KR102202941B1

KR102202941B1 - 싸리나무로부터 분리한 신규 화합물, 이의 분리방법 및 이를 포함하는 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102202941B1
Application number: KR1020190093506A
Authority: KR
Inventors: 조남기; 유희민
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 한국표준과학연구원
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-01-14

Abstract

본 발명은 싸리나무로부터 분리한 신규 화합물, 이의 분리방법 및 이를 포함하는 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 화합물은 백혈병 세포에서 세포사멸을 유도하는 활성을 나타내므로 혈액암의 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있다.

Description

싸리나무로부터 분리한 신규 화합물, 이의 분리방법 및 이를 포함하는 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물{Novel compounds isolated from Lespedeza bicolor, methods for isolation thereof and pharmaceutical composition for preventing or treating blood cancer comprising the same}

본 발명은 싸리나무로부터 분리한 신규 화합물, 이의 분리방법 및 이를 포함하는 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 싸리나무 메탄올 추출물로부터 크로마토그래피를 이용하여 분리한 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 대상인 싸리나무(Lespedeza bicolor)는 콩과에 속하는 낙엽 관목이며 높이는 1 내지 1.5 m이고 가지를 많이 친다. 일본, 북미 등 동아시아에 분포하며 기원적 형태학적 특성으로 볼 때, 19개의 표현형으로 분류된다. 싸리나무의 효능을 살펴보면 싸리나무는 줄기 또는 잎을 약용으로 사용하는데 생약명을 호지자라 하며 맛은 달고 약성은 평범하며 백일해, 해수, 비 출혈, 임병을 치료하고 예방법으로 쓴다.

본 발명자들은 싸리나무로부터 저캣(Jurkat) T 세포 림프종의 성장을 억제하는 작용을 갖는 6종의 신규 화합물을 분리하여 구조를 확인하였다. 이들 화합물은 프테로카르판(pterocarpans) 계열의 화합물, 코메스탄(coumestans) 계열의 화합물 및 아릴벤조퓨란(arylbenzofurans) 계열의 화합물이었다. 이러한 화합물의 구조는 1D/2D 핵자기공명(nuclear magnetic resonance; NMR), 자외선(ultraviolet UV) 분광법, 질량분석법(Mass spectrometry, MS)을 통해 확인되었다.

본 발명자들은 국내 각종 약용식물을 채집하여 저캣(Jurkat) T 세포 림프종의 성장을 억제하는 활성화 작용을 조사하였으며 최종적으로 싸리나무를 후보식물로 선정하였다. 이후, 싸리나무로부터 6종의 신규 화합물을 분리하였다. 이들 화합물은 공통적으로 저캣 T 세포 림프종의 세포 사멸 활성을 보였으므로 본 발명의 화합물은 혈액암의 억제 및 치료용도로서 사용 가능함을 밝힐 수 있었다.

이에, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서,

R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 H, 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기이고,

R₃은 O 또는 OH이고,

R₄는 CH₂, CO 또는 CHO이고,

단, 상기 R₃이 O일 경우 R₄의 임의의 C와 연결되어 고리 구조를 형성할 수 있고,

R₅는 H, OCH₃ 또는 OH이고,

R₆은 O 또는 OH이고,

R₇은 H, C₁ 내지 C₁₀의 에폭시프레닐기 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기이며,

단, 상기 R₆이 O일 경우 R₇의 임의의 C와 연결되어 고리구조를 형성할 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 싸리나무 추출물을 얻는 추출 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리방법을 제공하는 것이다:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서,

R₃은 O 또는 OH이고,

R₄는 CH₂, CO 또는 CHO이고,

R₅는 H, OCH₃ 또는 OH이고,

R₆은 O 또는 OH이고,

본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서,

R₃은 O 또는 OH이고,

R₄는 CH₂, CO 또는 CHO이고,

R₅는 H, OCH₃ 또는 OH이고,

R₆은 O 또는 OH이고,

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 혈액암 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

본 발명은 싸리나무로부터 분리한 신규 화합물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법으로부터 신규 화합물을 분리하여 수득할 수 있으며, 상기 화합물은 림프종 세포의 사멸을 증가시키는 결과를 나타냈다.

본 발명자들은 싸리나무 메탄올 추출물로부터 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획을 수행함으로써, 6종의 신규 화합물을 수득하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서,

R₃은 O 또는 OH이고,

R₄는 CH₂, CO 또는 CHO이고,

R₅는 H, OCH₃ 또는 OH이고,

R₆은 O 또는 OH이고,

본 명세서상의 용어 "알킬기"는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 알킬기는 프레닐기 또는 제라닐기일 수 있다.

상기 R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 H, 또는 C₅ 내지 C₁₀의 알킬기일 수 있고, 예를 들어, 상기 C₅ 내지 C₁₀의 알킬기는

로 표시되는 프레닐기 또는

로 표시되는 제라닐기인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 R₃이 O일 경우 R₄의 임의의 C와 연결되어 형성하는 고리 구조는 육각형인 것일 수 있다.

상기 R₆이 O일 경우 R₇의 임의의 C와 연결되어 형성하는 고리 구조는 육각형인 것일 수 있고, 예를 들어, 2,2-디메틸피란 모이어티일 수 있다.

상기 R₇은 수소, C₅ 내지 C₁₀의 에폭시프레닐기 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기일 수 있고, 예를 들어, 상기 C₅ 내지 C₁₀의 에폭시프레닐기는

일 수 있고, 상기 C₅ 내지 C₁₀의 알킬기는

로 표시되는 프레닐기일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 7로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다:

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

.

본 발명의 다른 양태는 싸리나무 추출물을 얻는 추출 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리방법이다:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서,

R₃은 O 또는 OH이고,

R₄는 CH₂, CO 또는 CHO이고,

R₅는 H, OCH₃ 또는 OH이고,

R₆은 O 또는 OH이고,

상기 R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 수소, 또는 C₅ 내지 C₁₀의 알킬기일 수 있고, 예를 들어, 상기 C₅ 내지 C₁₀의 알킬기는

로 표시되는 프레닐기 또는

상기 R₇은 H, C₅ 내지 C₁₀의 에폭시프레닐기 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기일 수 있고, 예를 들어, 상기 C₅ 내지 C₁₀의 에폭시프레닐기는

일 수 있고, 상기 C₅ 내지 C₁₀의 알킬기는

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

상기 추출 단계는 메탄올을 용매로 하여 수행되는 것일 수 있다.

