상기 두 단백질은 아멜로블라스틴(ameloblastins), 및 투프텔린(tuftelins) 단백질과 함께 에나멜 형성의 무기화(mineralization)에 관여하는 것으로 보고된 바 있다. 상기 무기화의 무기질은 인산칼슘으로서 히드록시아파타이트(hydroxyapatite)(Ca10(PO4)6(OH)2)인 결정으로 구성되며, 결정입(grain)은 대단히 미소(5nm)하다. Enamel, a hard tissue that covers the surface of tooth dentin, formed by enamel cells derived from oral mucosal epithelium, is also called enamel. 94-98% is inorganic, and the rest is composed of protein and moisture. In the early stages of amelogenesis, the main components of the proteins that make up the enamel are amelogenin and enamel, which are extracellular matrix (ECM) proteins, and after that, amelogenin is almost entirely. After shelling, it finally turns into mature enamel. These two proteins, together with ameloblastins and tuftelins, have been reported to be involved in mineralization of enamel formation. The inorganic material of the mineralization is calcium phosphate, which is composed of crystals of hydroxyapatite (Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ), and the grains are very fine (5 nm).

아멜로제닌은 성염색체에 한 카피(copy)씩 이성질체(isomer) 형태로 존재하기 때문에 성염색체에 따른 아멜로제닌 유전자를 이용하면 성별 판별이 가능한다. 성별에 따라, X 아이소형(isoform) 단백질을 코딩하는 X-염색체의 Xp22.1-Xp22.3에 위치하는 AMELX(amelogenin, X-linked) 유전자와 Y 아이소형(isoform) 단백질을 코딩하는 Y-염색체의 Yp 11.2에 위치하는 AMELY(amelogenin, Y-linked) 유전자가 있다(Nakahori Y, et al ., Genomics, 9(2):264-9, 1991; Salido EC et al ., American Journal of Human Genetics, 50(2):303-16). Since amelogenin exists in the form of an isomer by one copy on the sex chromosome, sex can be discriminated by using the amelogenin gene according to the sex chromosome. Depending on the sex, AMELX (amelogenin, X-linked) gene located at Xp22.1-Xp22.3 of the X-chromosome encoding the X isoform protein and the Y- encoding the Y isoform protein There is an AMELY (amelogenin, Y-linked) gene located at Yp 11.2 of the chromosome (Nakahori Y, et al . , Genomics , 9(2):264-9, 1991; Salido EC et al . , American Journal of Human Genetics , 50(2):303-16).

성염색체 비분리 현상으로 발생되는 질환인 클라인펠터 증후군은 성별을 구분할 수 있는 다양한 유전자들 중 아멜로제닌 유전자를 이용하여 이상 여부를 확인할 수 있다. 아멜로제닌 유전자의 경우 염기서열 분석이 완료되어 X-염색체(X chromosome) 및 Y-염색체(Y chromosome)의 유전적 변이(Single-nucleotide polymorphism, SNP)를 가지며, 이는 클라인펠터 증후군을 확인할 수 있는 중요한 바이오 마커로 활용할 수 있다. 하지만 일반적인 유전적 변이의 염기서열 분석만으로는 성염색체 수의 이상을 확인하기는 불가능하다. 이는 정상인 남성과의 상대적 비율을 이용하여 성별을 구분하기 때문에 기존의 검사법보다 복잡하며 많은 비용이 들어가게 된다. Klinefelter's syndrome, a disease caused by non-separation of sex chromosomes, can be checked for abnormalities using the amelogenin gene among various genes that can distinguish sex. In the case of the amelogenin gene, sequencing has been completed and has a single-nucleotide polymorphism (SNP) of the X-chromosome and Y-chromosome, which can confirm Klinefelter's syndrome. It can be used as an important biomarker. However, it is impossible to identify abnormalities in the number of sex chromosomes only by sequencing of general genetic mutations. This is more complicated and expensive than the existing test method because gender is classified by using the relative ratio with normal male.

이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 간편·신속·정확하게 성별 판별 및 클라인펠터 증후군을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 디자인하고, 상기 PNA 프로브를 이용한 혼성화를 통해 얻은 융해곡선을 분석하여, 핵형에 따른 아멜로제닌 유전자 변이를 효율적으로 판별하여 성별 판별 및 클라인펠터 증후군을 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Under this technical background, the inventors of the present invention designed a PNA probe for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis as a result of earnest efforts to develop a method that can easily, quickly and accurately diagnose gender and Klinefelter syndrome, and use the PNA probe. By analyzing the melting curve obtained through the hybridization using, it was confirmed that the mutation of the amelogenin gene according to the karyotype can be efficiently determined to diagnose sex and Klinefelter syndrome, and the present invention was completed.

본 발명의 목적은 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍, PNA 프로브 및 이를 포함하는 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a primer pair for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis, a PNA probe, and a composition and kit comprising the same.

본 발명의 다른 목적은 상기 프리이머 쌍을 이용하여 증폭된 성염색체에 포함된 아멜로제닌(amelogenin) 유전자 부위에 상기 PNA 프로브의 혼성화에 따른 성별 및 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)에 따른 Tm값을 얻어 성별 판별 및 클라인펠터 증후군을 진단하는 방법을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is the Tm value according to the karyotype of the Klinefelter syndrome and sex according to the hybridization of the PNA probe to the amelogenin gene site included in the sex chromosome amplified using the primer pair It is to provide a method for determining sex and diagnosing Klinefelter's syndrome.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a PNA probe for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis represented by SEQ ID NO: 1.

본 발명은 또한, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍을 제공한다.The present invention also provides a primer pair for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis represented by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.

본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.The present invention also provides a composition and kit for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis comprising the PNA probe and the primer pair.

본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for determining sex and diagnosing Klinefelter syndrome, characterized in that using the PNA probe.

본 발명은 또한, (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; (b) 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시킬 수 있는 상기 프라이머를 이용하여 상기 유전자를 증폭시키고, 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 성별을 판별하고 클라인펠터 증후군의 유무를 판별하는 단계를 포함하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법을 제공한다.
The present invention also includes the steps of: (a) extracting a target nucleic acid from a specimen; (b) amplifying the gene using the primer capable of amplifying an amelogenin gene, and hybridizing it with the PNA probe capable of hybridizing with the gene; And (c) determining sex through the analysis of the melting curve of the reactants hybridized in step (b) and determining the presence or absence of Klinefelter syndrome.

본 발명에 따른 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브 및 프라이머 쌍을 이용하면, 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)을 간단하고 신속하게 판별할 수 있으므로 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단에 유용하다.
When the PNA probe and primer pair for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis according to the present invention are used, amelogenin, a gene for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis, can be determined simply and quickly, so that sex determination and Klinein It is useful for diagnosing Pelter syndrome.

도 1은 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 X- 및 Y-염색체 내 아멜로제닌(amelogenin) 유전자의 염기서열에 따른 프로브 결합위치, 프라이머 결합위치 및 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브의 검증을 위한 DNA 올리고머의 PCR 증폭 조건을 나타낸 것이다.
도 3은 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 성염색체 내 아멜로제닌 유전자의 PNA 프로브의 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 U-TOPTM 방법의 성염색체 내 아멜로제닌 유전자의 PCR 증폭 및 U-TOPTM을 위한 조건을 나타낸 것이다.
도 5는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 아멜로제닌 유전자의 PNA 융해곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 아멜로제닌 유전자의 PNA 융해곡선의 반복실험을 나타낸 것이다.1 shows the probe binding position, primer binding position, and single-nucleotide polymorphism (SNP) position according to the nucleotide sequence of the amelogenin gene in the X- and Y-chromosomes for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis. .
Figure 2 shows the PCR amplification conditions of the DNA oligomer for the verification of the PNA probe for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis.
3 shows the verification results of the PNA probe of the amelogenin gene in the sex chromosome for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis.
Figure 4 is U-TOP TM for gender determination and Klinefelter syndrome diagnosis It shows the conditions for PCR amplification and U-TOP TM of the amelogenin gene in the sex chromosome of the method.
Figure 5 shows the PNA melting curve of the amelogenin gene for gender discrimination and Klinefelter syndrome diagnosis.
6 shows a repeated experiment of the PNA melting curve of the amelogenin gene for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by an expert skilled in the art to which the present invention belongs. In general, the nomenclature used in this specification is well known and commonly used in the art.

본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 이용한 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype) 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 성염색체의 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍과 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 이용한 성별 및 클라인펠터 증후군의 핵형 판별 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for discriminating gender and karyotype of Klinefelter syndrome using a PNA (Peptide Nucleic Acids) probe, and in more detail, amelogenin, a gene of sex chromosomes for sex discrimination and Klinefelter syndrome diagnosis ( amelogenin) and a method for determining the karyotype of Klinefelter syndrome using a primer pair capable of amplifying the gene and a PNA probe capable of hybridizing with the gene.

본 발명의 일 실시예에서는, 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위해 제조(합성)된 PNA 프로브의 검증을 수행하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 사용하면 이종의(Heterogeneous) 올리고머(즉, Kline-HE(XY))의 검출이 가능하였으므로 X- 및 Y-염색체의 수적 이상(차이)에 따른 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 판별이 가능할 것으로 추정하였다. In one embodiment of the present invention, verification of the prepared (synthetic) PNA probe for gender determination and Klinefelter syndrome diagnosis was performed. As a result, as shown in FIG. 3, when the PNA probe for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis was used, it was possible to detect heterogeneous oligomers (ie, Kline-HE(XY)), so X- and Y- It was estimated that gender and Klinefelter syndrome could be identified according to the number of chromosomal abnormalities (differences).

본 발명의 다른 실시예에서는, U-TOPTM 방법을 이용한 융해곡선 분석을 통한 성염색체의 수적 이상에 따른 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단의 가능 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 사람의 gDNA를 주형으로 PCR 증폭되고, PNA 프로브로 혼성화된 gDNA의 산물을 융해곡선 분석 시 아멜로제닌(amelogenin) 유전자의 염기변이는 성별에 따라 융해온도(Tm)의 차이가 있는 것으로 나타났다. 즉, X-염색체의 해당하는 융해 피크(Melting peak)(65℃)의 형광 값에서 Y-염색체에 해당하는 융해 피크(50℃)의 값을 제외한 값을 이용하면, 대조군의 성별 타입(XX 또는 XY)과 혼합 제조된 클라인펠터 증후군의 타입(XXY 또는 XXXY)을 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)과 Tm 값으로 구분할 수 있었다.In another embodiment of the present invention, it was confirmed whether sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis according to an abnormal number of sex chromosomes through the analysis of the melting curve using the U-TOP TM method. As a result, as shown in Figure 5, when PCR amplified human gDNA as a template and analyzed the melting curve of the product of gDNA hybridized with a PNA probe, the base variation of the amelogenin gene varies depending on the sex. There was a difference in Tm). That is, if a value excluding the value of the melting peak (50°C) corresponding to the Y-chromosome from the fluorescence value of the corresponding melting peak (65°C) of the X-chromosome is used, the gender type (XX or XY) and the type of Klinefelter syndrome (XXY or XXXY) prepared in combination with the relative fluorescence unit (RFU) and Tm value.

