KR102168855B1 - Primer set for detecting foot-and-mouth disease PAN serotype - Google Patents

Primer set for detecting foot-and-mouth disease PAN serotype Download PDF

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Abstract

본 발명은 구제역 바이러스 Pan 타입 검출용 프라이머 세트로서, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트는 혈청형 A 타입, O 타입 및 Asia 타입 모두 동시 검출이 가능할 뿐만 아니라, 등온증폭법을 사용할 수 있기 때문에 현장에서 실시간으로 구제역 바이러스를 검출할 수 있다. 또한, 낮은 농도의 RNA도 검출할 수 있는 높은 민감도 및 정확성을 가지고 있기 때문에 다양한 키트 및 진단기기에 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention is a primer set for detecting foot-and-mouth disease virus Pan type, since the primer set for foot-and-mouth disease virus detection according to the present invention can simultaneously detect both serotype A type, O type and Asia type, and can use isothermal amplification method. Foot-and-mouth disease virus can be detected in real time in the field. In addition, it is expected to be widely used in various kits and diagnostic devices because it has high sensitivity and accuracy to detect even low concentrations of RNA.

Description

구제역 바이러스 Pan 타입 검출용 프라이머 세트{Primer set for detecting foot-and-mouth disease PAN serotype}Primer set for detecting foot-and-mouth disease PAN serotype}

본 발명은 구제역 바이러스 Pan 타입 검출용 프라이머 세트 및 이의 이용 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for detecting foot-and-mouth disease virus Pan type and a method of using the same.

구제역 바이러스(Foot-and-Mouth Disease Virus; FMDV)는 피코나바이러스과 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하는 바이러스로서 소, 돼지, 양, 염소 등과 같은 우제류에 감염되는 고전염성 동물바이러스이다. 이러한 구제역 바이러스는 O, A, C, Asia 타입 등 여러가지 유형의 혈청형으로 분류되며, 입자의 직경은 22 내지 28 nm이고, 8,500 염기쌍으로 구성된 단일가닥의 RNA를 함유하고 있으며, VP-1, VP-2, VP-3, 및 VP-4 네 개의 단백질이 60개씩 모여서 바이러스 외피를 구성한다. 또한, 제1종 바이러스성 법정전염병으로 고전염성으로 무리에서 한 마리가 감염되면 나머지 가축 모두 급속도로 감염된다(국내출원특허 10-2011-0050917). 그러나 이러한 구제역 바이러스에 의한 감염은 특별한 치료법이 없기 때문에, 전파를 방지하기 위해서는 감염 동물이 발생한 근처 지역의 동물을 모두 살처분해야 하기 때문에 피해를 줄이기 위해서는 최대한 신속하게 진단하고 대처하는 것이 필요하다. 또한, 구제역은 혈청형별로 항체에 의한 교차방어 효율이 낮기 때문에 구제역 발생시 백신 정책의 수행을 위해서는 혈청형의 신속한 판단이 중요하다. 우리나라에서는 2000년 이후 현재까지 총 9차례의 구제역 발생을 경험하였고, 이로 인해 지출된 직접적인 방역비용만 약 4조원에 달한다. 2017년 현재 한국에는 새로운 혈청형인 O 타입과 A 타입의 구제역 바이러스가 새롭게 유입되어 이로 인한 문제가 새롭게 발생되고 있는 실정이다.Foot-and-Mouth Disease Virus (FMDV) is a virus belonging to the genus Piconavirus family Aphthovirus, and is a highly contagious animal virus that infects cattle such as cattle, pigs, sheep, and goats. These foot-and-mouth disease viruses are classified into various types of serotypes such as O, A, C, and Asia types, and the particle diameter is 22 to 28 nm, and contains single-stranded RNA consisting of 8,500 base pairs, and VP-1, VP The four proteins -2, VP-3, and VP-4 gathered in each of 60 to form the virus envelope. In addition, when one of the herds is infected with a highly contagious disease due to a type 1 viral legal infectious disease, all other livestock are rapidly infected (domestic application patent 10-2011-0050917). However, since there is no special treatment for infection by the foot-and-mouth disease virus, it is necessary to diagnose and respond as quickly as possible in order to reduce damage because all animals in the vicinity of the infected animal must be killed in order to prevent transmission. In addition, since foot-and-mouth disease has low cross-protection efficiency by antibodies for each serotype, it is important to quickly determine the serotype to implement a vaccine policy when foot-and-mouth disease occurs. In Korea, a total of 9 foot-and-mouth disease outbreaks have been experienced since 2000, and the cost of direct quarantine is about 4 trillion won. As of 2017, new serotypes O-type and A-type foot-and-mouth disease viruses were introduced to Korea, resulting in a new problem.