상기 분리방법은 싸리나무 추출물에 크로마토그래피를 이용하여 분획물을 분획하는 분획 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 분획 단계는 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있다:

싸리나무 추출물의 에틸아세테이트 가용부에 CH₂Cl₂ 및 메탄올을 농도구배적으로 이용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 수행하여 제1 분획물을 분획하는 제1 분획 단계;

상기 제1 분획물에 헥산 및 에틸아세테이트를 농도구배적으로 이용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 제2 분획물을 분획하는 제2 분획 단계;

상기 제2 분획물에 메탄올을 농도구배적으로 이용한 액체 크로마토그래피를 이용하여 제3 분획물을 분획하는 제3 분획 단계;

상기 제3 분획물에 아세토니트릴 및 물을 농도구배적으로 이용한 액체 크로마토그래피를 이용하여 제4 분획물을 분획하는 제4 분획 단계; 및

상기 제4 분획물에 아세토니트릴 및 물을 농도구배적으로 이용한 액체 크로마토그래피를 이용하여 제5 분획물을 분획하는 제5 분획 단계.

본 발명의 또 다른 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물이다:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서,

R₃은 O 또는 OH이고,

R₄는 CH₂, CO 또는 CHO이고,

R₅는 H, OCH₃ 또는 OH이고,

R₆은 O 또는 OH이고,

로 표시되는 프레닐기 또는

일 수 있고, 상기 C₅ 내지 C₁₀의 알킬기는

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

.

상기 혈액암은 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수생성이상증후군, 만성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 거대모구성 백혈병, 다발골수종 및 적백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

도 1a는 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 내 화합물 1의 ¹H NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 1b는 DMSO 내 화합물 1의 ¹³C NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 1c는 DMSO 내 화합물 1의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 결과이다.
도 1d는 DMSO 내 화합물 1의 HSQC 스펙트럼 결과이다.
도 1e는 DMSO 내 화합물 1의 HMBC 스펙트럼 결과이다.
도 1f는 DMSO 내 화합물 1의 NOESY 스펙트럼 결과이다.
도 1g는 DMSO 내 화합물 1의 ROESY 스펙트럼 결과이다.
도 2a는 DMSO 내 화합물 2의 ¹H NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 2b는 DMSO 내 화합물 2의 ¹³C NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 2c는 DMSO 내 화합물 2의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 결과이다.
도 2d는 DMSO 내 화합물 2의 HSQC 스펙트럼 결과이다.
도 2e는 DMSO 내 화합물 2의 HMBC 스펙트럼 결과이다.
도 3a는 DMSO 내 화합물 4의 ¹H NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 3b는 DMSO 내 화합물 4의 ¹³C NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 3c는 DMSO 내 화합물 4의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 결과이다.
도 3d는 DMSO 내 화합물 4의 HSQC 스펙트럼 결과이다.
도 3e는 DMSO 내 화합물 4의 HMBC 스펙트럼 결과이다.
도 4a는 DMSO 내 화합물 5의 ¹H NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 4b는 DMSO 내 화합물 5의 ¹³C NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 4c는 DMSO 내 화합물 5의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 결과이다.
도 4d는 DMSO 내 화합물 5의 HSQC 스펙트럼 결과이다.
도 4e는 DMSO 내 화합물 5의 HMBC 스펙트럼 결과이다.
도 5a는 DMSO 내 화합물 6의 ¹H NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 5b는 DMSO 내 화합물 6의 ¹³C NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 5c는 DMSO 내 화합물 6의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 결과이다.
도 5d는 DMSO 내 화합물 6의 HSQC 스펙트럼 결과이다.
도 5e는 DMSO 내 화합물 6의 HMBC 스펙트럼 결과이다.
도 6a는 DMSO 내 화합물 7의 ¹H NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 6b는 DMSO 내 화합물 7의 ¹³C NMR(400 MHz) 스펙트럼 결과이다.
도 6c는 DMSO 내 화합물 7의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼 결과이다.
도 6d는 DMSO 내 화합물 7의 HSQC 스펙트럼 결과이다.
도 6e는 DMSO 내 화합물 7의 HMBC 스펙트럼 결과이다.
도 7a는 DMSO 내 화합물 1의 HRESIMS 스펙트럼 결과이다.
도 7b는 DMSO 내 화합물 2의 HRESIMS 스펙트럼 결과이다.
도 7c는 DMSO 내 화합물 4의 HRESIMS 스펙트럼 결과이다.
도 7d는 DMSO 내 화합물 5의 HRESIMS 스펙트럼 결과이다.
도 7e는 DMSO 내 화합물 6의 HRESIMS 스펙트럼 결과이다.
도 7f는 DMSO 내 화합물 7의 HRESIMS 스펙트럼 결과이다.
도 8a는 DMSO 내 화합물 1의 CD 스펙트럼 결과이다.
도 8b는 DMSO 내 화합물 2의 CD 스펙트럼 결과이다.
도 9는 싸리나무 추출물로부터 분리된 화합물 1, 5 및 6에 대한 COSY, HMBC 및 ROSEY 상관 관계를 나타낸 그림이다.
도 10은 림프종 세포(Jurkat cells)에 의한 항증식 효과를 MTS 분석을 통해 세포생존율로 나타낸 그래프이다.
도 11은 24시간 및 48시간 동안 화합물을 이용한 처리 후 형태학적 변화를 보여주는 위상 대비 현미경 이미지이다.
도 12a는 화합물에 의해 처리된 림프종 세포의 세포사멸을 유세포분석(flow cytometry)을 통해 측정한 결과이다.
도 12b는 화합물에 의해 처리된 림프종 세포에서의 조기 세포사멸 및 후기 세포사멸을 구분하여 정량화한 그래프이다.
도 12c는 화합물 1 및 4를 처리한 림프종 세포를 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.
도 13a는 화합물이 처리된 림프종 세포에서 미토콘드리아 멤브레인 전위 수치를 검출한 결과이다.
도 13b는 화합물이 처리된 림프종 세포에서 미토콘드리아 멤브레인 전위 수치를 검출하여 정량화한 그래프이다.
도 14a는 화합물이 처리된 림프종 세포에서 세포 주기를 분석한 결과이다.
도 14b는 화합물이 처리된 림프종 세포에서 G1 또는 S, G2/M 단계의 세포 비율을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.

실시예 1: 싸리나무 추출물의 추출 및 분리

2018년 6월 대한민국 전라남도 보성의 메디칼 플랜트 가든에서 싸리나무(Lespedeza bicolor) 뿌리를 채취하여 확인하였다. 대한민국 전남대학교 약과대학에 바우처 표본(CNU-0602)이 예치되었다.

건조된 싸리나무 뿌리(1.7 kg)는 실온에서 초음파 100% MeOH를 사용하여 세 번 추출하였다. 용제는 진공 상태에서 제거되어 메탄올 추출물(203.2 g)을 생성하였다. 상기 메탄올 추출물은 물(H₂O)에서 부유물질로 사용되어 n-헥산과 에틸 아세테이트(EtOAc)로 분리되었다. 증발을 통해 n-헥산(6.0 g)과 EtOAc(51.1 g)의 조제 추출물을 생성하였다. EtOAc 분획물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography; CC)(Kieselgel 60 silica gel (less than 0.063 mm; Merck, Germany) and octadecyl (C18) silica gel (Yamazen, Japan))를 적용하고 CH₂Cl₂:MeOH = 100:1 ~ 1:100 v/v로 용해하여 4개의 분획물을 산출하였다(E1-E4).

