KR102189490B1

KR102189490B1 - 라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그의 에테르 유도체-함유 지질나노물질의 바이러스 감염 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102189490B1
Application number: KR1020200117642A
Authority: KR
Inventors: 정재준; 서보승
Original assignee: 주식회사 아리바이오
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-09-14
Publication date: 2020-12-11

Abstract

본 발명에서는 아데노신 2a 수용체 (A2aAR) 및 아데노신 2b 수용체 (A2bAR) 결합하는 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 함유 지질나노물질의 세포 내 환형 아데노신 모노인산(cAMP: Cyclic adenosine monophosphate)의 신호전달을 향상시키며, 사이토카인 감소 및 호중구 축적 억제작용을 수행하고, 바이러스 및 외부 감염원으로부터 바이러스 감염증 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

Description

라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그의 에테르 유도체-함유 지질나노물질의 바이러스 감염 질환 치료용 조성물{A composition for treating virus infection disease comprising lysophosphatidylcholine or a derivative nano formulation thereof}

본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 함유하는 지질나노물질의 폐렴, 급성호흡기증후군 등과 같은 바이러스 감염 질환 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC)은 내재성 지질의 일종으로 G 단백연결 수용체 (G-protein coupled receptor, GPCR)의 일종인 G2A 의존적으로 항패혈증 작용이 있음이 알려져 있다 (Yan 등, 2004).

보다 구체적으로 라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC)은 산화 저밀도 지단백질의 주요구성 성분으로, 단핵구, 탐식세포 및 중성호성 백혈구를 포함한 다양한 면역 담당 세포를 활성화시켜 패혈증에 비교적 유용한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 복막염 동물모델과 맹장 결찰 및 천공 (Cecal Ligation and Puncture, CLP) 동물모델에서 LPC 투여에 의하여 복막염에 기인한 사망률이 유의하게 억제되며, 선천성 면역증강 작용에 의하여 복막염, 페렴, 골수염, 봉소염, 골수염 등을 비롯한 다양한 바이러스성, 세균성 감염질환 치료에 효과가 있음이 알려져 있다(한국등록특허 제10-0842160호, 한국등록특허 제10-0849448호). 또한, 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC)는 급성 호흡곤란 증후군 및 다발성 장기부전의 치료제로서 사용될 수 있음이 알려져 있다 (한국등록특허 제10-0842159호).

그러나, 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 화합물은 수상 매질 (aqueous phase)에 대한 용해도가 매우 낮아 멸균수, 주사용수, 탈이온수 및 완충용매와 같은 의약품 제조용 수상에 용해하여 투여 시 체내이용률이 낮거나, LPC 화합물이 가용화된 제제라 할지라도 체내 투여 직후 체액 및 조직에서 석출되는 등 안정한 약제학적 제제의 개발에 한계가 있었다. 또한, LPC 화합물은 적혈구의 용혈 및 응집을 유도하고 (Tanaka Y. et al., J Biochem. 94(3):833-40(1983)), 동물실험에서 피하투여 시 현저한 LPC 자체의 국소 자극성이 나타나 (Ryborg AK, et al., Acta Derm Venereol.80(4):242-6(2000)), 이를 극복하기 위한 새로운 제형의 개발이 요구된다.

본 발명자들은 라이소포스파티딜콜린이 나타내는 낮은 용해도 문제, 국소 자극성 문제 및 적혈구 용혈과 응집현상 문제를 해소하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 라이소포스파티딜콜린을 지질나노물질 형태로 제형화하고, 상기 지질나노물질 제형이 국소 자극성을 나타내지 않음을 동물실험을 통하여 확인하였으며, 라이소파티딜콜린의 적혈구 용혈 및 응집현상을 현저히 개선시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다 (한국등록특허 제10-1951933호).

다만, 현재까지 라이소포스파티딜콜린 지질나노물질 형태로 바이러스로 인한 감염증의 치료에 대한 연구를 진행한 바가 없을뿐 아니라, 라이소포스파티딜콜린 (LPC, 18:0) 에 대한 항 바이러스 효과에 대한 연구도 미미한 편이다.

