KR102186218B1 - 에리트로페론 및 erfe 폴리펩티드 및 철 대사의 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 명세서에서는 개체에서 헵시딘의 양을 조절할 수 있는 폴리펩티드가 개시된다. 또한 철 대사의 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.

Description

에리트로페론 및 ERFE 폴리펩티드 및 철 대사의 조절 방법{ERYTHROFERRONE AND ERFE POLYPEPTIDES AND METHODS OF REGULATING IRON METABOLISM}

EFS-WEB을 통해 제출된 서열 목록에 대한 참조

14.3 kb 크기의 ASCII 텍스트 파일로 된 "20131031_034044_119WO1_seq_ST25"라는 제목의 서열 목록의 내용은 2013년 10월 28일에 생성되었으며 본 명세서와 함께 EFS-Web을 통해 전자서면 제출되었고, 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.

정부 지원의 인정

본 발명은 미 국립보건원 산하 국립 당뇨 소화기 신장 질환 연구소(The National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, NIDDK)에서 제공하는 승인 번호 제R01 DK 082717호 및 제RO1 DK 065029호의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부가 본 발명의 특정 권리를 갖는다.

발명의 배경

1. 기술 분야

본 발명은 철 대사를 조절하는 폴리펩티드 및 이를 제조하고 이용하는 방법에 관련된 것이다.

2. 관련 기술의 설명

적혈구 생산은 현재까지 신체의 가장 주된 철 소비방식이다. 적혈구 생산의 요구에 반응하여 철을 조절하는 호르몬의 존재는 누구보다도 Finch 등에 의해 적어도 50년 전에 제안되었다. Finch 1994를 참조한다. 불행히도, Finch 및 다른 이들은 그런 호르몬을 끝내 발견하지 못했다.

지중해성 빈혈(thalassemia)에서 철 흡수 증가의 원인을 조사했던 다른 연구자들이 상기 질환에서 두 개의 물질, GDF15 및 TWSG1이 헵시딘 억제와 철분 과다를 일으킬 수 있다고 제안했으나, 이것이 철 흡수의 생리학적 신호는 아니라고 결론내렸다. Tanno 2010b 및 Casanovas 2013을 참조한다. 지중해성 빈혈의 철분 과다에서 GDF15 또는 TWSG1의 역할은 구체적으로 밝혀진 바 없다.

발명의 요약

일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:16에 대해 약 95-100%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 가지는 C-말단 서열을 포함하는 단리된, 정제된, 합성, 및/또는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:17에 대해 약 70-100%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지는 N-말단 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:16에 대해 약 95-100%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 가지는 C-말단 서열 및 서열 번호:17에 대해 약 70-100%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지는 N-말단 서열로 본질적으로 구성되거나 이들로 구성되는 단리된, 정제된, 합성, 및/또는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1 또는 서열 번호:2에 대해 약 70 내지 100%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지는 단리된, 정제된, 합성, 및/또는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성되는 단리된, 정제된, 합성, 및/또는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이고: 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13, 서열 번호:14, 및 서열 번호:15, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 하기 서열을 전부 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성되는 단리된, 정제된, 합성, 및/또는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이고: 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13, 서열 번호:14, 및 서열 번호:15, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 투여될 경우 인간 개체에서 간의 헵시딘 mRNA 및/또는 혈청 헵시딘 수준을 떨어뜨린다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호:1 또는 서열 번호:2와 동일하거나 실질적으로 유사한 에리트로페론 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호:1 또는 서열 번호:2에 의해 제공되는 에리트로페론 활성의 약 60-100%, 약 70-100%, 약 80-100%, 약 90-100%, 또는 약 95-100%를 나타낸다.

일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 또는 서열 번호:16의 연속적인 아미노산 잔기를 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 또는 적어도 약 25개 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성되는 단리된, 정제된, 합성, 및/또는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 합성 또는 재조합 기술을 이용하여 제조된다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 단리된, 정제된, 합성, 및/또는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있고 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 단클론 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 인간화된 항체, 키메라 항체, 또는 인간 항체이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 항체를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성되는 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 항체를 정상인 개체에서 발견되는 것보다 더 높은 농도로 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 개체에서 철 대사 질환을 치료하는 방법에 관한 것이되, 상기 방법은 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 항체, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하거나, 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 또는 이러한 단계로 구성된다. 일부 구체예에서, 상기 개체는 인간이다. 일부 구체예에서, 상기 개체는 치료가 필요한 개체이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료가 필요한 개체"는 철 대사 질환을 가지거나 이로 인해 고통받는 것으로 진단받은 개체이다. 일부 구체예에서, 철 대사 질환은 철분 과다 질환 또는 비정상적으로 낮은 수준의 헵시딘과 연관된 질환 및/또는 장애이다. 일부 구체예에서, 철 대사 질환은 비정상적으로 낮은 수준의 철 및/또는 비정상적으로 높은 수준의 헵시딘과 연관된 질환 또는 장애이다. 일부 구체예에서, 개체에 투여되는 폴리펩티드는 -ERFE 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 개체에 투여되는 폴리펩티드는 +ERFE 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 폴리펩티드는 효과적인 양으로, 바람직하게는 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체에 ERFE 폴리펩티드를 효과적인 양으로, 바람직하게는 치료적으로 효과적인 양으로 투여함으로써 개체에서 헵시딘의 양을 조절하는 단계를 포함하거나, 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 또는 이러한 단계로 구성된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 투여 전, 도중, 또는 후에 개체에서 하나 이상의 ERFE 폴리펩티드 및/또는 헵시딘의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, ERFE 폴리펩티드의 양은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 하나 이상의 항체를 이용하는 검정으로 측정된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체에게, 헵시딘의 측정치가 정상을 초과하는 경우 하나 이상의 +ERFE 폴리펩티드를 투여하는 단계 또는 헵시딘의 측정치가 정상 미만인 경우 하나 이상의 -ERFE 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 샘플에서 ERFE 폴리펩티드의 존재를 검출 및/또는 양을 측정하기 위한 검정에 관한 것이되, 상기 검정은 샘플을 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 항체와 접촉시키는 단계 및 그 후 결합된 항체의 존재를 검출 및/또는 양을 측정하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 본 명세서에 개시된 바와 같은 재조합 세포, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 항체, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물을 포함하고, 시약, 장치, 설명서, 또는 이들의 조합과 함께 포장된 키트에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 특이적으로 인식하거나 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 항체를 발현할 수 있는 하이브리도마(hybridoma) 세포주에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 항체와 결합된 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 복합체에 관한 것이되, 여기서 상기 적어도 하나의 폴리펩티드 및/또는 항체는 재조합 기술에 의해 제조된다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 항체, 또는 상기 폴리펩티드, 핵산 분자, 및 항체 중 하나 이상을 포함하는 조성물의 철 대사 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 용도에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 철 대사 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대응하도록 만들어진 항체, 또는 상기 폴리펩티드, 핵산 분자, 및 항체 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

앞의 일반적인 설명과 이어지는 상세한 설명은 오로지 예시와 설명을 위한 것이며, 청구된 본 발명의 부가적인 설명을 제공하도록 의도된다. 첨부된 도면은 본 발명의 더 나은 이해를 제공하기 위해 포함된 것이며, 본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하고, 본 발명의 몇 가지 구체예를 예시하고 명세서와 더불어 본 발명의 원리를 설명하는데 기여한다.

도면의 설명
본 발명은 하기 도면을 참고함으로써 더 잘 이해되며 여기서:
도 1: 간의 Hamp mRNA는 처리 안된 동물에 비해 적혈구생성 자극 (사혈 (실선) 또는 EPO 주입 (파선)) 후에 억제된다. 수컷 6-주령 마우스를 n=4/그룹으로 사용하였다. 스튜던트의 t-시험으로 처리 안된 동물에 대해 비교하였다 *p<0.05, **p<.01, ***p<.001.
도 2: 제2일 오전 9시에 제공된 EPO 5000 U에 대한 건강한 인간 지원자의 반응(Ashby 2010).
도 3A-3B: ERFE는 TNF-α 슈퍼패밀리의 구성원이다. 도 3A: 마우스 (서열 번호:2) 및 인간 ERFE 단백질 (서열 번호:1)을 정렬한 것. 강조된 서열은 서열 번호:16이다. TNF 패밀리의 다른 인간 구성원 및 ERFE의 인간 변종에 대해 인간 ERFE의 C-말단 조각의 채색 CLUSTAL 정렬이 수행되었다. ERFE의 인간 변종은 신호전달 서열에서 차이를 보이는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명에 따른 ERFE 폴리펩티드는 서열 번호:16에 제시된 N-말단 조각에 대해 90-100%, 바람직하게는 95-100%, 더 바람직하게는 98-100%, 및 가장 바람직하게는 99-100% 서열 동일성을 포함한다. 도 3B: TNFα 슈퍼패밀리의 다른 구성원에 대한 유사성에 기초한 ERFE의 구조 모델.
도 4: 처리 안된 마우스와 비교한 사혈 (실선) 또는 EPO 주입 (파선) 후에 골수 Erfe mRNA의 배수적 증가. 6 주령 수컷을 n=4/그룹으로 사용하였다. t-시험으로 처리 안된 동물에 대해 비교하였다 *p<.001, **p<.01. 도 5: 인간 ERFE는 중간 적혈구모세포에서 최대로 발현되는 적혈구 전사물이다. 도 5A는 다양한 조직에서의 상대적인 인간 ERFE mRNA 발현을 강도의 순서로 나타낸다. 인간 ERFE mRNA를 높은 수준으로 발현하는 태아 간 및 골수, 기관은 적혈구모세포를 지닌다. 도 5B는 인간 적혈구모세포 성숙 데이터베이스를 기초로 한다 (Merryweather-Clarke 2011). 성숙하는 인간 적혈구모세포 내 인간 ERFE mRNA의 상대적인 발현이 보여지며, 적혈구계 발달의 매우 초기 단계인 콜로니-형성단위-적혈구계 세포 (CFU-E)부터, 전기 적혈구모세포 (Pro-E)를 지나, 중기 적혈구모세포 (Int-E)에서 후기 적혈구모세포 (LateE)까지 이른다.
도 6: 마우스 골수 적혈구모세포에서의 Erfe mRNA 발현은 소콜로브스키(Socolovsky) 방법에 의해 전기 적혈구모세포 (ProE) 및 적혈구모세포 EryA, B, C 단계로 분류된다 (Liu 2006). 흰색 막대는 0.5 ml를 사혈하고 15시간 후에 C57BL/6 마우스로부터의 골수를 나타내고; 검은 막대는 조작 안된 대조 마우스로부터의 골수를 나타낸다. 6-주령 수컷 마우스, n=3/그룹, t-시험에 의해 *p<0.01.
도 7A-7C: 사혈을 수행한 Erfe ^+/+, Erfe ^+/- 및 Erfe ^-/- 마우스의 간에서의 Hamp mRNA 변화(WT (야생형, 도 7A), HT (이형접합체, 도 7B), 및 KO (녹아웃, 도 7C)로 표시함). 그룹당 n=3 내지 6 마우스. 사혈하지 않은 대조에 비교한 t-시험에 의해 *p<.001, **p<.01.
도 8: Erfe-결핍 마우스는 빈혈로부터 지연된 회복을 보인다. (A 및 B) 사혈을 수행한 Erfe-결핍 마우스 (실선)는 야생형 마우스 (파선)와 비교할 때 헤모글로빈의 지연된 회복 및 더 낮은 평균 적혈구 헤모글로빈 (MCH)을 나타낸다. 혈액학적 변수 (A, B)를 WT (n=17) 및 KO (n=15) 사이의 각각의 측정치와 스튜던트 t-시험에 의해 비교하였다. 성별에 따른 차이가 부재하면, 각각의 파라미터에 성별을 조합하였다. ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05.
도 9A-9C: 도 9A: 마우스 Erfe cDNA를 인코딩하는 0.5 또는 1 μg의 플라스미드 DNA로 형질주입된 HEK293T 세포를 C-말단 6His 태그에 융합시켰다. 항-6His 항체를 이용한 웨스턴 블롯(Western blot)은 상청액에서 우세한 Erfe를 검출하며 이는 Erfe가 다량으로 분비된 것을 가리킨다. 도 9B: 분비된 Erfe는 N- 및 O-글리코실화된다. 도 9C: 내부 펩티드 서열 PSRVPAAQEL (서열 번호:18)에 대응하도록 만들어진 토끼 항-마우스 항- Erfe 항체 2는 웨스턴 블롯에서 재조합 단백질을 검출하며, 여기서 +/-는 Erfe 플라스미드로 형질주입된 것 또는 그렇지 않음을 나타낸다.
도 10: Erfe는 간에 직접 작용하여 헵시딘을 억제시킨다. (A, B, C) 여섯 마리의 C57BL/6 수컷 마우스를 마우스 재조합 Erfe (2 μg/g) 또는 식염수 중 어느 하나로 복강내 처리하고 15 시간 후에 분석하였다. 간의 헵시딘 mRNA (A) 및 혈청 헵시딘 (B) 수준은 간 Saa1 mRNA 발현의 증가 (C)로 나타나는 염증 반응에도 불구하고 Erfe 처리에 의해 상당히 억제되었다. (D, E, F) 여덟 마리의 7 주령 C57BL/6 수컷을 GFP 또는 마우스 Erfe cDNA 서열을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입시켰다. (D) Erfe mRNA 발현은 Erfe 렌티바이러스로 형질도입된 마우스의 간에서 약하게 증가했으나 (조혈 촉진을 통한 마우스 골수에서의 32-배 상향조절에 비해 기초선 골수 수준의 단지 2-배) 이러한 증가는 간의 헵시딘 mRNA (E) 및 혈청 헵시딘 (F) 수준을 낮추기에는 충분했다. (G) 재조합 마우스 Erfe는 Erfe 렌티바이러스로 감염된 HEK293T 세포에 의해 분비됨이 항-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다. (H) 대조 세포 또는 Erfe를 과발현하는 HEK293T 세포로부터의 상청액 (50% v/v)을 이용한 마우스 일차 간세포의 처리는 Erfe가 간에 직접 작용하여 헵시딘 mRNA 발현을 억제함을 나타내었다. 삼중복으로 15시간 처리하는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM이 나타난다. 헵시딘 (Hamp), 혈청 아밀로이드 1 (Saa1) 및 Erfe mRNA (Erfe) 수준을 qRT-PCR로 측정하였다. -ΔCt (즉, Ct Hprt - Ct Hamp, Saa1 또는 Erfe)의 평균 ± SEM이 나타난다. 혈청 헵시딘 수준 (B, F)을 효소-연결 면역 흡수 검정으로 측정하였다. 처리된 마우스와 대조 마우스 사이에 또는 Erfe-처리된 것과 대조 샘플 사이에 평균 수치를 스튜던트 t-시험으로 비교하였다. ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05.
도 11: 야생형 마우스 (WT) (n=5)에 비교한 β-지중해성 빈혈 중간종 th3/+ 마우스 (thal) (n=4)의 골수 및 비장에서 증가된 Erfe mRNA. 수컷 6-개월령 마우스를 사용하였다. *p=0.016, **p<0.001. Hprt를 기준 유전자로 사용하였다.
도 12: Erfe의 예상 구조 도메인. SP = 신호전달 펩티드, NTD = N-말단 도메인 1 및 2.