표 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, 각각의 시료에 대해 X-염색체 및 Y-염색체 융해 피크의 형광 값(RFU)의 차이(Z = X-염색체 형광 값 - Y-염색체 형광 값)를 계산한 결과, 성별 염색체에 따른 Tm에서의 형광 패턴은 유사하였고, 클라인펠터 증후군의 타입을 나타내는 실험군 1(XXY) 및 실험군 2(XXXY)의 형광 값이 대조군 2(XY)보다 증가하는 것을 확인하였다.As shown in Table 3 and Table 4, the difference in the fluorescence values (RFU) of the X-chromosome and Y-chromosome melting peaks (Z = X-chromosome fluorescence value-Y-chromosome fluorescence value) for each sample was calculated. As a result, the fluorescence patterns in Tm according to the sex chromosome were similar, and it was confirmed that the fluorescence values of experimental group 1 (XXY) and experimental group 2 (XXXY) indicating the type of Klinefelter syndrome increased than that of the control group 2 (XY).

상기와 같은 결과를 토대로, 성별 및 클라인펠터 증후군을 판정하기 위한 기준을 설정하였다. 즉, 대조군(XY)과 실험군(XXY, XXXY) 간의 융해곡선의 차이를 이용하여, X-염색체는 63.0~67.0℃, Y-염색체는 48.0~52.0℃에서의 핵형에 따른 융해온도 범위에서의 PNA 프로브로 혼성화된 반응물의 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)을 수학식 1에 대입하여 성별의 확인 및 클라인펠터 증후군의 존재 여부를 확인(진단)하였다.Based on the above results, criteria for determining gender and Klinefelter syndrome were established. That is, using the difference in the melting curve between the control group (XY) and the experimental group (XXY, XXXY), the X-chromosome is 63.0~67.0℃, and the Y-chromosome is PNA in the melting temperature range according to karyotype at 48.0~52.0℃. The fluorescence value (relative fluorescence unit, RFU) of the reactant hybridized with the probe was substituted into Equation 1 to confirm the sex and the presence of Klinefelter syndrome (diagnosis).

[수학식 1][Equation 1]

Q(%) = ((｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜)/X-염색체 RFU) X 100
Q(%) = ((｜X-chromosome RFU-Y-chromosome RFU｜)/X-chromosome RFU) X 100

여기서, Q(%)는 X-염색체 비율임;Where Q(%) is the ratio of the X-chromosome;

｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜의 값은 절대값임; The value of |X-chromosome RFU-Y-chromosome RFU| is an absolute value;

Q = 100 %일 경우, 정상 여성(XX);If Q = 100%, normal female (XX);

0 % < Q < 10.0 %일 경우, 정상 남성(XY); For 0% <Q <10.0%, normal male (XY);

15.0 % < Q < 100 %일 경우, 클라인펠터 증후군(XXY 핵형 또는 XXXY 핵형)으로 진단함.If 15.0% <Q <100 %, it is diagnosed as Klinefelter syndrome (XXY karyotype or XXXY karyotype).

결국, 아멜로제닌(amelogenin) 유전자의 염기변이 64C>T를 표적으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 사용하여 아멜로제닌 특유 유전자 증폭용 프라이머로 증폭된 방응물의 염색체별 융해온도 범위에서의 증폭량(형광량)으로 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
In the end, the melting temperature range for each chromosome of the amplified chromosome with a primer for amplifying the gene specific to amelogenin using a PNA probe for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis targeting the base mutation 64C>T of the amelogenin gene. It was confirmed that sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis were possible with the amplification amount (fluorescence amount) of.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브에 관한 것이다.Therefore, in one aspect, the present invention relates to a PNA probe for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis represented by SEQ ID NO: 1.

사람의 성별은 성염색체 상의 아멜로제닌 유전자를 이용하면 판별할 수 있다. 아멜로제닌 유전자의 염기서열은 유전자은행(GenBank)에서 확인할 수 있으며, 남성의 경우 Y-염색체에 존재하는 AMELY(amelogenin, Y-linked, HUMAMELY) 유전자를, 여성의 경우 X-염색체에 존재하는 AMELX(amelogenin, X-linked, HUMAMELX) 유전자를 이용하면 성별을 확인할 수 있다. 본 명세서에서 A(adenine), T(thymine), G(guanine) 및 C(cytosine)는 뉴클레오티드(nucleotide)의 기호를 나타낸 것이며, 본 명세서에서 사용되는 아멜로제닌 유전자의 '64C>T' 염기변이는, X-염색체 상에서 64번째 염기인 C(cytosine)를 나타내고, 이에 대한 염기변이로 Y-염색체 상에서 70번째 염기인 T(thymine)를 나타낸 것이다(도 1 참조). 따라서, '64C>T' 염기변이의 양상을 이용하면 성별의 판별이 가능하다.Human sex can be determined by using the amelogenin gene on the sex chromosome. The nucleotide sequence of the amelogenin gene can be found at GenBank, and in the case of males, the AMELY (amelogenin, Y-linked, HUMAMELY) gene in the Y-chromosome, and AMELX in the X-chromosome in females. (amelogenin, X-linked, HUMAMELX) genes can be used to identify sex. In the present specification, A (adenine), T (thymine), G (guanine), and C (cytosine) represent the symbols of nucleotides, and the '64C>T' base mutation of the amelogenin gene used in the present specification Represents C (cytosine), which is the 64th base on the X-chromosome, and represents T (thymine), which is the 70th base on the Y-chromosome, as a base mutation for this (see FIG. 1). Therefore, gender can be discriminated by using the pattern of '64C>T' base variation.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 아멜로제닌(amelogenin) 유전자와 혼성화하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PNA 프로브는 아멜로제닌 유전자의 64C>T 염기변이가 포함된 부위와 혼성화하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the PNA probe may be characterized in that it hybridizes with an amelogenin gene, and the PNA probe hybridizes with a region containing the 64C>T base mutation of the amelogenin gene. can do.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter) 및/또는 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하며, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하고, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.In the present invention, the PNA probe is characterized in that a reporter and/or a quencher capable of quenching reporter fluorescence are coupled to both ends, and the reporter is FAM(6- carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3, and CY5 at least one selected from the group consisting of Characterized in, and the quencher may be characterized in that at least one selected from the group consisting of TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, and Dabcyl, but is not limited thereto, and preferably Dabcyl (FAM -labeled) can be used.

본 발명에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the karyotype of the Klinefelter syndrome is a non-mosaicism karyotype selected from the group consisting of 47,XXY karyotype, 48,XXXY karyotype, 49,XXXXY karyotype, and combinations thereof, or 46 ,XY/47,XXY karyotype, 46,XX/47,XXY karyotype, 46,XX/46,XY/47,XXY karyotype, 46,XY/48,XXX karyotype, 46,XX/48,XXXY karyotype, 46, Select from the group consisting of XX/46,XY/48,XXXY karyotype, 46,XY/49,XXXXY karyotype, 46,XX/49,XXXXY karyotype, 46,XX/46,XY/49,XXXXY karyotype, and combinations thereof It may be characterized as being a mosaic (mosaicism) karyotype.

펩티드핵산(peptide nucleic acid: PNA)은 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 포리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection) 할 수 있게 된다.Peptide nucleic acid (PNA) is artificially synthesized as one of gene recognition materials such as LNA (locked nucleic acid) or MNA (Mopholino nucleic acid), and its basic skeleton is composed of polyamide. PNA has excellent affinity and selectivity, and has high stability against nucleases, so it is not degraded by the existing restriction enzymes. In addition, thermal/chemical properties and stability are high, so storage is easy and it is not easily decomposed. In addition, the PNA-DNA binding power is very superior to the DNA-DNA binding power, so even one nucleotide miss match differs by about 10 to 15°C. Using the difference in binding force, it is possible to detect changes in SNP (Single-nucleotide polymorphism) and In/Del nucleotides.

본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. 'Target nucleic acid','synthetic DNA', or'artificial oligo' of the present invention means a nucleic acid sequence (including SNP) to be detected or not, and a'target gene' encoding a protein having physiological and biochemical functions. It contains a specific site of the nucleic acid sequence of, and is annealed or hybridized with a primer or probe under conditions of hybridization, annealing or amplification.

본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 'Hybridization' of the present invention means that complementary single-stranded nucleic acids form double-stranded nucleic acids. Hybridization can occur when the complementarity between the two nucleic acid strands is perfect match or even in the presence of some mismatch bases. The degree of complementarity required for hybridization may vary according to hybridization conditions, and in particular, may be controlled by temperature.

본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석(Fluorescence Melting Curve Analysis; FMCA)을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다.The PNA probe containing the reporter and quencher of the present invention generates a fluorescent signal after hybridization with the target nucleic acid, and as the temperature rises, the fluorescent signal is quenched by rapidly melting with the target nucleic acid at an appropriate melting temperature of the probe. The presence or absence of base denaturation (including SNP) of the target nucleic acid may be detected through high-resolution melting curve analysis (FMCA) obtained from the fluorescence signal according to

PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe)가 있다.The Tm value is also changed according to the difference between the nucleotide of the PNA probe and the nucleotide of the DNA complementarily bound thereto, making it easy to develop an application using this. PNA probes are analyzed using a hybridization method different from the hydrolysis method of TaqMan probes, and probes that play a similar role include molecular beacon probes and scorpion probes. There is.

본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a primer pair for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis represented by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.

본 발명에 있어서, 상기 프리이머 쌍은 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 프리이머 쌍은 아멜로제닌 유전자의 64C>T 염기변이가 포함된 부위를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the primer pair may be characterized in that it is used to amplify the amelogenin gene, the primer pair is a region containing the 64C>T base mutation of the amelogenin gene It may be characterized as being used to amplify.

본 발명에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the karyotype of the Klinefelter syndrome is a non-mosaicism karyotype selected from the group consisting of 47,XXY karyotype, 48,XXXY karyotype, 49,XXXXY karyotype, and combinations thereof, or 46 ,XY/47,XXY karyotype, 46,XX/47,XXY karyotype, 46,XX/46,XY/47,XXY karyotype, 46,XY/48,XXX karyotype, 46,XX/48,XXXY karyotype, 46, Select from the group consisting of XX/46,XY/48,XXXY karyotype, 46,XY/49,XXXXY karyotype, 46,XX/49,XXXXY karyotype, 46,XX/46,XY/49,XXXXY karyotype, and combinations thereof It may be characterized as being a mosaic (mosaicism) karyotype.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a composition and a kit for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis comprising the PNA probe and the primer pair.