대한민국 등록특허 제10-0842160호 대한민국 등록특허 제10-0849448호 대한민국 등록특허 제10-0842159호 대한민국 등록특허 제10-1951933호

본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그 유도체(derivatives)의 바이러스 감염증 치료제로서의 작용 기전에서 LPC가 G2A와 함께 아데노신 2B 수용체에도 의존한다는 것과 G2A와 아데노신 2B 수용체가 상호 작용을 통해 신호전달에 대한 상승효과를 가지며, 바이러스 감염증 치료에 있어 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 함유 지질나노물질이 기존의 라이소포스파티딜콜린보다 상승효과를 가지며, 바이러스 감염증 치료에 있어 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 함유 지질나노물질이 기존의 라이소포스파티딜콜린보다 상승효과를 가진다는 것을 이용한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 G2A 수용체에 결합하는 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine: LPC) 또는 그 유도체 (derivatives); 및 아데노신 A2B 수용체 또는 그 작용제;를 포함하는 지질 나노물질인 것을 특징으로 한다.

다른 일례로, 본 발명에 따른 조성물은 G2A 수용체 또는 그 작용제; 및 아데노신 A2B 수용체 또는 그 작용제;를 포함하는 지질 나노물질인 것을 포함하며, 세포 내 환형 아데노신 모노인 (cyclic adenosine monophosphate: cAMP)의 신호전달을 향상시키고, 아데노신 2a 수용체 (A2aAR) 및 아데노신 2b 수용체 (A2bAR) 의존적인 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그 유도체(derivatives)를 함유하는 지질나노물질의 선택적 chemotaxis 조절을 이용한 바이러스 감염증 치료 및 예방 용도인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 활성성분으로서 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그의 에테르 유도체를 포함하는 지질 나노물질인 것을 포함한다. 상기 라이소포스파티딜콜린 또는 유도체를 포함하는 지질 나노물질은 패혈증, 세균성 감염 질환 (예컨대, 복막염, 폐렴), 급성호흡곤란 증후군 및 다발성 장기부전 등의 질병 (질환)에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

또한, 본 발명의 상기 라이소포스파티딜콜린 또는 유도체를 포함하는 지질 나노물질은 바이러스 감염증에 예방 및 치료에 효과가 있다는 것을 확인하였다. 여기서 바이러스 감염증은 사스 코로나 바이러스, 메르스 코로나 바이러스 및 신종 코로나 바이러스로 이루어지는 군 중에서 어느 하나의 바이러스에 의해 유발된 것을 예시할 수 있다.

이러한 바이러스 감염증은

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 라이소포스파티딜콜린 함유 지질나노물질은 (a) 중간 사슬 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴을 포함하는 지질구조물; 및 (b) 약제학적 활성성분으로서 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그의 에테르 유도체를 포함하며, 상기 중간사슬 트리글리세라이드:오일:레시틴의 중량비는 1:0.5-3:2-10 인 것을 특징으로 하는 지질나노물질로서, 상기 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그의 에테르 유도체와 지질구조물의 중량비는 1:1-50인 것을 특징으로 하는 지질나노물질로서, 상기 지질나노물질은 1-1000 nm 크기를 갖는 나노입자인 것을 특징으로 하는 지질나노물질로서, 상기 지질나노물질은 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그의 에테르 유도체를 수상 용매, 중간 사슬 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴과 혼합하여 상기 중간 사슬 트리글리세라이드:오일:레시틴의 중량비가 1:0.5-3:2-10 인 것을 특징으로 하는 지질 혼합물이다.

여기서, 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC)은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R1은 C4-30의 알킬이거나, 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C4-30의 알케닐인 것을 예시할 수 있다.

상기 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC)의 에테르 유도체는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서, R2는 C4-30의 알킬이거나, 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C4-30의 알케닐인 것을 예시할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화 될 수 있다. 경구 투여용 제형으로는, 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제(elixir) 등이 있으며, 이들 제형은 상기 유효성분 외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 제제는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사제, 정맥주사제, 근육 내 주사제 또는 흉부 내 주사제를 주입하는 방법, 또는 경피 흡수제에 의해 경피 투여하는 방법을 포함한다. 이때, 주사제로 제제화하기 위해서는 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체 함유 지질나노물질을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

