KR102207989B1 - 꾸지나무 추출물의 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 - Google Patents

꾸지나무 추출물의 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.
상기 꾸지나무 추출물은 인간 모낭의 모유두 세포(HHDFP)의 성장을 유도 또는 촉진시킴으로써, 효과적으로 탈모를 방지하거나 발모를 촉진시키는데 활용될 수 있다.

Description

꾸지나무 추출물의 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING HAIR LOSS OR PROMOTING HAIR GROWTH COMPRISING BROUSSONETIA PAPYRIFERA EXTRACT}
본 발명은 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
최근 급속한 경제 성장과 생활수준의 향상으로 사람들의 삶의 질은 향상되었으나, 이에 따른 공해와 환경오염의 발생으로 인해 현대인들은 외부의 자극과 각종 질병에 노출되어 있다. 특히 모발과 관련하여 국소감염, 유전적 소인, 내분비 장애 등에 의해 탈모증이 발병된다고 밝혀졌으나, 최근의 연구에서는 스트레스, 환경오염에 의한 부작용, 화학적 제품에 의한 부작용 등 탈모에 관련한 다양한 요인들이 작용하는 것으로 나타났다.
탈모의 유발 기전 중에서도 특히 스트레스 등 환경에 의해 면역 세포와 호중구가 활성화되어 염증 반응을 일으키게 되고 모낭 조직을 파괴하여 모발 세포의 세포사를 유발하여 탈모가 진행되게 된다. 의료/제약 업계에서 이처럼 대응을 제대로 못하는 중요한 이유는 탈모의 발현 기작이 유전적 요인에 기반한 호르몬에 있기 때문이다. 물론 탈모의 원인은 호르몬 이외에 약물, 영양 등의 요인도 있지만, 그 두 가지는 항구적인 것이 아니라 일시적인 요인이고, 약물 투여를 중단하거나 영양 보충 등을 통해 손쉽게 해결할 수 있는 반면, 호르몬 문제는 쉽게 해결하기가 어려운 이슈이다.
따라서 현재의 탈모를 치료하는 약물들은 대게 탈모에 영향을 주는 호르몬을 제어하는 기작을 통해 탈모의 진행을 지연시키거나 중단시키는 것에 초점이 맞춰져 있다. 그러다 보니 기존의 화학적(Chemical) 기반의 약품은 호르몬을 제어함으로 인해 생기는 부작용을 수반하게 되고, 약물의 광범위한 사용 및 개발 제약에 영향을 끼치게 되었다. 의료/제약 업계의 어려움이 역설적으로 화장품 및 시술 시장에 대한 풍선효과를 유발하고, 화장품 및 시술은 주로 결과적으로 나타나는 현상인 모발의 두께가 가늘어지거나 두피의 피부 상태적인 문제로 인해 모공이 막히는 것을 해소하는 정도이다. 이를 위한 방안으로 두피의 각질을 제거하는 스켈링(scaling)을 하거나, 모근에 영양을 공급해줄 수 있는 외용제를 도포하기도 하고, 좀 더 근본적으로는 모근에 영양공급을 위해 필요한 모공 주변의 혈류를 개선해준다는 명목 하에 적외선 주사나 두피 마사지를 한다.
따라서 현존하는 의료/제약 업계와 화장품 사이의 간극을 메우고 의료/제약 및 화장품 업계가 탈모 치료의 주도권을 되찾기 위해서는 천연물 기반의 모발 관련 제품의 개발이 시급하다. 탈모의 원인이 되는 남성호르몬인 테스토스테론이 모발의 라이프 사이클(life cycle)에서 쇠퇴기로의 급격한 진행을 제어하고, 육모/양모 효과를 갖는 표적 단백질을 개발함으로써 부작용 없이 호르몬을 제어할 수 있는 모발화장품을 개발하는 것이 시급하다. 또한 탈모 치료는 일회성 약물 치료 보다는 부작용이 적은 다양한 치료법을 병행하는 것이 효과적이라고 의료 및 시술 업계에서 알려져 있는 사실이기 때문에, 천연물 기반의 의약품과 더불어 유사한 효과를 보유하고 있으면서 보조적 역할을 할 수 있는 화장품의 개발이 필요하다. 동일한 효과를 보유한 물질을 개발하고, 이에 대해 의약품과 화장품이 갖는 약품 함량의 규제 수준에 따라 적절하게 분배한 제품을 개발하는 것이 소비자의 부작용을 줄일 수 있고, 의료/제약 시장 및 화장품 시장의 동반 성장에도 효과적일 것이다.