본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.The kit of the present invention may optionally include a buffer, a DNA polymerase cofactor, and reagents necessary to perform a target nucleic acid amplification reaction (eg, PCR reaction) such as deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Optionally, the kits of the present invention may also include various polynucleotide molecules, reverse transcriptases, various buffers and reagents, and antibodies that inhibit DNA polymerase activity. In addition, in the kit, the optimal amount of the reagent to be used in a specific reaction can be easily determined by a person skilled in the art who has learned the disclosure herein. Typically, the kits of the present invention may be manufactured in separate packaging or compartments containing the aforementioned components.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method for determining sex and diagnosing Klinefelter syndrome, characterized in that the PNA probe is used.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; (b) 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시킬 수 있는 상기 프라이머를 이용하여 상기 유전자를 증폭시키고, 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 성별을 판별하고 클라인펠터 증후군의 유무를 판별하는 단계를 포함하는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단 방법에 관한 것이다.In another aspect of the present invention, (a) extracting a target nucleic acid from a sample sample; (b) amplifying the gene using the primer capable of amplifying an amelogenin gene, and hybridizing it with the PNA probe capable of hybridizing with the gene; And (c) determining sex through the analysis of the melting curve of the reactants hybridized in step (b) and determining the presence or absence of Klinefelter syndrome.

혼성화에 따른 분석 방법으로는 U-TOPTM 방법 및 MeltingArrayTM 방법으로 형광의 융해곡선을 이용한 분석방법(Fluorescence Melting Curve Analysis: FMCA), 즉 PCR(Polymerase Chain Reaction)이 종료한 후 생성된 산물과 첨가된 PNA 프로브간의 결합력의 차이를 Tm으로 판별하여 분석한다. 다른 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 검출용 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 9~15mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 Tm값을 가지는 프로브를 디자인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절하거나 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브에 변화를 주어 Tm값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High resolution melting) 방법과는 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어려운 반면 PNA 프로브의 프로브 서열은 SNP에 대해서 영향을 받지 않아 분석이 가능하다.As an analysis method according to hybridization, the U-TOP TM method and the MeltingArray TM method use fluorescence melting curve analysis (FMCA), that is, the product and addition after completion of PCR (polymerase chain reaction). The difference in binding force between the prepared PNA probes is determined by Tm and analyzed. Unlike other probes for single-nucleotide polymorphism (SNP) detection, the probe design is very simple, so it is manufactured using a nucleotide sequence of 9 to 15mer including SNP. Therefore, in order to design a probe having a desired Tm value, the Tm value can be adjusted according to the length of the PNA probe, or the Tm value can be adjusted by changing the probe even with a PNA probe of the same length. Since PNA has better binding power than DNA and has a high basic Tm value, it can be designed with a shorter length than DNA, so that even close neighboring SNPs can be detected. Compared to the existing HRM (high resolution melting) method, the difference in Tm value is very small, about 0.5℃, so additional analysis programs or detailed temperature changes are required, making it difficult to analyze when two or more SNPs appear, whereas the probe sequence of the PNA probe is SNP. Is not affected, so analysis is possible.

PNA 프로브를 이용한 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 분석을 위해서는 우선 SNP를 포함하는 부분의 염기를 이용한 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.For single-nucleotide polymorphism (SNP) analysis using a PNA probe, it is sufficient to first need only a probe using the base of the part containing the SNP and a forward/reverse primer set for PCR. For the PCR conditions, a conventional method can be used, and a melting process is required after PCR is completed, and the Tm value is obtained by measuring the fluorescence intensity every 0.5°C increase. In particular, general real-time PCR (real-time PCR) devices are widely used and have the advantage of not requiring additional program purchases or detailed temperature changes such as high resolution melting (HRM).

본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 목적의 변이(SNP 포함)를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 점돌연변이(SNP 포함)의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 돌연변이(SNP 포함)가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. The melting curve analysis of the present invention is a method of analyzing the melting temperature of a double-stranded nucleic acid formed of a target nucleic acid, DNA or RNA, and a probe. Since such a method is performed by, for example, Tm analysis or analysis of the melting curve of the double chain, it is called a melting curve analysis. A hybrid (double-stranded DNA) of the target single-stranded DNA of the detection sample and the probe is formed by using a probe complementary to the detection target sequence containing the mutation for detection (including SNP). Subsequently, the hybrid formed body is subjected to a heat treatment, and the dissociation (melting) of the hybrid according to the temperature increase is detected by fluctuations in signals such as absorbance. Then, by determining the Tm value based on this detection result, it is a method of determining the presence or absence of a point mutation (including SNP). The Tm value is higher as the homology of the hybrid formed body is higher and lower as the homology is lower. For this reason, a Tm value (evaluation reference value) is obtained in advance for a hybrid formed body of a detection target sequence containing a point mutation and a probe complementary thereto, and the Tm value (measurement) between the target single-stranded DNA of the detection sample and the probe (measurement Value), and if the measured value is the same degree as the evaluation reference value, it can be determined that a match, that is, mutation (including SNP) exists in the target DNA, and if the measured value is lower than the evaluation reference value, a mismatch, that is, target DNA It can be determined that there is no mutation in

본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.The fluorescence melting curve analysis of the present invention is a method of analyzing a melting curve using a fluorescent material, and more specifically, the melting curve may be analyzed using a probe containing a fluorescent material. The fluorescent material may be a reporter and a quencher, and may be an intercalating fluorescent material.

본 발명에 있어서, 상기 아멜로제닌(amelogenin) 유전자는 64C>T 염기변이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 PNA 프로브는 리포터 및 소광자 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the amelogenin gene may be characterized in that it contains a 64C>T base mutation, and the PNA probe may be characterized in that any one or more of a reporter and a quencher are bound. And, the reporter is composed of FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 and CY5 It may be characterized in that at least one selected from the group, and the quencher may be characterized in that at least one selected from the group consisting of 6-carboxytetramethyl-rhodamine (TAMRA), BHQ1, BHQ2, and Dabcyl.

본 발명에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the karyotype of the Klinefelter syndrome is a non-mosaicism karyotype selected from the group consisting of 47,XXY karyotype, 48,XXXY karyotype, 49,XXXXY karyotype, and combinations thereof, or 46 ,XY/47,XXY karyotype, 46,XX/47,XXY karyotype, 46,XX/46,XY/47,XXY karyotype, 46,XY/48,XXX karyotype, 46,XX/48,XXXY karyotype, 46, Select from the group consisting of XX/46,XY/48,XXXY karyotype, 46,XY/49,XXXXY karyotype, 46,XX/49,XXXXY karyotype, 46,XX/46,XY/49,XXXXY karyotype, and combinations thereof It may be characterized as being a mosaic (mosaicism) karyotype.

본 발명에서 "검체 시료"는 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료(biosample)가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 검체 시료는, 바람직하게는, 인간의 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 것이다.In the present invention, the "sample sample" may be analyzed from a biosample of plant, animal, human, fungi, bacterial and viral origin. When analyzing a sample of mammalian or human origin, the sample may be derived from a specific tissue or organ. Representative examples of tissue include connective, skin, muscle or nervous tissue. Representative examples of organs include eyes, brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, small intestine, testicle, ovary, uterus, rectum, nervous system, Includes glandular and internal blood vessels. The biological sample to be analyzed includes any cells, tissues, fluids from biological sources, or any other medium that can be well analyzed by the present invention, which is human, animal, human or animal consumption. Samples obtained from food prepared for use are included. In addition, biological samples to be analyzed include bodily fluid samples, which include blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, ocular fluid, saliva, semen, brain extract (e.g., brain crush), spinal fluid, appendix, spleen. And tonsil tissue extracts are included, but are not limited thereto. The specimen is preferably derived from human sputum, blood, saliva, or urine.

본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the melting curve analysis may be characterized in that it is performed by the FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis; fluorescence melting curve analysis) method, the amplification is performed by a real-time PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) method. It can be characterized.

본 발명의 실시간 PCR 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이(SNP 포함) 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.In the real-time PCR method of the present invention, a fluorescent substance is interchelated to a double-stranded DNA chain in the PCR process, and the temperature is increased to release the double-stranded DNA by amplifying the PCR product. By analyzing the pattern of the melting curve at which the amount of fluorescent substance present in is reduced, in particular, the temperature at which DNA is melted (denatured) (Tm), it is possible to analyze the presence or absence of nucleotide sequence variation between the normal control and the mutation (including SNP). .

본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 X-염색체: 63.0~67.0℃ 및 Y-염색체: 48.0~52.0℃의 핵형 융해온도 범위에서의 PNA 프로브로 혼성화된 반응물의 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)을 하기 수학식 1에 대입하여 계산하는 방법을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the melting curve analysis is a fluorescence value of a reactant hybridized with a PNA probe in a karyotype melting temperature range of X-chromosome: 63.0 to 67.0°C and Y-chromosome: 48.0 to 52.0°C (relative fluorescence unit, RFU) It may be characterized by using a method of calculating by substituting in Equation 1 below.

[수학식 1][Equation 1]

Q(%) = ((｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜)/X-염색체 RFU) X 100
Q(%) = ((｜X-chromosome RFU-Y-chromosome RFU｜)/X-chromosome RFU) X 100

여기서, Q(%)는 X-염색체 비율임;Where Q(%) is the ratio of the X-chromosome;

｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜은 절대값임; |X-chromosome RFU-Y-chromosome RFU| is an absolute value;

Q = 100 %일 경우, 정상 여성(XX);If Q = 100%, normal female (XX);

0 % < Q < 10.0 %일 경우, 정상 남성(XY); For 0% <Q <10.0%, normal male (XY);

15.0 % < Q < 100 %일 경우, 클라인펠터 증후군(XXY 핵형 또는 XXXY 핵형)으로 진단함.
If 15.0% <Q <100 %, it is diagnosed as Klinefelter syndrome (XXY karyotype or XXXY karyotype).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예Example 1: 성별 판별용 및 1: for gender identification and 클라인펠터Klinefelter 증후군 진단용 For diagnosis of syndrome 프로브의Of the probe 제조 Produce

성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 성염색체의 유전자인 아멜로제닌(amelogenin)의 X- 또는 Y-염색체 특이적인 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 염기서열을 검출할 수 있는 1쌍의 프라이머와 PNA(Peptide Nucleic Acids) 프로브를 제조하였다. 또한, 상기 PNA 프로브를 검증하기 위해, PNA 프로브의 염기서열에 상보적인 DNA 올리고머를 제조하였다(표 1).A pair of primers and PNA (Peptide) capable of detecting the X- or Y-chromosome-specific single-nucleotide polymorphism (SNP) nucleotide sequence of amelogenin, a gene of sex chromosomes for sex identification and Klinefelter syndrome diagnosis. Nucleic Acids) probe was prepared. In addition, in order to verify the PNA probe, a DNA oligomer complementary to the nucleotide sequence of the PNA probe was prepared (Table 1).

상기 PNA 프로브는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위하여 직접 설계하였고, 표적 핵산과의 효과적인 결합을 위해 PNA 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다. 특히 염기의 변이 부분(SNP)은 보통 표적 핵산과 5℃ 이상 융해온도(Tm)차이가 나도록 PNA 프로브 결합부위 중앙에 위치하도록 디자인하였고, 융해온도(Tm)의 최적화를 위해 표적 핵산과 PNA 프로브가 결합하는 염기서열의 중앙에 아멜로제닌 유전자 염기서열과 상보적 결합이 일어날 수 있도록 제작하였다. The PNA probe was directly designed for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis, and unnecessary secondary structures of the PNA probe were avoided for effective binding with target nucleic acids. In particular, the base mutation part (SNP) was designed to be located in the center of the PNA probe binding site so that the melting temperature (Tm) of the target nucleic acid and the normal target nucleic acid differs by more than 5°C. To optimize the melting temperature (Tm), the target nucleic acid and the PNA probe are It was constructed so that complementary binding to the amelogenin gene nucleotide sequence can occur in the center of the binding nucleotide sequence.