현재 구제역바이러스 항원을 진단하는 방법인 유전자 검출방법으로는 리얼타임 RT-PCR 또는 일반적인 RT-PCR 등을 들 수 있으며, 리얼타임 RT-PCR의 경우, 구제역바이러스 검출 민감도가 가장 높은 방법으로써, 감염의심 시료(혈액, 타액, 정액, 조직 등)를 실험실로 수송하여, 특수 차폐 실험실 내(생물안전3등급 실험실)에서 시료로부터 총 RNA를 채취하여, 형광 검출 리얼타임 PCR 기기로 구제역바이러스 특이 유전자 증폭을 수행하여, 구제역 양성 여부를 확인하는데 사용되나, RNA 추출부터 리얼타임 PCR을 작동하는 단계까지 상당한 숙련된 연구자가 요구되며, 특수 실험실 및 고가의 시약과 장비가 필요하다.Current gene detection methods for diagnosing foot-and-mouth disease virus antigens include real-time RT-PCR or general RT-PCR. In the case of real-time RT-PCR, the method with the highest sensitivity to detect foot-and-mouth disease virus is suspicious of infection. Transport samples (blood, saliva, semen, tissue, etc.) to the laboratory, collect total RNA from the sample in a special shielded laboratory (Biosafety Level 3 laboratory), and amplify the foot-and-mouth disease virus-specific gene with a fluorescence detection real-time PCR device. It is used to confirm whether or not foot-and-mouth disease is positive, but requires considerable skilled researchers from RNA extraction to real-time PCR, and requires special laboratories and expensive reagents and equipment.

이와 같이, 구제역 바이러스에 의한 피해를 감소시키고, 바이러스의 전파를 최대한 감소시키기 위해서는 구제역 감염 가축을 신속, 정확하게 확인하여 신속한 초동 방역 조치를 취하는 것이 핵심이며, 이를 위하여 고감도 현장 검출이 가능할 뿐만 아니라, 단시간 내에 우리나라에서 전파가 확산되고 있는 A 타입, O 타입, 및 Asia 타입을 모두 정확하게 검출할 수 있는 새로운 검출 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.In this way, in order to reduce the damage caused by the foot-and-mouth disease virus and to reduce the spread of the virus as much as possible, it is essential to quickly and accurately identify livestock infected with foot-and-mouth disease and take rapid initial quarantine measures. For this purpose, not only can high-sensitivity field detection but also short time There is a demand for the development of a new detection method capable of accurately detecting all types of A, O, and Asia, which are spreading radio waves in Korea.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 구제역 바이러스 A 타입, O 타입, 및 Asia 타입을 동시에 검출할 수 있는 Pan 타입 검출용 프라이머 세트 및 이의 이용 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.The present invention was conceived to solve the problems of the prior art as described above, and provides a primer set for Pan type detection and a method of using the same that can simultaneously detect foot-and-mouth disease virus A type, O type, and Asia type. The purpose.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems that are not mentioned will be clearly understood by those of ordinary skill in the art from the following description.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.Hereinafter, various embodiments described herein are described with reference to the drawings. In the following description, for a thorough understanding of the present invention, various specific details, such as specific forms, compositions, and processes, are set forth. However, certain embodiments may be practiced without one or more of these specific details, or with other known methods and forms. In other instances, well-known processes and manufacturing techniques have not been described in specific details in order not to unnecessarily obscure the present invention. Reference throughout this specification to “one embodiment” or “an embodiment” means that a particular feature, form, composition, or characteristic described in connection with the embodiment is included in one or more embodiments of the invention. Thus, the context of “in one embodiment” or “an embodiment” expressed in various places throughout this specification does not necessarily represent the same embodiment of the invention. Additionally, particular features, shapes, compositions, or properties may be combined in one or more embodiments in any suitable manner.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Unless otherwise defined in the specification, all scientific and technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention belongs.

본 명세서에 있어서, "구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus)"란, 소, 돼지, 양, 염소 등과 같은 우제류에 감염되는 동물성 바이러스로서, 구제역의 원인이 되는 바이러스를 의미한다. 상기 바이러스는 바람직하게는 O, A, C, Asia 타입 등 여러가지 유형의 혈청형으로 분류되며, 입자의 직경은 22 내지 28nm이고, 8,500 염기쌍으로 구성된 단일가닥의 RNA를 함유하고 있으며, VP-1, VP-2, VP-3, 및 VP-4 네 개의 단백질이 60개씩 모여서 바이러스 외피를 구성하는 바이러스이나, 구제역의 원인이 되는 바이러스라면 이에 제한되지 않는다.In the present specification, the "foot-and-mouth disease virus" is an animal virus that is infected with cows such as cattle, pigs, sheep, goats, etc., and refers to a virus that causes foot-and-mouth disease. The virus is preferably classified into various types of serotypes such as O, A, C, and Asia type, the diameter of the particle is 22 to 28 nm, contains a single-stranded RNA composed of 8,500 base pairs, VP-1, VP-2, VP-3, and VP-4 are not limited to viruses that form a viral envelope in which 60 proteins are collected, or a virus that causes foot-and-mouth disease.