한국공개특허 제10-2005-0013278호(2005.02.04 공개)
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 천연물을 이용한 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 탈모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물은 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 탈모 방지 또는 발모 촉진용 약학 조성물은 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 탈모 방지 또는 발모 촉진용 식품 조성물은 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 꾸지나무 추출물은 인간 모낭의 모유두 세포(HHDFP)의 성장을 유도 또는 촉진시킬 수 있다. 상기 추출물은 TCF/LEF-루시퍼라제 활성을 증가시키고, 모낭 발생 기전 중의 하나인 WNT 신호전달 활성을 통해 β-카테닌(β-catenin)을 증가시켜 전사인자인 TCF(T cell factor)의 활성을 유도하며, NFkB-루시퍼라제와 사이토카인(cytokine)에 의한 STAT6-루시퍼라제 활성을 억제하여 양성대조군인 미녹시딜 투여군보다 증가된 모발 생장 유도 효과를 가질 수 있다.
이에 따라, 본 발명에 따른 꾸지나무 추출물은 탈모 방지 또는 발모 촉진을 위한 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 꾸지나무 추출물의 지표물질인 루틴(rutin) 및 카페인산(caffeic acid)이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 크로마토그램으로, 도 2의 A는 꾸지나무 추출물의 지표성분인 카페인산(caffeic acid) 표준품의 크로마토그램을, 도 2의 B는 320 nm에서 분석된 꾸지나무 추출물의 크로마토그램을 나타내고, 도 3의 A는 루틴(rutin) 표준품의 크로마토그램을, 도 3의 B는 360 nm에서 분석된 꾸지나무 추출물의 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 꾸지나무 추출물이 인간 모낭의 모유두(HHDFP) 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5 및 도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 꾸지나무 추출물이 인간 모낭의 모유두(HHDFP) 세포 성장에 미치는 영향을 실시간 모니터링 한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른 TCF/LEF-루시퍼라제 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실험예에 따른 STAT6-루시퍼라제 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실험예에 따른 STAT3-루시퍼라제 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명의 발명자들은 종래의 합성 화학물질에 비해 부작용이 적으면서도 양모, 탈모 방지, 발모 촉진 효능이 뛰어난 물질에 대하여 연구하던 중, 꾸지나무 추출물이 인간 모낭의 모유두 세포 성장을 촉진시키고, TCF/LEF-루시퍼라제 활성을 증가시키며, NFkB-루시퍼라제와 STAT6-루시퍼라제 활성을 억제하여 모발 생장 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "꾸지나무(Broussonetia papyrifera)"는 아시아의 난대와 열대에 분포하며, 주로 산기슭의 양지쪽에서 자라는 쌍떡잎식물 쐐기풀목 뽕나무과의 낙엽활엽 소교목이다. 나무껍질은 종이의 원료로 각종 한지를 만들고, 열매는 약으로 쓰거나 맛이 좋아 그냥 먹기도 하며, 어린잎도 식용으로 사용한다. 한방에서는 신체 허약, 시력 감퇴 등의 약으로 사용하기도 한다.