발명의 상세한 설명

본 발명은 단백질의 발견을 기초로 하며, 상기 단백질은 본 명세서에서 "에리트로페론"으로 지칭된다. 에리트로페론은 가장 처음 규명된, 개체에서 적혈구 생산 및 철의 흡수 및 분포를 매개하는 "호르몬"이다. 에리트로페론은 개체의 골수에서 만들어지며 이의 생산은 적혈구 생산이 촉진되는 경우, 예컨대, 출혈 후 또는 빈혈의 회복 도중에 크게 증가된다. 에리트로페론은 철의 공급을 조절하여 골수에서의 적혈구 생산 필요를 충족시킨다. 상세하게는, 에리트로페론은 간에 작용하여 주요한 철-조절 단백질인 헵시딘의 생산을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 에리트로페론의 과다생산은 β-지중해성 빈혈과 같은 질환에서 철분 과다를 야기할 수 있고 그러므로 에리트로페론을 상쇄하는 것이 β-지중해성 빈혈의 치료를 위해 사용될 수 있다.

에리트로페론은 헵시딘 발현을 억제하는 요인을 찾던 중에 발견되었다. 간에 의해 합성되는 25개 아미노산 펩티드 호르몬인 헵시딘은 철 항상성의 핵심 조절제이다. Ganz 2011를 참조한다. 헵시딘은 유일한 철 배출자인 페로포르틴에 결합함으로써 작용하여 이의 유비퀴틴화, 세포내 함입 및 리소좀에서의 분해를 유도한다. 세포막에서 페로포르틴이 사라지면 식이 흡수가 억제되고 재사용된 철이 대식 세포 내로 고립되어, 적혈구 생성을 위해 이용가능한 철이 감소된다. 그와 반대로, 낮은 헵시딘은 페로포르틴이 세포에 계속 작용하여 철을 혈장으로 배출하도록 허용하며, 헤모글로빈 합성을 위해 이용가능한 철이 더 많아지게 만든다. 철, 염증, 또는 ER 스트레스가 헵시딘 생산을 촉진하는 반면, 저산소증, 철 결핍증 및 증가된 적혈구생성 활성이 이를 억제한다.

헵시딘은 다량 출혈 또는 에리트로포이에틴 (EPO) 투여 후 억제된다. 헵시딘은 출혈, 용혈 또는 철 결핍증으로 야기된 빈혈, 또는 비효과적인 적혈구 생성을 가진 유전성 빈혈에서 감소된다. 헵시딘에 대한 적혈구 생성의 억제 효과는 비효과적인 적혈구 생성을 가진 질환에서 특히 현저하며 여기서 적혈구 전구체는 다량으로 증가하나 적혈구모세포 단계에서 성숙하여 적혈구가 되는 대신 대부분 아폽토시스를 겪는다. 따라서, C57BL/6 마우스에서, 다량 출혈 (500 μL) 또는 EPO 주입 (200 U)에 대한 반응으로의 헵시딘 mRNA의 시간-경과를 검사하였고 9 내지 15시간에 간의 헵시딘 mRNA의 상당한 억제가 관찰되었다. 적혈구생성 자극 후 12-15시간에, 상기 저해는 약 90%로 최대였다 (도 1). 반응 시점은 사람 지원자에서와 유사하며 감소는 9-24 시간에 발생한다 (도 2).

마우스에서 다량 출혈에 대한 반응의 시간-경과에 관한 이러한 생체내 데이터는 비록 헵시딘의 식별가능한 강한 억제가 있더라도 간에서 전사 인자 핵심 요소 결합 단백질 α (C/EBPα) mRNA과 단백질 수준은 변화하지 않음을 보여준다. 헵시딘의 억제는 EPO 투여 후에도 증가된 철 이용으로 인해 변화하지 않는데, 이는 극적인 헵시딘 감소가 트랜스페린 포화 또는 다른 공지의 철-연관 변수의 어떠한 변화보다 우선하기 때문이다 (도 2). 따라서, 빈혈 또는 다른 저산소 자극에 대응하여, 높은 수준의 EPO가 골수로부터 하나 이상의 적혈구계 인자의 분비를 유도함으로써 헵시딘 억제를 간접적으로 야기하고, 이는 다시, 간에 작용하여 헵시딘 발현을 억제시키고 식이 흡수 및 저장분으로부터 철 수송을 증가시키는 것으로 보인다. EPO 주입에 따른 헵시딘의 이른 억제는 적혈구 전구체가 빠르게 흡수할 수 있는 철을 더 많이 만들고, 적혈구 생성을 가속화할 수 있다.

따라서, 출혈 (0-48 시간)에 대한 골수에서의 유전자 발현 프로파일을, 시판되는 유전자 칩-기반 발현 프로파일링 (아피메트릭스(Affimetrix) 마우스 유전자 1.0 ST 어레이)를 이용하여 연구하였다. 발현 프로파일링은 또한 당해 분야에서 "RNA Seq"로 지칭되는 cDNA의 차세대 염기서열분석을 비롯한 대안적인 방법에 의해 수행될 수 있었다. 발현이 헵시딘 mRNA의 억제 전에 유도되고 헵시딘 수준이 정상 기초선으로 회복되기 전까지 높은 수준으로 유지되는 적혈구-특이적 전사물 중에는 이전에 규명되지 않았던 희귀(orphan) 전사물이 있으며, 분비 단백질을 인코딩하는 다양한 공공의 서열 데이터베이스에서 Fam132b로 등재되어 있다. Fam132b mRNA는 출혈 후 4시간 이내에, 헵시딘 억제가 일어나기 전에 고도로 유발되는 것으로 밝혀졌다. 에리트로페론은 Fam132b mRNA에 의해 인코딩되는 단백질이다.

"ERFE 폴리펩티드" (+ERFE 및 -ERFE 폴리펩티드) 및 "ERFE 폴리뉴클레오티드"를 지칭할 때를 제외하고는, 본 명세서에서 사용된, "ERFE" (모두 대문자이고 이탤릭임)는 에리트로페론을 인코딩하는 인간 유전자를 지칭하고, "Erfe" (첫 문자가 대문자이고, 이탤릭임)는 에리트로페론을 인코딩하는 마우스 유전자를 지칭하고, "ERFE" (모두 대문자이고 이탤릭이 아님)는 인간 단백질 에리트로페론을 지칭하며, "Erfe" (첫 문자가 대문자이고, 이탤릭이 아님)는 마우스 단백질 에리트로페론을 가리킨다.

에리트로페론은 TNFα 슈퍼패밀리의 구성원이다 - 에리트로페론 상동체의 아미노산 서열은 척추동물 진화를 통해 잘 보존되었으며 따라서 마우스 및 인간 단백질은 약 71% 동일하고 (도 3A) C-말단 절반은 제브라피쉬(zebrafish) 상동체와 약 44% 동일하다. 도메인 분석은 Erfe가 공지의 사이토킨에 대해 중간의 유사성을 가진 TNFα 슈퍼패밀리의 구성원임을 나타내었다. TNFα 및 RANK 리간드 (RANKL)는 가장 가까운 친척이다. 유전체 및 mRNA 데이터베이스의 연구는 신호전달 서열만 서로 다른 인간 ERFE의 두 가지 변종을 규명해냈다. 두 가지 모두가 골수에서 발현되는지 그리고 상기 변종들이 상이한 수준의 발현 또는 상이한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성하는지는 여전히 결정해야 할 문제로 남아있다. 인간 태아 간-유래 적혈구모세포로부터의 mRNA의 역전사 및 cDNA 서열분석에 의해, C-말단 220 아미노산 (도 3A에 강조됨)이 확인되었다.

HHPredictB를 이용한 전체 단백질의 구조 모델링 (도 3B)은 단백질의 N-말단 부분 (왼쪽)이 신호전달 서열로 구성되며 다음으로 콜라겐-유사 조각을 갖는 개방 부위가 이어지고, C-말단 부분은 TNFα/RANKL와 상동체임 (오른쪽)을 나타낸다. TNFα에 대한 유사성은 유의할 만한데 왜냐하면 TNFα가 일차 간세포 배양물에서 헵시딘 mRNA을 억제하기 때문이다. TNFα에 대한 유사성은 다량체를 형성할 경향을 예고한다.

골수에서 에리트로페론 발현은 EPO에 반응한다 - qPCR을 이용하여, 골수에서 (도 4)뿐만 아니라 비장에서 (데이터 나타내지 않음) 사혈에 따른 Erfe mRNA 발현의 유도를 시험하였고, 이를 통해 적혈구 생성에 이것이 관여함을 확인하였다. 마우스에서의 EPO 주입은 정도 및 시간 경과 모두에서, 사혈을 수행한 마우스의 경우에 필적하는 헵시딘 억제를 유도한다(도 1). 유사하게, 골수 및 비장에서 EPO에 대한 Erfe mRNA의 반응은 사혈에 의해 유발된 경우와 유사했으나 Erfe 자극은 EPO-주입된 마우스에서 더 빨리 일어났다 (도 4). 이는 사혈 모델에서 EPO의 Erfe 작용 후속과정과 동일하다.

에리트로페론은 적혈구모세포에 의해 생산된 에리트로카인일 것이다 - 유전자 발현 데이터베이스의 연구는 인간 ERFE이 인간 골수 및 태아 간에서 고도로 발현됨 (예컨대, 도 5A), 및 "시험관내" 분화된 인간 CD34+ 세포가 중기 적혈구모세포에서 CFU-E에 비해 대략 8-배에 달하는 최대 발현에 도달함 (도 5B)을 밝혔다. 이는 적혈구모세포가 에리트로페론의 주요 공급원임을 시사한다. 이를 0.5 ml 사혈 후 15 시간에 수득된 생체외 마우스 골수로 직접 검사하였고, 상기 검사는 적혈구모세포에서, 우세하게는 (초기 및 중기 적혈구모세포) EryA 및 B 단계 (도 6, qRT-PCR, Hprt 기준)에서 대조 마우스에 비해 대량의 Erfe 발현 증가를 나타내었다. EryB 단계에서의 상대적인 풍부성으로 인해, 이들 세포는 골수에서 Erfe의 주요 공급원을 이룰 것이다.