본 명세서에 있어서, “프라이머(primer)”란 짧은 서열의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서 목적하는 DNA 또는 RNA의 반대편 가닥의 상보적 위치에 특이적으로 부착되어 유전자의 증폭(amplification)을 개시하는 역할을 하는 올리고뉴클레오티드로서, 바람직하게는 구제역 바이러스의 3D 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열일 수 있다.In the present specification, "primer" is an oligonucleotide, which is a short sequence of nucleotides, which is specifically attached to the complementary position of the opposite strand of the target DNA or RNA to initiate amplification of the gene. As an oligonucleotide serving as an oligonucleotide, preferably, it may be an oligonucleotide that specifically binds to the 3D gene of foot-and-mouth disease virus, more preferably as an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 2, The oligonucleotide may be a sequence similar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 2 by 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 99% or more.

본 명세서에 있어서, “프로브(probe)”란, 목적하는 유전자에 특이적으로 부착되어 목적 유전자를 확인 및/또는 검출하는 탐침자를 포괄적으로 포함하는 광의의 개념이며, 바람직하게는 구제역 바이러스의 3D 유전자에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 용이한 검출을 위한 표지를 하나 이상 포함할 수 있다.In the present specification, the term "probe" is a broad concept including a probe that is specifically attached to the gene of interest to identify and/or detect the gene of interest, and is preferably a 3D gene of foot-and-mouth disease virus It may be a compound, antibody, protein, oligonucleotide, etc. that specifically binds to, and more preferably, an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the oligonucleotide is 80% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 , 90% or more, 95% or more, or 99% or more similar sequences. In addition, the probe may include one or more labels for easy detection.

본 명세서에 있어서, "키트(kit)"란 구제역 바이러스의 RNA를 증폭 및/또는 검출하여 구제역 바이러스 감염 여부를 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 구제역 바이러스에 감염되었을 것으로 의심되는 동물로부터 분리된 생물학적 시료로부터 구제역 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 바람직하게는 구제역 바이러스의 3D 유전자에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브(probe) 또는 프라이머(primer) 세트를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 또는 구제역 바이러스 3D에 특이적으로 결합하는 항체(antibody) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는 형태일 수 있으나, 구제역 바이러스의 RNA를 증폭 및/또는 검출하여 구제역 바이러스 감염 여부를 예측할 수 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.In the present specification, "kit" refers to a screening device capable of predicting whether or not infected with foot-and-mouth disease virus by amplifying and/or detecting RNA of foot-and-mouth disease virus, and isolated from animals suspected of being infected with foot-and-mouth disease virus. There is no limitation as long as it is a form that can confirm whether or not the foot-and-mouth disease virus is infected from a biological sample. Preferably it may include a probe or primer set having a sequence complementary to the 3D gene of foot and mouth disease virus, more preferably may include the primer set of the present invention, or foot and mouth disease virus 3D It may be a form including an antibody or an aptamer that specifically binds to, but is not limited thereto as long as it is a form capable of predicting whether or not infected with a foot and mouth disease virus by amplifying and/or detecting RNA of a foot and mouth disease virus.

본 명세서에 있어서, “검출(detection)”이란 구제역 바이러스에 감염되었을 것으로 의심되는 동물의 구제역 바이러스 감염 여부를 판단하는 방법에 관한 것으로서, 구제역 바이러스의 RNA를 확인하여 바이러스 감염 여부를 확인하는 방법을 의미한다.As used herein, “detection” refers to a method of determining whether an animal suspected of being infected with a foot-and-mouth disease virus is infected with a foot-and-mouth disease virus, and refers to a method of confirming the presence of a virus by checking the RNA of the foot-and-mouth disease virus. do.

