KR102561140B1

KR102561140B1 - 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102561140B1
Application number: KR1020210030737A
Authority: KR
Inventors: 조남기; 유희민
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 한국표준과학연구원
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2023-07-31
Also published as: KR20220126841A

Abstract

본 발명은 싸리(Lespedeza bicolor Turcz.) 추출물에서 유래한 화합물을 유효 성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 화학식 1 내지 화학식 8 중에서 선택된 화학식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 조성되는 염을 유효 성분으로 포함할 수 있다.

Description

치매 예방 또는 치료용 약학 조성물{The Pharmaceutical composition for the improvements and prevention of the symptoms in the dementia comprising the extracts from Lespedeza bicolor Turcz.}

본 발명은 싸리(Lespedeza bicolor Turcz.) 추출물에서 유래한 화합물을 유효 성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 싸리 추출물의 화합물 또는 이의 약학적으로 조성되는 염을 유효 성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

치매는 우리나라 65세 이상의 노령인구 약 8.2~10.8%에서 나타날 정도로 흔하며, 인구의 급속한 고령화와 함께 심각한 사회문제로 대두되고 있는 대표적인 노년기 질환으로 후천적으로 지적능력을 상실하고 인지장애, 행동 및 성격의 점진적 황폐화라는 임상증상을 나타내는 퇴행성질환이다. 특히, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 가장 많은 유형의 치매로 대뇌 피질(cortex)이나 해마(hippocampus)에 생기는 뇌위축과 노인반(senile plaque), 신경섬유다발(neurofibrillary tangles) 그리고 신경세포의 과립공포변성(granulovacuolar degeneration), 히라노체(Hirano body) 등의 조직학적 소견을 특징으로 하며, 베타 아밀로이드(β-amyloid, Aβ)는 노인반의 주요 구성성분으로 AD가 발생하는 중요한 원인으로 추정되고, 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 발생시켜 산화적 스트레스(oxidative stress)로 인한 신경세포사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다.

주요 증상은 뇌세포파괴로 인한 인지기능, 기억력 감퇴로 서서히 진행되는 경우 사망에 이르게 된다. 40-65세 사이에 발병하는 경우 early-onset 또는 가족형 AD(familial AD), 65세 이상에서 발병되는 경우 late-onset 또는 산발성(sporadic AD)로 분류 된다. 가족형은 유전적 요인이 많이 작용한다. 일부 노화로 인한 신경퇴행성으로 발병하여 진행과정이 느린 경우를 노인성 치매(senile dementia)라고 하며 AD는 진행성으로 노인성 치매보다 증상의 진행속도(악화)가 빠르다.

치매에 임상적으로 사용되는 항치매 약물은 치매 환자의 인지 기능 저하를 예방하고 회복시키며, 아울러 생활 기능을 증진시키는 약물인 콜린에스테라제(cholinesterase) 차단제인 타크린(tacrine), 도네페질(donapezil), 리바스티그민(revastigmine), 갈란타민(galantamine), MAO-B 차단제인 selegilin, 혈관 확장제, 뇌영양제(nootropics)등이 있고, 여성 호르몬 보충제 비타민 등도 인지 기능 저하를 치료하는 약물로 제안되고 있다.

치매의 치료는 주로 알츠하이머병을 중심으로 발전되어 왔기 때문에 알츠하이머병의 약물 치료가 필수적인데 비인지 장애 및 이상 행동의 치료제로는 사고 장애 및 공격 행동의 치료에 항정신병 약물인 할로페리돌(haloperidol)이 사용되어 왔지만, 현재 비전형적 정온제로 알려진 크로자핀(clozapine) 및 리스레리돈(risperidone), 올란자핀(olanzapine)의 소량 사용이 권장되고 있고 정동장애의 치료에는 현재 세로토닌 재흡수를 차단시키는 프로작(prozac), 졸로푸트(zoloft), 세로작(seroxat) 등의 항우울제가 비교적 폭 넓게 사용되고 있다.

공개특허공보 제10-2008-0103321호

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 뉴런 HT22 해마 세포에서 글루탐산염(glutamate) 유도 신경독성에 대한 1-메톡시레스퍼플로린(1-methoxylespeflorin) G11 (MLG)의 신경 보호 효과에 관한 것이다.

MLG의 보호 효과는 MTT 분석 및 현미경 분석을 사용하여 평가되었다. 세포사멸의 정도는 아넥신 V/요오드화 프로피디움(annexin V/propidium iodide)으로 탐침된 손상된 세포에서 수행된 유세포 분석을 통해 연구하였다.

또한 미토콘드리아 활성산소종(ROS)은 MitoSOXTM Red 염색(staining)을 통한 유세포 분석을 통해평가하였다. 미토콘드리아 막 전위를 결정하기 위해, 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine)과 JC-1으로 염색한 후 유세포 분석을 수행하였다.