상기 PNA 프로브는 형광물질(FAM-labeled, Dabcyl)로 표지한 다음, HPLC 정제방법을 통해 합성하였고(Panagene, 한국), 상기 합성된 PNA 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다.
The PNA probe was labeled with a fluorescent substance (FAM-labeled, Dabcyl), and then synthesized by HPLC purification (Panagene, Korea), and the purity of the synthesized PNA probe was confirmed by mass spectrometry.

하기 표 1은 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브, 프라이머 및 PNA 프로브의 검증을 위한 DNA 올리고머 염기서열을 나타낸 것이다. 표 1에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 나타낸 것이다. Table 1 below is for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis It shows the DNA oligomer nucleotide sequence for verification of the PNA probe, primer, and PNA probe. In Table 1, O represents a linker and K represents lysine.

Figure 112015069298408-pat00001
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표 1에 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 성염색체의 유전자인 아멜로제닌의 특이 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 사이트를 타입으로 나타내었다. 각 염기의 번호는 아멜로제닌의 유전자 로커스(locus)의 대립인자(allele)를 기준으로 작성하였으며, PNA 프로브가 퍼펙트 매치(perfect match)를 나타내도록 유도하여 제작하였다(도 1 참조).
Table 1 shows a specific SNP (Single-nucleotide polymorphism) site of amelogenin, a gene of sex chromosomes for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis, by type. The number of each base was prepared based on the allele of the gene locus of amelogenin, and was prepared by inducing a PNA probe to show a perfect match (see FIG. 1).

실시예Example 2: 성별 판별 및 2: gender determination and 클라인펠터Klinefelter 증후군 진단을 위해 제조된 PNA PNA manufactured to diagnose the syndrome 프로브의Of the probe 검증 Verification

성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위해 실시예 1에서 제조(합성)된 PNA 프로브가 표적 핵산(예: 검출시료 gDNA(genomic DNA))에 대해 제대로 작동할 수 있는지 검증하기 위하여, 상기 PNA 프로브의 염기서열에 상보적인 DNA 올리고머를 사용하였다(표 1). 상기 DNA 올리고머는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군을 진단할 수 있게, 여성(XX)의 경우 Kline-PM(Perfect Match)(XX)을 사용하고, 남성(XY)의 경우 Kline-PM(XX)과 Kline-MM(Mismatch)이 동량으로 혼합된 이종의(Heterogeneous) 올리고머(즉, Kline-HE(XY))를 사용하여 검증하였다.In order to verify whether the PNA probe prepared (synthesized) in Example 1 for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis can function properly against a target nucleic acid (eg, a detection sample gDNA (genomic DNA)), the base of the PNA probe DNA oligomers complementary to the sequence were used (Table 1). The DNA oligomer used Kline-PM (Perfect Match) (XX) for females (XX) and Kline-PM (XX) and Kline for males (XY) so that gender determination and Klinefelter syndrome can be diagnosed. -MM (Mismatch) was verified using a heterogeneous oligomer (ie, Kline-HE (XY)) mixed in the same amount.

성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위해 제조된 PNA 프로브의 검증을 위해서, 상기 DNA 올리고머 및 PNA 프로브를 혼합하여 융해곡선 분석 장비인 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 PNA 프로브의 검증을 수행하였다. 더욱 상세하게는, 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X MeltingArray 버퍼(2X MeltingArray Buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국) 10㎕, DNA 올리고머 2.5pmol/1㎕, PNA 프로브 10pmol/0.5㎕, 증류수 8.5㎕를 혼합한 다음, 도 2의 리얼타임 PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) 조건에서, 융해곡선 형광을 측정하였다. In order to verify the PNA probe prepared for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis, the DNA oligomer and PNA probe were mixed and the melting curve analysis equipment, CFX96™ Real-Time System (BIO-RAD, USA) was used to PNA Validation of the probe was performed. More specifically, 10 μl of 2X MeltingArray Buffer (2X MeltingArray Buffer, Sisun Biomaterials, Korea), 2.5 pmol/1 μl of DNA oligomer, 10 pmol/0.5 μl of PNA probe, and 8.5 μl of distilled water are mixed so that the total volume is 20 μl. Then, in the real-time PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) condition of Figure 2, the melting curve fluorescence was measured .

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 제조(합성)된 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브를 사용하면 이종의(Heterogeneous) 올리고머(즉, Kline-HE(XY))의 검출이 가능하였으므로 X- 및 Y-염색체의 수적 이상(차이)에 따른 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 판별이 가능할 것으로 추정하였다.
As a result, as shown in Figure 3, when the prepared (synthetic) PNA probe for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis was used, it was possible to detect heterogeneous oligomers (ie, Kline-HE(XY)), so X It was estimated that gender and Klinefelter syndrome could be identified according to the number of abnormalities (differences) of-and Y-chromosomes.

실시예Example 3: U- 3: U- TOPTOP TMTM 방법을 이용한 융해곡선 분석을 통한 성염색체의 수적 이상(차이)에 따른 성별 판별 및 Sex discrimination according to the number abnormality (difference) of sex chromosomes through melting curve analysis using the method and 클라인펠터Klinefelter 증후군 진단 Syndrome diagnosis

실시예 1에서 제조된 PNA 프로브 및 표적 핵산(예: 검출시료 gDNA(genomic DNA))을 이용하여 융해곡선 분석을 수행하고자 하였다. 우선 검출가능한 표적 핵산을 생성하기 위하여 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 단일가닥 표적 핵산을 생성하기 위해 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 도 4의 조건으로 수행하였다. 더욱 상세하게는, 총 볼륨이 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 프리믹스 버퍼(2X SSB qPCR PreMix buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국), 2.5mM MgCl2, 200μM dNTPs, 1.0 U Taq polymerase, forward 프라이머 및 reverse 프라이머 0.5㎕/10pmol, 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프로브 0.5㎕, 3㎕ 인간 DNA(또는 표적 핵산)를 첨가한 다음 리얼타임 PCR을 수행하였다. 클라인펠터 증후군의 염색체 수적 이상을 재현하기 위한 시료는 정상인 여성(대조군 1: XX)과 남성(대조군 2: XY)의 gDNA를 수득한 다음, NanoDrop spectrophotometer(Thermo Scientific, 미국)으로 최종 15ng/1㎕의 농도가 되도록 제조하여 사용하였다(표 2).
It was intended to perform a melting curve analysis using the PNA probe prepared in Example 1 and a target nucleic acid (eg, a detection sample gDNA (genomic DNA)). First, in order to generate a detectable target nucleic acid, PCR (Polymerase Chain Reaction) was performed under the conditions of FIG. 4 to generate a single-stranded target nucleic acid using the CFX96™ Real-Time system (BIO-RAD, USA). More specifically, 2X SightBio real-time premix buffer (2X SSB qPCR PreMix buffer, SightBiomaterials, Korea), 2.5mM MgCl 2 , 200μM dNTPs, 1.0 U Taq polymerase, forward primer and 0.5 µl/10 pmol of a reverse primer, 0.5 µl of a probe for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis, and 3 µl human DNA (or target nucleic acid) were added, followed by real-time PCR. Samples for reproducing the chromosome number abnormality of Klinefelter syndrome were obtained by obtaining gDNA of normal women (control 1: XX) and male (control 2: XY), and then finally 15 ng/1 μl with a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific, USA). It was prepared and used so that the concentration of (Table 2).

하기 표 2는 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위한 gDNA 시료의 조성 조건을 나타낸 것이다. Table 2 below shows the composition conditions of the gDNA sample for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis.

Figure 112015069298408-pat00002
Figure 112015069298408-pat00002

리얼타임 PCR 과정은, 도 4에 나타난 바와 같이, 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 60℃에서 45초, 73℃에서 25초 동안 반응시켰으며, 이를 36 사이클 반복하였고, 실시간으로 형광을 측정하였다. 융해곡선 분석은 95℃에서 5분간 변성 단계를 거친 다음, 35℃에서 5분간 혼성화 시킨 후, 40℃에서 80℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 0.5초간 정지 상태를 유지하였다.The real-time PCR process, as shown in FIG. 4, was denatured at 95° C. for 10 minutes, and then reacted at 95° C. for 30 seconds, 60° C. for 45 seconds, and 73° C. for 25 seconds, and 36 cycles were repeated. Fluorescence was measured in real time. The melting curve analysis was performed by performing a denaturation step at 95°C for 5 minutes, hybridizing at 35°C for 5 minutes, increasing 0.5°C from 40°C to 80°C, and measuring fluorescence. It was kept stationary for 0.5 seconds between each step.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 사람의 gDNA를 주형으로 PCR 증폭되고, PNA 프로브로 혼성화된 gDNA의 산물을 융해곡선 분석 시 아멜로제닌(amelogenin) 유전자의 염기변이는 성별에 따라 융해온도(Tm)의 차이가 있는 것으로 나타났다. 즉, X-염색체의 해당하는 융해 피크(Melting peak)(65℃)의 형광 값에서 Y-염색체에 해당하는 융해 피크(50℃)의 값을 제외한 값을 이용하면, 대조군의 성별 타입(XX 또는 XY)과 혼합 제조된 클라인펠터 증후군의 타입(XXY 또는 XXXY)을 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)과 Tm 값으로 구분할 수 있다.As a result, as shown in Figure 5, when PCR amplified human gDNA as a template and analyzed the melting curve of the product of gDNA hybridized with a PNA probe, the base variation of the amelogenin gene varies depending on the sex. There was a difference in Tm). That is, if a value excluding the value of the melting peak (50°C) corresponding to the Y-chromosome from the fluorescence value of the corresponding melting peak (65°C) of the X-chromosome is used, the gender type (XX or The type of Klinefelter syndrome (XXY or XXXY) prepared in combination with XY) can be classified into a relative fluorescence unit (RFU) and a Tm value.

표 3에 나타난 바와 같이, 각각의 시료에 대해 X-염색체 및 Y-염색체 융해 피크의 형광 값(RFU)의 차이(Z = X-염색체 형광 값 - Y-염색체 형광 값)를 계산한 다음, 대조군 2(XY)와 비교해보면, 실험군 1(XXY)의 경우 형광 값의 차이가 약 45 RFU로, 실험군 2(XXXY)의 경우 약 69 RFU로 나타나 성염색체의 수적 이상에 따른 특정 융해온도에서니 형광 값의 차이가 있음을 확인하였다.
As shown in Table 3, the difference between the fluorescence values (RFU) of the X-chromosome and Y-chromosome melting peaks for each sample (Z = X-chromosome fluorescence value-Y-chromosome fluorescence value) was calculated, and then the control Compared to 2(XY), the difference in fluorescence value in the case of Experimental Group 1 (XXY) is approximately 45 RFU, and approximately 69 RFU in the case of Experimental Group 2 (XXXY), so fluorescence at a specific melting temperature according to the number of sex chromosomes or more. It was confirmed that there was a difference in values.