상기 꾸지나무는 자연에서 채취 또는 재배된 것일 수 있고, 상업적으로 판매되는 것을 구입한 것일 수 있다. 상기 꾸지나무 추출물은 상기 꾸지나무의 꽃, 잎, 기둥, 뿌리 또는 이들 부위의 혼합물을 추출한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 꾸지나무 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 것일 수 있고, 바람직하게는 열수 추출물일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 꾸지나무 원료의 20배의 물을 투입하여 90 내지 100℃, 바람직하게는 95℃에서 5 내지 7시간, 바람직하게는 6시간 가열하여 추출한 뒤, 감압 농축 및 동결 건조하여 꾸지나무 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명에서, "추출물"이란, 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고 천연물, 즉 꾸지나무의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 의미하는 것으로, 꾸지나무의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함할 수 있다.
상기 꾸지나무 추출물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출될 수 있고, 예를 들어, 열수 추출, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등이 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 꾸지나무 추출물은 모유두 세포의 성장을 유도하거나 촉진시킬 수 있다.
본 발명에서, "모유두(Humam dermal papilla, HDP) 세포"는 모낭 하부의 모유두(dermal papilla)에 위치한 세포로써, 모낭의 발달 및 성장을 조절한다. 모유두 세포에는 모세혈관이 분포하고 있어, 이를 통해 모낭에 영양을 공급하고 성장인자와 저해인자를 분비하여 모낭 상피세포의 성장을 조절할 수 있다. 또한, 모유두 세포는 여러 성장인자와 사이토카인(cytokine)을 생성하여 모발의 생성, 증식, 분화에 관여한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 세포의 ATP 측정 키트를 통해 모유두 세포의 성장을 확인한 결과, 대조군에 비해 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였고, 양성 대조군과는 유사한 값을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 실시간 세포 성장 측정 장치를 통해서도 농도 의존적으로 세포 성장이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 꾸지나무 추출물은 모발 표적 단백질인 WNT 또는 JAK3의 신호 전달을 조절할 수 있고, 이를 통해 모유두 세포를 활성화하고 성장을 촉진시킬 수 있다.
본 발명에서, "WNT 단백질"은 Wnt 경로(Wnt pathway)의 리간드로 사용되는 단백질로, β-카테닌(β-catenin)의 안정성을 조절한다.
상기 꾸지나무 추출물은 WNT 신호 전달 활성을 통해 β-카테닌을 증가시켜 모유두 세포의 성장을 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일 실험예에 따르면, β-카테닌의 합성을 촉진하는데 관여하는 전사인자인 TCF/LEF-루시퍼라제의 활성이 꾸지나무 추출물의 농도에 따라 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다.
또한, 상기 꾸지나무 추출물은 JAK3-STAT6 신호 전달을 억제하여, 모유두 세포를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, "JAK-STAT 경로"는 사이토카인의 주요 정보 교환 경로로, IL-6 또는 IL-4에 의해 신호 전달이 조절될 수 있고, 본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 꾸지나무 추출물은 그 중 IL-4에 특이적인 STAT6를 억제함으로써, 모발 성장 저해의 신호 체계만를 억제함을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 꾸지나무 추출물은 전체 화장료 100 중량부에 대하여, 0.1 내지 10 중량부로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.5 내지 4 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계의 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있고, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말, 샴푸 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 화장료 조성물은 모발, 두피에 사용하는 모든 형태의 화장료로 제조될 수 있고, 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 또는 젤의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 추출물 외에 모발 화장료 제제에 있어서 수용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등이 포함될 수 있다.
상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등으로 사용될 수 있는 구체적인 화합물 또는 조성물은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 화합물 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 화장료 조성물뿐만 아니라, 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분인 상기 꾸지나무 추출물 외에 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 더 포함할 수 있고, 국소형 제형, 예를 들어, 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(패치제, 붕대 등) 등으로 제조될 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
약학적으로 허용되는 담체는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산칼슘, 식물성 기름(땅콩기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(프로필렌글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(TWEENS), 습윤제(라우릴 황산나트륨), 착색제, 풍미제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 포함할 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약학 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.