분획물 E1(16.4 g)은 실리카 겔 CC(헥산:에틸 아세테이트 = 10:1 ~ 1:1 v/v ~ 100% MeOH)를 사용하여 평가하여 5개의 소분획물(H1-H6)을 산출하였다.

소분획물 H2(2.3 g)는 RP C18-MPLC(10% 메탄올 ~ 100% 메탄올)를 적용하여 5개의 소분획물(M1-M5)을 산출하였다.

화합물 1(25.9 mg) 및 3(8.6 mg)은 산술적 HPLC(아세토니트릴:H₂O = 7:3)에 의해 소분획물 M2로부터 분리되었다. 소분획물 M1을 예비 HPLC(아세토니트릴:H₂O = 6:4)를 이용하여 추가로 정제하여 화합물 2(3.7 mg)를 산출하였다.

소분획물 M3는 예비 HPLC(아세토니트릴:H₂O = 7:3) 3개의 소분획물을 산출하였다(M10-M12). H₂O에서 70%인 아세토니트릴을 사용하여 HPLC에 의해 추가로 소분획물 M11을 정제하여 화합물 5(13.1 mg)를 생성하였다. 화합물 7(2.7 mg)은 80% 아세토니트릴을 사용하여 HPLC에 의한 소분획물 M12에서 얻었다.

소분획물 H3(2.5 g)은 RP C18-MPLC(10% 메탄올 ~ 100% 메탄올)를 적용하여 4개의 소분획물(M6-M9)을 산출하였다. 소분획물 M6의 추가 정화는 예비 HPLC(아세토니트릴:H₂O = 6:4)에 의해 수행되어 5개의 소분획물(M13-17)를 산출하였다. 화합물 6(1.4 mg)은 55% 아세토니트릴을 사용하여 HPLC에 의해 소분획물 M13에서 분리되었고, 화합물 4(5.0 mg)는 소분획물 M7에서 예비 HPLC(아세토니트릴:H₂O = 8:2)에 의해 분리되었다.

분리된 화합물 1 내지 8을 확인하기 위하여 ¹H NMR(AVANCE-400 및 600 NMR 스펙트럼계, Bruker, Billerica, MA, USA), ¹³C NMR, ¹H-¹H COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY 스펙트럼을 분석하여 도 1a 내지 9로 나타내었다.

광회전은 PerkinElmer 모델 343 plus polarimeter(Jasco Corp., Japan)에서 실행되었다. UV 스펙트럼은 JASCO V-530 UV/VIS 스펙트럼계(Jasco Corp., Japan)를 사용하여 기록되었다. ECD 데이터는 Chirascan CD 스펙트럼 분석기(Applied Photophysics, Leatherhead, UK)를 사용하여 얻었으며 IR 스펙트럼은 JASCOFTIR 300-E 스펙트럼계에서 얻었다. HR-TOF-MS 스펙트럼은 JMS-T200GC AccuTOF GCx-GC-TOF 질량분석기(Jeol Ltd, Jeol Ltd.)로 측정하였다. 얇은 층 크로마토그래피(Thin layer chromatography; TLC) 스팟은 Kieselgel 60 F254 코팅된 정상상 실리카겔 TLC 플레이트와 TLC 실리카겔 60 RP-18 F254(Merck, Germany)에서 시각화되었다. 모든 용제는 대정화학금속(한국 시흥시)에서 조달하였다.

바이콜로신 D(Bicolosin D) (화합물 1): 갈색 고체; [α]_D ²⁰ -125 (c 1.6, MeOH); ECD △ε +1.05 at 291 nm (MeOH); UV (MeOH) λ_max(log ε) 297 (3.21), 212 (4.07) nm; IR (MeOH) v _max 3397 (OH), 2915, 1611, 1497, 1462, 1372, 1342, 1258, 1209, 1128, 1100, 1016, 858, 772 cm^-1; ¹H (400MHz, DMSO-d ₆ ) and ¹³C NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) data, see Table 1; HR-TOF-MS m/z 452.2201 [M⁺], calcd for C₂₇H₃₂O₆, 452.2193).

바이콜로신 E(Bicolosin E) (화합물 2): 백색 고체; [α]_D ²⁰ -152 (c 0.3, MeOH); ECD △ε +1.23 at 291 nm (MeOH); UV (MeOH) λ_max(log ε) 285 (3.52), 215 (4.17) nm; IR (MeOH) v _max 3379 (OH), 2921, 1593, 1452, 1362, 1265, 1132, 1074, 800 cm^-1; ¹H (400MHz, DMSO-d ₆ ) and ¹³C NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) data, see Table 1; HR-TOF-MS m/z 438.2041 [M⁺], calcd for C₂₆H₃₀O₆, 438.2036).

바이콜로스탄 A(Bicolostan A) (화합물 4): 노란색 무정형 분말; UV (MeOH) λ_max(log ε) 377 (4.23), 358 (4.55), 254 (4.46), 233 (4.48) nm; IR (MeOH) v _max 2826, 1600, 1357, 1165, 1078, 773 cm^-1; ¹H (600MHz, DMSO-d ₆ ) and ¹³C NMR (600MHz, DMSO-d ₆ ) data, see Table 1; HR-TOF-MS m/z 450.1675 [M⁺], calcd for C₂₆H₂₆O₇, 450.1673).

바이콜로스탄 B(Bicolostan B) (화합물 5): 노란색 무정형 분말; UV (MeOH) λ_max(log ε) 373 (4.11), 358 (4.16), 259 (4.24), 231 (4.29) nm; IR (MeOH) v _max 2829, 1719, 1596, 1441, 1361, 1163, 1116, 1075, 1005, 843, 772, 720 cm^-1; ¹H (400MHz, DMSO-d ₆ ) and ¹³C NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) data, see Table 1; HR-TOF-MS m/z 448.1517 [M⁺], calcd for C₂₆H₂₄O₇, 448.1516).

바이콜로퓨란 A(Bicolofuran A) (화합물 6): 노란색 고체; UV (MeOH) λ_max(log ε) 349 (3.79), 297 (3.81), 228 (4.20) nm; IR (MeOH) v _max 2824, 1596, 1361, 1067, 777 cm^-1; ¹H (600MHz, DMSO-d ₆ ) and ¹³C NMR (600MHz, DMSO-d ₆ ) data, see Table 2; HR-TOF-MS m/z 450.1669 [M⁺], calcd for C₂₆H₂₆O₇, 450.1673).