본 발명은 라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그 유도체(derivatives)를 포함하는 지질 나노물질의 바이러스 감염 치료제로서의 작용 기전에서 LPC가 G2A와 함께 아데노신 2B 수용체에도 의존한다는 것과 G2A와 아데노신 2B 수용체가 상호 작용을 통해 신호전달에 대한 상승 효과와, 바이러스 감염증 치료에 있어 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC) 함유 지질나노물질이 기존의 라이소포스파티딜콜린보다 상승효과를 가진다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

도 1a는 마우스의 복강 내로 thioglycollate를 주사하여 분리한 염증성 활성화 복강 대식세포에 LPS를 처리한 후 G2A와 아데노신 A2B 수용체 (A2bAR)에 대한 mRNA 발현이 증가함을 확인한 실험예 1의 결과를 나타낸 것이다.
도 1b은 HEK-293 세포주 (human embryonic kidney cell line)에서 G2A, 아데노신 A2B 수용체, G2A + 아데노신 A2B 수용체, 그리고 cAMP luciferase reporter construct를 과 발현 시킨 다음, G2A와 아데노신 2B 수용체 사이에 세포 내 cAMP 신호전달에 있어서 상승작용 (synergistic action)이 있음을 확인한 실험예 2의 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 Cos-7 세포주 (fibroblast-like cell lines derived from monkey kidney tissue)에서 N-terminal fragment of venus (VN)가 표지된 G2A와 C-terminal fragment of venus (VC)가 표지된 아데노신 2B 수용체를 과 발현 시켜서 G2A와 아데노신 2B 수용체가 직접적인 물리적 상호작용 (co-localization)이 있음을 확인한 실험예 4의 결과를 나타낸 것이다.
도 2에서 G2A+/+과 G2A-/- 마우스로부터 분리한 쿠퍼세포(간대식세포)에 LPS을 처리한 후 아데노신 2B 수용체 특이적 작용제인 BAY 60-6583를 처리하여 BAY 60-6583에 의한 cAMP의 증가작용이 아데노신 2B 수용체 뿐만 아니라 G2A에도 의존적임을 확인한 실험예 4의 결과를 나타낸 것이다.
도 3에서 Wild Type, G2A-/-, A1AR-/-, A2aAR-/-, A2bAR-/-, A3AR-/- 마우스에서 맹장 결찰과 천자 (cecal ligation and puncture: CLP)로 감염성 질환을 유발하여 LPC (18:0)의 감염성 질환 치료효과를 검증한 실험에서 LPC (18:0)의 감염성 질환 치료효과가 G2A와 아데노신 2B 수용체 (A2bAR) 의존적임을 확인한 실험예 5의 결과를 나타낸 것이다.
도 4에서 ICR 마우스에 맹장 결찰과 천자 (CLP) 처치 전에 꼬리 정맥을 통해 간대식세포 (Kupffer cell)의 억제제인 GdCl3 (gadolinium(III) chloride)를 주입하고 맹장 결찰과 천자 (CLP)로 복막염으로 유발시켜서 LPC (18:0)의 감염성 질환 치료효과가 손상되지 않은 간대식세포 의존적임을 확인한 실험예 6의 결과를 나타낸 것이다.
도 5에서 ICR 마우스에 맹장 결찰과 천자 (CLP)로 복막염으로 유발시켜서 자이그리스, LPC (18:0), LPC 함유 지질나노물질을 처리하여 자이그리스, LPC 처리군에 비하여 LPC 함유 지질나노물질처리군이 생존율이 뛰어남을 확인한 실험예 7의 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6c는 Vero cell에 SARS-CoV2를 감염시키고 LPC 함유 지질나노물질을 처리 후, 플라크 감소(Plaque reduction assay) 시험을 통한 SARS-CoV2 치료효과에 대한 실험예 8의 실험 방법 및 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 Vero cell에 Murine corona virus (MHV-A59 strain, MHV-2 strain)을 각각 감염시키고 LPC 함유 지질나노물질을 처리 후, 플라크 감소(Plaque reduction assay) 시험을 통한 코로나바이러스 치료효과에 대한 실험 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 판례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

[실험예 1]

Thioglycollate 유도 염증성 활성화 복강 대식세포에 G2A와 A2bAR의 mRNA 발현량 확인 실험.