그 결과는 MLG가 세포내 ROS 생성과 미토콘드리아 기능 장애를 억제함으로써 HT22 세포에서 글루탐산염(glutamate) 유도 세포사멸을 약화시키는 것으로 나타났다. 또한, MLG는 Bcl-2의 상향 조절과 절단된 PARP-1, AIF 및 인산화된 MAPK 케스케이드(cascade)의 하향조절을 통해 HT22 세포에서 글루탐산염으로 유도된 세포 사멸 경로를 방지하였다.

또한, MLG 치료는 HT22 세포에서 HO-1 발현을 유도하였다. 이러한 결과는 MLG가 산화전 스트레스와 세포사멸을 억제함으로써 신경세포의 HT22 세포에서 글루탐산염으로 유도된 신경독성에 대한 신경 보호 효과를 보인다는 것을 시사한다.

한편, 치매의 가장 흔한 형태인 알츠하이머병(AD)은 진행성 노화관련 신경퇴행성 질환이다. 산화적 스트레스와 흥분독성 장애는 AD의 주요 특징인 신경세포 손실과 시냅스 기능 장애와 크게 관련되어 있다.

주요 흥분성 신경전달물질인 글루탐산염(glutamate)은 뇌 발달 과정에서 세포 생존, 이동 및 분화를 담당한다. 그러나, 과도한 양의 글루탐산염(glutamate)은 산화적 스트레스나 흥분독성을 통해 신경 세포의 사멸을 초래한다.

뉴런(neurons)은 특히 활성산소종(ROS)의 생성에 취약하며 산화환원 스트레스에 매우 민감하다. 따라서, AD는 ROS의 생성과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 신경 세포의 사멸을 초래한다.

게다가, 산화적 스트레스는 미토콘드리아 기능 장애를 유발한다; 이것은 세포사멸 유도 인자(apoptosis-inducing factor, AIF)의 핵으로의 전좌(translocation)를 유발하여, 카스파제(caspase) 독립적인 세포사멸 경로의 활성화를 초래한다. ROS의 과도한 생산은 미토겐 활성 단백질 키나아제(MAPK)의 인산화를 촉진한다.

따라서 항산화제를 사용한 글루탐산염 유도 산화적 스트레스의 억제는 AD의 예방과 치료에 좋은 전략이 될 수 있다.

자연적으로 발생하는 폴리페놀 화합물인 플라보노이드는 사람의 식생활에서 정상적인 구성 성분이며 다양한 생물학적 활성에 대해 알려져 있다. 프테로카르판(pterocarpans)은 두 번째로 큰 이소플라보노이드 그룹을 구성한다. 이들은 플라보노이드 골격에서 파생된 6a와 11a 위치에 두 개의 키랄 중심을 갖는 벤조푸란-벤조피란(benzofuran-benzopyran)의 4환 고리 시스템을 포함한다.

프테로카르판(pterocarpans)은 항신경염증제, 항암제, 항산화제, 말라리아 방지제, 항균제 등 다양한 생물학적 활성을 나타낸다.

본 발명에서는 항산화 및 항아폽토시스(antiapoptotic) 성질을 모두 갖는 약용 식물의 다기능제를 검사하는 과정에서, 싸리(Lespedeza bicolor Turcz.) (Leguminosae)의 메탄올 추출물이 글루탐산염(glutamate)으로 손상된 HT22 해마 세포에서 보호 활성을 하는 것으로 밝혀졌다.

싸리(L. bicolor)로부터 유래된 프테로카르판(pterocarpans)은 특히 항암, 항산화, 뉴라미니다아제(neuraminidase) 억제 활성 등 유익한 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

이전에, Jurkat 세포에서 항증식 활성을 보이는 싸리(L. bicolor)로부터 4개의 새로운 프테로카르판(pterocarpans)을 분리하였다. 그러나, 본 발명자들이 아는 한, HT22 해마 세포에서 글루탐산염(glutamate) 유도 독성에 대항하는 프테로카르판(pterocarpans)의 신경 보호 활성은 아직 조사되지 않았다. 본 발명자들은 글루탐산염((glutamate) 유도 산화적 스트레스에 의한 신경 세포 사멸을 연구하기 위해, 쥐(murine)의 해마 신경 세포주인 HT22 세포에서 신경 보호 효과를 보이는 싸리(L. bicolor)에서 생리 활성 프테로카르판(pterocarpans)을 추가로 확인하였다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기 해결하려는 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 하기 화학식 1 내지 화학식 8 중에서 선택된 화학식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 조성되는 염을 유효 성분으로 포함할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

상기 화합물은 싸리(Lespedeza bicolor Turcz.) 추출물로부터 유래된 것이다.

상기 추출물은 싸리의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물이다.

상기 조출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 비극성용매 가용 추출물은 메틸렌클로라이드, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 화합물은 신경세포에서 산화적 스트레스 또는 세포 사멸을 유발하는 글루탐산염(glutamate)의 신경독성을 억제할 수 있다.