Erfe 녹아웃 및 반수체부족성 마우스에서 다량 출혈에 대한 헵시딘 반응 - 혼합된 Sv129/C57BL/6 바탕 (Fam132btm1Lex, 렉시콘 파마슈티칼스(Lexicon Pharmaceuticals)) 및 표지자-보조 가속화된 여교배법(backcrossing)을 이용하여 C57BL/6 바탕에 여교배된 Erfe ^+/- 마우스를 사용하여 본 발명에 따른 Erfe 폴리펩티드를 더욱 분석할 수 있다. 일부 실험에서, 혼합된 Erfe ^-/- 및 Erfe ^+/- 바탕을 이들의 야생형 (WT) 한배 자손들과 비교하였다. Erfe 녹아웃 (KO)은 생존했고, 표현형적으로 정상인 것으로 보였고, 렉시콘 마우스 데이터베이스에 있어서 완전히 정상이고 매우 광범위한 표준화 워크업(workup)을 수행했으며, 번식이 가능했다. 자동 혈액학 분석기 (Hemavet 850; 드루 사이언티픽(Drew Scientific), 옥스포드, CT)를 이용하여 6주령(3주, 12주 또는 6달 아님)에서 수행한 정확한 혈구 수치 결과는 야생형 및 이형접합체에 비해 Erfe-결핍 동물의 기초선에서 감소된 헤모글로빈 수준을 나타냈다. 6 주령은 출혈 후 스트레스성 적혈구 생성과 유사하게 철에 대한 높은 필요를 갖는 빠른 적혈구 증가 및 성장 시기이다. Erfe가 출혈에 의한 헵시딘 억제의 중요한 매개체인지 시험해보기 위해, Erfe ^-/-, Erfe ^+/- 및 Erfe ^+/+ 한배 자손들에 사혈을 수행하고 (500 μL) 사혈 후 12, 15, 24 및 48 시간에 분석하였다 (도 7A-7C). Erfe ^-/- 마우스는 간의 헵시딘 mRNA 발현을 감소시키지 못했고 이는 다량 출혈 후 빠른 헵시딘 억제를 위해 Erfe가 필수적임을 나타낸다 (도 7A-7C). 반수체부족성 마우스는 12-15시간에 부분적인 반응만을 나타냈고 이는 Erfe에 대한 헵시딘의 용량-의존적 반응을 시사한다.

Erfe -결핍 마우스는 출혈-유도 빈혈로부터 지연된 회복을 나타낸다 - 12 주령 Erfe ^+/+ 및 Erfe ^-/-에 사혈을 수행하고 이들의 회복을 9 일 동안 관찰하였다. Erfe -결핍 마우스는 야생형 대조에 비해 더 낮은 헤모글로빈 및 중간 적혈구 헤모글로빈을 나타내었고 (도 8) Erfe-결핍 마우스의 다량 출혈-유도 빈혈로부터의 회복은 며칠 가량 늦어졌다.

재조합 단백질 생산 및 분석 - C-말단 Myc/Flag, V5 에피토프/His, Myc/His 및 Flag/His를 갖는 마우스 및 인간 ERFE의 cDNA를 인코딩하는 다중 발현 플라스미드를 제작하였다. 형질주입된 HEK293T의 웨스턴 블롯은 상기 단백질이 분비됨을 확인하였다 (도 9A). 원료를 태그 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, SDS-PAGE로 분석하였고, 주요 밴드가 검출된 것들과 상응하는지 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 밴드의 정체는 HPLC-MS에 의한 트립신화 단편의 단백질학적 분석에 의해 Fam132b/Erfe인 것으로 확인되었다. 흥미롭게도, Erfe의 분비된 형태는 세포내 형태보다 약간 더 높은 분자량을 가지고, 두 단백질은 모두 예상된 크기의 두 배였으며, 이는 이량체화 가능성을 나타낸다. 정제된 분비되는 생성물의 탈글리코실화는 Erfe가 N- 및 O-글리코실화되어 있음을 나타낸다 (도 9B). Erfe 및 Erfe 폴리펩티드의 재조합 형태는 시험관내 및 생체내에서 이들의 활성을 분석하기 위해 사용될 수 있다. Erfe에 대응하도록 만들어진 항체를 생성하였고, 이는 내인성 단백질 검출을 위해 (도 9C) 및 개체, 예컨대, 철 장애를 갖는 마우스 모델 및 환자에서 하나 이상의 ERFE 폴리펩티드의 혈청 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예비 실험에서, HEK293 세포주의 한 변종이 높은 수준으로 Erfe를 발현하지만 분비하지 못하는 것을 발견하였고, 따라서 이는 분비 현상이 세포-유형 특이적이거나 세포의 특정한 특징에 의존적일 수 있음을 나타낸다.

분비된 에리트로페론 단백질이 헵시딘의 억제제인지 시험하기 위해, C57BL/6 수컷 마우스에 쥐의 재조합 Erfe (2 μg/g)을 주입하였다. 헵시딘 mRNA 및 혈청 단백질 수준은 Saa1 mRNA의 증가된 발현(도 10C)으로 나타난 재조합 단백질에 의해 유발된 상당한 염증 반응에도 불구하고, Erfe 처리 후 15 시간에 식염수-주입된 마우스에 비해 크게 감소되는 것으로 발견되었다 (도 10A, 10B). 염증이 헵시딘 발현을 증가시킬 것이다.

재조합 Erfe 제제의 급성 염증 효과를 피하기 위해, C57BL/6 수컷 마우스에 Erfe를 인코딩하는 렌티바이러스계 벡터를 형질도입시켰다. 3 주 후에, Erfe-렌티바이러스를 처리한 마우스의 간에서 (골수는 아님) 대조 렌티바이러스를 처리한 마우스에 비해 중간의 Erfe mRNA의 증가가 관찰되었다 (도 10D). 그럼에도 불구하고, 헵시딘 mRNA 및 혈청 수준은 각각 30-배 및 10-배로 상당히 감소하였고 (도 10E, 10F) 이는 간 내 아주 소량의 Erfe이라도 헵시딘 전사에 저해 효과를 주기에 충분하였다는 점을 시사한다. 그러므로, 헵시딘을 조절하기 위해 Erfe가 간에 직접 작용할 수 있는지 검사하였다. 마우스 일차 간세포를 15시간 동안 Erfe를 과다발현하는 대조 HEK293T 또는 HEK293T로부터의 50% (v/v) 상청액으로 처리하였고 (도 10G), 그 결과 Erfe-처리된 세포에서 헵시딘 mRNA 수준의 4-배 감소가 일어났다 (도 10H). 종합하면, 이들 결과는 에리트로페론이 헵시딘 mRNA 발현을 억제하기 위해 간에 직접 작용할 수 있는 헵시딘의 강한 억제제라는 것을 보여준다.

항체의 제조 - 에리트로페론의 검출 및 특징분석을 용이하게 하기 위해, 에리트로페론 및 ERFE 폴리펩티드의 쥐의 및 인간 형태 모두에서 펩티드 항원을 표적하는 일련의 항체가 생산되고 사용될 수 있다. 또한, 에리트로페론 및/또는 ERFE 폴리펩티드의 내부 및 N-말단 에피토프에 대한 항체는 본 발명에 따른 다양한 검정 및 처리 방법에서 사용될 수 있다.

지중해성 빈혈 마우스에서 Erfe의 다량 증가 - 에리트로페론 과다생산은 수혈받지 못한 β-지중해성 빈혈의 철분 과다에 기여할 수 있다. β-지중해성 빈혈의 Hbb^th3/+ 마우스 모델 (Gardenghi 2007)을 이용하여, Erfe mRNA가 야생형 대조군에 비해 Hbb^{th3 /+} 마우스의 골수와 비장에서 크게 증가함이 나타났다 (도 11). Hbb^{th3 /+} 마우스가 팽창된 골수와 3배 더 큰 비장을 가지는 것을 생각하면 Erfe의 순(net) 발현은 야생형 마우스보다 이들에게서 훨씬 더 많다.

폴리펩티드 및 조성물

일부 구체예에서, 본 발명은 에리트로페론 및 이의 유사체 및 단편에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된, 에리트로페론 (ERFE 및 Erfe을 포함) 및 이의 유사체 및 단편은 본 명세서에서 통합적으로 "ERFE 폴리펩티드"로 지칭된다. ERFE 폴리펩티드는 에리트로페론 활성을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "에리트로페론 활성"은 대조군과 비교할 때 간의 헵시딘 mRNA 또는 혈청 헵시딘 수준을 감소시키는 물질의 능력을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 둘 이상의 서로 연결된 아미노산을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 아미노산 축약어 그룹 또는 문자열이 펩티드를 나타내기 위해 사용된다. 특정하게 언급되는 경우가 아닌 한, 펩티드는 왼쪽에 N-말단이 나타나고 서열은 N-말단에서 C-말단으로 쓰여진다.

본 발명의 ERFE 폴리펩티드는 화학 합성, 생합성 또는 재조합 DNA 방법을 이용한 시험관내 합성, 및 고체상 합성을 비롯한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예컨대, Kelly & Winkler (1990) Genetic Engineering Principles and Methods, vol. 12, J. K. Setlow ed., Plenum Press, NY, pp. 1-19; Merrifield (1964) J Amer Chem Soc 85:2149; Houghten (1985) PNAS USA 82:5131-5135; 및 Stewart & Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2ed. Pierce, Rockford, IL을 참조하고, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로서 포함된다. 본 발명의 ERFE 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 단백질 정제 기술 가령 역상 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 이온-교환 또는 면역친화성 크로마토그래피, 여과 또는 크기 배제, 또는 전기영동을 이용하여 정제될 수 있다. Olsnes 및 Pihl (1973) Biochem. 12(16):3121-3126; 및 Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, NY를 참조하고, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로서 포함된다. 대안적으로, 본 발명의 ERFE 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 ERFE 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 포함되고 본 명세서에서 "ERFE 폴리뉴클레오티드"로서 지칭된다. 일부 구체예에서, ERFE 폴리뉴클레오티드는 단리된다. 본 명세서에서 사용된, "단리된" 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생한 폴리뉴클레오티드와 상이한 환경에 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들면, 단리된 폴리뉴클레오티드는 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 5'- 및/또는 3' 말단에 일반적으로 붙어있는 염기를 가지지 않는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 ERFE 폴리펩티드는 실질적으로 정제된다. 본 명세서에서 사용된, "실질적으로 정제된" 화합물은 이의 자연적인 환경에서 분리되고 및/또는 자연이나 그의 합성에서 상기 화합물과 결합하는 다른 고분자 성분 또는 화합물로부터 적어도 약 60% 유리되고, 바람직하게는 약 75% 유리되고, 및 더 바람직하게는 약 90% 유리되고, 및 가장 바람직하게는 약 95-100% 유리된 화합물을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된, "단리된" 화합물은 이의 자연적인 환경으로부터 단리된 화합물을 지칭한다. 예를 들면, 단리된 폴리펩티드는 전장(full length) 폴리펩티드에 해당하는, N-말단, C-말단, 또는 둘다에 붙어있는 이의 자연적인 아미노산을 가지지 않는다. 예를 들면, 에리트로페론 또는 ERFE 폴리펩티드의 단리된 단편은 에리트로페론 또는 ERFE 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 일부를 포함하나, 전부는 아닌 단리된 폴리펩티드를 지칭하지만, 상기 단리된 폴리펩티드는 이의 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에 비-자연적인 아미노산, 즉, 에리트로페론 또는 ERFE 폴리펩티드의 상응하는 위치의 아미노산과 동일성을 가지지 않는 상이한 아미노산을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 ERFE 폴리펩티드는 합성 및/또는 재조합 기술을 이용하여 제조된다.

일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 ERFE 폴리펩티드는 그의 의도되는 목적을 위해 적절한 담체를 포함하는 조성물의 형태로 제공된다. 상기 조성물은 또한 그의 의도되는 목적을 위해 적절한 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 검정을 위해서, 조성물은 리포좀, 니클로사미드, SL220 가용화 물질 (NOF, 일본), 크레모포어(Cremophor) EL (시그마(Sigma)), 에탄올, 및 DMSO를 포함할 수 있다. 철 장애의 치료를 위해, 조성물은 상이한 흡수 촉진제 및 프로테아제 저해제, 펩티드 캡슐화 (가령 키토산 및 하이드로겔), 고분자 접합, 지질화 및 다른 화학적 개질을 위한 고체 미립자 또는 나노입자를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 ERFE 폴리펩티드를 정상인 개체에서 발견되는 것보다 더 높은 농도로 포함한다.