마우스의 복강 내로 2 ml의 3% thioglycollate를 주사하고 4일째에 염증성 활성화 복강 대식세포를 분리하였다. 분리한 염증성 활성화 복강 대식세포에 LPS (1 μg/ml)를 5시간 동안 처리한 후 G2A와 A2bAR에 대한 mRNA 발현변화를 real-time quantitative RT-PCR로 확인하였다.

도 1a에 나타난 바와 같이, 염증성 활성화 복강 대식세포에서 G2A와 A2bAR의 mRNA 발현량이 각각 3.5배와 127배 증가하였다 (**P<0.01).

[실험예 2]

G2A와 아데노신 A2B 수용체 사이에 세포내 cAMP 신호전달에 있어서 상승작용 (synergistic action) 확인 실험.

HEK-293 세포에 G2A, 아데노신 A2B 수용체, G2A + 아데노신 A2B 수용체, 그리고 cAMP luciferase reporter construct를 transfection 시킨 다음, 세포내 cAMP 신호전달 정도를 luminescence로 측정하였다.

도 1b에 나타난 바와 같이, G2A와 아데노신 A2B 수용체 사이에 상승작용(synergistic action)이 있음을 관찰하였다 (**P<0.01, ***P<0.001).

[실험예 3]

G2A와 아데노신 2b 수용체 사이에 물리적 상호작용 (co-localization) 확인 실험.

G2A와 아데노신 2b 수용체 사이에 물리적인 상호작용이 존재하는지 (co-localization)를 확인하기 위하여, N-terminal fragment of venus (VN)가 표지된 G2A와 C-terminal fragment of venus (VC)가 표지된 아데노신 2b 수용체을 pcDNA3.1 vector (Invitrogen)에 cloning하여 Cos-7 세포 (fibroblast-like cell lines derived from monkey kidney tissue)에 transfection 시켜서 G2A와 아데노신 2b 수용체 사이에 물리적인 상호작용 (co-localization)에 대한 bimolecular fluorescence complementation (BiFC) 신호를 Varioskan™ LUX multimode microplate reader (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 500/535 nm (excitation/emission) 필터로 측정하였다.

도 1c에 나타난 바와 같이, BiFC 신호 (노란색점)를 보임으로써, G2A와 아데노신 2b 수용체 사이에 직접적인 물리적 상호작용이 있음을 확인하였다.

[실험예 4]

G2A+/+과 G2A-/- 마우스로부터 분리한 간대식세포에서 G2A와 아데노신 2b 수용체수용체의 상호작용 실험.

G2A+/+과 G2A-/- 마우스로부터 분리한 대식세포에 LPS (1 μg/ml)을 24 시간 동안 처리한 후 아데노신 2b 수용체 특이적 작용제인 BAY 60-6583 (1 μM)을 10분 동안 처리한 후, 세포 내 cAMP 활성을 측정하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 아데노신 2b 수용체 특이적 작용제인 BAY 60-6583은 G2A+/+ 마우스에서 분리된 대식세포에서 세포 내 cAMP 활성을 현저히 증가 시켰으나 G2A-/- 마우스에서는 세포 내 cAMP 활성을 증가 시키지 못하였다 (**P<0.01). 이는 대식세포에서도 아데노신 2b 수용체 자극에 의한 cAMP 신호전달에 있어서, G2A와 아데노신 2b 수용체의 밀접한 상호작용이 있음을 나타낸다.

[실험예 5]

LPC (18:0)의 항패혈증 효과가 아데노신 2B 수용체에 의존적인지 여부에 대한 실험.

Wild type, G2A-/-, A1AR-/-, A2aAR-/-, A2bAR-/-, A3AR-/- 마우스에서 맹장 결찰과 천자 (cecal ligation and puncture: CLP)로 감염성 질환을 유발시킨 다음, 2시간부터 LPC(18:0)를 10 mg/kg의 용량으로 피하주사로 12시간 간격으로 4회 투여하여 LPC(18:0)의 감염성 질환 치료효과를 확인하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, Wild-Type 마우스에서 10일 까지 60%의 생존율을 보인 것과 대조적으로 G2A-/- 마우스에서는 LPC (18:0)의 감염성 질환 치료효과가 소실되었다. A1AR-/-, A3AR-/- 마우스에서는 생존율의 변화가 거의 없었으며, A2aAR-/- 마우스에서는 4일 이후에도 생존율 40%를 보였다. 그러나 A2bAR-/- 마우스의 경우 LPC (18:0) 투여 후 2일 후에 생존율일 20% 이하를 보였고 10일까지의 생존율도 10% 미만을 보였다 (*P<0.05, **P<0.01). 이는 맹장 결찰과 천자 유도 (CLP) 감염성 질환 마우스에 대한 LPC (18:0)의 보호 효과가 A2bAR 의존적이고 A1AR, A2aAR 및 A3AR에 의존적이지 않음을 보여주는 결과이다.