상기 화합물은 신경세포 내에서 산화적 스트레스에 의한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 축적을 완화할 수 있다.

상기 화합물은 미토콘드리아의 막전위(mitochondrial membrane potential, MMP, ΔΨm) 붕괴를 조절할 수 있다.

상기 화합물은 MAPK(mitogen-activated protein kinases)의 인산화를 억제할 수 있다.

상기 화합물은 신경세포 내에서 HO-1(heme oxygenase 1)의 발현을 증가시킬 수 있다.

상기 해결하려는 과제를 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 하기 화학식 1 내지 화학식 8 중에서 선택된 화학식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 조성되는 염을 유효 성분으로 포함할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

본 발명은 싸리(Lespedeza bicolor Turcz.) 추출물에서 유래한 화합물을 유효 성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의할 경우, 싸리 추출물의 화합물 또는 이의 약학적으로 조성되는 염을 유효 성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

도 1은 싸리 추출물로부터 수득한 치매 예방 또는 치료 효능을 갖는 이소플라보노이드 화합물들이다.
도 2는 (A), (B) 글루탐산염 처리된 HT22 세포에서 화합물 1-8의 신경 보호 효과(*p<0.05, **p<0.01 대 글루탐산염 그룹)를 나타낸 결과이고, (C) 형태 변화에 대해 현미경(400 × magnification) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 글루탐산염 유도 세포 사멸에 대한 MLG의 억제 효과를 나타낸 것으로, (A) 아넥신 V/PI(annexin V/PI) 이중 염색을 사용하여 세포 사멸 수준을 평가한 것이고, 세포 사멸은 유세포 분석으로 평가한 결과이고, (B) HT22 세포의 전체 세포 용해물을 Bcl-2, 절단된 PARP, AIF, IF-1 및 GAPDH에 특이적인 항체로 면역 블롯검사 결과이다(*p<0.05 대 글루탐산염 그룹).
도 4는 MLG가 활성산소종(ROS) 생성 및 미토콘드리아 기능 장애를 방지하여 글루탐산염으로 유도된 세포 사멸을 약화시킨 것을 나타낸 것이다. (A) 형광 현미경을 사용한 형광 강도 측정을 통한 ROS 검출한 결과이고, (B) MMP는 유세포 분석을 사용하여 분석한 결과이고, (C) JC-1 염색으로 염색한 결과이다 (*p<0.05 대 글루탐산염 그룹).
도 5는 글루탐산염으로 유도된 세포 사멸을 받은 HT22 세포의 MAPK 캐스케이드에 대한 MLG의 효과를 나타낸 것이다. 즉, p-JNK, JNK, p-ERK, ERK의 발현 수준을 나타낸 것이다(*p<0.05 대 글루탐산염 그룹).
도 6은 HT22 세포에서 HO-1 발현에 대한 MLG의 효과를 나타낸 것이다. (A) HO-1 및 GST의 mRNA 수준은 RT-qPCR에 의해 측정된 결과이고(*p<0.05 대 글루탐산염 그룹), (B) 다양한 농도에서 MLG의 존재 하에 HO-1의 발현을 평가한 결과이고(*p<0.05 대 글루탐산염 그룹), (C) HO-1 억제제인 SnPP는 MLG의 세포보호 효과를 억제하였고, HT22 세포를 4mM 글루탐산염으로 처리하고 0.2μM SnPP 또는 10 μM MLG와 함께 배양한 후 HO-1 발현을 측정한 결과이다(#p <0.05 vs 글루탐산염 그룹; *p <0.05 vs 글루탐산염 및 MLG 처리 그룹).

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 화합물의 추출 및 분리

화힉식 1로 표시된 화합물 1의 분리를 위해, 에틸 아세테이트 분획 (EA)을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(CC)에 적용하여 CH2Cl2-MeOH로 용출돤 4개의 분획 (E1-E4)을 수득하였다. E1(16.4 g)은 실리카 겔 CC(헥산- 에틸 아세테이트)를 사용하여 추가로 분리하여 5개의 서브분획(H1-H6)을 수득하였다. 7개의 서브분획(H18-H24)이 RPC18-MLPC에 의해 서브분획 H1으로부터 수득되었다. 서브분획 M22(1.5g)를 분리하여 H₂O중 75% CH₃CN을 사용하는 반분취 HPLC에 의해 화합물 1(44.2mg)을 생성하였다. 2-게라닐비콜로신A(2-Geranylbicolosin A) (1): 갈색-황색 고체; [α]²⁰ _D -163 (c 0.21, MeOH); ECD (Δε+5.85) at 287nm (MeOH); UV(MeOH)λmax(logε) 284(3.98), 230(4.27)nm; IR(MeOH) vmax 3421, 2969, 2923, 1615, 1462, 1348, 1169, 1128, 1072 cm-1; 1H (DMSO-d₆, 400MHz); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) data, 보충 표 1 참고; HRTOFMS m/z 504.2877 [M+] (calcd for C₃₂H₄₀O₅, 504.2870).