본 발명에 따른 하나 이상의 ERFE 폴리펩티드 또는 이의 조성물은 철 대사 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "철 대사 질환"은 비정상적인 철 대사가 직접적으로 질환을 유발하거나, 혈중 철 수준이 이상조절되어 질환을 유발하거나, 또는 철 이상조절이 또 다른 질환의 결과로 나타나는 질환, 또는 철 수준을 조절함으로써 치료될 수 있는 질환, 등을 포함한다. 더 특정하게는, 본 개시에 따른 철 대사 질환은 철분 과다 질환, 철 결핍증 장애, 생물학적 철 분배 장애, 다른 철 대사 장애 및 철 대사와 잠재적으로 연관된 다른 장애, 등을 포함한다. 철 대사 질환은 혈색소증, HFE 돌연변이 혈색소증, 페로포르틴 돌연변이 혈색소증, 트랜스페린 수용체 2 돌연변이 혈색소증, 헤모주벨린(hemojuvelin) 돌연변이 혈색소증, 헵시딘 돌연변이 혈색소증, 소아 혈색소증, 신생아 혈색소증, 헵시딘 결핍증, 수혈성 철분 과다, 지중해성 빈혈, 중간 지중해성 빈혈, 알파 지중해성 빈혈, 철적모구 빈혈, 포르피린증, 만발성 피부 포르피린증, 아프리카 철분 과다, 고피리틴혈증, 세룰로플라스민 결핍증, 무트랜스페린혈증, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 만성 질환성 빈혈, 염증성 빈혈, 감염성 빈혈, 저색소성 소구성 빈혈, 철-결핍성 빈혈, 철-불내성 철 결핍성 빈혈, 만성 신 질환성 빈혈, 에리트로포이에틴 내성, 비만의 철 결핍증, 다른 빈혈, 헵시딘을 과다생산하거나 그의 과다생산을 유도하는 양성 또는 악성 종양, 헵시딘 과다 증상, 프리드리히(Friedreich) 운동실조증, 쇠약 증후군(gracile syndrome), 할러포르덴-스파츠(Hallervorden-Spatz) 질환, 윌슨(Wilson) 질환, 폐혈철증, 간세포 암종, 암, 간염, 간경변, 이식증, 만성 신부전, 인슐린 내성, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 신경퇴행성 장애, 다발성 경화증, 파킨슨(Parkinson) 질환, 헌팅턴(Huntington) 질환, 및 알츠하이머(Alzheimer) 질환을 포함한다. 일부 구체예에서, 철분 과다 질환은 골수형성이상 증후군이다. 일부 경우에 상기 질환 및 장애는 철과 관련된다고 전형적으로 규명되지 않은 "철 대사 질환"의 정의에 포함된다. 예를 들면, 헵시딘은 쥐의 췌장에서 고도로 발현되며 이는 숨어있던 철 대사 장애를 치료함으로써 당뇨병 (I형 또는 II형), 인슐린 내성, 글루코스 불내증 및 다른 장애가 완화될 수 있음을 시사한다. Ilyin, G. et al. (2003) FEBS Lett. 542 22-26를 참조하고, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로서 포함된다. 따라서 이들 질환은 넓은 정의 하에 포함된다. 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에 참고로서 포함된 제WO 2004092405호의 검정을 비롯한 당해 분야에 공지된 방법, 및 당해 분야에 공지된 헵시딘, 헤모주벨린, 또는 철 수준 및 발현을 관찰하는 검정, 가령 본 명세서에 참고로서 포함된 미국 특허 제7,534,764호에 기술된 것들을 이용하여 소정의 질환이 본 발명에 따른 "철 대사 질환" 인지 쉽게 결정할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 철 대사 질환은 유전성 혈색소증, 철-과다 빈혈, 알코올성 간 질환 및 만성 C형 간염을 포함하는 철분 과다 질환이다.

본 명세서에서 사용된, 헵시딘 과다와 연관된 질환 및 장애는 만성질환성 빈혈 (또한 염증성 빈혈이라 지칭됨), 급성 또는 만성 감염과 연관된 빈혈, 만성 신 질환성 빈혈, 헵시딘을 분비하는 종양으로 인한 빈혈, 및 철-불내성 철-결핍증 빈혈 (IRIDA)을 포함한다.

본 명세서에서 사용된, 헵시딘 결핍과 연관된 질환 및 장애는 성인 및 소아 유형의 유전성 혈색소증, α-지중해성 빈혈, β-지중해성 빈혈 및 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 및 알코올 간 질환 및 만성 B형 및 C형 간염을 비롯한 만성 간 질환을 포함한다.

본 명세서에서 사용된, "+ERFE 폴리펩티드"는 마우스 및/또는 인간 에리트로페론과 동일하거나 유사한 에리트로페론 활성을 나타내는 ERFE 폴리펩티드를 지칭한다. 에리트로페론은 +ERFE 폴리펩티드이다. 본 명세서에서 사용된, "-ERFE 폴리펩티드"는 에리트로페론 활성을 나타내지 않고 일부 구체예에서 +ERFE 폴리펩티드의 활성을 간섭하는 ERFE 폴리펩티드를 지칭한다. 에리트로페론은 -ERFE 폴리펩티드가 아니다. 따라서, 용어 "ERFE 폴리펩티드"는 +ERFE 폴리펩티드 및 -ERFE 폴리펩티드 모두를 지칭하기 위해 사용된다. 달리 말하면, ERFE 폴리펩티드는 +ERFE 폴리펩티드 또는 -ERFE 폴리펩티드일 수 있다.

+ERFE 폴리펩티드 및 처리

일부 구체예에서, 본 발명은 헵시딘 과다 및/또는 철 결핍과 연관된 질환 및 장애, 예컨대, 염증성 빈혈 및 철-불내성 철 결핍성 빈혈 (IRIDA)을 치료하기 위해 하나 이상의 +ERFE 폴리펩티드를 단독으로 또는 하나 이상의 에리트로페론의 작용제와 조합으로 사용하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 +ERFE 폴리펩티드는 에리트로페론의 작용을 모방하며, 즉, 에리트로페론과 동일하거나 실질적으로 유사한 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 발명은 헵시딘 발현을 저해, 억제 또는 감소시키기 위해 또는 추가적인 헵시딘 발현을 방지하기 위해 하나 이상의 +ERFE 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

-ERFE 폴리펩티드 및 처리

일부 구체예에서, 본 발명은 헵시딘 결핍 및/또는 철분 과다와 연관된 질환 및 장애를 치료하기 위해 하나 이상의 -ERFE 폴리펩티드를 단독으로 또는 하나 이상의 에리트로페론 길항제와 조합으로 사용하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 헵시딘 발현 및/또는 양을 증가시키기 위해 하나 이상의 -ERFE 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, -ERFE 폴리펩티드는 에리트로페론 수용체에 대하여 에리트로페론과 경쟁적으로 경쟁하고 헵시딘 발현 및/또는 헵시딘 양을 증가시키는 것들을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 철 독성 및 헵시딘 결핍으로 야기되는 질환 및 장애, 예컨대, β-지중해성 빈혈 또는 선천성 적혈구생성이상 빈혈을 치료하기 위해 하나 이상의 -ERFE 폴리펩티드를 단독으로 또는 하나 이상의 에리트로페론 길항제와 조합으로 사용하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 하나 이상의 ERFE 폴리펩티드는 개체에게, 바람직하게는 포유류 가령 인간에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, ERFE 폴리펩티드는 약학 조성물의 제형으로 투여된다. 일부 구체예에서, ERFE 폴리펩티드는 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 본 명세서에서 사용된, "치료적으로 효과적인 양"은 소정의 철 대사 질환의 증상 및/또는 병리를 대조군 가령 위약군에 비해 완화시키는 양이다.

치료적으로 효과적인 양은 당해 분야에 공지된 표준 방법으로 쉽게 결정될 수 있다. 투여되어야 하는 용량은 질환의 임상적 중증도, 개체의 연령과 체중, 또는 철에 대한 개체의 노출 정도에 따라 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물의 바람직한 효과적인 양은 비경구 제형에 있어서 약 0.01 내지 약 10 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 3 mg/kg 체중, 및 더 바람직하게는 약 0.5 내지 약 2 mg/kg 체중 범위이다. 경구 투여를 위한 바람직한 효과적인 양은 최대 약 10-배 더 높을 수 있다. 게다가, 본 발명의 ERFE 폴리펩티드 또는 조성물을 이용한 개체의 치료는 일회성 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는, 연속성 치료를 포함할 수 있다. 실제 투여는 특정 ERFE 폴리펩티드 또는 조성물, 특정 제형, 투여의 방식, 및 특정 부위, 환자, 및 치료되는 질환에 따라 달라질 것임이 이해될 것이다. 치료를 위해 사용되는 효과적인 투여량은 특정 치료의 경과 동안 증가되거나 감소될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 소정의 증상의 집합을 위한 최적 투여량은 당해 분야의 숙련가에 의해 소정의 ERFE 폴리펩티드 또는 조성물에 대한 실험 데이터를 고려하여 종래의 투여-측정 시험을 이용하여 확인될 수 있다. 투여량은 당해 분야에 공지된 표준 진단 검정에 의해 변화되고 명백해질 수 있다. 일부 증상에서 장기적인 투여가 요구될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 요망되는 투여 방식을 위해 적절한 단위-투여 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 요법에 있어서 임의의 적절한 경로에 의해 예컨대 경구, 직장, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 질 및 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함)로 투여될 수 있다. 바람직한 경로는 치료받는 개체의 상태 및 연력, 치료되어야 할 증상의 성질, 및 선택된 ERFE 폴리펩티드 및 조성물에 따라 달라질 수 있음이 이해될 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 치료적으로 효과적인 양의 적어도 하나의 본 명세서에 개시된 바와 같은 ERFE 폴리펩티드, 및 불활성이고, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 표현 "약제학적으로 허용되는 담체" 는 약학적 투여와 양립할 수 있으며 당해 분야에 공지된 임의의 및 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항생제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제, 등을 포함하는 것으로 의도된다. 임의의 통상적인 매체 또는 물질이 활성 물질과 양립성이지 않은 경우가 아닌 한, 조성물 내 이들의 사용이 포함된다.

보조적 활성 화합물이 또한 조성물에 포함될 수 있다. 보조적 활성인 화합물은 니클로사미드, 리포좀, SL220 가용화 물질 (NOF, 일본), 크레모포어 EL (시그마), 에탄올, 및 DMSO를 포함한다.

본 발명의 ERFE 폴리펩티드 및 조성물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약학 절차, 예컨대, LD₅₀ (집단의 50%에 대해 치사성인 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)를 측정하기 위한 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고 이는 LD₅₀/ED₅₀ 비율로 표시될 수 있다. 더 큰 치료 지수를 나타내는 ERFE 폴리펩티드가 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 ERFE 폴리펩티드가 사용될 수 있는 반면, 감염되지 않은 세포에 대한 가능한 손상을 최소화하고 그럼으로써 부작용을 줄이기 위해 그러한 ERFE 폴리펩티드를 발병 조직의 위치로 표적화하는 송달 시스템을 설계하도록 주의해야 한다.

세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간에서 사용을 위한 일정 범위의 투여량을 제형화하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 ERFE 폴리펩티드의 투여량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 ED₅₀를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 속한다. 투여량은 상기 범위 내에서 사용되는 투여 제형 및 사용되는 투여의 경로에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 ERFE 폴리펩티드에 있어서, 치료적으로 효과적인 투여량은 처음에는 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 투여량은 동물 모델에서, 세포 배양에서 측정된 바와 같은 IC₅₀ (즉, 증상의 최대-절반 저해를 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환하는 혈장 농도 범위를 얻도록 구성된다. 그러한 정보는 사람에서 유용한 투여량의 더 정확한 측정을 위해 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피로 측정될 수 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 ERFE 폴리펩티드 및/또는 조성물을 포함하고 시약, 장치, 설명서, 또는 이들의 조합과 함께 포장된 키트를 제공한다. 예를 들면, 키트는 검정을 수행하기 위해 사용되는 시약, 철 대사 장애를 진단, 치료, 또는 관찰하기 위한 약물 및 조성물, 검정될 샘플을 수득하기 위한 장치, 시약을 혼합하고 검정을 수행하기 위한 장치 등을 포함할 수 있다.

하기 실험은 본 발명을 예시하기 위함이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실험

1. 철 대사의 에리트론-의존성 조절에서 에리트로페론의 역할

에리트로페론 생산 - 예비 데이터는 다량 출혈 및 EPO 주입 후 골수 및 비장에서 Erfe mRNA가 크게 증가했음을 나타낸다. 정상 조건 하에 그리고 스트레스성 적혈구 생성 도중 Erfe 전사물을 발현하는 골수 및 비장 세포 유형은 다음과 같이 확인된다: 간략하게, 전체 비장 및 골수 세포를 대조 마우스 및 사혈을 수행한 마우스 (15 시간)로부터 단리하고, Ter119, CD71의 발현 수준 및 전방산란값(forward scatter)을 기초로 하여 유세포 분석으로 분류하였다. 예컨대 Socolovsky 2007; Chen 2009를 참조한다. 각각의 세포 집단에서 두 항존유전자(housekeeping gene)에 대하여 Erfe mRNA 발현을 qPCR로 정량화했다. 사혈 후에 모든 적혈구모세포 단계에서 Erfe 발현은 대조 마우스에 비해 크게 증가했다(도 6) (ProE, EryA, B 및 C). EryB 단계에서의 상대적인 풍부성으로 인해, 이들 세포는 골수에서 에리트로페론의 주요 공급원을 이룰 것이다. Erfe가 실제로 적혈구-특이적 생성물인지 확인하기 위해, 기초선 및 사혈 후에 대표적인 마우스 조직의 qPCR 분석을 수행할 수 있다.