부형제도 본 발명의 약학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 바람직하게는 국소적으로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 통상 0.001~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 이는 투여자의 필요에 따라 증감할 수 있으며, 두피의 상태, 탈모의 진행 정도 등 상황에 따라 적절히 증감할 수 있다.
또한, 본 발명은 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 식품 조성물을 제공한다. 예를 들어, 건강보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있고, 또는 천연식품, 가공식품 등에 본 발명에 따른 조성물이 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 유효성분인 상기 꾸지나무 추출물 외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 더 포함될 수 있다.
상기 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. 이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005 중량% 내지 약 0.5중량% 범위일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 꾸지나무( Broussonetia papyrifera ) 추출물 제조
절단된 꾸지나무 3kg을 준비하였고, 상기 꾸지나무 원료의 20배의 물을 투입하여 95℃에서 6시간 가열하여 추출하였다. 상기 추출물은 2.5μm 여과지로 여과하였고, 여과된 액은 감압농축기를 이용하여 60±5℃에서 35∼45 brix가 될 때까지 농축하였다. 상기 농축물은 95℃에서 30초간 살균시킨 후, 동결건조 및 분쇄의 단계를 거쳐 분말 형태로 제조되었다.
<실험예 1> 꾸지나무 추출물 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 분석
1-1. 폴리페놀 함량 분석
폴린-시오칼토 시약(Folin-Ciocalteu reagent)이 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과, 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 한 폴린-시오칼토(Folin-Ciocalteu) 방법(Folin과 Ciocalteu, 1927)을 이용하였다.
2.5 mL의 증류수에 0.1 mL의 꾸지나무 추출물을 넣어 혼합한 후, 0.1 mL의 폴린-시오칼토 시약을 첨가하였다. 20% 탄산나트륨(Na2CO3) 용액 0.5 mL를 첨가하여 교반한 후 30분간 암실(20℃)에서 방치한 다음, 760 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 이때 표준물질로 사용한 갈산(gallic acid)의 농도는 1000 ppm의 스톡 솔루션(stock solution)을 제조하여 단계별(0, 100, 200, 500, 1000 ppm)로 희석한 다음 얻은 검량선으로부터 총 페놀함량을 구하였으며, 함량은 %(시료 100g 중의 g) 갈산(water)으로 나타내었다.
상기 실험예 1-1에 따라 측정한 결과, 꾸지나무 추출물의 폴리페놀 함량은 9.2%로 나타났다.
1-2. 플라보노이드 함량 분석
총 플라보노이드 함량은 비색(colorimetric) 방법(Zhishen 등, 1999)을 이용하여 측정하였다.
꾸지나무 추출물 0.25 mL와 (+)-카테킨(catechin) 표준물질 용액에 1.25 mL의 증류수를 첨가한 후 0.075 mL의 5% NaNO2 용액을 혼합하였다. 6분경과 후, 0.15 mL의 10% AlCl3 용액을 가하여 5분 동안 반응시킨 다음, 1M NaOH 용액 0.5 mL를 첨가하여 반응을 종료하였다. 이에 증류수 0.225 mL을 넣어 총량이 2.5 mL가 되도록 한 다음 교반하고, 즉시 510 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 플라보노이드 함량은 카테킨(catechin) 농도별(0, 100, 200, 500, 1000 ppm)로 희석된 표준품으로 검량선을 작성한 후, %(시료 100g 중의 g) (+)-카테킨으로 나타내었다.
상기 실험예 1-2에 따라 측정한 결과, 꾸지나무 추출물의 플라보노이드 함량은 3.5%로 나타났다.
<실험예 2> 꾸지나무 추출물의 지표 성분 분석
도 1은 본 발명에 따른 꾸지나무 추출물의 지표물질인 루틴(rutin) 및 카페인산(caffeic acid)이다.