[실험예 6]

맹장 결찰과 천자 (CLP) 패혈증 마우스에서 LPC (18:0)의 감염질환 치료효과가 손상되지 않은 간대식세포 (Kupffer cell) 의존적인지 여부에 대한 실험.

ICR 마우스에 맹장 결찰과 천자 (CLP) 처치 24 시간 전에 꼬리 정맥을 통해 간대식세포 (Kupffer cell)의 억제제인 GdCl3 (20 mg/kg)을 주입하였다. GdCl3 주입 24 시간 후에 CLP로 복막염으로 인한 감염질환을 유발시킨 다음, 2시간 부터 LPC (18:0)를 10 mg/kg의 용량으로 피하주사로 12시간 간격으로 4회 투여하여 LPC (18:0)의 감염성 질환 치료효과를 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 간대식세포 (Kupffer cell)의 억제제인 GdCl3 처리군 모두에서 생존율이 5일 이후에 40%로 감소하는 결과를 보였다. 특히 LPC (18:0)을 투여한 실험군에서도 동일한 결과를 보였다 (*P<0.05). 이는 맹장 결찰과 천자 (CLP) 감염질환 마우스에 대한 LPC(18:0)의 보호 효과가 손상되지 않은 간대식세포 (Kupffer cell)에 의존적임을 보여주는 결과이다.

실험예 1 내지 6의 결과는, LPC (18:0)이 G2A와 아데노신 아데노신 2B 수용체가 상호작용을 통하여, 감염성 질환 치료작용을 유발한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 세포내 cAMP 신호전달에 있어서 G2A와 아데노신 A2B 수용체가 상승작용을 한다는 것을 확인하였는 바, 이러한 G2A와 아데노신 A2B 수용체의 상호작용을 이용하여 G2A/A2BAR (아데노신 2B 수용체)의 특이적인 작용제 리간드의 신규한 치료학적 용도로 활용할 수 있다.

[실시예 1]LPC를 포함하는 지질나노물질 제조

라이소포스파티딜콜린(LPC 18:0, NOF) 5.00g, 에그 레시틴(Lipoid E-80) 15.00g, 대두유 5.00g, 수크로오스 50.00g, EDTA2Na2H₂O 27.5 mg 및 중간 사슬 트리글리세라이드(Miglyol 812) 5.00g에 정제수를 투입하여 총 중량 500g으로 만들었다. 20-25℃로 유지하면서 호모게나이저(L5M-A, Silverson)로 5000 rpm에서 3시간 동안 혼합된 용액을 균질화 하였다. 위 과정을 두 번 수행하여 균질화한 용액 1,000g을 0.1N 수산화나트륨 용액 또는 0.1N 염산 용액을 사용하여 pH 5.5로 조절하였다. pH 조절 후 30분간 더 균질화한 후 다시 한 번 pH를 5.5로 조절하였다. pH 조절을 한 용액을 10℃ 이하에서 냉장 보관하였다. 상기와 같은 과정을 8회 반복하여 pH 5.5로 조절된 용액 8,000g을 제조하였다.

상기 라이소포스파티딜콜린 화합물을 포함하는 지질혼합물 용액을 마이크로플루다이져(M-110EH-30, MFIC Corp.)를 이용하여 25,000 psi의 압력으로 균질화 하여 에멀젼화 하였다. 이러한 균질화 과정을 5회 반복한 다음 0.2 ㎛ 막에 여과하여 라이소포스파티딜콜린 화합물을 포함하는 액체 상태의 지질나노입자를 제조하였다.

[실험예 7]

맹장 결찰과 천자 (CLP) 감염성 질환 마우스에서 자이그리스, LPC (18:0), LPC 함유 지질나노물질의 감염질환 치료효과에 대한 비교실험.