조혈 세포 - 생체활성 에리트로페론 생산에 조혈 세포가 관여하는지 검사하기 위해, 대조군으로 자가이식편을 사용하고 골수소멸성 방사선을 조사한 후에, Erfe ^-/- 및 Erfe ^+/+ 마우스 간에 상호적인 골수 이식을 수행할 수 있다. 그러한 실험은 최근의 수의학적 가이드라인에 따라 수행할 수 있다. Duran-Struuck 2009을 참조한다. 방사선 조사 및 이식에 대한 염증 반응의 적혈구생성 원상복구 및 중지를 위해 3주 동안 방치한 후, 500 μl 사혈 후 15시간에서의 헵시딘 억제를 표현형 판독 표지로서 사용할 수 있다. 생착 및 공여 세포 우세 여부는 골수 DNA의 qPCR에 의해 교란된 Erfe 알릴(allele)에 비한 온전한 알릴로 확인할 수 있고 Erfe의 생산은 qRT-PCR(또는 ELISA, 등)에 의해 평가할 수 있다. 표현형은 골수와 함께 전달될 것으로 예상된다. 가능성이 없는 대안적인 결과에서, 다른 세포 유형이 에리트로페론에 대한 공급원으로서 검정될 수 있다.

EPO에 의한 조절 - EPO는 에리트로페론 발현에 대해 이중의 효과를 가질 수 있다: 1) 전기 적혈구모세포-호염기성 적혈구모세포 단계를 통해 전구체의 생존을 촉진시킴으로써 에리트로페론을 발현하는 세포 (중기 적혈구모세포)의 수를 증가시키거나, 2) 에리트로페론 mRNA 농도를 직접적이거나 간접적으로 조절할 수 있다. Erfe는 마우스에서 EPO 주입 후 4시간에 거의 최대로, 30-배 가량 증가하는데(도 4), 상기 시점에 비장 또는 골수 적혈구계 전구세포의 수는 단지 소폭 상승하기 때문에, 두 번째 메커니즘이 지배적이며 EPO에 대한 반응은 아마도 적혈구모세포-자율적일 것이다. 그럼에도 불구하고, EPO에 의한 조절은 하기처럼 측정될 수 있다: 간략하게, 갓 채취한 마우스 골수 세포를 배지에 0-2.5 u/ml 농도의 EPO를 보충하며 4시간 동안 배양하고 이후 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 적혈구계 세포를 분류한다. 각각의 적혈구 성숙 단계는 EPO 용량의 함수로서 Erfe 발현에 관한 qRT-PCR에 의해 분석될 것이다.

에리트로페론은 기초적인 적혈구 생성에서는 필요하지 않기 때문에, 에리트로페론은 EPO 수용체 (EPOR) 스트레스 경로에 의해 조절될 것이다. Stat5는 스트레스성 적혈구 생성-활성화 유전자에 대한 EPO-EPOR/Jak2 경로의 주요 전사 인자이고 (Teglund 1998; Menon 2006) 게노메틱스(Genomatix) 소프트웨어를 이용한 마우스 및 인간 에리트로페론 프로모터의 3킬로염기의 분석은 다중 기능의 Stat5 (또는 다른 Stat) 결합 원소 및 GATA-결합 모티프를 나타내었다. 그러므로, Erfe 전사가 다음에 따른 Stat 경로에 의해 조절되는지 확인해볼 수 있다. 마우스 태아 간 및 마우스 골수로부터의 적혈구계 전구체를 배양하고 (England 2011), Stat5 저해제(피모지드 또는 N'-((4-옥소-4H-크로멘-3-일)메틸렌)니코티노하이드라지드)와 함께 또는 없이 차등한 농도의 EPO로 4시간 동안 처리하고 Erfe mRNA 수준에 대한 효과를 qPCR에 의해 평가한다. 만일 적혈구모세포가 Stat5 저해제에 대한 짧은 노출을 견디지 못하면, EPO 처리 하에 적혈구계 분화로 들어가는 UT7 세포주 또는 헤모글로빈 (Wong 2010) 또는 J2E 세포주 (Greene 2002)를 생성할 수 있는 능력이 있는 적혈구계 전구세포 세포주인 연속성 CD36E 세포주를 이용할 수 있다. 이들 세포주 및 Erfe 프로모터 루시페라아제를 이용하여 추정상의 Stat5 결합 부위의 구성 부위-공략성 돌연변이유발을 수행하여 EPO가 Erfe 프로모터를 조절하는 메커니즘을 시험한다. 마지막으로, 만일 이들 접근법이 STAT5 경로가 Erfe 발현을 조절하는지 성공적으로 결정하지 못하는 경우, 차등한 STAT5 반응에서 마우스 EPOR-HM 마우스 결핍체를 얻어서 이들 마우스가 EPO에 대응하여 Erfe를 조절하는지 결정할 수 있다. Porpiglia 2012를 참조한다. 이보다 가능성이 적으나, STAT5보다 EPO 수용체 신호전달의 하나 이상의 대안적 경로가 Erfe를 조절하는데 더 중요할 수도 있다. 일반적으로, 이들 경로는 훨씬 덜 이해되어있지만 PI3-키나아제 및 MAP-키나아제 경로를 포함하며, 적혈구모세포 생존 및 증식의 조절에 대부분 관여한다. Richmond 2005; Bouscary 2003를 참조한다.

EPO 용량 의존성 - EPO의 치료적 용량은 심지어 정상 또는 증가된 내인성 EPO 생산의 조건 하에서, 및 심지어 염증 및 철분 과다의 경우에도 불구하고 헵시딘 농도를 낮춘다. Huang 2009을 참조한다. 이러한 EPO의 중요한 효과는 이해되어 있지 않으며, 헵시딘이 상승되고 철이 대식 세포 내로 고립되는 염증성 빈혈 및 암성 빈혈에서 그의 치료적 효과를 제공할 수 있기 때문에 중요하다. Erfe KO 및 이형접합체 동물에서 차등한 용량의 EPO (일회 주입, 0.2-200 U)에 대한 간 헵시딘 mRNA 및 혈청 헵시딘의 반응을 WT 대조군에 비교하여 용량 의존성을 측정할 수 있다. WT 마우스에서의 예비 데이터에서 나타난 바와 같이, EPO 주입은 헵시딘 또는 Erfe mRNA 발현의 시간-경과에 있어서 일회성 사혈과 동일한 효과를 가졌고, 따라서 EPO-주입된 Erfe ^-/- 마우스가 사혈을 수행한 Erfe ^-/-과 유사하게 헵시딘을 억제하지 못할 것이 예상된다. 헵시딘을 억제하는 대안적인 경로가 더 높은 농도의 EPO에서 Erfe ^-/- KO 마우스에서 발견될 수도 있다. 비록 헵시딘 발현에 대한 EPO의 직접적인 효과가 보고되었으나 (Pinto 2008), 그러한 억제는 본 발명자들에 의한 실험에서 관찰되지 않았다. 만일 고용량 EPO가 Erfe ^-/- 마우스에서 헵시딘을 억제한다면, 고농도의 EPO가 간접적으로, 아마도 일부 일차 간세포 배양에서 또한 혼입될 수 있는 간세포가 아닌 세포 집단에 작용함으로써 간 내 헵시딘 mRNA를 억제할 수 있는지 재실험해볼 수 있다.

용혈로부터의 빈혈 - 페닐하이드라진-유도된 용혈 모델은 마우스에서의 스트레스성 적혈구 생성의 연구를 위해 전통적으로 사용되며, 빈혈은 헵시딘 억제와 연관된다 (Nicolas 2002). 상기 모델은 회복이 헴(heme)과 철 재사용에 의존된다는 점에서 다량 출혈성 빈혈과 다르다. 페닐하이드라진 100 mg/kg(Lim 1998)의 일회 투여 후 급성 용혈성 빈혈로부터의 회복에 대한 Erfe 소모의 효과를 분석할 수 있다. 마우스를 완전한 혈구 수치, 적혈구 성숙에 대해 제2일, 제4일 및 제6일에 유세포 분석, 헵시딘 발현, 및 철 변수에 의해 분석할 것이다. 헵시딘이 Erfe ^-/- 마우스에서 억제되지 않을 것이며 이들이 지연된 적혈구 회복을 가질 것임이 예상된다.

보충적 식이 철 흡수 및 저장분으로부터의 철 배출 - 인간에서, 식이 철 흡수는 총 일일 철 필요량의 10% 미만을 차지하여 대부분의 철이 노화 적혈구를 재사용하는 대식 세포로부터 전달된다. 표준 사료를 먹는 마우스에서는 그러나, 식이 흡수가 총 일일 철 요구량의 약 50%를 제공한다. Ramos 2011를 참조한다. 따라서, 다량 출혈로부터의 회복 도중 재사용된 철에 비한 식이 철의 이용에 Erfe 소모가 분명한 효과를 갖는 경우와 구별하기 위해, 마우스 철 저장 및 식이 철 함량을 조작할 수 있다. 식이 철 흡수에 대한 Erfe 결핍의 영향을 평가하기 위해, 먼저 동물에게 2주간 4 ppm 사료를 줌으로써 철 저장분을 고갈시킨다. 일단 한 마우스 소집단에서 간 및 비장 철의 기초선 분석에 의해 확인하여 철 저장분이 낮으면, 또 다른 집단의 동물에게 500 μl 사혈을 수행하고 철이-충분한 (300 ppm) 사료를 급여한다. 철 재사용 및 저장분으로부터의 동원에 대한 Erfe의 효과를 평가하기 위해, 마우스를 철 덱스트란으로 전처리하여 500 μl 혈액 손실 (300 μg의 철)을 보상하는 충분한 철 저장분을 제공하고, 한 주 후에 사혈을 수행하고 4 ppm 철-결핍 사료를 급여한다. Erfe KO 마우스에서 헵시딘 억제의 결여는 저장된 철의 방출 및 사료로부터의 철의 흡수 둘 다에서 보상적인 증가를 못하게 할 것임이 예상된다. 다른 결과는 다른 이들 (Chaston 2008)에 의해 보고된 바와 같이 대식 세포 철 수송에 비한 장의 철 수송의 차별적인 조절 가능성 또는 이들의 조절에 있어서 너무 많은 경로가 있을 가능성을 부를 것이다.

다른 가능한 활성: Erfe가 골수 환경에 약간의 영향을 주는 경우가 가능하다. 주요한 영향을 알아내기 위해 Erfe-과발현성, Erfe ^-/- 및 WT 마우스에서 대퇴골 단면의 형태학을 비교할 수 있다. 이들 마우스에서 적혈구의 계통을 비교하기 위해, 전체 비장 및 골수 세포를 c-kit, Ter119, CD71 및/또는 CD44의 발현 수준을 기초로 하여 유세포 분석에 의해 분석할 수 있다. Socolovsky 2007; Chen 2009를 참조한다.

2. 에리트로페론 특징분석, 이의 활성 및 작용 메커니즘

세포내 및 세포외 동형(isoform)을 비롯한 에리트로페론의 질량 및 조성, 및 이의 기능적 성분을 구성하기 위한 성능 도메인 결실 분석을 특징분석할 수 있다. 에리트로페론이 순환계로 분비되는지 및 그것이 직접적으로 간에 효과를 주는지를 또한 결정할 수 있다. 에리트로페론의 재조합 및/또는 합성 형태를 사용하여 생체내 및 시험관내 헵시딘 발현에 대한 효과를 검사할 수 있다. 에리트로페론이 적혈구계 전구체 및 이들의 분화, 뿐만 아니라 에리트로페론 수용체에 주는 영향을 검사할 수 있다.

물리화학적 및 조성 특징 - C-말단 FLAG 및 6-히스티딘 태그에 융합된 마우스 및 인간 에리트로페론 cDNA 서열을 인코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK293T 세포(프리스타일(Freestyle) 293 발현 시스템, 인비트로겐(Invitrogen))의 중간 규모의 일시적인 형질감염을 수행할 수 있다. 포유동물 세포에서의 발현은 재조합 단백질이 현실적으로 생존가능한 자연 형태와 가까워질 가능성을 높인다. 세포 용해물로부터의 세포내 형태 및 매체로부터의 분비 형태를 정제하고 검정할 수 있다. 앞의 실험을 기초로 하여, 생체내 및 시험관내 처리를 위해 사용될 수 있는 충분히 순수한 단백질을 얻기 위해서 2-단계 정제가 바람직하다. 그러므로, 재조합 에리트로페론의 최초의 정제는 먼저 하나의 C-말단 태그에 대해 특이적인 친화성 비드를 이용하여 이루어질 수 있고 최종 정제는 HPLC에 의해 이루어질 수 있다. 정제 도중 또는 태그에 의해 일어날 수 있는 활성의 저해를 막기 위해, 부분적으로 정제된 분획 및 태그를 제거하기 위해 처리된 단백질의 활성을 또한 시험해볼 수 있다. 정제된 단백질은 겔 투과 크로마토그래피 및 SDS-PAGE를 이용하여 크기에 따라 특징분석될 수 있고, 이후 서열은 N-말단 에드만(Edman) 분해 및 엔도프로테아제 절단 및 단편화 질량 분석법에 의해 결정될 수 있다. 에리트로페론에 대응하는 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 이용하여, 배양액에서 EPO-촉진된 쥐의 적혈구모세포에 의해 분비된 Erfe에 대한 재조합 단백질의 크기를 비교할 수 있다.