바이콜로퓨란 B(Bicolofuran B) (화합물 7): 노란색 고체; UV (MeOH) λ_max(log ε) 354 (3.95), 297 (3.94), 230 (4.37) nm; IR (MeOH) v _max 2879, 1598, 1440, 1360, 1069 cm^-1; ¹H (400MHz, DMSO-d ₆ ) and ¹³C NMR (400MHz, DMSO-d ₆ ) data, see Table 2; HR-TOF-MS m/z 518.2299 [M⁺], calcd for C₃₁H₃₄O₇, 518.2299).

실시예 2: 화합물의 분리

2-1. 화합물 1의 분리

하기 화학식 2'와 같은 화합물 1은 갈색 고체로 분리되었으며, 분자식은 HR-TOF-MS에 의해 C₂₇H₃₂O₆으로 결정되었다(m/z 452.2201 [M⁺], 452.2193으로 계산). 프테로카르판(pterocarpans) 골격은 1D 및 2D NMR을 사용하여 얻은 데이터에서 추론되었다.

<화학식 2'>

¹H NMR 스펙트럼에서 δ_H 4.20(1H, dd, J= 4.4, 6.4 Hz), 3.50(1H, t, J= 6.4 Hz), 3.37(1H, m) 및 5.47(1H, d, J= 7.2 Hz)의 신호는, 각각 H-6α, H-6β, H-6a, H-11a에 해당하는 것으로 알려진 프테로카르판(표 1)의 ¹H NMR 스펙트럼에 존재하는 동일한 양성자의 신호와 유사했다.

Position	1		2		3		4		5
Position	δ_C	δ_H (J in Hz)	δ_C	δ_H (J in Hz)	δ_C	δ_H (J in Hz)	δ_C	δ_H (J in Hz)	δ_C	δ_H (J in Hz)
1	157.8		159.9		160		153.7		154.2
2	92.1	6.16, s	115.5		115.4		119.6		120.2
3	156.3		158		157.9		159.1		160.1
4	107.3		99.5	6.19, s	99.4	6.19, s	99.2	6.76, s	99.7	6.75, s
4a	154.7		155		154.9		152.6		153.3
6	66.2	4.20, dd (4.4, 6.4) 3.50, t (6.4)	66.4	4.16, dd (4.4, 6.4) 3.50, t (6.4)	66.2	4.13, dd (4.4, 6.4) 3.45, t (6.4)	157.7		158.7
6a	38.7	3.37, m	39	3.45, m	39	3.35, m	102.6		115.3
6b	116.4		117.9		117.7		113.1		102.7
7	110.5	6.97, s	123.1	7.02, d (8.0)	122.3	6.92, d (8.0)	101.8	7.16, s	105.2	7.18, s
8	141.7		108.6	6.25, d (8.0)	107.5	6.32, d (8.0)	144		144.9
9	147.4		154		156.3		142.9		144.7
10	98.1	6.27, s	104.3		110.8		112.4		107.4
10a	153.5		158.2		158.7		148.1		139.8
11a	74.7	5.47, d (7.2)	75.9	5.58, d (6.8)	75.4	5.50, d (6.4)	157.5		158.1
11b	100.5		106.2		106.2		100.1		100.2
12									115.4	6.84, d (10.0)
13									133	5.99, d (9.6)
14									77.1
15									27.7	1.45, s
16									27.7	1.45, s
1'	21.4	3.12, d (4.4)	22.8	3.20, d (4.4)	23	3.22, d (6.8)	22.1	3.34, d (4.4)	22.5	3.32, d (6.8)
2'	123.3	5.08, t (6.0)	124.1	5.16, t (6.8)	124.2	5.16, t (4.6)	122.5	5.18, t (6.8)	123	5.18, t (4.6)
3'	133.1		130.3		130.3		130.9		131.3
4'	39.2	1.90, d (7.6) 1.95, d (8.0)	26	1.64, s	25.9	1.60, s	25.5	1.64, s	26	1.65, s
5'	26.2	1.97, m 1.87, m	18.2	1.72, s	18.2	1.72, s	17.8	1.76, s	18.2	1.76, s
6'	124.1	5.02, t (5.6)
7'	130.6
8'	17.5	1.52, s
9'	25.5	1.58, s
10'	15.8	1.68, s
1''			26.3	2.79, dd (5.6, 11.2) 2.34, dd (5.2, 7.6)	22.8	3.14, d (4.6)	22.9	3.60, d (4.6)
2''			67.9	3.61, t (4.4)	123.2	5.20, t (6.4)	121.7	5.37, t (6.0)
3''			77.4		130.6		131.5
4''			26	1.26, s	25.9	1.60, s	25.5	1.64, s
5''			20.8	1.12, s	18	1.64, s	17.7	1.81, s
1-OCH₃	55.2	3.74, s	62.9	3.88, s	62.8	3.88, s	62.3	3.91, s	62.7	3.92, s
8-OCH₃	56.9	3.71, s

또한 ¹H NMR 스펙트럼에는 3개의 방향 양성자(δ_H 6.16, 6.97 및 6.27)와 2개의 메톡시 그룹(.H 3.74 및 3.71)에 대한 신호가 포함되어 있었다.

COSY 스펙트럼에서 H-1′/H-2', H-4′/H5′' 및 H-5′/H-6' 사이의 연결 상수는 제라닐 치환기(geranyl substituent)가 존재함을 암시한다. 화합물 1의 방향 고리에 대한 치환기의 위치는 주로 ¹³C NMR과 HMBC 상관 관계를 사용하여 얻은 데이터에 기초하였다.

HMBC 크로스 피크는 H-1'(δ_H 3.12)에서 C-3(δ_C 156.3), C-4(δ_C 107.3), C-4a(δ_C 154.7)로, H-2'(δ_H 5.08)에서 C-4(δ_C 107.3)로 각각 C-4 및 C-3에 부착된 제라닐 및 하이드록시 그룹의 위치를 정의하였다.

δH 3.74(3H, s, 1-OCH₃)와 3.71(3H, s, 8-OCH₃)의 두 메톡시 그룹은 각각 C-1(δ_C 157.8)과 C-8(δ_C 141.7)과의 강한 상관관계에 의해 검출되었다.

도 9에서 확인할 수 있듯이, 1-OCH ₃/H-2와 8-OCH ₃/H-7 사이의 NOE 상호작용을 보여주는 NOESY와 ROESY를 사용하여 메톡시 그룹의 존재에 대한 추가 근거를 얻었다.

H-6a와 H-11a 사이의 연결 상수(J= 7.2 Hz)는 이러한 양성자의 축-등축 방향을 나타내며, 본질적으로 프테로카르판이 6a, 11a-cis 구성에서만 발견된다는 사실을 뒷받침했다.

화합물 1의 절대적인 구성은 291 nm에서 양의 코통 효과(positive Cotton effect)(△ε +1.05)와 음의 광회전(negative optical rotation)([α]D²⁰ -125, c 1.6, MeOH)에 근거하여 R로 결정되었다.

따라서 C-8의 메톡시 그룹 치환기에서만 바이콜로신(bicolosin) C와 차이가 있었기 때문에 화합물 1이 식별되고 바이콜로신 D로 결정되었다.