본 명세서에 있어서, "생물학적 시료(biological sample)"란 구제역 바이러스에 감염된 동물에서 구제역 바이러스의 RNA를 포함하고 있는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 모피, 소변 등일 수 있으나, 구제역 바이러스의 RNA를 확인할 수 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.In the present specification, "biological sample" refers to all samples containing RNA of foot-and-mouth disease virus in animals infected with foot-and-mouth disease virus, preferably blood, plasma, serum, bone marrow, tissue, cells, saliva , Sputum, fur, urine, etc., but is not limited thereto as long as it is a sample capable of confirming RNA of foot-and-mouth disease virus.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머를 포함하는, 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및/또는 2의 서열 일부를 포함할 수 있으며, 또는 서열번호 1 및/또는 2에 추가로 다른 서열을 포함할 수 있으며, 구제역 바이러스 Pan 타입을 특이적으로 검출할 수 있는 서열이라면 이에 제한되지 않는다. 상기 Pan 타입은 바람직하게는 O 타입, A 타입 및 Asia 타입의 조합을 의미하나, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 검출 가능한 구제역 바이러스 타입이라면 이에 제한되지 않는다.The present invention provides a primer set for detection of foot-and-mouth disease virus, comprising a primer comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The primer set may include a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 and/or 2, or may include other sequences in addition to SEQ ID NO: 1 and/or 2, and specifically detect the foot-and-mouth disease virus Pan type. If there is a sequence, it is not limited thereto. The Pan type preferably means a combination of O type, A type and Asia type, but is not limited thereto as long as it is a foot-and-mouth disease virus type detectable using the primer set of the present invention.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 3의 일부 서열을 포함할 수 있으며, 또는 서열번호 3에 추가로 다른 서열을 포함할 수 있으며, 이는 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 서열을 특이적으로 검출할 수 있는 서열이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 프로브는 검출을 용이하게 하기 위하여 말단 부위 또는 중간 부위에 하나 이상의 표지를 포함할 수 있으며, 상기 표지는 바람직하게는 형광 모이어티이며, 더욱 바람직하게는 다민, 쿠마린, 시아닌, EvoBlue, 옥사진, 카르보피로닌(carbopyronin), 나프탈렌, 바이페닐, 안트라센(anthracene), 페난트렌, 파이렌, 카르바졸 등을 기본 백본으로 가지는 형광 색소 또는 이의 유도체 같은 형광 모이어티가 선택적으로 연결 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 형광 모이어티는 Cy5.5 (694), Cy7 (773), ATTO 390™ (479), ATTO　425™ (484), ATTO　465™ (508), ATTO　488™ (523), ATTO　495™ (527), ATTO　520™ (538), ATTO　532™ (553), ATTO　Rho6G™ (570), ATTO　550™ (576), ATTO　565™ (592), ATTO　Rho3B™ (565), ATTO　Rho11™ (608), ATTO　Rho12™ (532), ATTO　Thio12™ (579), ATTO　610™ (634), ATTO　611 X™ (681), ATTO　620™ (643), ATTO　Rho14™ (625), ATTO 633™ (657), ATTO　647™ (669), ATTO　647 N™ (669), ATTO　655™ (684), ATTO　Oxa12™ (663), ATTO　700™ (719), ATTO 725™ (752), ATTO　740™ (764), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), EvoBlue10™, EvoBlue30™, MR121, Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), 로다민(Rhodamine) 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), 피코에리트린 R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), 피로닌 Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-피코시아닌 (642), C-피코시아닌 (648), TOPRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), 티아디카르보시아닌 (671), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar650 (566), Quasar570 (667), Quasar670 (705), Quasar705 (610) 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 또한, 상기 형광 모이어티 유도체는 본 발명의 검출을 방해하지 않는 한 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다. 또는, 형광 빛을 흡수하여 퀀칭시킬 수 있는 퀀처가 선택적으로 연결 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 퀀처는 답실(Dabsyl), BHQ(Black Hole Quencher)-0,BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Iowa Black®FQ, Iowa Black®RQ, QXLTM 490, IRDye QC-1, Deep Dark QuencherII, Deep Dark QuencherI, Eclipse® Dark Quencher, ATTO 540Q, ATTO 580Q, ATTO 612Q 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 퀀처 유도체는 본 발명의 검출을 방해하지 않는 한 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다. 또는 상기 표지는 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파 등 검출이 가능한 시그널을 제공할 수 있는 표지라면 제한이 없다.In one embodiment of the present invention, the primer set may further include a probe including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the probe may include a partial sequence of SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 3 Other sequences may be included in addition to, and this is not limited thereto as long as it is a sequence capable of specifically detecting a sequence amplified using the primer set. In addition, the probe may include at least one label at a terminal or intermediate portion to facilitate detection, and the label is preferably a fluorescent moiety, more preferably damine, coumarin, cyanine, EvoBlue, jade. Photo, fluorescent moieties such as carbopyronin, naphthalene, biphenyl, anthracene, phenanthrene, pyrene, carbazole, etc. as basic backbones or derivatives thereof are selectively linked or conjugated Can be. For example, the fluorescent moiety of the present invention is Cy5.5 (694), Cy7 (773), ATTO 390™ (479), ATTO 425™ (484), ATTO 465™ (508), ATTO 488™ (523) , ATTO 495™ (527), ATTO 520™ (538), ATTO 532™ (553), ATTO Rho6G™ (570), ATTO 550™ (576), ATTO 565™ (592), ATTO Rho3B™ (565), ATTO Rho11™ (608), ATTO Rho12™ (532), ATTO Thio12™ (579), ATTO 610™ (634), ATTO 611 X™ (681), ATTO 620™ (643), ATTO Rho14™ (625), ATTO 633™ (657), ATTO 647™ (669), ATTO 647 N™ (669), ATTO 655™ (684), ATTO Oxa12™ (663), ATTO 700™ (719), ATTO 725™ (752), ATTO 740™ (764), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), EvoBlue10™, EvoBlue30™, MR121, Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509) , YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green ™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO ™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), T RITC (572), Magnesium Orange™ (575), phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582) , Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO ™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-phycocyanin (648), TOPRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) ) (665), Cy5™ (670), thiadicarbocyanine (671), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar650 (566), Quasar570 (667), Quasar670 (705), Quasar705 ( 610) and derivatives or conjugates thereof, but is not limited thereto. The numbers in parentheses indicate the maximum emission wavelength expressed in nanometers. In addition, the fluorescent moiety derivative may additionally include a free carboxyl group, an ester (eg, N-hydrosuccinimide (NHS) ester) or a maleimide derivative as long as it does not interfere with the detection of the present invention. Alternatively, a quencher capable of quenching by absorbing fluorescent light may be selectively linked or conjugated. For example, the quencher of the present invention is Dabsyl, Black Hole Quencher (BHQ)-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Iowa Black ® FQ, Iowa Black ® RQ, QXL TM 490, IRDye QC-1, Deep Dark Quencher II, Deep Dark Quencher I, Eclipse ® Dark Quencher, ATTO 540Q, ATTO 580Q, ATTO 612Q and derivatives or conjugates thereof, but not limited thereto. In addition, the quencher derivative may additionally include a free carboxyl group, an ester (eg, N-hydrosuccinimide (NHS) ester) or a maleimide derivative as long as it does not interfere with the detection of the present invention. Alternatively, the label is not limited as long as it can provide a detectable signal such as radioactivity, color development, weight measurement, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, and high frequency hybridization.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 혈청형 Pan 타입을 검출하는 것을 특징으로 한다. 그러나 상기 프라이머 세트로 검출 가능한 타입이라면 이에 제한되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the primer set is characterized by detecting a serotype Pan type. However, any type detectable by the primer set is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 등온증폭 용도이며, 더욱 바람직하게는 RT-RPA(Reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification) 용도일 수 있으나, 현장에서 단시간 내에 유전자를 증폭 및 검출 가능한 방법이라면 제한이 없다.In another embodiment of the present invention, the primer set for detecting foot-and-mouth disease virus is preferably for isothermal amplification, more preferably for RT-RPA (Reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification), but in the field within a short time There is no limitation as long as it is a method capable of amplifying and detecting.