ERFE 폴리펩티드 및 활성 - 두 가지 상호보완적인 접근법에 의해 ERFE 폴리펩티드의 기능적 형태 및 도메인을 분석할 수 있다. 첫 번째에서, 부분적으로 또는 완전히 정제된 용해성이고 세포-유래된 ERFE를 마우스에 주입함으로써 생체활성을 시험한다. 두 번째 접근법에서, 렌티바이러스 송달 방법을 사용하여 Erfe 변종을 연구하며 여기서 단백질은 개별적인 구조적 도메인의 부분 또는 전부를 제거하기 위해 변형된다. 처음에는, 유전적 신호전달 서열을 치환하고 상기 단백질을 N-말단 절단 분석으로 처리하여 N-말단 도메인 (NTD1) 및/또는 콜라겐 도메인 (도 12)을 제거하고 이들이 생체내 Erfe 활성을 위해 중요한지 결정할 수 있다. N-말단 도메인 2 (NTD2)은 이의 Cys142가 이황화 결합에 관여할 수 있기 때문에 완전히 제거되기가 더 어려울 수 있지만 적어도 이의 반쪽 N-말단은 제거될 것이다. 다른 사이토킨과 이의 상동성을 기반으로, TNF-유사 C-말단은 활성인 모이어티이며, 다른 도메인들은 합성, 분비 또는 가능한 대안적인 기능 가령 막-결합 형태의 Erfe의 세포-대-세포 신호전달을 촉진한다고 예상된다. 두 접근법 모두에서, 4-15 시간 후 판독 표지는 간에서 헵시딘 mRNA 발현의 면역검정 및 qPCR 측정에 의한 혈청 헵시딘을 포함할 것이다. 마우스에게 약한 철분 과다를 야기하는 "표준" 사료(전형적으로 270-300 ppm)를 줄 경우 헵시딘을 촉진하는 강한 철 신호전달로부터의 방해를 방지하기 위해, 주입 전 2주동안 마우스에게 저 (4 ppm Fe) 또는 충분한 (50 ppm Fe) 철 사료를 급여할 수 있다. 이러한 예비 컨디셔닝은 긍적적 및 부정적 자극 모두에서 헵시딘의 반응성을 확실히 할 수 있다.

적혈구 성숙 - 에리트로페론은 또한 직접적으로 또는 철 송달에 영향을 줌으로써 적혈구 증가 및 성숙에 영향을 줄 수 있다. 철 결핍성 빈혈 이후 철 과다는 유핵 적혈구 세포를 2.5-배, 및 적혈구모세포를 최대 3.9 배로 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 철 이용가능성이 적혈구모세포 증가를 제한함을 나타낸다. 예비 연구에서, 유세포 분석 (Ter119, CD71, CD44 마커) (Socolovsky 2007; Chen 2009)을 사용하여 사혈을 수행한 야생형, 이형접합체 및 KO 마우스의 골수 및 비장에서 적혈구모세포 성숙을 처리-안된 한배 자손 대조군에 비교하여 분석하였다. 사혈 후 72시간에, Erfe ^-/- 마우스 내 적혈구 세포는 WT와 이형접합체에 비해 덜 성숙한 것으로 보였지만, 더 많은 죽은 세포는 관찰할 수 없었고, 따라서 이는 Erfe가 아폽토시스에 대해 적혈구모세포 보호의 기능을 수행하지 못함을 시사한다. KO 마우스가 상대적으로 더 적은 미숙한 전구체 (초기 적혈구모세포)를 가지는 것으로 보이며 아폽토시스는 Erfe KO 마우스에서 차이가 없는 것으로 보이기 때문에, Erfe가 초기 전구세포 증식 및 분화의 조절 역할을 하지 못할 수 있다.

적혈구 생성에서 에리트로페론의 역할은 적혈구생성 촉발 후 다양한 시간 간격으로 수집한 비장 및 골수 전구세포의 유세포 분석에 의해, 그리고 배양된 태아 간 전구세포에서의 역할은, Erfe KO 마우스를 WT 마우스에 비교함으로써 연구할 수 있다. 또한 적혈구 생성에 대한 주입된 에리트로페론의 효과는 Erfe KO 및 WT 마우스 둘다에서 유사한 방법을 이용하여 연구할 수 있다. 적혈구모세포 분화는 Ter119, CD71 및/또는 CD44 발현에 의해 특징분석할 수 있다. 아폽토시스 신호전달 및 세포사는 각각 아넥신(Annexin)V 및 7-아미노-악티노마이신 D (7-AAD)로 염색함으로써 평가할 수 있다.

생체내 Erfe 처리 후 성숙 단계간 적혈구계 전구체 숫자 및 분포의 유세포 분석은 적혈구계 전구체 증식 또는 성숙에 대한 Erfe의 어떠한 중요한 효과도 나타낼 것이다. 그러나, 이들 방법으로는 상기 효과가 철 및 헵시딘에 의해 매개된 것인지 또는 적혈구계 전구체에 대한 Erfe의 직접적 효과에 의한 것인지 알 수 없을 것이다. 이 문제에 대답하기 위해서는, 철 (홀로트랜스페린)이 배지에 존재하고 헵시딘 농도는 매우 낮은 태아 간 적혈구계 전구체 배양액에 부가된 Erfe의 효과를 연구할 수 있다. WT 및 Erfe ^-/- 마우스로부터의 14.5-15.5 일 태아 간 적혈구계 전구체의 시험관내 배양은 부가된 재조합 Erfe의 존재 또는 부재에서 수행할 수 있다. 적혈구계 전구체의 성숙은 앞서와 마찬가지로 유세포 분석에 의해 분석할 수 있다. 모든 이들 연구에서, Erfe KO와 WT 마우스 사이 그리고 Erfe- 및 가짜(sham)-처리 조건 사이에 전구체 집단 또는 세포사/아폽토시스 지수를 비교할 수 있다.

ERFE 수용체 - TNFα에 대한 에리트로페론의 유사성을 기초로, 에리트로페론 수용체는 TNF 수용체 (TNFR) 패밀리에 속할 수 있다. 상기 패밀리 내 몇몇 수용체는 희귀하며, 즉, 임의의 공지된 리간드가 결여되어 있다. Bossen 2006을 참조한다. 따라서, 유세포 분석에 의해 공지의 쥐 및 인간 TNFR 패밀리의 발현 라이브러리를 선별할 수 있다. 수용체 구조체는 HEK293 세포에서 일시적으로 발현될 수 있고 (Bossen 2006) 이들을 쥐의 또는 인간 에리트로페론의 FLAG-태그된 형태로 염색하고 (도 10G) 그 후에 비오티닐화 항-FLAG M2 항체 및 PE-연결된 스트렙타비딘으로 염색할 수 있다. 공지의 TNFR 패밀리 중 어느 것도 에리트로페론에 결합하지 않는다면, 384-웰 플레이트 및 고처리량 형광 현미경에서 부착 세포를 이용하여 마우스 및 인간 cDNA 발현 라이브러리로부터의 모든 수용체-유사 분자의 로봇식 고처리량 선별을 수행할 수 있다. 선별된 것(hit)은 유세포 분석 확인을 거칠 수 있다. 모든 규명된 수용체의 발현 패턴은 에리트로페론의 표적 조직(매개체가 직접 작용하는 경우에는 간세포)에서 수용체가 발현되는지 확인하기 위해, 및 에리트로페론에 대해 가능한 추가적인 조직 및 기관 표적을 알아내기 위해 조직 발현 데이터베이스 (예컨대, 넥스트바이오 보디 아틀라스(NextBio Body Atlas))의 검사에 의해 선별될 수 있다. 또한 에리트로페론과 상호작용하는 단백질을 알아내기 위해 생화학적 접근법을 취할 수 있다. 에리트로페론 및/또는 ERFE 폴리펩티드를 자기(magnetic) 비드에 고정시키고, 마우스 일차 간세포 (또는 선행 연구에서 ERFE 표적으로서 식별되는 다른 세포 유형)의 막 또는 세포 용해물로부터 임의의 결합 단백질을 추출하기 위해 사용할 수 있다. 상기 복합체는 HPLC-질량 분석법을 이용하여 확인할 수 있다. 일단 에리트로페론 수용체가 확인되면, 다른 수용체 (존재할 경우)와의 유사성을 이용하여 가능한 신호전달 메커니즘을 예측할 수 있다.

3. 헵시딘 억제와 연관된 철분 과다 장애에서 에리트로페론이 증가되는가

건강한 지원지 및 환자 혈청 샘플뿐만 아니라 마우스 모델에서 에리트로페론 농도를 검정하여 에리트로페론이 비효과적인 적혈구 생성을 갖는 빈혈에서 병리적 헵시딘 억제제로서 작용함을 확인할 수 있다.

정상 및 병리적 에리트로페론 농도 - 에리트로페론 및/또는 ERFE 폴리펩티드에 대응하는 항-에리트로페론 항체를 개체 내 정상 및 비정상 에리트로페론 농도를 측정하기 위해 사용할 수 있다. Erfe 단백질의 두 가지 상이한 에피토프에 대한 항-마우스 Erfe 항체가 웨스턴 블롯에서 재조합 단백질과 강하게 반응하는 것으로 밝혀졌다 (도 9C). ELISA 검정을 사용하여 정상인 개체 및 사혈, 용혈성 빈혈 또는 빈혈로부터의 회복 후 개체, 및 철 결핍성 빈혈을 비롯한 철 장애 및 다양한 형태의 지중해성 빈혈, 가령 중간 지중해성 빈혈을 앓고 있는 개체를 포함하는 개체에서 ERFE의 순환계 수준을 측정할 수 있다.

에리트로페론의 소모 - 헵시딘은 중간 지중해성 빈혈을 갖는 환자에서 결핍이며 (Papanikolaou 2005; Origa 2007) 이는 왜 이들 환자가 적혈구 수혈 또는 임의의 다른 비식이 철의 공급원이 없음에도 식이 철을 과도하게 흡수하며 철분 과다를 일으키는지 설명해준다. β-지중해성 빈혈에서 병원성 헵시딘 억제제로서 에리트로페론의 역할을 설명하기 위해, 중간 지중해성 빈혈을 위한 마우스 모델, 가령 Hbb^th3/+에서 헵시딘 발현 및 간의 철분 과다에 대한 Erfe 소모의 효과를 분석할 수 있다. Hbb^th3/+ 마우스는 Hb 수준 7-9 g/dL, 5-내지 10-배 증가된 순환하는 EPO 농도 및 골수외의 부위를 비롯한 비효과적인 적혈구 생성을 가지며, 이용가능한 두 가지 β-중간 지중해성 빈혈 중 더 심각한 모델이다. 헵시딘은 낮게 나타나지만 결국은 간의 철분 과다가 6 개월령의 계통 대조군의 그것보다 3- 내지 5-배 증가하기 때문에 "정상" 수준까지 올라간다. Gardenghi 2007; Nai 2012을 참조한다.

예를 들면, 6 개월-령 Hbb^th3/+ 마우스 및 이들의 WT 계통 대조군에서 Erfe 수준을 측정하여 높은 수준의 Erfe가 부적절하게 낮은 수준의 헵시딘의 원인이 될 수 있는지 결정하였다. Erfe mRNA가 WT 마우스에 비해 Hbb^th3/+ 마우스의 골수와 비장에서 크게 증가함이 나타났다 (도 11). 증가된 Erfe가 상기 모델에서 관찰된 철분 과다의 원인인지 시험해보기 위해, Erfe 발현을 제거하여 영향을 평가할 수 있다. Erfe 유전자는 마우스 염색체 1 위에 있고 베타 글로빈 유전자는 마우스 염색체 7위에 있으므로 중간 지중해성 빈혈 마우스에서 다른 유전자에 대해 수행했던 것처럼 교배시켜 Hbb^th3/+ Erfe ^-/- 마우스를 만들 수 있다. Nai 2012; Gardenghi 2010를 참조한다. C57B/6J 바탕의 Hbb^th3/+ 마우스는 잭슨 연구소(Jackson Labs)에서 입수할 수 있다 (B6.129P2-Hbb-b1tm1Unc Hbb-b2tm1Unc/J, 물품 번호, 002683).