2-2. 화합물 2의 분리

화합물 2는 흰색 고체로 입수되었다. 분자식은 HR-TOF-MS에 의해 C₂₆H₃₀O₆으로 결정되었다(m/z 438.2041 [M⁺], 438.2036으로 계산).

화합물 2의 ¹H NMR 스펙트럼에는 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 표 1과 같은 화합물 1의 스펙트럼과 비교하여 2개의 OH 그룹(δ_H 9.55 및 8.91), 1개의 프레닐 그룹(δH 5.16, 3.20, 1.72 및 1.64), 1개의 에폭시프레닐 모이어티(δ_H 3.61, 2.79, 2.34, 1.26 및 1.12), 1H 비교한 2개의 단일항(singlet) 방향성 양성자(7.02 및 6.25), 및 2개의 직교 커플링 방향 양성자(7.02 및 6.25)가 할당되었다.

프테로카르판 골격에 측면 사슬을 결합하는 것은 ¹³C NMR 시프트(shift)를 사용하여 결정되었으며, 이는 프레닐 모이어티의 존재와 일치한다. 프레닐 그룹은 HMBC가 H-1'(δ_H 3.20)에서 C-1(δ_C 159.9), C-2(δ_C 115.5), 및 C-3(δ_C 158.0)까지의 상관관계에 의해 C-2 위치에 할당되었다.

δ_H 1.12(3H, s, H-5''), 1.26(3H, s, H-4′′), 3.61(1H, t, J= 4.4Hz, H-2′′), 2.79(1H, dd, J= 5.6, 11.2 Hz, H-1') 및 2.34(1H, dd, J= 5.2, H-1'')의 신호와 함께, C''(δ_C 67.9)와 C-3''(δ_C 77.4)에서 두 개의 탄소 신호와 함께, 화합물 2가 2'', 3''-에폭시프레닐 모이어티를 포함하고 있다는 것을 분명히 증명했다. HMBC의 H-1''(δ_H 2.79, 2.34)에서 C-9(δ_C 154.0), C-10(δ_C 104.3), 및 C-10a(δ_C 158.2)까지의 상관관계는 2'', 3''-에폭시프레닐 모이어티가 C-10과 연결되었음을 나타낸다.

291 nm에서 양의 코통 효과(Cotton effect)(△ε+1.23)와 음의 광회전([α]_D ²⁰ -152, c 0.3, MeOH])은 6aR, 11aR, 2''R 구성과 일치했다. 따라서 화합물 2는 바이콜로신 E로 결정되었다.

2-3. 화합물 3의 분리

화합물 3은 하기 화학식 8로 표시되는, 기존에 공지된 1-메톡시에릴스라바이신 Ⅱ로 하였다.

<화학식 8>

2-4. 화합물 4의 분리

화합물 4는 황색의 무정형 분말로 얻었으며, 그 분자식은 HR-TOF-MS 스펙트럼의 m/z 450.1675 (450.1673으로 계산)에서 [M⁺] 이온을 기초로 C₂₆H₂₆O₇로 결정되었다.

화합물 4에 대한 ¹H 및 ¹³C NMR 데이터는 쿠메스탄(coumestan) 유도체(표 1)을 나타내는 특성 신호를 제외하고 1-메톡시에리스라바이신 II(1-methoxyerythrabyssin II; 화합물 3)의 데이터와 매우 유사하다.

¹H NMR 스펙트럼에는 두 개의 5-치환기(pentasubstituted) 방향족 시스템에 해당하는 δ_H 6.76(1H, s, H-4) 및 7.16(1H, s, H-7)에서 두 개의 방향족 양성자가 표시되었다.

δ_H 5.18(1H, t, J= 6.8 Hz, H-2), 3.34(2H, d, J= 4.4 Hz, H-1), 1.76(3H, s, H-5'), 및 1.64(3H, s, H-4')에서의 극성 양성자 신호 한 세트, 및 δ_H 5.37(1H, t, J= 6.0 Hz, H-2''), 3.60(2H, d, J= 4.6 Hz, H-1'), 1.81 (3H, s, H-5''), 및 1.64(3H, s, H-4'')에서의 또 다른 한 세트는 두 개의 프레닐 모이어티를 결정하였다.

C-6a(δ_C 102.6), C-6b(δ_C 113.1), C-8(δ_C 144.0), C-9(δ_C 142.9) 및 C-10a(δ_C 148.1)에서의 올레핀 탄소 위치는 방향 양성자 δ_H 7.16(1H, s, H-7)을 나타내는 HMBC 교차 피크에 의해 확인되었다.

방향 양성자 δ_H 7.16(1H, s, H-7)에서 C-8(δ_C 144.0) 및 C-9(δ_C 142.9)까지의 교차 피크에 의해 C-8 및 C-9에 위치한 두 개의 하이드록실 그룹이 나타났다.

두 개의 프레닐 그룹은 H-1'(3.34)에서 C-1(δ_C 153.7), C-2(δ_C 119.6) 및 C-3(δ_C 159.1)까지, 및 H-1''(δ_H 3.60)에서 C-9(δ_C 142.9), C-10(δ_C 112.4), 및 C-10a(δ_C 148.1.1)의 HMBC 상관관계에 의해 C-2 및 C-10a의 위치에 할당되었다.

이러한 데이터를 바탕으로 자연으로부터 처음으로 분리된 화합물 4가 새로운 쿠메스탄 유도체로 확인되었고 바이콜로스탄 A(bicolostan A)로 결정되었다.

2-5. 화합물 5의 분리

화합물 5는 황색 무정형 분말로 분리되었으며, 분자식은 HR-TOF-MS(m/z 448.1517 [M⁺], 448.1516으로 계산)에 의해 C₂₆H₂₄O₇로 결정되었다.

¹H와 ¹³C NMR을 사용하여 얻은 데이터에 따르면, 화합물 5는 화합물 4(표 1)와 동일한 쿠메탄 골격을 가졌지만, C-10에서 프레닐 그룹 대신 2,2-디메틸피란 고리에 해당하는 신호를 보였다.

DMSO의 ¹H NMR 스펙트럼에는 AX 시스템을 나타내는 6H[δ_H 1.45(6H, s, H-15, H-16)에서 자성적으로 동등한 메틸 양성자 쌍에 할당됨]의 단일항, δ_H 5.99(1H, d, J= 9.6 Hz, H-13)의 이중항(doublet), 및 δ_H 6.84(1H, d, J= 10.0 Hz, H-12)의 두 번째 이중항(doublet)이 나타나, 2,2-디메틸피란 모이어티의 존재를 구성했다.

대체된 프레닐 그룹은 COSY 커플링 상수 H-1'/H-2'에서 얻었다. HMBC는 H-1'(δ_H 3.32)에서 C-1(δ_C 154.2), C-2(δ_C 120.2), C-3(δ_C 160.1)까지의 상관관계를 통해 프레닐 그룹이 C-2에 붙어 있음을 보여주었다.