꾸지나무 추출물의 지표 성분을 분석하기 위해 먼저 루틴 및 카페인산 적정량을 100% 메탄올로 용해하여 1.0 mg/mL가 되게 녹여 표준 원액으로 하였다. 검체 약 0.5 g을 취한 후, 100 mL 부피플라스크에 넣고 60% 메탄올 용액으로 표선까지 채웠다. 초음파 진탕기에서 충분히 녹인 후, 여과용 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 하였다.
지표물질 분석은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 정량분석 하였다. HPLC는 LC20A(Shimadzu, Japan), 컬럼(column)은 sunfire C18(4.6 × 250mm, 5μm, Waters, USA)을 사용하였다. 이동상 조성은 아세토니트릴(acetonitrile)과 0.1% 포름산(formic acid)으로 단계적으로 농도 구배를 주었으며, 유속은 1.0 mL/min, 주입량은 10μL, 컬럼 오븐은 35℃, 파장은 루틴, 카페인산 각각 360, 320 nm에서 분석하였다. 하기 표 1은 HPLC의 이동상 조건을 나타낸다.
시간(분) A%(Acetonitrile) B%(0.1% formic acid in water)
0 10 90
5 15 85
10 18 82
20 20 80
30 30 70
36 80 20
42 90 10
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 크로마토그램으로, 도 2의 A는 꾸지나무 추출물의 지표성분인 카페인산(caffeic acid) 표준품의 크로마토그램을, 도 2의 B는 320 nm에서 분석된 꾸지나무 추출물의 크로마토그램을 나타내고, 도 3의 A는 루틴(rutin) 표준품의 크로마토그램을, 도 3의 B는 360 nm에서 분석된 꾸지나무 추출물의 크로마토그램을 나타낸다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 꾸지나무 추출물을 분석한 결과, 주요 성분인 카페인산 및 루틴의 피크 머무름 시간은 각각 13분, 19분대로 나타났고, 꾸지나무 추출물 중 카페인산 및 루틴의 함량은 각각 2.7mg/g, 6.8mg/g 으로 확인되었다.
<실험예 3> 인간 모낭의 모유두 세포(Human hair dermal follicle papilloma cells, HHDFP) 성장 분석
본 발명의 일 실험예에 사용된 인간 모낭의 모유두 세포(Human hair dermal follicle papilloma cells, HHDFP)는 abm(Richmond, BC, Canada)으로부터 구입하였다. 세포는 질소 탱크에 보관 전에 세포 유전학적으로 시험하였고, 입증하였다. HHDFP 세포는 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin) 100 units/ml 및 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지로 37℃, 5% CO2 배양기에서 유지되었다.
모발(hair) 세포에서 꾸지나무 추출물의 모발 성장에 미치는 영향을 보기 위해 세포의 ATP 측정 키트(CellTiterGlo®luminescent cell viability kit)와 실시간 세포 성장 측정 장치(xCELLigence Real Time Cell Analysis Instruments)를 사용하여 꾸지나무 추출물이 HHDFP 세포 성장에 미치는 영향을 분석하였다.
3-1. 세포의 ATP 측정 키트(CellTiterGlo®luminescent cell viability kit)를 이용한 세포 성장 확인
모유두(HDP) 세포는 96-웰 플레이트(5×103 cell/well)에 접종하여 24시간 DMEM + 10% FBS에 배양하였다. 24시간 후 세포들에 농도별 꾸지나무 추출물(3.12 ~ 50 mg/ml)을 처리하여 72시간 더 배양하였고, 음성 대조군으로는 1% 미만의 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 사용하였다.