하기 표 3은 PNA 프로브를 이용한 성별 및 클라인펠터 증후군 시료의 형광 값을 나타낸 것이다. Table 3 below shows the fluorescence values of sex and Klinefelter syndrome samples using a PNA probe.

Figure 112015069298408-pat00003
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한편, 표 4에 나타난 바와 같이, 각각의 시료에 대해 3회 반복실험을 통하여 결과의 재현성을 확인한 결과, 각각의 시료로부터 유래된 성별 염색체에 따른 Tm에서의 형광 패턴은 유사하였고, 클라인펠터 증후군의 타입을 나타내는 실험군 1(XXY) 및 실험군 2(XXXY)의 형광 값이 대조군 2(XY)보다 증가하는 것을 확인하였다.On the other hand, as shown in Table 4, as a result of confirming the reproducibility of the results through three replicate experiments for each sample, the fluorescence patterns at Tm according to the sex chromosomes derived from each sample were similar, and the Klinefelter syndrome It was confirmed that the fluorescence values of experimental group 1 (XXY) and experimental group 2 (XXXY) representing the type were increased than that of the control group 2 (XY).

상기와 같은 결과를 토대로, 성별 및 클라인펠터 증후군을 판정하기 위한 기준을 설정하였다. 즉, 대조군과 실험군 간의 융해곡선의 차이를 이용하여, X-염색체는 63.0~67.0℃, Y-염색체는 48.0~52.0℃에서의 핵형에 따른 융해온도 범위에서의 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)을 수학식 1에 대입하여 성별을 판별하고 클라인펠터 증후군의 존재 여부를 진단하였다.Based on the above results, criteria for determining gender and Klinefelter syndrome were established. That is, using the difference in the melting curve between the control group and the experimental group, the fluorescence value at the melting temperature range according to karyotype at 63.0 to 67.0°C for the X-chromosome and 48.0 to 52.0°C for the Y-chromosome (relative fluorescence unit, RFU) By substituting in Equation 1, sex was determined and the presence of Klinefelter syndrome was diagnosed.

[수학식 1][Equation 1]

Q(%) = ((｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜)/X-염색체 RFU) X 100
Q(%) = ((｜X-chromosome RFU-Y-chromosome RFU｜)/X-chromosome RFU) X 100

여기서, Q(%)는 X-염색체 비율임;Where Q(%) is the ratio of the X-chromosome;

｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜은 절대값임; |X-chromosome RFU-Y-chromosome RFU| is an absolute value;

0 % < Q < 10.0 %일 경우, 정상 남성; If 0% <Q <10.0 %, normal male;

Q > 15.0 %일 경우, 클라인펠터 증후군(XXY 핵형 또는 XXXY 핵형)으로 진단함.
If Q> 15.0%, it is diagnosed as Klinefelter syndrome (XXY karyotype or XXXY karyotype).

하기 표 4는 3번 반복된 재현 실험에서의 PNA 프로브를 이용한 성별 및 클라인펠터 증후군 시료의 형광 값을 나타낸 것이다. Table 4 below shows the fluorescence values of sex and Klinefelter syndrome samples using a PNA probe in a repetition experiment repeated three times.

Figure 112015069298408-pat00004
Figure 112015069298408-pat00004

한편, 본 발명의 성별 판별 및 클라인펠터 증후군의 진단 방법은 절대값으로 염색체 수적 이상(차이)의 확인은 불가능하고, 대조군 2(XY)와의 비교를 통한 상대값으로 클라인펠터 증후군의 유무를 진단하기 때문에 3대의 CFX96™ Real-Time 시스템 기계를 각각 사용하여 반복실험을 수행함으로써 기계 간 발생할 수 있는 오류를 최소화하고 실험의 재현성을 확인하고자 하였다.On the other hand, in the method of determining gender and Klinefelter syndrome of the present invention, it is impossible to check the number of chromosomal abnormalities (differences) by absolute value, and to diagnose the presence or absence of Klinefelter syndrome by a relative value through comparison with the control group 2 (XY). Therefore, by performing repeated experiments using each of the three CFX96™ Real-Time system machines, we tried to minimize errors that may occur between machines and confirm the reproducibility of the experiment.

그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, CFX96™ Real-Time 시스템 기계별 시료 테스트 수행 시, 클라인펠터 증후군의 타입을 나타내는 실험군 1(XXY) 및 실험군 2(XXXY)의 경우 전체 성염색체 중 X-염색체가 차지하는 % 비율(Q)이 대조군 2(XY)보다 더 높게 나타나는 것을 형광 값으로 확인하였다. 따라서, CFX96™ Real-Time 시스템 기계에 따른 형광 값은 조금씩 다르지만 전체 성염색체 중 X-염색체의 함유량에 따른 % 비율(Q)은 유사하게 증가하였다.
As a result, as shown in Table 5, when performing a sample test for each machine of the CFX96™ Real-Time system, in the case of Experimental Group 1 (XXY) and Experimental Group 2 (XXXY) indicating the type of Klinefelter's syndrome, the X-chromosome among all sex chromosomes. It was confirmed by the fluorescence value that the% ratio (Q) occupied by is higher than that of the control group 2 (XY). Therefore, the fluorescence values according to the CFX96™ Real-Time system machine are slightly different, but the% ratio (Q) according to the content of the X-chromosome among the total sex chromosomes has similarly increased.

하기 표 5는 3대의 CFX96™ Real-Time 시스템 기계들을 이용한 성별 및 클라인펠터 증후군 시료의 형광 값을 나타낸 것이다.Table 5 below shows the fluorescence values of sex and Klinefelter syndrome samples using three CFX96™ Real-Time system machines.

Figure 112015069298408-pat00005
Figure 112015069298408-pat00005

한편, PNA 프로브 농도에 변화를 가하여, 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단이 가능한지 확인하였다. 그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, PNA 프로브 농도에 따른 X-염색체의 비율(Q)의 변화는 크게 없었고, X-염색체의 비율(Q)은 X-염색체의 수적 이상에 따라 증가하였다.
On the other hand, by applying a change in the concentration of the PNA probe, it was confirmed whether sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis were possible. As a result, as shown in Table 6, there was no significant change in the ratio (Q) of the X-chromosome according to the concentration of the PNA probe, and the ratio (Q) of the X-chromosome increased with more than the number of X-chromosomes.

하기 표 6은 PNA 프로브 농도에 따른 성별 및 클라인펠터 증후군 시료의 X-염색체 비율(Q)을 나타낸 것이다.Table 6 below shows the X-chromosome ratio (Q) of sex and Klinefelter syndrome samples according to the PNA probe concentration.

Figure 112015069298408-pat00006
Figure 112015069298408-pat00006

실시예Example 4: 염기변이와 융해온도에 따른 성별 판별 및 4: Sex determination according to base variation and melting temperature and 클라인펠터Klinefelter 증후군의 진단 Diagnosis of the syndrome

실시예 3의 U-TOPTM 결과로 확인된 Tm값을 표 4에 나타내었다. 즉, PM(Perfect Match), MM(Mismatch), 또는 PM 및 MM이 동시에 존재 시 온도의 ±2℃ 범위를 만들고 이 범위 안에 포함되면 각각의 문자로 표기하여 고유의 표기법을 가지도록 하였다.U-TOP TM of Example 3 Table 4 shows the Tm value confirmed as a result. In other words, when PM (Perfect Match), MM (Mismatch), or PM and MM exist at the same time, a range of ±2°C of temperature was created, and when included within this range, each character was used to have a unique notation.

실시예 3의 U-TOPTM 결과로 확인된 Tm 값을 표 7에 나타내었다. PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석에 따른 X- 및 Y-염색체의 Tm(℃) 값을 ±2℃ 범위로 설정하고, 이 범위 안에 포함되는 대조군과 실험군의 염색체 타입에 따른 형광 값(RFU)을 공식(수학식)에 대입하여 산출된 값을 기준으로 성별을 판별하고 클라인펠터 증후군 여부를 진단할 수 있도록 하였다.
U-TOP TM of Example 3 Table 7 shows the Tm values confirmed as a result. The Tm (℃) values of the X- and Y-chromosomes according to the melting curve analysis using a PNA probe are set in the range of ±2℃, and the fluorescence values (RFU) according to the chromosome types of the control and experimental groups within this range are formulated. Based on the calculated value by substituting it into (Equation), gender was determined and Klinefelter syndrome was diagnosed.

하기 표 7은 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브의 융해온도 범위와 성별 판별 및 클라인펠터 증후군 진단을 위해 X-염색체의 % 비율(Q)을 구하는 공식이 포함된 판정표를 나타낸 것이다.Table 7 below shows a determination table containing a formula for determining the percentage of X-chromosomes (Q) for the melting temperature range of the PNA probe for gender determination and Klinefelter syndrome diagnosis and gender determination and Klinefelter syndrome diagnosis.