H-12(δ_H 6.84)에서 C-9(δ_C 144.7), C-10(δ_C 107.4), C-13(δ_C 133.0), 및 C-14(δ_C 77.1)까지의 장거리 상관관계에서 2,2-디메틸피란 모이어티가 C-9 및 C-10에 융합된 것이 밝혀졌다. 이러한 데이터에 근거하여, 화합물 5는 바이콜로스탄 B로 결정되었다.

2-6. 화합물 6의 분리

하기 화학식 6'으로 표시되는 화합물 6은 노란색의 고체로 분리되었다. 분자식은 HR-TOF-MS에 의해 C₂₆H₂₆O₇로 결정되었다(m/z 450.1669[M⁺], 450.1673으로 계산).

<화학식 6'>

¹³C NMR 스펙트럼에서의 특징적인 올레핀성의 산화된 4차 탄소 C-2(δ_C161.4), 및 C-3의 올레핀성 탄소(δC 118.1)의 존재는 화합물 6이 2- 아릴벤조퓨란 유도체임을 나타내었다.

¹H NMR 스펙트럼은 δ_H 6.37 및 7.32에서 두 개의 단일항을 보였으며, δ_H 5.16(1H, t, J= 4.6 Hz, H-2''), 3.16(2H, d, J= 6.6 Hz, H-1''), 1.69(3H, s, h-5′′) 및 1.63(3H, s, H-4)으로 나타났으며 이는 표 2의 프레닐 그룹을 의미한다.

Position	6^f		7^g
Position	δ_C	δ_H (J in Hz)	δ_C	δ_H (J in Hz)
2	161.4		161.9
3	118.1		118.5
3a	116.4		116.8
4	105.8	7.32, s	106.7	7.32, s
5	143.9		144.4
6	143.7		144.2
7	106.2		106.3
7a	138.7		139.2
8	115.3	6.70, d (9.6)	115.7	6.69, d (9.6)
9	131.9	5.88, d (9.6)	132.4	5.88, d (9.6)
10	76.3		76.8
11	27.2	1.43, s	27.6	1.43, s
12	27.2	1.43, s	27.6	1.43, s
1'	100.4		100.8
2'	158.8		159.3
3'	112.6		113.1
4'	159.3		159.8
5'	98.6	6.37, s	99.1	6.38, s
6'	155.7		156.2
1''	22.2	3.16, d (6.6)	22.6	3.17, d (4.4)
2''	123.6	5.16, t (4.6)	124.1	5.16, t (6.4)
3''	129.8		133.9
4''	25.5	1.63, s	40	1.92, d (7.4)
4''	25.5	1.63, s	40	1.94, d (8.0)
5''	17.7	1.69, s	26.6	1.99, m
5''	17.7	1.69, s	26.6	2.01, m
6''			124.6	5.03, t (6.0)
7''			131.1
8''			18	1.53, s
9''			25.9	1.59, s
10''			16.3	1.69, s
3-CHO	187.2	9.72, s	187.6	9.72, s
2'-OCH₃	61.3	3.42, s	61.7	3.41, s

또한, δ_H 1.43(6H, s, H-11 및 H-12)에서 2개의 메틸기를 갖는 δ_H 6.70 (1H, d, J= 9.6 Hz, H-8) 및 5.88(1H, d, J= 9.6 Hz, H-9)은 2,2- 디메틸피란 모이어티의 존재를 나타냈다. 또한, 데스힐드 알데히드 양성자는 HSQC 스펙트럼의 δ_C 187.2에서 상응하는 탄소 신호와 함께 δ_H 9.72에서 단일항으로 관측되었다.

알데히드 그룹의 위치는 HMBC가 δH 9.72에서 C-2(δC 161.4) 및 C-3(δC 118.1) 사이의 상관관계에 의해 결정되었다. 2,2-디메틸피란 모이어티는 H-8(δ_H 6.70)에서 C-6(δ_C 143.7), C-7(δ_C 106.2) 및 C-7a(δ_C 138.7)까지, 및 H-9(δ_H 5.88)에서 C-7(δ_C 106.2)까지의 HMBC의 상호작용에 따라 C-6 및 C-7에 위치하였다.

메톡시 그룹(δ_H 3.42)의 위치는 C-2'에 대한 HMBC 상관관계를 통해 설정되었다. 이러한 분광학적 특징을 바탕으로 L. bicolor에서 처음으로 분리된 아릴벤조퓨란을 확인하고 바이콜로퓨란 A(bicolofuran A)로 결정되었다.

2-7. 화합물 7의 분리

화합물 7은 노란색의 고체로 분리되었다. 분자식은 HR-TOF-MS 스펙트럼의 m/z 518.2299 (518.2299로 계산됨)에서 [M⁺] 이온에 따라 C₃₁H₃₄O₇로 결정되었다.

화합물 7은 각각 3'-프레닐 체인을 3'-제라닐 체인으로 대체한 화합물 6의 유도체이다. 기본 골격에 해당하는 모든 ¹H NMR 신호가 관찰되었으며, 표 2에 따르면 δ 값은 6이었다.

¹H NMR은 δH 3.17(2H, d, J= 4.4 Hz, H-1''), 5.16(1H, t, J= 6.4 Hz, H-2′′), 1.92, 1.94(각 1H, d, J= 7.4, 8.0 Hz, H-4''), 1.99, 2.01(각 1H, m, H-5''), 5.03(1H, t, J= 6.0 Hz, H-6′′)에서, 및 1.53, 1.59, 1.69(각 3H, s, H-7피, H-8'', H-9′′)으로 제라닐 그룹에 상응하는 양성자 공명을 나타내었다.

상기 제라닐 그룹은 H-1''에서 H-10''까지의 COSY 커플링 상수로 확인되었다. 긴 범위의 HMBC 크로스 피크는 H-1''(δ_H 3.17)부터 C-2'(δ_C 159.3), C-3'(δ_C 113.1), C-4'(δ_C 159.8)까지 제라닐 그룹이 C-3'에 위치했음을 나타낸다. 따라서 화합물 7은 바이콜로퓨란 B로 결정되었다.

실시예 3: 백혈병 세포에 대한 싸리나무 유래 화합물의 항증식 효과 확인

저캣 세포(Jurkat cells; 백혈병 세포)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 얻었다. ATCC가 제공한 정보에 따라 각 셀 라인의 배양 배지를 사용하였다. 세포주는 37℃, 5% CO₂의 습한 대기에서 배양되었다. 계대배양은 3일 또는 4일마다 세포밀도가 80 내지 90%에 달했을 때 1:5의 비율로 수행하였다.