세포 성장 및 생존력은 celltiter-Glo luminescent cell viability kit를 이용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 세포 내 루시퍼라제(luciferase) 반응을 통한 ATP 측정을 기반으로 하였으며, 상기 산물은 생존 세포의 수와 비례한다. 세포 증식 억제율은 [(실험군 상대 발광정도/대조군 상대 발광정도)×100]으로 계산 되며, 세포 생존능을 간접적으로 반영하는 발광 정도는 루비 루미노미터(Lubi luminometer, bethold TEC GmbH & co, TN,USA)로 측정하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복하였다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 꾸지나무 추출물이 인간 모낭의 모유두(HHDFP) 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4를 참조하면, 꾸지나무 추출물은 대조군(control)과 비교하였을 때, 유의성있게 농도 의존적으로 세포의 성장을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 양성 대조군인 미녹시딜(minoxidil)과 토파시티닙(Tofacitinib)과 비교하였을 때, 동등의 효과를 나타내었다. 즉, 꾸지나무 추출물은 모유두 세포의 성장을 유도함을 확인할 수 있다.
3-2. 실시간 세포성장 측정장치(xCELLigence Real Time Cell Analysis Instruments)를 이용한 세포 성장 확인
xCELLigence system은 전기적 세포 센서 어레이(array) 기술을 이용하여, 세포 증식, 세포 독성, 밀착성, 생존, 침윤 및 이동과 같은 세포 과정을 라벨 없이, 실시간 모니터링 할 수 있도록 한다. 세포의 상황이 특수한 조직 배양 플레이트(E-Plates, ACEA Biosciences)의 하부에 집적된 마이크로 전극을 지나는 전기 임피던스를 측정함으로써 라벨과의 결합 없이도 실시간으로 모니터링 된다. 셀 인덱스(CI) 값으로 표시되는 전극의 임피던스는 세포 수, 생존율 및 형태를 포함하는 세포의 생체 상태에 대한 정량적인 정보를 제공하는데 사용된다. 이러한 세포 형태, 세포 부착 또는 세포 생존 같은 세포 상태의 변경은 웰(well)에 존재하는 세포 수의 정량적 측정에 의한 CI값의 변화에 따른다.
이에 따라, 3% FBS 배지에 HDP 세포를 E-Plates L8에서 20,000 cells/well로 배양하였다. 성장 곡선은 자동으로 실시간으로 xCELLigence 시스템에 기록되었고, 24시간 후 꾸지나무 추출물을 농도별로 첨가하여 96시간 살아있는 세포를 모니터링 하였다.
도 5 및 도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 꾸지나무 추출물이 인간 모낭의 모유두(HHDFP) 세포 성장에 미치는 영향을 실시간 모니터링 한 결과이다.
도 5 및 도 6을 참조하면, 꾸지나무 추출물을 농도별로 처리했을 때 대조군과 비교하여 HHDFP 세포의 성장이 유의성 있게 농도 의존적으로 증가됨을 확인할 수 있다.
<실험예 4> 루시퍼라제(luciferase) 활성 평가
4-1. 윈트 신호전달(Wnt signaling)에 전사인자인 탑-플레쉬(TOP-Flash)의 루시퍼라제(luciferase) 활성 평가
윈트/베타-카테닌(Wnt/β-catenin) 신호전달은 모낭 형성과 발달 및 성장에 중요하다. T세포 인자/림포이드 강화인자(T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF) 유전자 결합부위와 루시퍼라제 리포터(luciferase reporter) 유전자를 퓨전(fusion)시킨 탑-플레쉬(TOP-flash) HDP 세포는 24-웰 플레이트에 1×105 세포수로 접종한 후, 24시간 후에 TCF-루시퍼라제 벡터(TCF-luciferase vector)를 4시간 동안 형질주입(transfection)시켰다. 그 후, 세포는 WNT3a 단독 또는 다양한 농도의 꾸지나무 추출물 시료(sample)로 24시간 동안 처리되었다.
모발 발생 과정에는 여러 가지 물질이 관여하는데, 모낭 발생의 첫 번째 신호는 진피 쪽에서 온다고 알려져 있으며, β-카테닌(β-catenin)이 가장 중요한 물질로 추정되고 있다. 또한, LEF/TCF, WNT 신호도 첫 번째 신호에 관여하는 것으로 알려져 있다.