또한, 본 발명은 상기 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트를 포함하는 구제역 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting foot-and-mouth disease virus comprising the primer set for detecting foot-and-mouth disease virus.

상기 검출용 조성물은 추가로 유전자를 증폭할 수 있는 효소, 완충용액, dNTP 등을 포함할 수 있으나, 유전자를 증폭하는데 필요한 요소라면 제한이 없다.The detection composition may further include an enzyme capable of amplifying a gene, a buffer solution, dNTP, etc., but there is no limitation as long as it is an element necessary to amplify the gene.

또한, 본 발명은 상기 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트를 포함하는 구제역 바이러스 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting foot-and-mouth disease virus, comprising the primer set for detecting foot-and-mouth disease virus.

또한, 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하여 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브를 이용하여 검출하는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of: (a) separating total RNA from a biological sample; (b) amplifying a target sequence using a primer including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 using the isolated RNA as a template; And (c) it provides a foot-and-mouth disease virus detection method comprising the step of detecting the amplification product using a probe including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 일 구체예예 있어서, 상기 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 모피, 소변 등일 수 있으나, 구제역 바이러스의 RNA를 포함하고 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the biological sample may be blood, plasma, serum, bone marrow, tissue, cells, saliva, sputum, fur, urine, etc., but the sample containing RNA of foot-and-mouth disease virus is not limited thereto. .

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 검출 방법은 구제역 바이러스 Pan 타입을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the detection method is characterized in that it specifically detects the foot-and-mouth disease virus Pan type.

본 발명에 따른 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트는 A 타입, O 타입, 및 Asia 타입(Pan 타입)을 모두 동시에 검출이 가능할 뿐만 아니라, 등온증폭법을 사용할 수 있기 때문에 현장에서 실시간으로 구제역 바이러스를 검출할 수 있다. 또한, 낮은 농도의 RNA도 검출할 수 있는 높은 민감도 및 정확성을 가지고 있기 때문에 다양한 키트 및 진단기기에 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.The primer set for foot-and-mouth disease virus detection according to the present invention can detect both A type, O type, and Asia type (Pan type) at the same time, and because isothermal amplification method can be used to detect foot and mouth disease virus in real time. I can. In addition, it is expected to be widely used in various kits and diagnostic devices because it has high sensitivity and accuracy to detect even low concentrations of RNA.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 국가의 구제역 바이러스의 유전자 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 구제역 바이러스의 3D 유전자 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 RT-RPA 및 아가로스겔 전기영동을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 RT-RPA를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 RT-RPA를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 RT-RPA를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.1 is a diagram showing the results of genetic analysis of foot-and-mouth disease viruses in various countries according to an embodiment of the present invention.
2 is a view showing the result of performing 3D gene analysis of foot-and-mouth disease virus according to an embodiment of the present invention.
3 is a view showing the result of performing RT-RPA and agarose gel electrophoresis according to an embodiment of the present invention.
4 is a diagram showing a result of performing RT-RPA according to an embodiment of the present invention.
5 is a diagram showing a result of performing RT-RPA according to an embodiment of the present invention.
6 is a diagram showing a result of performing RT-RPA according to an embodiment of the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로써, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. will be.