싸리나무 유래화합물(Lespedeza bicolor compounds; LBC)이 저캣 세포에 미치는 항균 효과를 평가하기 위해 키트(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell PSI Kit, Promega)를 사용하였다. 백혈병 세포는 24시간 동안 100 uL RPMI 1640에서 웰당 5Х10⁵의 세포 밀도로 배양되었다. 세포는 서로 다른 농도의 LBC(10 uM, 50 uM 또는 100 uM)로 처리되었다. 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)로 처리된 세포를 대조군으로 하였다.

LBC 처리 후 48시간 동안 저캣 세포의 생존 가능성(%)을 추정하기 위해 37℃에서 2시간 동안 20 uL의 시약(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell PSI)과 반응시켰다. OD490 nm에서 마이크로플레이트 리더(Syergy HTX, BIO-TEK Instruments, Inc.)로 흡광도를 측정하였다.

도 10 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, LBC 1 및 4(화합물 1 및 4)로 48시간 동안 처리한 경우 저캣 세포의 생존 가능성이 현저하게 감소하였다.

	DMSO	LBC 1	LBC 2	LBC 3	LBC 4	LBC 5	LBC 6
10 uM (%)	100	20.358	18.675	19.370	24.981	25.572	21.227
50 uM (%)	100	22.432	18.723	19.191	27.506	21.978	20.009
100 uM (%)	100	29.522	77.043	63.129	35.505	59.903	90.402

실시예 4: LBC에 의해 유도되는 백혈병 세포의 형태학적 변화 확인

상기 실시예 3에서와 같이 LBC로 처리된 저캣 세포를 위상대조현미경(phase contrast microscope; Olympus)으로 분석하여 형태학적 변화를 측정하였다. 백혈병 세포의 사진(400Х)은 LBC로 24시간 및 48시간 처리 후 획득되었으며, 세포의 형태, 크기, 수치의 변화를 분석하였다.

도 11에서 확인할 수 있듯이, 살아있는 세포는 둥근 모양이 특징이다. LBC 1 및 4로 처리 후 저캣 세포에서 세포사멸의 형태학적 변화 특성이 나타났다.

실시예 5: LBC에 의해 유도되는 세포사멸의 확인

LBC로 처리된 저캣 세포를 7-AAD(BioLegend)가 포함된 키트(PE Annexin V Apoptosis Detection Kit)를 사용하여 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 검사하였다. 저캣 세포에서 LBC 유도 세포독성의 메커니즘을 확인하기 위하여, 세포의 세포주기 진행과 세포사멸의 시작에 대한 변화를 평가하기 위해 유세포 분석 및 웨스턴 블랏을 사용하였다.

아넥신 V(Annexin V)는 초기 세포 사멸 유도 과정에서 포스파티딜세린(Phosphatidylserine: PS)이 원형질막의 내부에서 외부 판막으로 튀어나가기 때문에 세포의 PS와 결합한다. 이와는 대조적으로, 7-AAD는 막이 붕괴될 때 세포 DNA를 염색하는데, 이는 후기 사멸이 유도되는 동안 DNA가 염색될 수 있도록 한다. FL-2 및 FL-3 채널은 각각 항-피코에리트린(Anti-Phycoerythrin; PE) 및 7-AAD의 형광 발광을 측정하는 데 이용되고, 초기(Annexin V+)와 후기 세포사멸 세포(7-AAD+)를 구별하기 위해 사용되었다.

LBC 처리 및 미처리(대조군) 저캣 세포는 6-웰 플레이트에서 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 세포는 48시간 동안 처리한 후 채취하여 PBS로 세척한 후 결합 버퍼(1Х)로 재현탁시켰다. 세포는 제조사의 지침에 따라 Annexin V-PE 및 7-AAD로 염색되었다. 염색 후, 유동 세포계(BD FACSVerse, BD Bioscience)를 이용하여 세포를 획득하고 FlowJo 소프트웨어(BD Bioscience)를 통해 세포사멸의 비율을 분석하였다. 사멸 세포는 초기(Annexin V+/7-AAD-) 및 후기(Annexin V+/7-AAD+)으로 구별되었다.

도 12a, 12b 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, LBC 1 및 4를 처리한 경우 후기 세포사멸이 일어나는 세포의 비율이 현저하게 높게 나타났다.

	CTL	LBC 1	LBC 2	LBC 3	LBC 4	LBC 5	LBC 6
초기 (%)	3.16	11.3	4.15	10.8	12.3	6.26	8.41
후기 (%)	3.78	40.4	9.02	15.3	46.7	17.9	5.81

웨스턴 블랏의 수행을 위해 LBC를 처리한 세포에 단백질 용해 효소 칵테일 (cOmplete, Roche)을 보충한 용균 버퍼[25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate 및 0.1% sodium dodecyl sulfate]를 처리하였다. 용해물을 얼음 위에 5분 동안 두었다가 4℃에서 13000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 총 단백질 농도는 Pierce BCA 단백질 분석(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 측정하였다. 러닝 버퍼(Thermo Fisher Scientific)로 1X MES를 사용하여 4 내지 12% BisTris-NuPage 폴리아크릴아미드 겔에서 겔 전기영동[sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)]하여 총 단백질 용해물 (40 ug / PVDF 멤브레인(0.45 uM 공극 크기)으로 옮겼다.

막의 비특이적 결합을 막기 위해 5% 탈지 분유에서 배양한 후, 제조사의 지침에 따라 다음의 단클론 항체 또는 다클론 항체로 탐침하였다: 항-절단된 PARP-1, 항-BCL2 및 항-액틴(Santa Cruz Biotechnology, Inc.). 그 후 멤브레인을 각각 1:5000으로 희석된 HRP-접합 2차 항체(Jackson Laboratory)와 함께 배양하고, ImageQuant LAS 4000 mini(Fujifilm)로 스캐닝하고, 이미지 분석 프로그램(Multi Gauge Ver.3.0, Fujifilm)으로 분석하였다.

도 12c에서 확인할 수 있듯이, LBC 1 및 4를 처리한 세포의 경우 BCL-2 및 분할된 PARP 단백질을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.

LBC 처리로 인하여 세포 사멸을 억제하는 Bcl-2 단백질의 발현이 감소함으로써 결과적으로 저캣 암세포의 사멸이 유도되었으며, ADP-리보오스 중합효소-1(PARP-1)이 과활성화 되어 유발된 PARP-1 단백질의 절단을 통하여 암세포의 성장억제 및 사멸이 확인되었다.

실시예 6: LBC에 의한 세포주기 진행의 변화 확인

상기 실시예 5에서 LBC 처리된 저캣 세포는 48시간 동안 배양된 후 수확되었다. 셀은 PBS로 세척하였으며, PBS에서 10 mM TMRM(Tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate) 스톡을 희석하여 100 nM 셀 투과성 형광 표시기 TMRM(Thermo Fischer Scientific)을 준비하였다. 37℃에서 30분 동안 LBC 처리된 저캣 세포를 배양하였다. 미토콘드리아 멤브레인 전위분석을 위해 PBS에서 셀을 세척하고 재현탁하여 유동 세포계(BD FACSVerse, BD Bioscience)를 통해 획득한 후 FlowJo 소프트웨어(BD Bioscience)를 사용하여 분석하였다.