[실시예 2] 세포 생존력(cell viability)

HT22 세포의 생존력에 대한, 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물1 내지 8의 다양한 효과는 MTT 분석으로 결정하였다. 100μL 성장배지를 포함하는 웰(well)당 105개의 세포로 96-웰(well) 플레이트(plate)에 세포를 플레이팅하고, 24시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 각 화합물을 각 웰에 첨가하였다. 또한 각 웰에 MTT용액(5mg/mL)을 첨가하였다.

형성된 포르마잔(formazan) 침전물을 100μL의 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 용해시키고, 세포를 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 흡광도는 562nm에서 자동화된 마이크로 플레이트 리더(Bio-Tek, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 상대 세포 생존율(%)은 처리 세포와 대조군(처리되지 않은) 세포의 흡광도 사이의 비율로 계산되었으며, 백분율로 표시하였다. 실험은 3회 이상 수행되었고, 각 조건은 삼중으로 배양되었다.

[실시예 3] 현미경 관찰 (microscopy)

형태학적 변화를 관찰하기 위해, MLG 처리 유무에 관계없이 글루탐산(4mM) 처리된 HT22 세포를 위상차 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 검사하였다.

[실시예 4] 세포사멸 분석 (analysis of apoptosis)

세포 사멸 세포 집단은 아넥신(Annexin) V APC/PI 세포사멸 검출 키트(BioLegend, San Diego, CA, USA)를 사용하여 평가하였다. 간단히 말해, HT22세포를 6-웰(well) 플레이트에 시드하고 다양한 농도의 MLG로 처리하였다. 이어서 12시간 및 24시간 동안 4mM 글루탐산염(glutamate)에 노출시켰다. 세포를 채취하고, PBS로 세척한 후, 37℃ 및 5% CO₂에서 30분 동안 아넥신 V/PI(annexin V/PI) 로 염색하였다. 이어서, 유세포 분석기(BD FACSVerse, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포를 분석하였다. 데이터는 Flow Jo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

[실시예 5] 미토콘드리아 막전위 (Δψm)

MMP는 테트라메틸로다민 메틸 에스테르 퍼클로레이트(tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate, TMRM) 및 MitoProbe JC-1(5′,6,6′-테트라클로로(tetrachloro)-1,1′,3,3′-테트라에틸벤지미다졸릴카르보시아닌(tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine) 요오드화물; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 염색을 사용하여 측정되었다. 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 MLG로 처리한 후, 12시간 및 24시간 동안 4 mM 글루탐산염(glutamate)에 노출시켰다.

채취 후, 세포를 100 nM 세포 투과성 형광 지표 TMRM으로 20분간 배양하였다. MitoProbe JC-1으로 Δψm을 검출하기 위해, 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 30분 동안 2μM JC-1과 함께 배양하였다.

TMRM 또는 JC-1으로 염색된 샘플을 PBS로 세척하고 1% FBS로 PBS에 재현탁시켰다. 유세포 분석기(BD FACSverse, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에서 샘플을 추가로 분석하였다. FlowJo 소프트웨어로 결과를 분석하였다(Becton, Dickinson and Company, Frankiln Lakes, NJ, USA).

[실시예 6] 세포내 ROS 분석

세포 내 미토콘드리아 ROS 수치를 측정하기 위해, MitoSOXTM Red 미토콘드리아 슈퍼옥사이드(superoxide) 지표 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. 요약하면, MitoSOXTM Red 시약 작업(5μM)을 MLG 및 글루탐산염(glutamate)으로 전처리된 세포에 추가하였다. 또한, 어두운 곳의 37℃에서 10분 동안 세포를 배양하였다. 세포를 세척하고 1% FBS가 있는 500μl PBS에 다시 재현탁시켰다. 유세포 분석기(BD FACSVerse, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포 내 형광을 측정하여 ROS 수준을 분석하였다.

[실시예 7] 웨스턴 블롯(western blot)

웨스턴 블롯의 경우, 0.1mg/mL 페닐메틸수포니 플루오르화물(phenylmethylsufony fluoride)이 함유된 RIPA 버퍼로 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 13000 rpm 및 4℃에서 10분 동안 원심분리를 하였다.

단백질 수준은 브래드포드(Bradford) 분석을 사용하여 정량화하였다. 동일한 양의 단백질을 10% SDS-PAGE로 투여하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride) 막으로 전달했으며, TBST에서 1차 항체와 함께 4℃에서 무지방 건유 1%로 배양하였다.