Figure 112015069298408-pat00007
Figure 112015069298408-pat00007

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and for those of ordinary skill in the art, it is obvious that these specific techniques are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Therefore, it will be said that the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Seasunbiomaterials <120> Method for Sex Determination and Diagnosing Klinefelter Syndrome Using PNA Probe <130> P15-B183 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klinefelter-P <400> 1 tcctaccacc agcttc 16 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klinefelter- F <400> 2 ccctgggctc tgtaaagaat agtg 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klinefelter- R <400> 3 aggcttgagg ccaaccatca g 21 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kline-PM (XX) <400> 4 gaagctggtg gtagga 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kline-MM <400> 5 gaagctgatg gtagga 16 <210> 6 <211> 5824 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens amelogenin precursor (AMELX) gene, complete cds <400> 6 atggggacct ggattttatt tgcctgcctc ctgggagcag cttttgccat gcctgtgagt 60 aaaacacccc ttgcataagt cagtgtccaa tttcacaaac ttggacataa aaatctgctc 120 atagttggtg aaattagggt ttaaaacagt atgagatcag atgtcttcat atgtctctgg 180 gttgaagaaa cacttcagga gcttgtttta aaaaggtata ttctcaaatg ccgctaccaa 240 aaattctgat ttggtacagc tggggcgggg cccaggactc tgcattttta taagcacccc 300 aggagattct gttggaactg ttagcttgta aatatcacca cccatctcta gatggaggaa 360 gcttttggaa gggacccttg aaaggtctcc agagaaagtg cttaaccagc tttggacaaa 420 tattacagag atgccagttt tgtctaaaac ccaattcctc tcaagattcc aaatctcttc 480 ctgccctcca catattgctg ctcttacccc tcagggggta agatttttgt gttaggaatc 540 cactttttga gccacattcc tgttctcaga ggccccaccc ctttgggtac atctgatgag 600 tacgtgactt ttttgtggtt gcccgggatc ctgcctacac ccaatacata gtgatatatt 660 ttatattcaa atgtattaaa gatcaggaca ttagacccac tctgtctgga cacaggtgca 720 taagggcaga gaacttagat cacatgcatg ccaagcaggc tgcatctgct ttttggtgga 780 ataaagagca gttgatacaa ccagaagcca gcaagcttgc acccttgcct cctctcttcc 840 tctctcaccc acaaaaccaa gattctgtgc tctgacttcc tgaaatcctg cattgcagcg 900 attcctagtt tcctcagggg tccctgcctt acaaattcag cccttttccc actctctaag 960 atggtattgt tcaagagggt 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taaaaacaga cctcaagtat attctgcact atatagattt 1860 ttttaaagta gcttcagtct cctttaatgt gaacaattgc atactgactt aatctcttcc 1920 tctctcttct cttccttcac tctctccctt cctctctctt tctattctcc tcccctcctc 1980 cctgtaaaag ctaccacctc atcctgggca ccctggttat atcaacttca gctatgaggt 2040 aatttttctc tttactaatt ttgaccattg tttgcgttaa caatgccctg ggctctgtaa 2100 agaatagtgt gttgattctt tatcccagat gtttctcaag tggtcctgat tttacagttc 2160 ctaccaccag cttcccagtt taagctctga tggttggcct caagcctgtg tcgtcccagc 2220 agcctcccgc ctggccactc tgactcagtc tgtcctccta aatatggccg taagcttacc 2280 catcatgaac cactactcag ggaggctcca tgatagggca aaaagtaaac tctgaccagc 2340 ttggttctaa cccagctagt aaaatgtaag gattaggtaa gatgttattt aaaactcttt 2400 ccagctcaaa aaactcctga ttctaagata gtcacactct atgtgtgtct cttgcttgcc 2460 tctgctgaaa tattagtgac taagtggtat aggagagact ccgcagaaca gcggaatgca 2520 tgagttttgg acgtcgggtt tgaggttctc ctcaacctct tactaacttt gtgattttgg 2580 gcaaatcatt tcctctttct ggaaccctgg tttcctcatc tggagaaagg aaataattat 2640 aataaccata tttcaaaata ttgtttggag agtaatatag ttaatgaata tgaaaagtgc 2700 tttgtcaagt ataatatgag caaggttact gattattttt tgtatcgatt aaatgccgta 2760 ttactatatg aagaatcctc aaacctaagg ctaaccaagt atatatactg ttcagaaagg 2820 aataagattc ttacttctct cacaggttca ggtaacaatc tatgagttta tttacttata 2880 aaagctgaag acaaatgtta gtaagatttt gaggcaagat tttctgttga accgaaaaga 2940 ttgacacatc tgatcagtca atctgtgttt ctaggatgag ggacagtgtt tgcacctctc 3000 tttttcccat tgtgacatca aagaaaaaaa tgaaattaac atcatgtcat attattatgt 3060 cataattttg tgtttgtttt gctcttacaa tgaaaagaag gaactatgga attaaacaga 3120 tttactccct gtgtaacctc agtcaagtta atgaatctct ttaactcccc ataaccttat 3180 ctaaaaagtg agagtaataa tacttgcctc ctagcatata agaaaagatg aagaatgtgt 3240 gtgatggatg taaacacagt gcctgtcaca caggaagcac ccaacaaatt tttaccttct 3300 tctttctttt gtagaactca cattctcagg ctatcaatgt tgacaggact gcattagtga 3360 gtctatattt cctactgcat cagtgagttt ctatattgga tgaaagtaaa ttaaatcaaa 3420 tgggttctaa tatctttttc tcttaaggtg cttacccctt tgaagtggta ccagagcata 3480 aggccaccgg tatgtagaca ttttgttcct tattccctga aaatattagg catgcattaa 3540 aattcccata ttaagtgaaa tatcatgtct actccacatg cagacattaa tgggaaattt 3600 agtttgtaaa aaatcatatc tgtgtacaca gttacaaatt tttgcaaagg aaaaatgaat 3660 aaaatattcc tatagccata atggcaaaga aaacactgct gcttctctgg ttggagtcac 3720 ctgagccaat ggtaaacctg cctctctgtt tctcaccagt acccttccta tggttacgag 3780 cccatgggtg gatggctgca ccaccaaatc atccccgtgc tgtcccaaca gcaccccccg 3840 actcacaccc tgcagcctca tcaccacatc ccagtggtgc cagctcagca gcccgtgatc 3900 ccccagcaac caatgatgcc cgttcctggc caacactcca tgactccaat ccaacaccac 3960 cagccaaacc tccctccgcc cgcccagcag ccctaccagc cccagcctgt tcagccacag 4020 cctcaccagc ccatgcagcc ccagccacct gtgcacccca tgcagcccct gccgccacag 4080 ccacctctgc ctccgatgtt ccccatgcag cccctgcctc ccatgcttcc tgatctgact 4140 ctggaagctt ggccatcaac agacaagacc aagcgggagg aagtggtgag tatattttga 4200 agccactaca atgcaaatcc tgtgaaaatg gtgcagcaaa ataggcccca gagttctaag 4260 gtctccgaca accaaggatc tagagttgta gtagttacag gtctatgatt ctattagtcc 4320 aagcaatatg ctataccttt atgttaaaga caaattcctc taaatggctt ggtaattaag 4380 accacagttt ttatggtagg tttcaatttt actattactg aatttctacc agaatatgta 4440 ttaccaaaac ccattaatag aaatatatat tactaaaccc catgaatttt aagggcaaca 4500 gtataaggga atatcagttc tccttatatt tcaaaggttt gactagcaag aataggctag 4560 agttgcactg aaggcttaag acaagaggga gcggataatt ttgagagtgc aaatatctga 4620 acaggctaca aaaggtagac gggaaatctc ttcaaaaacc tacaggaaga ttccccattt 4680 ccagtagttt tcaatctaac ttggaggcgg ctaaactaaa catactgtta gattcctttt 4740 ctgtactggg gttctataga tgattaagct tttagcaaga agttactgca atttagcact 4800 aaatcttcca ttacaggtag ctcttacaaa tgaatgggaa tagtcaacaa aacaaactta 4860 atctacatcc ataaagtctt acttctatgt atacgagatt atgtgatcct atcatgtata 4920 tgtatccaac tgtaattcca atttatacat gttattgatg atttgctact gagaagaaga 4980 gagaagtgag gtggaaatga ccaggataag aagccaggac acaaaggttc caattctggc 5040 tttgccctca aagacgaggc agtattgtaa aagttacttc aaatgtatcg gtgttttatt 5100 ttcttttaaa tgggggaaaa tgacgaaatc agattatttt caagtctctg tccaattata 5160 aataccatag tttctgaatt taaaaaaatc ataatatatg tcataaatgg cttcataatt 5220 gtgagcatgt ttacggaaaa tatggggcag aattttttga aaattgattg aatcccaagt 5280 aatcggtgcc tatcattggc tattctagtc caaggcacat gttctctctg tacatagaaa 5340 atgcatttac ttctttatga ataattaata ccatgaactt tataatgtgc tcacatcttg 5400 acaaagctat ttatggaaag gtgactttgg gcagatagtt tgaactcttt aaaactcagt 5460 ttctttttgt gtaaaatttg agtataaaca ttgatagttt cttagagttg ttttatggaa 5520 aacaaaatag cgtgataagc ttggagcctg acatgcaaga cgtacccccc aaaaaggtag 5580 caattgttat tttattataa aataataggc tttaagtgtc ctgaaggtgg aagcagtcct 5640 catggacacc taatatctaa tgacaacgaa ataacaaaga aacttcagaa attatagagt 5700 tcaacttaaa tggttgtaca ttgttttgac aaaactgaag ccagacatgt tattgtaaat 5760 ggtactcact aggaacattt gtaaattatt ttaactgttc ttttgcaatt tttttcagga 5820 ttaa 5824 <210> 7 <211> 1495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens amelogenin Y-linked (AMELY), RefSeqGene on chromosome Y <400> 7 aaaacctata cgaaggtttc ccattttcag tagttttcag tctaacttgg aggaggctaa 60 actaaacatg ctgttagagt cctttttagt gctgagattc tatagatgat taagctttta 120 aaaagaagtt acctcaattt atgactgaat ctcccattac aagaagcact tacaaatgaa 180 tgggaataat caataaaaaa actttatcca catccataaa atcttatttc tacgtatata 240 agattatgtg atctatcact tatatgtatc caactgtaat tccaatttat acaagctatt 300 gatgatatac tactgagaag cagagaaaag tgaggtggaa atgaccagga tagacagcca 360 ggacagctag gttcaagttc tggctttgcc ctcaaaaagg aggcactatt gtaaaagtta 420 cttcaaatgt gtgagtattt tcgtttcttt taaatggggg aaaatgacaa aatcagatca 480 ttttcaagcc tctgtccagg tataaatgtg ataacttctg aattaaaaaa tcataatata 540 tgttataaat ggcttaataa ttgtgagcat gtttacagag aatatggggc agaatttttg 600 aaaattgatt gaggctgggt ggggtggctc acacttgtaa tctcagcact ttgagaagcc 660 cagacaggtg gatcacctga ggtcaggagt ttgagaccag cctggtcaac atggtgaaac 720 cacatctcta ctaaaaacac gaagggaaaa aaaaaagtta gttgggcgtg gaagcagatg 780 cctgtaattc caattacaag ggaggctgag gcagcagaat tgtttcaacc gaggaagtgg 840 aggttgcagt gagccaagat cgtgccattg agctacagcc tgggtagcaa gagtgaaact 900 ccgcctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga aaggaaattg attgaatccc aagtaatctg 960 acgactatca ttggctattc tagtctaaag cacatgttct ctctgtgcat agaaaatgca 1020 tttatttatc tccttattaa gaattaacac cgtggattta taatgtgctc acaccttgac 1080 aaagctattt atggaaaggt gactttgggc agatagtttg aactctttaa aactcagttt 1140 cttttcgtat aaaatttgag tataaataat agtttcttag agttgtttta agaaaaataa 1200 aatagcatgg tgagcttgga acctggcatg caagaattac tcaaagaaag gtagcaattg 1260 ttattttgtt ataaaataat aggctttaag tgttccaaag gtagaagaag gcttcatgga 1320 cacctaatat ctaatgacaa cgaatgaaca aagaaacttt ggaaattata gagttcaact 1380 taagtggttg tacattggtt tgacaaaacc gaaggcatac atgtattgta aatggtactc 1440 actggaaaca attaaattat ttaattgttc cttttgctat ttttttcagg attaa 1495 <110> Seasunbiomaterials <120> Method for Sex Determination and Diagnosing Klinefelter Syndrome Using PNA Probe <130> P15-B183 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klinefelter-P <400> 1 tcctaccacc agcttc 16 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klinefelter- F <400> 2 