실시예Example

실시예 1: 구제역 바이러스 Pan 타입 검출용 프라이머의 제작Example 1: Preparation of primers for detecting foot-and-mouth disease virus Pan type

구제역 바이러스 Pan 타입 특이적인 검출용 프라이머를 제작하기 위하여, 일차적으로 기존에 검출된 A 타입, O 타입 및 Asia 타입의 바이러스의 유전 정보를 이용하여 다중 정렬(multiplealignment)을 수행하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다. 구제역 바이러스의 유전자 중 3D를 선택하였고, 2차적으로 3D 유전자 정보를 이용하여 다시 다중 정렬을 통한 유전자 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 유전자 서열이 유사한 지역을 선택하고 DNAMAN DNA analysis software package를 이용하여 다양한 프라이머들을 제작하였다. 제작된 프라이머들을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 실시하여 헤어핀 구조가 생성되는지, 다이머(dimer)를 형성하는지 등에 대하여 확인하고, 최종적으로 포워드 프라이머(forward primer), 리버스 프라이머(reverse primer) 및 검출용 프로브(detection probe)를 제작하였다. 검출용 프로브는 올리고뉴클레오티드 골격에 dT-fluorophore(FAM-dT)와 이에 상응하는 dT-quencher(BHQ-dT) 그룹을 abasic 뉴클레오타이드 유사체(tetrahydrofuran residue; THF, 혹은 dSpacer)에 인접하도록 제작하였고, 중합효소에 의한 중합반응(연장)을 방지하기 위하여 3' 말단에는 3'-modification 그룹인 C3-spacer를 배치함으로써, 프로브 결합시 형광의 발생을 통하여 구제역 바이러스를 검출할 수 있도록 제작하였다. 그 서열은 하기와 표 1과 같다.In order to prepare a primer for detection of a foot-and-mouth disease virus Pan type-specific, multiple alignment was performed primarily using the genetic information of the previously detected A type, O type and Asia type viruses. The results are shown in FIG. 1. 3D was selected among the genes of foot-and-mouth disease virus, and the gene analysis was performed through multiple alignment again using 3D gene information. The results are shown in FIG. 2. Regions with similar gene sequences were selected and various primers were prepared using a DNAMAN DNA analysis software package. Conduct a polymerase chain reaction (PCR) using the prepared primers to check whether a hairpin structure is generated or a dimer is formed, and finally, a forward primer and a reverse primer ( reverse primer) and a detection probe were prepared. The detection probe was constructed so that dT-fluorophore (FAM-dT) and the corresponding dT-quencher (BHQ-dT) group were adjacent to the abasic nucleotide analogue (tetrahydrofuran residue; THF, or dSpacer) on the oligonucleotide backbone, and polymerase In order to prevent polymerization (extension) by the 3'end, C3-spacer, which is a 3'-modification group, was arranged to detect foot-and-mouth disease virus by generating fluorescence when the probe was bound. The sequence is shown in Table 1 below.

종류Kinds 프라이머 서열Primer sequence 서열번호Sequence number 포워드 프라이머Forward primer 5'-CAAGCATCATCAACACAATTTTGAACAACATCTAC-3'5'-CAAGCATCATCAACACAATTTTGAACAACATCTAC-3' 1One 리버스 프라이머Reverse primer 5’-GAAGTGTCTTTTGAGGAAAGTGACATCGGTAATG-3’5’-GAAGTGTCTTTTGAGGAAAGTGACATCGGTAATG-3’ 22 검출용 프로브Probe for detection 5'-ACGACATCGTGGTGGCAAGTGATTACGATC [FAM-dT] G [THF] AC [BHQ-dT] TTGAGGCTCTCAAGC-[3'-block]5'-ACGACATCGTGGTGGCAAGTGATTACGATC [FAM-dT] G [THF] AC [BHQ-dT] TTGAGGCTCTCAAGC-[3'-block] 33