Bcl-2, pp38, p38, pJNK, JNK, IF-1, GAPDH 및 -튜불린에 대한 특정 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다. 절단된 PARP, AIF, HO-1, pERK 및 ERK에 대한 항체는 Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. 1×TBST로 세척한 후, 1시간 동안 항-마우스 또는 항-토끼 호스래디시-퍼옥시다제-접합(horseradish-peroxidase-conjugated) 2차 항체(Jackson Laboratory)와 함께 1시간 동안 배양하였다. 신호는 Image Quant LAS mini(Fujifilm, Tokyo, Japan)로 감지하였다.

[실시예 8] 역전사 중합 효소 연쇄반응(RT-qPCR)

HT22 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고 4mM 글루탐산염(glutamate)의 존재하에 MLG와 함께 배양하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 Total RNA를 추출하였다.

cDNA는 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 1μg total RNA로 합성하고 특정 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 혼합물은 iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)의 10μL, PCR 순방향 프라이머(10μM)의 1μL, PCR 역방향 프라이머(10μM)의 1μL, cDNA 템플릿(template)의 1μL 및 ddH2O의 7μL를 포함한다. qRT-PCR 조건은 다음과 같다: 10분 동안 95°C(변성), 후에 15초 동안 95°C 및 60초 동안 60°C의 40 사이클

이 절차는 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 수행하였다.

모든 값은 평균 ± 표준 오차로 표시되었다. 통계적 유의성은 Student’s t-test에 의해 결정되었다. p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.

[결과 분석]

1) 신규 프테로카르판(pterocarpans), 2-게라닐비콜로신 A(2-geranylbicolosin A)(1)의 구조 설명

신규 프테로카르판(pterocarpans), 2-게라닐비콜로신 A(2-geranylbicolosin A)(1)와 이전에 보고된 7개의 이소플라보노이드가 싸리(L. bicolor)의 생물학적 분석 유도 분획 및 화학적 조사 후에 분리되었다.

화학식 1로 표시되는 화합물 1의 ¹H 및 ¹³C NMR 데이터와 화학식 2로 표시되는 화합물 2 (비콜로신(bicolosin) A)의 데이터를 상세하게 비교하면 화합물 1이 비콜로신 A의 게라닐 유도체임이 나타났다 (표 1).

게라닐 측쇄의 위치는 H-1'[δ_H 3.19 (2H, m)]에서 C-1(δ_C 160.0), C-2 (δ_C 115.4) 및 C-3 (δ_C 157.9)까지 그리고 H-2′[δ_H 5.16 (1H, m)]에서 C-2까지 HMBC 상관 관계를 통해 C-2에서 확인되었습니다. 양성자 H-6a와 H-11a의 cis 구성은 ¹H-¹H 결합 상수 (J = 6.4 Hz)와 ROESY 실험 (도 1)을 기반으로 관찰되었다.

287 nm에서 양의 Cotton 효과(

ε+5.85)와 음의 광학 회전([α]²⁰ _D -163, c 0.21, MeOH)에 따라, 화합물 1의 절대 배열은 R형태로 표시되었으며, 앞서 보고된 바와 같이 분리된 프테로카르판(pterocarpans)의 그것과 비교되었다. 따라서, 화합물 1은 게라닐기의 치환에 대해서만 비콜로신 A(bicolosin A)와 다르기 때문에 2-게라닐비콜로신 A(2-geranylbicolosin A)로 명명되었다 (도 2A).

2) 싸리( L. bicolor )에서 분리된 화합물이 글루탐산염(glutamate) 처리된 HT22 세포에 미치는 신경 보호 효과

분리된 화합물의 신경 보호 효과를 평가하기 위해 글루탐산염으로 처리된 HT22 세포를 분리된 화합물과 함께 배양하였다. 글루탐산염(glutamate)은 독성물질로, HT22 세포에서 산화적 스트레스를 유발하여 여러 가지 손상과 신경 흥분독성을 유발한다. HT22 세포는 분리된 화합물의 존재 하에 0.1 ~ 10μM 범위의 농도에서 24 시간 동안 글루탐산염(4mM)에 노출되었다.

세포 생존력은 3-(4,5-디메틸티자올-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthizaol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT) 분석을 사용하여 결정되었고 처리되지 않은 대조군의 백분율로 표현되었다.

4mM 글루탐산염(glutamate)으로 24시간 동안 배양한 후, HT22 세포의 생존율은 20.5%±0.1%로 감소하여 4mM 글루탐산염이 상당한 독성을 유발했음을 나타냈다(도 2B).

그러나 그 독성 효과는 싸리(L. bicolor)에서 얻은 몇 가지 화합물에 의해 감소되었다. 보호 조치에 대한 구조적 요구 조건이 추가로 분석되었다.

아릴벤조퓨란(arylbenzofuran) 타입 화합물 8(화학식 8)은 글루탐산염으로 유도된 세포 사멸로부터 HT22 세포를 보호하지 못했다. 유사하게, 쿠메스탄(coumestan) 타입 화합물 7(화학식 7)은 최대 10μM 농도에서 보호 효과를 나타내지 않았다.