ccctgggctc tgtaaagaat agtg 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klinefelter- R <400> 3 aggcttgagg ccaaccatca g 21 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kline-PM (XX) <400> 4 gaagctggtg gtagga 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kline-MM <400> 5 gaagctgatg gtagga 16 <210> 6 <211> 5824 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens amelogenin precursor (AMELX) gene, complete cds <400> 6 atggggacct ggattttatt tgcctgcctc ctgggagcag cttttgccat gcctgtgagt 60 aaaacacccc ttgcataagt cagtgtccaa tttcacaaac ttggacataa aaatctgctc 120 atagttggtg aaattagggt ttaaaacagt atgagatcag atgtcttcat atgtctctgg 180 gttgaagaaa cacttcagga gcttgtttta aaaaggtata ttctcaaatg ccgctaccaa 240 aaattctgat ttggtacagc tggggcgggg cccaggactc tgcattttta taagcacccc 300 aggagattct gttggaactg ttagcttgta aatatcacca cccatctcta gatggaggaa 360 gcttttggaa gggacccttg aaaggtctcc agagaaagtg cttaaccagc tttggacaaa 420 tattacagag atgccagttt tgtctaaaac ccaattcctc tcaagattcc aaatctcttc 480 ctgccctcca catattgctg ctcttacccc tcagggggta agatttttgt gttaggaatc 540 cactttttga gccacattcc tgttctcaga ggccccaccc ctttgggtac atctgatgag 600 tacgtgactt ttttgtggtt gcccgggatc ctgcctacac ccaatacata gtgatatatt 660 ttatattcaa atgtattaaa gatcaggaca ttagacccac tctgtctgga cacaggtgca 720 taagggcaga gaacttagat cacatgcatg ccaagcaggc tgcatctgct ttttggtgga 780 ataaagagca gttgatacaa ccagaagcca gcaagcttgc acccttgcct cctctcttcc 840 tctctcaccc acaaaaccaa gattctgtgc tctgacttcc tgaaatcctg cattgcagcg 900 attcctagtt tcctcagggg tccctgcctt acaaattcag cccttttccc actctctaag 960 atggtattgt tcaagagggt ataggacctg actaaaacca ttcacatcca gatgagagag 1020 aataaacctt cccatgaaat gtgagcattt ttaaagaata taatagagcc aatcctaaat 1080 gaggccaatg tctgagggag attttctgca tgaccgtctc tcctccctgg accccaggca 1140 caaccagagt tccacaatac aggcaccaga cacttgggcc ccacttttga gaggacagac 1200 agtcctgatt cagatcatca ttcaggtggc cttttatttt taacttgaaa atttttctgc 1260 cataaaaccg ttggcagaat aataaaaaaa gatcggccta aacgtcataa atcaactctt 1320 tcattttcca tgggatttat aatgtttcca ctttgctcca cccatcttgt tctggcattc 1380 atcaataatt cccaccttgt ggtttctttt gtggcttctt ttgttgtatg gaagtgttgt 1440 ttactttgca tgtcaattat gagaaatccc tttgatactt aaaagtactt gaccacctcc 1500 tgatctacaa gggaacattc gtgagacaat tctctccttg ttgatatttc tttattgtga 1560 aagagaaaca cacttctctc cccattatgg ggtgagtttt atcagcaagt aaactgttgg 1620 gcaggatagg gtaggattca ttgaaaacac tgggcgtggg ggtgggatgc tgtccaaaga 1680 tcactggaga ataaatgtgt gctggtttct gcttccaggt ctccagccat aaggctataa 1740 ccccaggaac agtcatttag ctgttctgaa cctctttaaa ataaaaggtc tcctcttcta 1800 tacagcacat ttgttcaaac taaaaacaga cctcaagtat attctgcact atatagattt 1860 ttttaaagta gcttcagtct cctttaatgt gaacaattgc atactgactt aatctcttcc 1920 tctctcttct cttccttcac tctctccctt cctctctctt tctattctcc tcccctcctc 1980 cctgtaaaag ctaccacctc atcctgggca ccctggttat atcaacttca gctatgaggt 2040 aatttttctc tttactaatt ttgaccattg tttgcgttaa caatgccctg ggctctgtaa 2100 agaatagtgt gttgattctt tatcccagat gtttctcaag tggtcctgat tttacagttc 2160 ctaccaccag cttcccagtt taagctctga tggttggcct caagcctgtg tcgtcccagc 2220 agcctcccgc ctggccactc tgactcagtc tgtcctccta aatatggccg taagcttacc 2280 catcatgaac cactactcag ggaggctcca tgatagggca aaaagtaaac tctgaccagc 2340 ttggttctaa cccagctagt aaaatgtaag gattaggtaa gatgttattt aaaactcttt 2400 ccagctcaaa aaactcctga ttctaagata gtcacactct atgtgtgtct cttgcttgcc 2460 tctgctgaaa tattagtgac taagtggtat aggagagact ccgcagaaca gcggaatgca 2520 tgagttttgg acgtcgggtt tgaggttctc ctcaacctct tactaacttt gtgattttgg 2580 gcaaatcatt tcctctttct ggaaccctgg tttcctcatc tggagaaagg aaataattat 2640 aataaccata tttcaaaata ttgtttggag agtaatatag ttaatgaata tgaaaagtgc 2700 tttgtcaagt ataatatgag caaggttact gattattttt tgtatcgatt aaatgccgta 2760 ttactatatg aagaatcctc aaacctaagg ctaaccaagt atatatactg ttcagaaagg 2820 aataagattc ttacttctct cacaggttca ggtaacaatc tatgagttta tttacttata 2880 aaagctgaag acaaatgtta gtaagatttt gaggcaagat tttctgttga accgaaaaga 2940 ttgacacatc tgatcagtca atctgtgttt ctaggatgag ggacagtgtt tgcacctctc 3000 tttttcccat tgtgacatca aagaaaaaaa tgaaattaac atcatgtcat attattatgt 3060 cataattttg tgtttgtttt gctcttacaa tgaaaagaag gaactatgga attaaacaga 3120 tttactccct gtgtaacctc agtcaagtta atgaatctct ttaactcccc ataaccttat 3180 ctaaaaagtg agagtaataa tacttgcctc ctagcatata agaaaagatg aagaatgtgt 3240 gtgatggatg taaacacagt gcctgtcaca caggaagcac ccaacaaatt tttaccttct 3300 tctttctttt gtagaactca cattctcagg ctatcaatgt tgacaggact gcattagtga 3360 gtctatattt cctactgcat cagtgagttt ctatattgga tgaaagtaaa ttaaatcaaa 3420 tgggttctaa tatctttttc tcttaaggtg cttacccctt tgaagtggta ccagagcata 3480 aggccaccgg tatgtagaca ttttgttcct tattccctga aaatattagg catgcattaa 3540 aattcccata ttaagtgaaa tatcatgtct actccacatg cagacattaa tgggaaattt 3600 agtttgtaaa aaatcatatc tgtgtacaca gttacaaatt tttgcaaagg aaaaatgaat 3660 aaaatattcc tatagccata atggcaaaga aaacactgct gcttctctgg ttggagtcac 3720 ctgagccaat ggtaaacctg cctctctgtt tctcaccagt acccttccta tggttacgag 3780 cccatgggtg gatggctgca ccaccaaatc atccccgtgc tgtcccaaca gcaccccccg 3840 actcacaccc tgcagcctca tcaccacatc ccagtggtgc cagctcagca gcccgtgatc 3900 ccccagcaac caatgatgcc cgttcctggc caacactcca tgactccaat ccaacaccac 3960 cagccaaacc tccctccgcc cgcccagcag ccctaccagc cccagcctgt tcagccacag 4020 cctcaccagc ccatgcagcc ccagccacct gtgcacccca tgcagcccct gccgccacag 4080 ccacctctgc ctccgatgtt ccccatgcag cccctgcctc ccatgcttcc tgatctgact 4140 ctggaagctt ggccatcaac agacaagacc aagcgggagg aagtggtgag tatattttga 4200 agccactaca atgcaaatcc tgtgaaaatg gtgcagcaaa ataggcccca gagttctaag 4260 gtctccgaca accaaggatc tagagttgta gtagttacag gtctatgatt ctattagtcc 4320 aagcaatatg ctataccttt atgttaaaga caaattcctc taaatggctt ggtaattaag 4380 accacagttt ttatggtagg tttcaatttt actattactg aatttctacc agaatatgta 4440 ttaccaaaac ccattaatag aaatatatat tactaaaccc catgaatttt aagggcaaca 4500 gtataaggga atatcagttc tccttatatt tcaaaggttt gactagcaag aataggctag 4560 agttgcactg aaggcttaag acaagaggga gcggataatt ttgagagtgc aaatatctga 4620 acaggctaca aaaggtagac gggaaatctc ttcaaaaacc tacaggaaga ttccccattt 4680 ccagtagttt tcaatctaac ttggaggcgg ctaaactaaa catactgtta gattcctttt 4740 ctgtactggg gttctataga tgattaagct tttagcaaga agttactgca atttagcact 4800 aaatcttcca ttacaggtag ctcttacaaa tgaatgggaa tagtcaacaa aacaaactta 4860 atctacatcc ataaagtctt acttctatgt atacgagatt atgtgatcct atcatgtata 4920 tgtatccaac tgtaattcca atttatacat gttattgatg atttgctact gagaagaaga 4980 gagaagtgag gtggaaatga ccaggataag aagccaggac acaaaggttc caattctggc 5040 tttgccctca aagacgaggc agtattgtaa aagttacttc aaatgtatcg gtgttttatt 5100 ttcttttaaa tgggggaaaa tgacgaaatc agattatttt caagtctctg tccaattata 5160 aataccatag tttctgaatt taaaaaaatc ataatatatg tcataaatgg cttcataatt 5220 gtgagcatgt ttacggaaaa tatggggcag aattttttga aaattgattg aatcccaagt 5280 aatcggtgcc tatcattggc tattctagtc caaggcacat gttctctctg tacatagaaa 5340 atgcatttac ttctttatga ataattaata ccatgaactt tataatgtgc tcacatcttg 5400 acaaagctat ttatggaaag gtgactttgg gcagatagtt tgaactcttt aaaactcagt 5460 ttctttttgt gtaaaatttg agtataaaca ttgatagttt cttagagttg ttttatggaa 5520 aacaaaatag cgtgataagc ttggagcctg acatgcaaga cgtacccccc aaaaaggtag 5580 caattgttat tttattataa aataataggc tttaagtgtc ctgaaggtgg aagcagtcct 5640 catggacacc taatatctaa tgacaacgaa ataacaaaga aacttcagaa attatagagt 5700 tcaacttaaa tggttgtaca ttgttttgac aaaactgaag ccagacatgt tattgtaaat 5760 ggtactcact aggaacattt gtaaattatt ttaactgttc ttttgcaatt tttttcagga 5820 ttaa 5824 <210> 7 <211> 1495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens amelogenin Y-linked (AMELY), RefSeqGene on chromosome Y <400> 7 aaaacctata cgaaggtttc ccattttcag tagttttcag tctaacttgg aggaggctaa 60 actaaacatg ctgttagagt cctttttagt gctgagattc tatagatgat taagctttta 120 aaaagaagtt acctcaattt atgactgaat ctcccattac aagaagcact tacaaatgaa 180 tgggaataat caataaaaaa actttatcca catccataaa atcttatttc tacgtatata 240 agattatgtg atctatcact tatatgtatc caactgtaat tccaatttat acaagctatt 300 gatgatatac tactgagaag cagagaaaag tgaggtggaa atgaccagga tagacagcca 360 ggacagctag gttcaagttc tggctttgcc ctcaaaaagg aggcactatt gtaaaagtta 420 cttcaaatgt gtgagtattt tcgtttcttt taaatggggg aaaatgacaa aatcagatca 480 ttttcaagcc tctgtccagg tataaatgtg ataacttctg aattaaaaaa tcataatata 540 tgttataaat ggcttaataa ttgtgagcat gtttacagag aatatggggc agaatttttg 600 aaaattgatt gaggctgggt ggggtggctc acacttgtaa tctcagcact ttgagaagcc 660 cagacaggtg gatcacctga ggtcaggagt ttgagaccag cctggtcaac atggtgaaac 720 cacatctcta ctaaaaacac gaagggaaaa aaaaaagtta gttgggcgtg gaagcagatg 780 cctgtaattc caattacaag ggaggctgag gcagcagaat tgtttcaacc gaggaagtgg 840 aggttgcagt gagccaagat cgtgccattg agctacagcc tgggtagcaa gagtgaaact 900 ccgcctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga aaggaaattg attgaatccc aagtaatctg 960 acgactatca ttggctattc tagtctaaag cacatgttct ctctgtgcat agaaaatgca 1020 tttatttatc tccttattaa gaattaacac cgtggattta taatgtgctc acaccttgac 1080 aaagctattt atggaaaggt gactttgggc agatagtttg aactctttaa aactcagttt 1140 cttttcgtat aaaatttgag tataaataat agtttcttag agttgtttta agaaaaataa 1200 aatagcatgg tgagcttgga acctggcatg caagaattac tcaaagaaag gtagcaattg 1260 ttattttgtt ataaaataat aggctttaag tgttccaaag gtagaagaag gcttcatgga 1320 cacctaatat ctaatgacaa cgaatgaaca aagaaacttt ggaaattata gagttcaact 1380 taagtggttg tacattggtt tgacaaaacc gaaggcatac atgtattgta aatggtactc 1440 actggaaaca attaaattat ttaattgttc cttttgctat ttttttcagg attaa 1495