도 13a, 13b 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, LBC 1 및 4를 처리한 저캣 세포의 경우 세포의 미토콘드리아 막 전위가 감소하였다.

	CTL	LBC 1	LBC 2	LBC 3	LBC 4	LBC 5	LBC 6
TMRM 형광 (%)	93.2	46.3	89.23	77.9	10.72	69.9	90.4

LBC 처리된 세포의 세포 DNA 함량 분석은 세포 주기의 서로 다른 단계(G0/G1:S:G2/M)에서 세포를 밝히고, 부분적인 DNA 함량을 가진 세포의 검출을 위해 사용되었다. LBC 처리된 저캣 세포는 6-웰 플레이트에 접종하고 48시간 동안 배양하였다. 세포는 4℃에서 3시간 동안 얼음처럼 차가운 70% 에탄올을 사용하여 채취, 세척한 후 고정하였다. 세포주기 분석을 위해 RNase-A(5 ug/mL)와 PI(Propidium Iodide, 50 ug/mL)가 포함된 PBS에서 셀을 다시 재현탁시켰다. 세포 샘플은 유동 세포계를 이용하여 획득하였고 세포주기를 분석하여 도 14a 및 표 6으로 나타내었으며, G0/G1, S 및 G2/M 단계에서의 세포 백분율을 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석하고 도 14b 및 표 7로 나타내었다.

도 14a, 14b, 표 6 및 7에서 확인할 수 있듯이, LBC 1 및 4를 처리한 저캣 세포에서 세포 주기 진행이 G0/G1은 증가하고 S 및 G2/M 단계는 감소하는 것으로 변화하여, 세포주기가 진행되지 않는 것으로 나타났다.

	CTL	LBC 1	LBC 2	LBC 3	LBC 4	LBC 5	LBC 6
G0/G1 (%)	71.4	82.1	67.8	68.5	82.3	74.6	68.9
S (%)	12.2	8.78	12.0	13.1	10.9	11.1	13.0
G2/M (%)	16.7	9.30	20.6	18.6	7.05	14.4	18.4

	CTL	LBC 1	LBC 2	LBC 3	LBC 4	LBC 5	LBC 6
G0/G1 (%)	71.05	82.2	67	67.95	82.4	74.8	68.95
S (%)	12.25	8.84	12.5	13.3	6.875	11.2	13.15
G2/M (%)	17	9.145	20.5	18.75	10.95	14.6	18.2

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
<화학식 1>

상기 화학식 1에서,
R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 H, 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기이고,
R₃은 O 또는 OH이고,
R₄는 CH₂, CO 또는 CHO이고,
단, 상기 R₃이 O일 경우 R₄의 임의의 C와 연결되어 고리 구조를 형성할 수 있고,
R₅는 H, OCH₃ 또는 OH이고,
R₆은 O 또는 OH이고,
R₇은 H, C₁ 내지 C₁₀의 에폭시프레닐기 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기이며,
단, 상기 R₆이 O일 경우 R₇의 임의의 C와 연결되어 고리구조를 형성할 수 있다.
제1항에 있어서, 상기 R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 H,
또는
인 것인, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 R₇은 H,
또는
인 것인, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 7로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 화합물:
<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

.
싸리나무 추출물을 얻는 추출 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리방법:
<화학식 1>

상기 화학식 1에서,
R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 H, 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기이고,
R₃은 O 또는 OH이고,
R₄는 CH₂, CO 또는 CHO이고,
단, 상기 R₃이 O일 경우 R₄의 임의의 C와 연결되어 고리 구조를 형성할 수 있고,
R₅는 H, OCH₃ 또는 OH이고,
R₆은 O 또는 OH이고,
R₇은 H, C₁ 내지 C₁₀의 에폭시프레닐기 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기이며,
단, 상기 R₆이 O일 경우 R₇의 임의의 C와 연결되어 고리구조를 형성할 수 있다.
제5항에 있어서, 상기 R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 H,
또는
인 것인, 화합물의 분리 방법.
제5항에 있어서, 상기 R₇은 H,
또는
인 것인, 화합물의 분리방법.
제5항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 7로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 화합물의 분리방법:
<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

.
제5항에 있어서, 상기 추출 단계는 메탄올을 용매로 하여 수행되는 것인, 화합물의 분리방법.
제5항에 있어서, 상기 분리방법은 싸리나무 추출물에 크로마토그래피를 이용하여 분획물을 분획하는 분획 단계를 더 포함하는 것인, 화합물의 분리방법.
제10항에 있어서, 상기 분획 단계는 다음의 단계를 포함하는 것인, 화합물의 분리방법:
싸리나무 추출물의 에틸아세테이트 가용부에 CH₂Cl₂ 및 메탄올을 농도구배적으로 이용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 수행하여 제1 분획물을 분획하는 제1 분획 단계;
상기 제1 분획물에 헥산 및 에틸아세테이트를 농도구배적으로 이용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 제2 분획물을 분획하는 제2 분획 단계;
상기 제2 분획물에 메탄올을 농도구배적으로 이용한 액체 크로마토그래피를 이용하여 제3 분획물을 분획하는 제3 분획 단계; 및
상기 제3 분획물에 아세토니트릴 및 물을 농도구배적으로 이용한 액체 크로마토그래피를 이용하여 제4 분획물을 분획하는 제4 분획 단계.
제11항에 있어서, 상기 분획 단계는 제4 분획물에 아세토니트릴 및 물을 농도구배적으로 이용한 액체 크로마토그래피를 이용하여 제5 분획물을 분획하는 제5 분획 단계를 더 포함하는 것인, 화합물의 분리방법.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물:
<화학식 1>

상기 화학식 1에서,
R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 H, 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기이고,
R₃은 O 또는 OH이고,
R₄는 CH₂, CO 또는 CHO이고,
단, 상기 R₃이 O일 경우 R₄의 임의의 C와 연결되어 고리 구조를 형성할 수 있고,
R₅는 H, OCH₃ 또는 OH이고,
R₆은 O 또는 OH이고,
R₇은 H, C₁ 내지 C₁₀의 에폭시프레닐기 또는 C₁ 내지 C₁₀의 알킬기이며,
단, 상기 R₆이 O일 경우 R₇의 임의의 C와 연결되어 고리구조를 형성할 수 있다.
제13항에 있어서, 상기 R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 H,
또는
인 것인, 약학 조성물.
제13항에 있어서, 상기 R₇은 H,
또는
인 것인, 약학 조성물.
제13항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 7로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물:
<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

.
제13항에 있어서, 상기 혈액암은 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수생성이상증후군, 만성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 거대모구성 백혈병, 다발골수종 및 적백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.