반면에, 프테로카르판(pterocarpans) 타입 화합물(1-6)은 글루탐산염-신경 독성에 대해 상당한 신경 보호 효과를 나타내었다.

이중, C-2에 게라닐기, C-10에 프레닐기, C-8에 메틸기를 갖는1-메톡시레스페플로린 G11(1-methoxylespeflorin G11) (MLG) (5)은 세포 생존력이 증가함에 따라 강력한 보호 효과를 나타냈다(도 2B).

또한, 현미경 분석에 따르면 MLG가 HT22 세포에서 글루탐산염(glutamate)에 의해 유도 된 세포 사멸을 강력하게 억제하는 것으로 나타났다 (도 2C). 또한, MLG 농도가 10μM 이하인 경우 유의한 세포 독성이 관찰되지 않았고, 25μM의 MLG에서는 약간의 세포 독성이 관찰되었다(보충 도 1).

따라서, 신경 보호 메커니즘을 추가로 조사하기 위해, MLG를 5 및 10μM 사용하였다.

3) HT22 세포에서 MLG에 의한 글루탐산염 유도 세포 사멸의 감쇠

글루탐산염 유도 세포 사멸에 대한 MLG의 보호 활성을 조사하기 위해, 아넥신 V/요오드화 프로피디움(propidium iodide)으로 탐침되어 손상된 세포에 대해 유세포 분석을 수행하였다(도 3A). 초기 세포 사멸 세포의 비율은 24시간 동안 글루탐산염에 노출된 후 증가하였다.

그러나, 글루탐산염에 노출되기 전에 10μM의 MLG로 세포를 처리 한 경우, 초기 세포 사멸 세포의 비율은 도 3A와 같이 감소하였다. 이러한 데이터는 MLG가 PI 염색에 의해 밝혀진 바와 같이 HT22 세포에서 글루탐산염 매개 조기 세포 사멸을 약화시켰음을 입증하였다.

웨스턴 블롯(western blot) 분석에서 4mM 글루탐산염 처리 후 감소된 항아폽토시스(antiapoptotic) 단백질 Bcl-2의 수준은 5 및 10μM의 MLG처리 후 회복되었다(도 3B).

한편, DNA 복구를 방지하여 세포 사멸을 촉진하는 AIF의 상승과 폴리 (ADP-리보스) 중합 효소 (PARP)의 절단은 용량 의존적으로 MLG에 의해 억제되었다. IF-1 수준은 MLG를 처리하거나 처리하지 않은 세포에서 유의하게 다르지 않았다.

4) MLG에 의한 글루탐산염 유도 세포 내 ROS 생성 및 미토콘드리아 기능 장애 예방

산화적 스트레스는 신경 세포 사멸의 주요 요인이기 때문에, ROS를 예방하는 것은 AD치료를 위한 전략이 될 수 있다. MitoSOXTM Red 염색을 통해 유세포 분석을 사용하여 미토콘드리아의 ROS를 조사하였다.

도 4A는 미토콘드리아의 ROS 수준은 글루탐산염으로 처리되지 않은 대조군보다 글루탐산염으로 처리된 HT22 세포에서 유의하게 향상되었음을 보여준다. 결과는 MLG가 글루탐산염 처리 후 증가된 세포 내 ROS의 축적을 현저히 억제함을 보여주었다(도 4A).

세포 사멸 유도 미토콘드리아 기능 장애는 미토콘드리아 막 전위 감소 (MMP; ΔΨm)에 의해 입증되었다. MMP를 결정하기 위해, 세포를 MLG로 처리하고, 테트라메틸로다민 메틸 에스테르 과염소산염(tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate) (TMRM)으로 염색한 후, 유세포 분석을 사용하여 분석하였다. 글루탐산염 처리된 세포는 24시간 후에 상당한 막 전위 탈분극을 나타냈다(도 4B).

MLG가 시간 및 용량 의존적 방식으로 글루탐산염에 의한 MMP의 파괴를 방지한다는 결과를 보여주었다. 또한, 글루탐산염(glutamate) 처리 하에서 MLG를 처리하거나 처리하지 않은 세포를 JC-1 염색하여 유세포 분석법으로 MMP의 붕괴 여부를 조사하였다 (도 4C).

글루탐산염으로 처리된 세포는 대조군보다 MMP가 더 급격하게 감소하였다.

JC-1은 정상 세포의 미토콘드리아에 적색 형광으로 응집체를 형성하고 세포 사멸 세포의 세포질에서 녹색 형광 단량체의 형태로 잔유물(remains)을 형성하며, 후자는 MMP의 감소를 나타낸다. 도 4C에서 볼 수 있듯이, MLG는 미토콘드리아 적색 / 녹색 형광 강도 비율을 크게 개선하여, MLG가 글루탐산염에 의한 미토콘드리아 기능 장애를 예방했음을 나타낸다.