Claims (20)

서열번호 1로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
PNA probe for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis represented by SEQ ID NO: 1.
 제1항에 있어서, 아멜로제닌(amelogenin) 유전자와 혼성화하는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
The PNA probe for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis according to claim 1, which hybridizes with an amelogenin gene.
 제1항에 있어서, 아멜로제닌 유전자의 64C>T 염기변이가 포함된 부위와 혼성화하는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
The PNA probe for sex determination and Klinefelter syndrome according to claim 1, wherein hybridization with a region containing a 64C>T base mutation of the amelogenin gene.
 제1항에 있어서, 리포터 및 소광자 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
The PNA probe for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis according to claim 1, wherein any one or more of a reporter and a quencher are combined.
 제4항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
The method of claim 4, wherein the reporter is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 And PNA probe for gender determination and Klinefelter syndrome diagnosis, characterized in that at least one selected from the group consisting of CY5.
 제4항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 PNA 프로브.
The PNA probe for sex determination and Klinefelter syndrome according to claim 4, wherein the quencher is at least one selected from the group consisting of 6-carboxytetramethyl-rhodamine (TAMRA), BHQ1, BHQ2, and Dabcyl.
 제1항에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프로브.
The method of claim 1, wherein the karyotype of the Klinefelter syndrome is a non-mosaicism karyotype selected from the group consisting of 47,XXY karyotype, 48,XXXY karyotype, 49,XXXXY karyotype, and combinations thereof, or 46,XY/47,XXY karyotype, 46,XX/47,XXY karyotype, 46,XX/46,XY/47,XXY karyotype, 46,XY/48,XXX karyotype, 46,XX/48,XXXY karyotype, 46 In the group consisting of, XX/46,XY/48,XXXY karyotype, 46,XY/49,XXXXY karyotype, 46,XX/49,XXXXY karyotype, 46,XX/46,XY/49,XXXXY karyotype, and combinations thereof A probe for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis, characterized in that the selected mosaic (mosaicism) karyotype.
 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍.
A pair of primers for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis represented by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
 제8항에 있어서, 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍.
9. The primer pair for gender identification and Klinefelter syndrome diagnosis according to claim 8, which is used to amplify the amelogenin gene.
 제8항에 있어서, 아멜로제닌 유전자의 64C>T 염기변이가 포함된 부위를 증폭시키는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍.
The primer pair for sex determination and Klinefelter syndrome according to claim 8, which is used to amplify a region containing the 64C>T base mutation of the amelogenin gene.
 제8항에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 프라이머 쌍.
The method of claim 8, wherein the karyotype of the Klinefelter syndrome is a non-mosaicism karyotype selected from the group consisting of 47,XXY karyotype, 48,XXXY karyotype, 49,XXXXY karyotype, and combinations thereof, or 46,XY/47,XXY karyotype, 46,XX/47,XXY karyotype, 46,XX/46,XY/47,XXY karyotype, 46,XY/48,XXX karyotype, 46,XX/48,XXXY karyotype, 46 In the group consisting of, XX/46,XY/48,XXXY karyotype, 46,XY/49,XXXXY karyotype, 46,XX/49,XXXXY karyotype, 46,XX/46,XY/49,XXXXY karyotype, and combinations thereof A pair of primers for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis, characterized in that the selected mosaic (mosaicism) karyotype.
 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 프라이머 쌍을 포함하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 조성물.
A composition for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis comprising a PNA probe of any one of claims 1 to 7 and a primer pair of any one of claims 8 to 11.
 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 프라이머 쌍을 포함하는 성별 판별용 및 클라인펠터 증후군 진단용 키트.
A kit for sex determination and Klinefelter syndrome diagnosis comprising a PNA probe of any one of claims 1 to 7 and a primer pair of any one of claims 8 to 11.
 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 또는 클라인펠터 증후군 진단을 위한 정보제공 방법.
A method of providing information for gender determination or Klinefelter syndrome diagnosis, characterized in that the PNA probe of any one of claims 1 to 7 is used.
 다음 단계를 포함하는 성별 판별 또는 클라인펠터 증후군 진단을 위한 정보제공 방법:
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 아멜로제닌(amelogenin) 유전자를 증폭시킬 수 있는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 프라이머를 이용하여 상기 유전자를 증폭시키고, 상기 유전자와 혼성화할 수 있는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 반응물의 융해곡선 분석을 통해 성별을 판별을 위한 결과 또는 클라인펠터 증후군의 유무를 판별을 위한 결과를 제공하는 단계.
A method of providing information for gender determination or Klinefelter syndrome diagnosis comprising the following steps:
(a) extracting a target nucleic acid from the specimen;
(b) Claims 1 to 7 capable of amplifying the gene and hybridizing with the gene by amplifying the gene using the primer of any one of items 8 to 11 capable of amplifying the amelogenin gene. Hybridizing with the PNA probe of any one of claims; And
(c) providing a result for determining sex or a result for determining the presence or absence of Klinefelter syndrome through analysis of the melting curve of the reactants hybridized with the PNA probe in step (b).
 제15항에 있어서, 상기 아멜로제닌 유전자는 64C>T 염기변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 또는 클라인펠터 증후군 진단을 위한 정보제공 방법.
16. The method of claim 15, wherein the amelogenin gene comprises a 64C>T base mutation.
 제15항에 있어서, 상기 클라인펠터 증후군의 핵형(karyotype)은 47,XXY 핵형, 48,XXXY 핵형, 49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 비모자이크(non-mosaicism) 핵형, 또는 46,XY/47,XXY 핵형, 46,XX/47,XXY 핵형, 46,XX/46,XY/47,XXY 핵형, 46,XY/48,XXX 핵형, 46,XX/48,XXXY 핵형, 46,XX/46,XY/48,XXXY 핵형, 46,XY/49,XXXXY 핵형, 46,XX/49,XXXXY 핵형, 46,XX/46,XY/49,XXXXY 핵형 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 모자이크(mosaicism) 핵형인 것을 특징으로 하는 성별 판별 또는 클라인펠터 증후군 진단을 위한 정보제공 방법.
The method of claim 15, wherein the karyotype of the Klinefelter syndrome is a non-mosaicism karyotype selected from the group consisting of 47,XXY karyotype, 48,XXXY karyotype, 49,XXXXY karyotype, and combinations thereof, or 46,XY/47,XXY karyotype, 46,XX/47,XXY karyotype, 46,XX/46,XY/47,XXY karyotype, 46,XY/48,XXX karyotype, 46,XX/48,XXXY karyotype, 46 In the group consisting of, XX/46,XY/48,XXXY karyotype, 46,XY/49,XXXXY karyotype, 46,XX/49,XXXXY karyotype, 46,XX/46,XY/49,XXXXY karyotype, and combinations thereof Information providing method for gender determination or Klinefelter syndrome diagnosis, characterized in that the selected mosaic (mosaicism) karyotype.
 제15항에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 또는 클라인펠터 증후군 진단을 위한 정보제공 방법.
The method of claim 15, wherein the melting curve analysis is performed by a fluorescence melting curve analysis (FMCA) method.
 제15항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 또는 클라인펠터 증후군 진단을 위한 정보제공 방법.
The method of claim 15, wherein the amplification is performed by a real-time polymerase chain reaction (PCR) method.
 제15항에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 X-염색체: 63.0~67.0℃ 및 Y-염색체: 48.0~52.0℃의 핵형 융해온도 범위에서의 PNA 프로브로 혼성화된 반응물의 형광 값(relative fluorescence unit, RFU)을 하기 수학식 1에 대입하여 계산하는 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 성별 판별 또는 클라인펠터 증후군 진단을 위한 정보제공 방법:
[수학식 1]
Q(%) = ((｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜)/X-염색체 RFU) X 100

여기서, Q(%)는 X-염색체 비율임;
｜X-염색체 RFU - Y-염색체 RFU｜의 값은 절대값임;
Q = 100 %일 경우, 정상 여성(XX);
0 % < Q < 10.0 %일 경우, 정상 남성(XY);
15.0 % < Q < 100 %일 경우, 클라인펠터 증후군(XXY 핵형 또는 XXXY 핵형)으로 진단함.The method of claim 15, wherein the melting curve analysis is performed on the X-chromosome: 63.0 to 67.0°C and the Y-chromosome: 48.0 to 52.0°C in the range of the karyotype melting temperature of the reactant hybridized with the PNA probe (relative fluorescence unit, RFU). A method for providing information for gender determination or Klinefelter syndrome diagnosis, characterized in that using a method for calculating) by substituting in Equation 1 below:
[Equation 1]
Q(%) = ((｜X-chromosome RFU-Y-chromosome RFU｜)/X-chromosome RFU) X 100

Where Q(%) is the ratio of the X-chromosome;
The value of |X-chromosome RFU-Y-chromosome RFU| is an absolute value;
If Q = 100%, normal female (XX);
For 0% <Q <10.0%, normal male (XY);
If 15.0% <Q <100 %, it is diagnosed as Klinefelter syndrome (XXY karyotype or XXXY karyotype).
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