하기 참고문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다:

Ashby, D.R., et al. (2010). Erythropoietin administration in humans causes a marked and prolonged reduction in circulating hepcidin. Haematologica 95, 505-508.

Bossen, C., et al. (2006). Interactions of Tumor Necrosis Factor (TNF) and TNF Receptor Family Members in the Mouse and Human. J. Biol. Chem. 281, 13964-13971.

Bouscary, D., et al. (2003). Critical role for PI 3-kinase in the control of erythropoietin-induced erythroid progenitor proliferation. Blood 101, 3436-3443.

Bramey, T., et al. (2009). No evidence for protective erythropoietin alpha signalling in rat hepatocytes. BMC Gastroenterology 9, 26.

Casanovas, et al. (2013) The murine growth differentiation factor 15 is not essential for systemic iron homeostasis in phlebotomized mice. Haematologica. 98(3):444-447.

Centis, F., et al. (2000). The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with β-thalassemia major. Blood 96, 3624-3629.

Chaston, T., et al. (2008). Evidence for differential effects of hepcidin in macrophages and intestinal epithelial cells. Gut 57, 374-382.

Chen, K., et al. (2009). Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. PNAS USA 106, 17413-17418.

Clark, R.J., et al. (2011). Understanding the structure/activity relationships of the iron regulatory peptide hepcidin. Chem. Biol 18, 336-343.

Duran-Struuck 및 Dysko (2009). Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am. Assoc. Lab. Anim Sci 48, 11-22.

England, S.J., et al. (2011). Immature erythroblasts with extensive ex vivo self-renewal capacity emerge from the early mammalian fetus. Blood 117, 2708-2717.

Fernandes, A., et al. (2009). The molecular basis of hepcidin-resistant hereditary hemochromatosis. Blood 114, 437-443.

Finch, C. (1994). Regulators of iron balance in humans. Blood 84, 1697-1702.

Ganz 및 Nemeth (2011). Hepcidin and disorders of iron metabolism. Annu. Rev. Med. 62, 347-360.

Ganz 및 Nemeth (2012). Iron metabolism: interactions with normal and disordered erythropoiesis. Cold Spring. Harb. Perspect. Med. 2, a011668.

Ganz, T., et al. Mini-Hepcidin Peptides and Methods of Using thereof. Patent Application. US 2012/0040894 A1. 6-10-2010.

Ganz, T., et al. (2008). Immunoassay for human serum hepcidin. Blood 112, 4292-4297.

Gardenghi, S., et al. (2010). Hepcidin as a therapeutic tool to limit iron overload and improve anemia in beta-thalassemic mice. J Clin. Invest 120, 4466-4477.

Gardenghi, S., et al. (2007). Ineffective erythropoiesis in β-thalassemia is characterized by increased iron absorption mediated by down-regulation of hepcidin and up-regulation of ferroportin. Blood 109, 5027-5035.

Ghoti, H., et al. (2011). Increased serum hepcidin levels during treatment with deferasirox in iron-overloaded patients with myelodysplastic syndrome. Br. J Haematol. 153, 118-120.

Goodnough, J.B., et al. (2012). Inhibition of hepcidin transcription by growth factors. Hepatology 56, 291-299.

Greene, W.K., et al. (2002). Enforced expression of HOX11 is associated with an immature phenotype in J2E erythroid cells. Br. J. Haematol 118, 909-917.

Horiuchi, T., et al. (2010). Transmembrane TNF-α: structure, function and interaction with anti-TNF agents. Rheumatology 49, 1215-1228.

Hrinda 및 Goldwasser (1969). On the mechanism of erythropoietin-induced differentiation. VI. Induced accumulation of iron by marrow cells. Biochim. Biophys. Acta 195, 165-175.

Huang, H., et al. (2009). Contribution of STAT3 and SMAD4 pathways to the regulation of hepcidin by opposing stimuli. Blood. 113(15): 3593-3599.

Karur, V.G., et al. (2006). Lyn kinase promotes erythroblast expansion and late-stage development. Blood 108, 1524-1532.

Kattamis, A., et al. (2006). The effects of erythropoetic activity and iron burden on hepcidin expression in patients with thalassemia major. Haematologica 91, 809-812.

Kimura, H., et al. (1986). Hematopoiesis in the rat: Quantitation of hematopoietic progenitors and the response to iron deficiency anemia. J. Cell. Physiol. 126, 298-306.

Lim, S.K., et al. (1998). Increased susceptibility in Hp knockout mice during acute hemolysis. Blood 92, 1870-1877.

Liu, Y., et al. (2006). Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood 108, 123-133.

Maes, K., et al. (2010). In anemia of multiple myeloma, hepcidin is induced by increased bone morphogenetic protein 2. Blood 116, 3635-3644.

Mastrogiannaki, M., et al. (2011). Hepatic HIF-2 down-regulates hepcidin expression in mice through epo-mediated increase in erythropoiesis. Haematologica.

Menon, M.P., et al. (2006). Signals for stress erythropoiesis are integrated via an erythropoietin receptor-phosphotyrosine-343-Stat5 axis. J Clin Invest 116, 683-694.

Merryweather-Clarke, A.T., et al. (2011). Global gene expression analysis of human erythroid progenitors. Blood 117, e96-e108.

Nai, A., et al. (2012). Deletion of TMPRSS6 attenuates the phenotype in a mouse model of beta-thalassemia. Blood 119, 5021-5029.

Nemeth, E., et al. (2006). The N-terminus of hepcidin is essential for its interaction with ferroportin: structure-function study. Blood 107, 328-333.

Nemeth, E., et al. (2004a). IL-6 mediates hypoferremia of inflammation by inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin. J Clin. Invest 113, 1271-1276.

Nemeth, E., et al. (2005). Hepcidin is decreased in TFR2 hemochromatosis. Blood 105, 1803-1806.

Nemeth, E., et al. (2004b). Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science 306, 2090-2093.

Nemeth, E., et al. (2003). Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood 101, 2461-2463.

Nicolas, G., et al. (2002). The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia, hypoxia, and inflammation. J Clin. Invest 110, 1037-1044.

Origa, R., et al. (2007). Liver iron concentrations and urinary hepcidin in beta-thalassemia. Haematologica 92, 583-588.

Pak, M., et al. (2006). Suppression of hepcidin during anemia requires erythropoietic activity. Blood 108, 3730-3735.

Papanikolaou, G., et al. (2005). Hepcidin in iron overload disorders. Blood 105, 4103-4105.

Park, C.H., et al. (2001). Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver. J. Biol. Chem. 276, 7806-7810.

Pinto, J.P., et al. (2008). Erythropoietin mediates hepcidin expression in hepatocytes through EPOR signaling and regulation of C/EBPalpha. Blood 111, 5727-5733.

Pippard, M.J., et al. (1979). IRON ABSORPTION AND LOADING IN [beta]-THALASSEMIA INTERMEDIA. The Lancet 314, 819-821.

Porpiglia, E., et al. (2012). Stat5 Signaling Specifies Basal versus Stress Erythropoietic Responses through Distinct Binary and Graded Dynamic Modalities. PLoS Biol 10, e1001383.

Preza, G.C., et al. (2011). Minihepcidins are rationally designed small peptides that mimic hepcidin activity in mice and may be useful for the treatment of iron overload. J Clin. Invest 121, 4880-4888.

Qiao, B., et al. (2012). Hepcidin-induced endocytosis of ferroportin is dependent on ferroportin ubiquitination. Cell Metab 15, 918-924.

Ramos, E., et al. (2011). Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology 53, 1333-1341.

Ramos, E., et al. (2012). Minihepcidins prevent iron overload in a hepcidin-deficient mouse model of severe hemochromatosis. Blood. 120(18): 3829-3836.

Ramos, P., et al. (2010). Iron metabolism and ineffective erythropoiesis in beta-thalassemia mouse models. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1202, 24-30.

Ravasi, G., et al. (2012). Hepcidin expression in iron overload diseases is variably modulated by circulating factors. PLoS. ONE. 7, e36425.

Richmond, Terri D., et al. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in Cell Biology 15[3], 146-155. 3-1-2005.

Rivera, S., et al. (2005a). Hepcidin excess induces the sequestration of iron and exacerbates tumor-associated anemia. Blood 105, 1797-1802.

Rivera, S., et al. (2005b). Synthetic hepcidin causes rapid dose-dependent hypoferremia and is concentrated in ferroportin-containing organs. Blood 106, 2196-2199.

Sadahira, Y., et al. (2000). Impaired splenic erythropoiesis in phlebotomized mice injected with CL2MDP-liposome: an experimental model for studying the role of stromal macrophages in erythropoiesis. J Leukoc Biol 68, 464-470.

Seldin, M.M., et al. (2012). Myonectin (CTRP15), a novel myokine that links skeletal muscle to systemic lipid homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 11968-11980.

Sham, R.L., et al. (2009). Hereditary hemochromatosis due to resistance to hepcidin: high hepcidin concentrations in a family with C326S ferroportin mutation. Blood 114, 493-494.

Socolovsky, M. (2007). Molecular insights into stress erythropoiesis. Curr. Opin. Hematol. 14, 215-224.

Tanno, T., et al. (2007). High levels of GDF15 in thalassemia suppress expression of the iron regulatory protein hepcidin. Nat. Med. 13, 1096-1101.

Tanno, T., et al. (2010a). Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease. Curr. Opin. Hematol. 17, 184-190.

Tanno, T., et al. (2009). Identification of TWSG1 as a second novel erythroid regulator of hepcidin expression in murine and human cells. Blood 114, 181-186.

Tanno, T., et al. (2010b). Expression of growth differentiation factor 15 is not elevated in individuals with iron deficiency secondary to volunteer blood donation. Transfusion 50, 1532-1535.

Teglund, S., et al. (1998). Stat5a and Stat5b proteins have essential and nonessential, or redundant, roles in cytokine responses. Cell 93, 841-850.

Vokurka, M., et al. (2006). Hepcidin mRNA levels in mouse liver respond to inhibition of erythropoiesis. Physiol Res. 55, 667-674.

Wong, S., et al. (2010). Establishment of an erythroid cell line from primary CD36+ erythroid progenitor cells. Exp. Hematol. 38, 994-1005.

Zhang, J., et al. (2003). Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood 102, 3938-3946.

본 발명의 개시를 이해하거나 완벽히 하기 위해 필수적인 정도까지, 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 본 명세서에 참고로서 마치 각각의 문헌이 개별적으로 포함된 것과 같은 정도로 명백하게 포함된다.