꾸지나무 추출물이 WNT 신호전달 활성을 통해 β-카테닌을 증가시켜 전사인자인 TCF(T-cell factor)의 활성을 유도하는지 평가하기 위하여, TCF/LEF-루시퍼라제 유전자가 안정적으로 발현되게 만들어진 3T3-WNT 세포를 이용하였다. 3T3-WNT 세포주는 퓨로마이신(puromycin; 3μg/ml), 스트렙토마이신(100 units/ml) 및 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 배양기에서 유지되었다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른 TCF/LEF-루시퍼라제 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7을 참조하면, 꾸지나무 추출물은 농도 의존적으로 TCF/LEF-루시퍼라제 활성에 작용됨을 알 수 있다. 특히, 상기 시료 10μM에서는 TCF/LEF-루시퍼라제 활성이 대조군에 비해 약 2배 정도 증가하는 것으로 나타났다. 본 결과를 통해, 꾸지나무 추출물이 인산화에 의한 β-카테닌의 분해를 억제하고, β-카테닌을 활성화하여 모유두 세포 성장을 촉진하는데 관여함을 알 수 있다.
4-2. JAK3 신호전달(JAK-STAT signaling)에 전사인자인 STAT6의 루시퍼라제(luciferase) 활성 평가
JAK3-STAT6(Janus kinase 3-signal transducer and activator of transcription 6) 신호의 억제는 모낭의 발달 및 모발 성장을 촉진한다. STAT3와 STAT6의 작용은 반대 작용으로 STAT3의 유지 또는 증가와 STAT6의 억제로 관찰된다.
HDP 세포는 24-웰 플레이트에 1×105 세포수로 접종한 후, 24시간 후에 STAT3 또는 STAT6-루시퍼라제 벡터(luciferase vector)를 4시간 동안 형질주입(transfection)시켰다. 그 후, 세포는 사이토카인(cytokine)인 IL-6 및 IL-4 (10ug/ml) 단독 또는 다양한 농도의 꾸지나무 추출물 시료에 24시간 동안 노출시켰다.
도 8은 본 발명의 일 실험예에 따른 STAT6-루시퍼라제 활성 측정 결과를 나타내고, 도 9는 STAT3-루시퍼라제 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8 및 도 9를 참조하면, 사이토카인인 IL-4에 의해 JAK3-STAT6 신호전달이 조절되는 것으로 나타났다. STATs의 신호전달에 대한 선택성을 주기 위해 생존력에 필요한 STAT3 신호와 모발 성장을 저해하는 STAT6 신호를 비교한 결과, 생존에 필요한 STAT3 신호에는 영향 없이 STAT6 신호 체계만을 억제함을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (8)

  1. 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하며,
    상기 꾸지나무 추출물은 상기 꾸지나무 원료 1 중량부에 대하여 20 중량부의 물을 첨가하여 90 내지 100℃에서 5 내지 7 시간 가열하여 추출한 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 꾸지나무 추출물은,
    모유두 세포의 성장을 유도 또는 촉진시키는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 꾸지나무 추출물은,
    모발 표적 단백질인 WNT 또는 JAK3의 신호 전달을 조절하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 꾸지나무 추출물은,
    전체 화장료 100 중량부에 대하여, 0.1 내지 10 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은,
    헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 또는 젤의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
  7. 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하며,
    상기 꾸지나무 추출물은 상기 꾸지나무 원료 1 중량부에 대하여 20 중량부의 물을 첨가하여 90 내지 100℃에서 5 내지 7 시간 가열하여 추출한 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 약학 조성물.
  8. 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하며,
    상기 꾸지나무 추출물은 상기 꾸지나무 원료 1 중량부에 대하여 20 중량부의 물을 첨가하여 90 내지 100℃에서 5 내지 7 시간 가열하여 추출한 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 식품 조성물.
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