실시예 2: 프라이머 확인Example 2: primer identification

2.1. O 타입 유전자 검출 민감도 1차 확인 실험2.1. First confirmation experiment for O type gene detection sensitivity

실시예 1의 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 구제역 바이러스 O 타입 검출이 가능한지 확인하기 위하여, Rapid viral RNA detection 키트(SPG-FMDV-A-001. Scorpiogen Co. cooperated with TwistDx Co.)를 이용하여 RT-RPA(reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification)를 실시하였다. RT-RPA를 실시하기 위하여 충청북도 보은군에서 분리된 구제역 바이러스 O 타입으로부터 viral RNA extraction 키트(1020953, QIAGEN)을 이용하여 RNA를 추출하고, 추출된 RNA를 정량하여 0.1pg, 1pg, 10pg, 100pg, 1ng, 10ng, 및 100ng의 RNA를 각각의 튜브에 담고, 실시예 1의 방법으로 제조된 프라이머들은 각각 1uL씩, 그리고 프로브는 0.5uL를 각각의 튜브에 첨가하고, 재수화-완충용액(rehydration buffer)을 29.5uL씩 첨가하였다. 그리고 증류수로 50uL를 맞춰준 후에 280mM의 아세트산마그네슘을 2.5uL씩 첨가하고 39℃에서 증폭 반응을 개시한 후에 초기반응 4분 후에 튜브를 꺼내어 5초간 와류시키고, 짧게 스핀다운 시킨 후에 다시 튜브를 39℃에서 20분 동안 반응시키며 형광을 관찰하고, 반응이 종료된 후에는 아가로스겔 전기영동을 실시하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.To confirm whether foot-and-mouth disease virus O type detection is possible using the primer prepared by the method of Example 1, RT using a Rapid viral RNA detection kit (SPG-FMDV-A-001. Scorpiogen Co. cooperated with TwistDx Co.) -RPA (reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification) was performed. To perform RT-RPA, RNA was extracted from foot-and-mouth disease virus O type isolated from Boeun-gun, Chungcheongbuk-do, using a viral RNA extraction kit (1020953, QIAGEN), and the extracted RNA was quantified and 0.1 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng , 10 ng, and 100 ng of RNA were added to each tube, 1 uL of each of the primers prepared by the method of Example 1, and 0.5 uL of the probe were added to each tube, and rehydration-buffer solution (rehydration buffer) Was added in 29.5 uL increments. Then, after adjusting 50uL with distilled water, 2.5uL of 280mM magnesium acetate was added each, and the amplification reaction was started at 39℃. After 4 minutes of the initial reaction, the tube was taken out and vortexed for 5 seconds. After a short spin down, the tube was again opened at 39℃. After reacting at for 20 minutes, fluorescence was observed, and after the reaction was completed, agarose gel electrophoresis was performed. The results are shown in FIG. 3.

도 3에 나타난 바와 같이, 구제역 바이러스 O 타입의 경우에 0.1pg의 낮은 농도에서도 16분이 지나면 관찰이 가능한 것을 확인하였다. As shown in Figure 3, in the case of the foot-and-mouth disease virus O type, it was confirmed that observation was possible after 16 minutes even at a low concentration of 0.1 pg.

2.2. O 타입 유전자 검출 민감도 2차 확인 실험2.2. Secondary confirmation experiment for O type gene detection sensitivity

실시예 1의 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 다른 종류의 구제역 바이러스 O 타입 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 충청북도 진천군에서 발견된 O 타입 구제역 바이러스를 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 RT-RPA를 실시하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.In order to confirm whether other types of foot-and-mouth disease virus O type can be detected using the primer prepared by the method of Example 1, RT-RPA was performed in the same manner as in Example 2.1 using the O type foot-and-mouth disease virus found in Jincheon-gun, Chungcheongbuk-do. I did. The results are shown in FIG. 4.

도 4에 나타난 바와 같이, 진천군에서 발견된 다른 종류의 O 타입에서도 0.1pg의 낮은 농도에서도 10분이 지나면 관찰이 가능한 것을 확인하였다. As shown in FIG. 4, it was confirmed that observation was possible after 10 minutes even at a low concentration of 0.1 pg even in other types of O type found in Jincheon-gun.

2.3. A 타입 유전자 검출 민감도 확인 실험2.3. A type gene detection sensitivity confirmation experiment

실시예 1의 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 다른 종류의 구제역 바이러스 A 타입 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 경기도 포천군에서 발견된 A 타입 구제역 바이러스를 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 RT-RPA를 실시하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.In order to confirm whether other types of foot-and-mouth disease virus A type can be detected using the primer prepared by the method of Example 1, RT-RPA was performed in the same manner as in Example 2.1 using the type A foot-and-mouth disease virus found in Pocheon-gun, Gyeonggi-do. I did. The results are shown in FIG. 5.