따라서 기술된 본 발명의 예시적인 구체예를 볼 때에, 당해 분야의 숙련가는 이것이 개시 내에서 오로지 예시적이며 다양한 다른 대안, 각색 및 변형이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있음에 주의해야 한다. 그러므로, 본 발명은 본 명세서에 예시된 특정한 구체예에 제한되지 않으며, 다만 이어지는 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California <120> ERYTHROFERRONE AND ERFE POLYPEPTIDES AND METHODS OF REGULATING IRON METABOLISM <130> 034044.119WO1 <150> 61/721,322 <151> 2012-11-01 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 354 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Ala Arg Arg Pro Ala Gly Ala Arg Leu Leu Leu Val Tyr 1 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ser Pro Glu Pro 20 25 30 Gly Ala Pro Ser Arg Ser Arg Ala Arg Arg Glu Pro Pro Pro Gly Asn 35 40 45 Glu Leu Pro Arg Gly Pro Gly Glu Ser Arg Ala Gly Pro Ala Ala Arg 50 55 60 Pro Pro Glu Pro Thr Ala Glu Arg Ala His Ser Val Asp Pro Arg Asp 65 70 75 80 Ala Trp Met Leu Phe Val Arg Gln Ser Asp Lys Gly Val Asn Gly Lys 85 90 95 Lys Arg Ser Arg Gly Lys Ala Lys Lys Leu Lys Phe Gly Leu Pro Gly 100 105 110 Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ile Ile Pro 115 120 125 Pro Glu Ala Leu Leu Lys Glu Phe Gln Leu Leu Leu Lys Gly Ala Val 130 135 140 Arg Gln Arg Glu Arg Ala Glu Pro Glu Pro Cys Thr Cys Gly Pro Ala 145 150 155 160 Gly Pro Val Ala Ala Ser Leu Ala Pro Val Ser Ala Thr Ala Gly Glu 165 170 175 Asp Asp Asp Asp Val Val Gly Asp Val Leu Ala Leu Leu Ala Ala Pro 180 185 190 Leu Ala Pro Gly Pro Arg Ala Pro Arg Val Glu Ala Ala Phe Leu Cys 195 200 205 Arg Leu Arg Arg Asp Ala Leu Val Glu Arg Arg Ala Leu His Glu Leu 210 215 220 Gly Val Tyr Tyr Leu Pro Asp Ala Glu Gly Ala Phe Arg Arg Gly Pro 225 230 235 240 Gly Leu Asn Leu Thr Ser Gly Gln Tyr Arg Ala Pro Val Ala Gly Phe 245 250 255 Tyr Ala Leu Ala Ala Thr Leu His Val Ala Leu Gly Glu Pro Pro Arg 260 265 270 Arg Gly Pro Pro Arg Pro Arg Asp His Leu Arg Leu Leu Ile Cys Ile 275 280 285 Gln Ser Arg Cys Gln Arg Asn Ala Ser Leu Glu Ala Ile Met Gly Leu 290 295 300 Glu Ser Ser Ser Glu Leu Phe Thr Ile Ser Val Asn Gly Val Leu Tyr 305 310 315 320 Leu Gln Met Gly Gln Trp Thr Ser Val Phe Leu Asp Asn Ala Ser Gly 325 330 335 Cys Ser Leu Thr Val Arg Ser Gly Ser His Phe Ser Ala Val Leu Leu 340 345 350 Gly Val <210> 2 <211> 340 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Ser Thr Arg Arg Pro Val Gly Ala Arg Thr Leu Leu Ala Cys 1 5 10 15 Ala Ser Leu Leu Ala Ala Met Gly Leu Gly Val Pro Glu Ser Ala Glu 20 25 30 Pro Val Gly Thr His Ala Arg Pro Gln Pro Pro Gly Ala Glu Leu Pro 35 40 45 Ala Pro Pro Ala Asn Ser Pro Pro Glu Pro Thr Ile Ala His Ala His 50 55 60 Ser Val Asp Pro Arg Asp Ala Trp Met Leu Phe Val Lys Gln Ser Asp 65 70 75 80 Lys Gly Ile Asn Ser Lys Arg Arg Ser Lys Ala Arg Arg Leu Lys Leu 85 90 95 Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly 100 105 110 Pro Phe Ile Pro Ser Glu Val Leu Leu Lys Glu Phe Gln Leu Leu Leu 115 120 125 Lys Gly Ala Val Arg Gln Arg Glu Ser His Leu Glu His Cys Thr Arg 130 135 140 Asp Leu Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Pro Ser Arg Val Pro Ala Ala 145 150 155 160 Gln Glu Leu Asp Ser Gln Asp Pro Gly Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 165 170 175 Ala Thr Leu Ala Gln Gly Pro Arg Ala Pro Arg Val Glu Ala Ala Phe 180 185 190 His Cys Arg Leu Arg Arg Asp Val Gln Val Asp Arg Arg Ala Leu His 195 200 205 Glu Leu Gly Ile Tyr Tyr Leu Pro Glu Val Glu Gly Ala Phe His Arg 210 215 220 Gly Pro Gly Leu Asn Leu Thr Ser Gly Gln Tyr Thr Ala Pro Val Ala 225 230 235 240 Gly Phe Tyr Ala Leu Ala Ala Thr Leu His Val Ala Leu Thr Glu Gln 245 250 255 Pro Arg Lys Gly Pro Thr Arg Pro Arg Asp Arg Leu Arg Leu Leu Ile 260 265 270 Cys Ile Gln Ser Leu Cys Gln His Asn Ala Ser Leu Glu Thr Val Met 275 280 285 Gly Leu Glu Asn Ser Ser Glu Leu Phe Thr Ile Ser Val Asn Gly Val 290 295 300 Leu Tyr Leu Gln Ala Gly His Tyr Thr Ser Val Phe Leu Asp Asn Ala 305 310 315 320 Ser Gly Ser Ser Leu Thr Val Arg Ser Gly Ser His Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Leu Leu Gly Leu 340 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 3 Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Pro <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 4 Ala His Ser Val Asp Pro Arg Asp Ala Trp Met Leu Phe Val 1 5 10 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 5 Ala His Ser Val Asp Pro Arg Asp Ala Trp Met Leu Phe Val Xaa Gln 1 5 10 15 Ser Asp Lys Gly Xaa Asn 20 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 6 Leu Leu Lys Glu Phe Gln Leu Leu Leu Lys Gly Ala Val Arg Gln Arg 1 5 10 15 Glu <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 7 Gly Pro Arg Ala Pro Arg Val Glu Ala Ala Phe 1 5 10 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 8 Val Xaa Arg Arg Ala Leu His Glu Leu Gly Xaa Tyr Tyr Leu Pro Xaa 1 5 10 15 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 9 Gly Leu Asn Leu Thr Ser Gly Gln Tyr 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 10 Ala Pro Val Ala Gly Phe Tyr Ala Leu Ala Ala Thr Leu His Val Ala 1 5 10 15 Leu <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Xaa Met Gly Leu Glu Xaa Ser Ser Glu Leu Phe Thr Ile Ser Val Asn 1 5 10 15 Gly Val Leu Tyr Leu Gln 20 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 12 Ser Ser Glu Leu Phe Thr Ile Ser Val Asn Gly Val Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 13 Thr Ser Val Phe Leu Asp Asn Ala Ser Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 14 Ser Leu Thr Val Arg Ser Gly Ser His Phe Ser Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 15 Ser Leu Thr Val Arg Ser Gly Ser His Phe Ser Ala Xaa Leu Leu Gly 1 5 10 15 Xaa <210> 16 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Phe Gln Leu Leu Leu Lys Gly Ala Val Arg Gln Arg Glu Arg Ala 1 5 10 15 Glu Pro Glu Pro Cys Thr Cys Gly Pro Ala Gly Pro Val Ala Ala Ser 20 25 30 Leu Ala Pro Val Ser Ala Thr Ala Gly Glu Asp Asp Asp Asp Val Val 35 40 45 Gly Asp Val Leu Ala Leu Leu Ala Ala Pro Leu Ala Pro Gly Pro Arg 50 55 60 Ala Pro Arg Val Glu Ala Ala Phe Leu Cys Arg Leu Arg Arg Asp Ala 65 70 75 80 Leu Val Glu Arg Arg Ala Leu His Glu Leu Gly Val Tyr Tyr Leu Pro 85 90 95 Asp Ala Glu Gly Ala Phe Arg Arg Gly Pro Gly Leu Asn Leu Thr Ser 100 105 110 Gly Gln Tyr Arg Ala Pro Val Ala Gly Phe Tyr Ala Leu Ala Ala Thr 115 120 125 Leu His Val Ala Leu Gly Glu Pro Pro Arg Arg Gly Pro Pro Arg Pro 130 135 140 Arg Asp His Leu Arg Leu Leu Ile Cys Ile Gln Ser Arg Cys Gln Arg 145 150 155 160 Asn Ala Ser Leu Glu Ala Ile Met Gly Leu Glu Ser Ser Ser Glu Leu 165 170 175 Phe Thr Ile Ser Val Asn Gly Val Leu Tyr Leu Gln Met Gly Gln Trp 180 185 190 Thr Ser Val Phe Leu Asp Asn Ala Ser Gly Cys Ser Leu Thr Val Arg 195 200 205 Ser Gly Ser His Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly Val 210 215 220 <210> 17 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Ala Pro Ala Arg Arg Pro Ala Gly Ala Arg Leu Leu Leu Val Tyr 1 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ser Pro Glu Pro 20 25 30 Gly Ala Pro Ser Arg Ser Arg Ala Arg Arg Glu Pro Pro Pro Gly Asn 35 40 45 Glu Leu Pro Arg Gly Pro Gly Glu Ser Arg Ala Gly Pro Ala Ala Arg 50 55 60 Pro Pro Glu Pro Thr Ala Glu Arg Ala His Ser Val Asp Pro Arg Asp 65 70 75 80 Ala Trp Met Leu Phe Val Arg Gln Ser Asp Lys Gly Val Asn Gly Lys 85 90 95 Lys Arg Ser Arg Gly Lys Ala Lys Lys Leu Lys Phe Gly Leu Pro Gly 100 105 110 Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ile Ile Pro 115 120 125 Pro Glu Ala Leu Leu Lys 130 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on sequences from Homo sapiens and Mus musculus. <400> 18 Pro Ser Arg Val Pro Ala Ala Gln Glu Leu 1 5 10

Claims (29)

1. ERFE 항체를 포함하는, 철 대사 질환의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물로서,
   (a) 철 대사 질환이 철분 과다 질환 또는 비정상적으로 낮은 수준의 헵시딘과 연관된 질환이고;
   (b) ERFE 항체가, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, X₁이 R이고 X₂가 V인 AHSVDPRDAWMLFVX₁QSDKGX₂N(서열 번호: 5), X₁이 E이고 X₂가 V이고 X₃이 D인 VX₁RRALHELGX₂YYLPX₃(서열 번호: 8), X₁이 I이고 X₂가 S인 X₁MGLEX₂SSELFTISVNGVLYLQ(서열 번호: 11), 및 X₁이 V이고 X₂가 V인 SLTVRSGSHFSAX₁LLGX₂(서열 번호: 15) 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ERFE 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 것인 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 철 대사 질환은 혈색소증, HFE 돌연변이 혈색소증, 페로포르틴 돌연변이 혈색소증, 트랜스페린 수용체 2 돌연변이 혈색소증, 헤모주벨린(hemojuvelin) 돌연변이 혈색소증, 헵시딘 돌연변이 혈색소증, 소아 혈색소증, 신생아 혈색소증, 헵시딘 결핍증, 수혈성 철분 과다, 지중해성 빈혈, 중간 지중해성 빈혈, 알파 지중해성 빈혈, 철적모구 빈혈, 포르피린증, 만발성 피부 포르피린증, 아프리카 철분 과다, 고페리틴혈증, 세룰로플라스민 결핍증, 무트랜스페린혈증, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 유전성 혈색소증, 철-과다 빈혈, 및 β-지중해성 빈혈로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
3. 철 대사 질환의 진단, 치료 또는 모니터링에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 시약, 장치, 설명서, 또는 이들의 조합과 함께 포장된, 하나 이상의 항- ERFE 항체를 포함하는 키트로서,
   (a) 철 대사 질환이 철분 과다 질환 또는 비정상적으로 낮은 수준의 헵시딘과 연관된 질환이고;
   (b) ERFE 항체가, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, X₁이 R이고 X₂가 V인 AHSVDPRDAWMLFVX₁QSDKGX₂N(서열 번호: 5), X₁이 E이고 X₂가 V이고 X₃이 D인 VX₁RRALHELGX₂YYLPX₃(서열 번호: 8), X₁이 I이고 X₂가 S인 X₁MGLEX₂SSELFTISVNGVLYLQ(서열 번호: 11), 및 X₁이 V이고 X₂가 V인 SLTVRSGSHFSAX₁LLGX₂(서열 번호: 15) 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ERFE 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 것인 키트.
4. 이하의 서열: GLPGPPGPPGPQGPPGP(서열 번호: 3), AHSVDPRDAWMLFV(서열 번호: 4), LLKEFQLLLKGAVRQRE(서열 번호: 6), GPRAPRVEAAF(서열 번호: 7), GLNLTSGQY(서열 번호: 9), APVAGFYALAATLHVAL(서열 번호: 10), SSELFTISVNGVLYLQ(서열 번호: 12), TSVFLDNASG(서열 번호: 13), 및 SLTVRSGSHFSA(서열 번호:14) 중 적어도 하나로 구성된 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체.
5. 제4항에 따른 항체를 포함하는 조성물.
6. 제4항에 따른 항체를 발현할 수 있는 하이브리도마 세포주.
7. ERFE 폴리펩티드에 결합된 적어도 하나의 항체를 포함하는 복합체로서, (i) 항체가 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, X₁이 R이고 X₂가 V인 AHSVDPRDAWMLFVX₁QSDKGX₂N(서열 번호: 5), X₁이 E이고 X₂가 V이고 X₃이 D인 VX₁RRALHELGX₂YYLPX₃(서열 번호: 8), X₁이 I이고 X₂가 S인 X₁MGLEX₂SSELFTISVNGVLYLQ(서열 번호: 11), 및 X₁이 V이고 X₂가 V인 SLTVRSGSHFSAX₁LLGX₂(서열 번호: 15) 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ERFE 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 ERFE 항체이고, (ii) 복합체의 적어도 하나의 항체 및 ERFE 폴리펩티드 중 하나 이상이 재조합 기술에 의해 제조되는 것인 복합체.
8. ERFE 폴리펩티드의 존재를 검출하고/거나 ERFE 폴리펩티드의 양을 측정하기 위한 ERFE 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 ERFE 폴리펩티드가 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, X₁이 R이고 X₂가 V인 AHSVDPRDAWMLFVX₁QSDKGX₂N(서열 번호: 5), X₁이 E이고 X₂가 V이고 X₃이 D인 VX₁RRALHELGX₂YYLPX₃(서열 번호: 8), X₁이 I이고 X₂가 S인 X₁MGLEX₂SSELFTISVNGVLYLQ(서열 번호: 11), 및 X₁이 V이고 X₂가 V인 SLTVRSGSHFSAX₁LLGX₂(서열 번호: 15) 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제

Images