ICR 마우스에서 맹장 결찰과 천자 (cecal ligation and puncture: CLP)로 감염성 질환을 유발시킨 다음 6시간후에 자이그리스는 2mg/kg, LPC (18:0)는 10 mg/kg, 실시예 1의 LPC 함유 지질나노물질은 1mg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg의 용량으로 정맥내주사로 1회 투여한 후, LPC (18:0)의 감염성 질환 치료효과를 비교하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 10일 동안의 생존율을 비교한 결과 자이그리스 2 mg/kg 투여군과 LPC 10mg/kg 투여군에서는 생존율 0%되는 시점은 CLP 처치 후 5일이 소요되나, LPC 함유 지질나노물질 투여군에서는 자이그리스, LPC 보다 탁월한 생존율을 나타내었다. LPC 함유 지질나노물질 5 mg/kg과 10 mg/kg 투여 군에서 CLP 처치 후 5일째 생존율이 각각 10%와 50%이었고, 특히 10 mg/kg 투여군은 7일째까지 생존율이 40%가 유지되었다.

[실험예 8]

Vero cell에 SARS-CoV2를 감염시키고 LPC 처리 후, 플라크 감소(Plaque reduction assay) 시험을 통한 SARS-CoV2 치료효과에 대한 실험.

1) Vero cell을 배양 한 후, 전체처리 방법으로는 도 6a에 도시된 바와 같이 SARS-CoV2로 감염을 시키기 2시간 전에 LPC 함유 지질나노물질을 20배, 100배로 희석하여 처리하고 SARS-CoV2를 감염시키고 플라크를 형성시키기 위하여 아가로스 오버레이를 시킨다. 72시간 후에 고정을 시키고 염색하여 플라크 형성을 계수하였다.

도 6b에 나타난 바와 같이, LPC 함유 지질나노물질 20배 희석하여 처리한 군에서는 세포독성이 나타나는 것으로 확인이 되었고, LPC 함유 지질나노물질 100배 희석하여 처리한 군에서는 플라크가 전혀 생기지 않는 것으로 보아, SARS-CoV2를 사멸시키는 것으로 나타났다.

2) 중간처리방법으로는 도 6a에 도시된 바와 같이 SARS-CoV2를 감염시키면서 동시에 LPC 함유 지질나노물질 20배, 100배 희석하여 처리하고 1시간 후에 결과를 보니, 도 6c에 나타난 바와 같이 LPC 함유 지질나노물질 20배, 100배 희석한 처리군에서 모두 플라크 형성을 80%, 65% 가량 억제하는 것으로 나타났다.

[실험예 9]

Vero cell에 Murine corona virus (MHV-A59 strain, MHV-2 strain)을 각각 감염시키고 LPC 함유 지질나노물질을 처리 후, 플라크 감소(Plaque reduction assay) 시험을 통한 코로나바이러스 치료효과에 대한 실험.

1) Vero cell을 배양 한 후, 전체처리 방법으로 도 6a에 도시된 바와 같이 Murine corona virus(MHV-A59 strain, MHV-2 strain)로 감염을 시키기 2시간 전에 LPC 함유 지질나노물질을 20배, 100배로 희석하여 처리하고, MHV-A59 strain(도 7a 참조) 및 MHV-2 strain(도 7b 참조)으로 감염시키고 플라크를 형성시키기 위하여 아가로스 오버레이를 시킨다. 72시간 후에 고정을 시키고 염색하여 플라크 형성을 계수하였다.

도 7a와 도 7b에 나타난 바와 같이, LPC 함유 지질나노물질을 50배, 100배 희석하여 처리한 군(LPC 1/50, LPC 1/100)에서는 플라크가 현저히 감소되고, 플라크의 사이즈가 줄어드는 것으로 보아, 코로나 바이러스를 사멸시키는 것으로 나타났다.

이상에서 설명된 본 발명은 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

바이러스 감염증 예방 및 치료용 조성물에 있어서,
라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC) 또는 그 유도체(derivatives)를 함유하는 지질나노물질을 포함하되,
상기 바이러스 감염증은 사스 코로나 바이러스, 메르스 코로나 바이러스 및 신종 코로나 바이러스로 이루어지는 군 중에서 어느 하나의 바이러스에 의해 유발된 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 바이러스 감염증은 급성호흡기 질환인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 및 치료용 조성물.
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