도 5에 나타난 바와 같이, 포천군에서 발견된 다른 종류의 A 타입에서도 0.1pg의 낮은 농도에서도 10분이 지나면 관찰이 가능한 것을 확인하였다.As shown in FIG. 5, it was confirmed that observation was possible after 10 minutes even at a low concentration of 0.1 pg even in other types of A types found in Pocheon-gun.

2.4. Asia 타입 유전자 검출 민감도 확인 실험2.4. Asia type gene detection sensitivity confirmation experiment

실시예 1의 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 다른 종류의 구제역 바이러스 Asia 타입 검출이 가능한지 확인하기 위하여, Asia Shamir 구제역 바이러스를 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 RT-RPA를 실시하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.In order to confirm whether other types of foot-and-mouth disease virus Asia type can be detected using the primer prepared by the method of Example 1, RT-RPA was performed in the same manner as in Example 2.1 using the Asia Shamir foot-and-mouth disease virus. The results are shown in FIG. 6.

도 6에 나타난 바와 같이, Asia 타입 구제역 바이러스에서도 0.1pg의 낮은 농도에서 8분이 지나면 관찰이 가능한 것을 확인하였다.As shown in FIG. 6, it was confirmed that even in Asia type foot-and-mouth disease virus, observation was possible after 8 minutes at a low concentration of 0.1 pg.

상기 결과들을 통하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 Pan 타입의 구제역 바이러스, 즉, A 타입, O 타입, 및 Asia 타입 모두를 동시에, 낮은 농도의 RNA에서도 검출이 가능할 뿐만 아니라, 프로브와 함께 이용하면 등온증폭법인 RT-RPA가 가능하기 때문에 초기 바이러스 감염 시에도 현장에서 분단위로 신속하게 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.Through the above results, when the primer set of the present invention is used, it is possible to detect both Pan-type foot-and-mouth disease virus, that is, A type, O type, and Asia type, at the same time, even at a low concentration of RNA, and isothermal when used with a probe. Since RT-RPA, an amplification method, is possible, it was confirmed that even in the case of initial virus infection, it can be detected quickly in minutes at the site.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and it is clear that these specific techniques are only preferred embodiments for those of ordinary skill in the art, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, it will be said that the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Republic of Korea(Animal and Plant Quarantine Agency) Yonsei University Wonju Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for detecting foot-and-mouth disease PAN serotype <130> DPB174056 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 caagcatcat caacacaatt ttgaacaaca tctac 35 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 gaagtgtctt ttgaggaaag tgacatcggt aatg 34 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Detection probe <400> 3 acgacatcgt ggtggcaagt gattacgatc gacttgaggc tctcaagc 48 <110> Republic of Korea (Animal and Plant Quarantine Agency) Yonsei University Wonju Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for detecting foot-and-mouth disease PAN serotype <130> DPB174056 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 caagcatcat caacacaatt ttgaacaaca tctac 35 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 gaagtgtctt ttgaggaaag tgacatcggt aatg 34 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Detection probe <400> 3 acgacatcgt ggtggcaagt gattacgatc gacttgaggc tctcaagc 48

Claims (9)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하고,
혈청형 Pan 타입 구제역 바이러스 검출용 RT-RPA(Reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification) 프라이머 세트를 포함하는, 혈청형 Pan 타입 구제역 바이러스 검출용 조성물.Including a primer including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a primer including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a probe including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
A composition for detecting serotype Pan-type foot-and-mouth disease virus detection comprising a RT-RPA (Reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification) primer set. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하고,
혈청형 Pan 타입 구제역 바이러스 검출용 RT-RPA(Reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification) 프라이머 세트를 포함하는, 혈청형 Pan 타입 구제역 바이러스 검출용 키트.Including a primer including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a primer including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a probe including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
A kit for detecting a serotype Pan-type foot-and-mouth disease virus, including a RT-RPA (Reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification) primer set for detecting a serotype Pan-type foot-and-mouth disease virus. (a) 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하여 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브를 이용하여 검출하는 단계를 포함하고,
상기 프라이머 및 상기 프로브는 RT-RPA(Reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification) 프라이머 세트이고,
상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 모피, 또는 소변인,
혈청형 Pan 타입 구제역 바이러스 검출 방법.(a) isolating total RNA from the biological sample;
(b) amplifying a target sequence using a primer including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 using the isolated RNA as a template; And
(c) detecting the amplification product using a probe containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
The primer and the probe are RT-RPA (Reverse transcriptase-recombinase polymerase amplification) primer set,
The biological sample is blood, plasma, serum, bone marrow, tissue, cells, saliva, sputum, fur, or urine,
Serotype Pan type foot and mouth disease detection method. 삭제delete 삭제delete
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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HOWSON, EMMA LUCY ANNA, UNIV. OF GLASGOW., The development and application of molecular tools for the diagnosis of foot-and-mouth disease in field and low-resource laboratory settings.[On line] (2017.12.11.)*

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