5) 글루탐산염 유도 세포 사멸 관련 단백질의 억제 및 MLG에 의한 MAPK 활성화

MAPK 활성화는 세포 생존과 죽음의 조절에서 중요한 역할을 한다. MAPK 인산화의 억제는 글루탐산염 유도 신경 세포 사멸에 대한 보호 메커니즘이 될 수 있다. 추가적으로, 세포 내 ROS 생성을 방지하는 것은 MAPK의 인산화와 세포 사멸을 억제하는 것으로 보고되어, AD에서 MAPK의 ROS 매개 인산화가 관여 함을 시사한다. 따라서 인산화된 ERK, JNK 및 p38 캐스케이드를 조사하여 MLG가 MAPK 활성화에 미치는 영향을 추가로 평가했다.

HT22 세포를 글루탐산염으로 처리하면 인산화된 MAPK 캐스케이드가 유의하게 유도되었다. 대조적으로 MLG는 글루탐산염에 의해 유도된 MAPK의 인산화를 억제하였다 (도 5). 이러한 결과는 MAPK의 인산화 억제가 HT22 세포에서 글루탐산염 유도 세포 사멸에서 MLG 매개 신경보호 효과의 기본 분자 메커니즘이라는 것을 시사하였다.

6) HO-1유도를 통한 MLG에 의한 HT22 세포의 글루탐산염 유도 세포 독성에 대한 보호

MLG의 항산화 효과를 조사하기 위해, 산화된 거대 분자의 제거에 핵심적인 역할을 하는 HO-1과 GST의 mRNA 수준을 평가하였다. HO-1의 mRNA 수준은 용량 의존적으로 눈에 띄게 증가한 반면, GST의 mRNA 수준은 크게 증가하지 않았다 (도 6A).

이전 연구는 HO-1이 세포 사멸 모델에서 잠재적인 신경보호 효과에 대해 상당한 관심을 받고 있다고 보고하였다. 본 연구에서 MLG의 처리는 HT22 세포에서 HO-1 발현을 서서히 증가시켰다. HO-1 억제제인 SnPP를 사용하여 HO-1이 HT22 세포에서 글루탐산염 유도 세포 독성에 관여하는지 조사하였다. 도 6A 및 B에 나타난 바와 같이, MLG 및 SnPP와의 병용 처리는 MLG 단독 처리에 비해 HT22 세포의 생존력을 감소 시켰으며, 이는 글루탐산염 유도 세포 독성에 대한 MLG 매개 세포보호 효과에 HO-1이 관여함을 나타낸다.

본 발명에서 싸리(L. bicolor)에서 얻은 이소플라보노이드(isoflavonoids)가 HT22 해마 세포에 미치는 신경보호 효과를 조사하였다.

모든 화합물 중, 프테로카르판(pterocarpans)의 일부를 갖는 MLG는 낮은 농도에서도 HT22 세포에 대한 보호 효과를 효과적으로 나타내었다(도 2B). 현미경 분석에서 밝혀진 바와 같이 MLG는 글루탐산염에 의해 유도된 형태학적 교번과 세포 사멸을 상당히 회복시켰다(도 2C).

글루탐산염은 세포내 ROS와 미토콘드리아 기능 장애를 증가시켰고, 이는 신경세포에서 AIF 의존적 세포사멸을 초래한다.

글루탐산염 유도 HT22 세포 사멸은 산화적 스트레스 유발 프로그램 세포 사멸의 전형적인 특징을 가지고 있기 때문에, 아넥신 V/PI(annexin V/PI) 염색을 사용하여 시간 경과 실험에서 관련 세포 사멸 메커니즘을 조사하였다.

그 결과 MLG가 글루탐산염으로 유도된 세포 사멸을 현저하게 예방하는 것으로 나타났다(도 3A). 본질적인 세포 사멸 경로는 미토콘드리아 의존적이며, 흥분 독성 및 산화적 스트레스와 같은 다양한 스트레스 조건에 반응한다. 따라서, 미토콘드리아는 세포 사멸 조절에 중요한 역할을 한다.

형태학적 변화 및 세포 사멸 진행에 따라 글루탐산염으로 처리된 HT22 세포에서 낮은 MMP가 관찰되었다. 그러나 MLG는 시간 및 용량 의존적 방식으로 글루탐산염에 의한 MMP의 붕괴를 방지하였다(도 4B).

또한 Bcl-2, PARP, AIF, IF 및 MAPK의 발현 수준은 카스파제(caspase) 조절이 글루탐산염 유도 세포 자멸사에 관여하는지 여부를 연구하기 위해 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정되었다.

MLG 처리는 antiapoptotic protein Bcl-2 수준의 증가와 세포 사멸을 촉진하는 절단된 PARP 및 AIF 수준의 감소를 가져왔다(도 3B). 또한, pp38, pERK 및 pJNK를 포함한 MAPK의 글루탐산염 유도 인산화는 MLG로 전처리함으로써 현저하게 감소하였다. 이전 연구에서는 ROS 생성이 MMP의 붕괴를 초래한 초기 미토콘드리아 막 과분극을 통해 세포 사멸을 유발할 수 있다고 보고하였다.

글루탐산염 유도 산화적 스트레스에 대한 MLG의 효과를 평가하기 위해 MitoSOXTM Red 염색과 유세포 분석을 사용하여 세포 내 ROS를 측정하였다. (도 4A). MLG는 글루탐산염 처리에 의해 증가된 세포 내 ROS의 축적을 현저하게 억제 하였다; 따라서 MLG는 ROS 및 카파아제(caspase) 의존 경로를 조절하여 글루탐산염 처리 HT22 세포에서 본질적인 미토콘드리아 세포 사멸을 예방하였다.

미토콘드리아 세포 사멸은 JC-1 분석에 의해 평가되었다 (도 4C). JC-1은 정상 세포의 미토콘드리아에서 적색 형광으로 응집체를 형성하고 세포 사멸 세포의 세포질에 녹색 형광 모노머 형태로 남아 있으며, 후자는 MMP의 감소를 나타낸다. 예상대로 MLG는 미토콘드리아 적색/녹색 형광 강도비를 크게 회복하였다.

HO-1은 ROS 생성 감소를 통해 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 하는 주요 항산화 효소이다. 천연물에서 분리된 여러 식물 화학 물질에 의한 HO-1의 유도는 효과적인 신경 보호 전략으로 널리 인식되어 왔기 때문에, 약리학적 조절자에 의한 HO-1 발현은 치료적 개입에 유용한 표적이 될 수 있다. 본 발명에서, MLG 처리는 HT22 세포에서 HO-1의 발현을 점진적으로 증가시켰다. 또한, MLG와 SnPP의 공동 처리는 HT22 세포의 생존력을 감소시켰고, 이는 MLG의 세포 보호 효과가 HO-1 발현의 유도 때문일 수 있음을 보여준다.

종합하여, 본 발명은 HT22 세포에서 글루탐산염 유도 세포 자멸에서 MLG 유도 신경 보호를 위한 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다. MLG가 ROS 축적을 제거하여 글루탐산염 유도세포 사멸을 억제한다는 것을 입증하였다. 또한, 글루탐산염 처리 세포에서 MLG의 세포 보호 효과는 HO-1 유도 및 MARK 활성의 감소를 동반하였다. ROS 과잉 생산이 신경 질환의 발달에 기여하는 요인으로 점점 더 중요해짐에 따라, MLG는 신경 퇴행성 질환을 치료하는 유망한 천연 물질로 작용할 수 있다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

하기 화학식 1 내지 화학식 6 중에서 선택된 화학식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 조성되는 염을 유효 성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]
제1 항에 있어서,
상기 화합물은 싸리(Lespedeza bicolor Turcz.) 추출물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2 항에 있어서,
상기 추출물은 싸리의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3 항에 있어서,
상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3 항에 있어서,
상기 비극성용매 가용 추출물은 메틸렌클로라이드, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 화합물은 신경세포에서 산화적 스트레스 또는 세포 사멸을 유발하는 글루탐산염(glutamate)의 신경독성을 억제하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 화합물은 신경세포 내에서 산화적 스트레스에 의한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 축적을 완화하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 화합물은 미토콘드리아의 막전위(mitochondrial membrane potential, MMP, ΔΨm) 붕괴를 조절하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 화합물은 MAPK(mitogen-activated protein kinases)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 화합물은 신경세포 내에서 HO-1(heme oxygenase 1)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1 내지 화학식 6 중에서 선택된 화학식으로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 조성되는 염을 유효 성분으로 포함하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]
제11 항에 있어서,
상기 화합물은 싸리(Lespedeza bicolor Turcz.) 추출물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제12 항에 있어서,
상기 추출물은 싸리의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제13 항에 있어서,
상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제13 항에 있어서,
상기 비극성용매 가용 추출물은 메틸렌클로라이드, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제11 항에 있어서,
상기 화합물은 신경세포에서 산화적 스트레스 또는 세포 사멸을 유발하는 글루탐산염(glutamate)의 신경독성을 억제하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제11 항에 있어서,
상기 화합물은 신경세포 내에서 산화적 스트레스에 의한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 축적을 완화하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제11 항에 있어서,
상기 화합물은 미토콘드리아의 막전위(mitochondrial membrane potential, MMP, ΔΨm) 붕괴를 조절하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제11 항에 있어서,
상기 화합물은 MAPK(mitogen-activated protein kinases)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제11 항에 있어서,
상기 화합물은 신경세포 내에서 HO-1(heme oxygenase 1)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.