KR20230075194A - Composition for recombinase polymerase amplification reaction for real time detection of African swine fever virus - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아프리카돼지열병 바이러스 유전자의 P30 gene에 특이적인 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 아프리카돼지열병 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 프라이머쌍을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법에 따르면 재조합효소 중합효소 증폭법에 따라 검체 내 아프리카돼지열병 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있어, 아프리카돼지열병 바이러스 감염증 진단 및 바이러스 검출에 매우 유용하게 활용될 수 있다. The present invention relates to a composition for a recombinase polymerase amplification reaction for rapid detection of African swine fever virus, and more particularly, to a composition comprising a primer pair and a probe specific to the P30 gene of the African swine fever virus gene It relates to a composition for a recombinase polymerase amplification reaction for rapid detection of African swine fever virus and a method for detecting African swine fever virus using the same.
According to the composition containing the primer pair provided by the present invention and the African swine fever virus detection method using the same, the African swine fever virus in a sample can be rapidly detected with very high sensitivity and specificity according to the recombinase polymerase amplification method, It can be very useful for diagnosing African swine fever virus infections and detecting viruses.
Description
본 발명은 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아프리카돼지열병 바이러스 유전자의 P30 gene에 특이적인 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 아프리카돼지열병 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for a recombinase polymerase amplification reaction for rapid detection of African swine fever virus, and more particularly, to a composition comprising a primer pair and a probe specific to the P30 gene of the African swine fever virus gene It relates to a composition for a recombinase polymerase amplification reaction for rapid detection of African swine fever virus and a method for detecting African swine fever virus using the same.
아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV)는 아스파바이러스과(Asfarviridae)에 속하는 유일한 바이러스로서 170~193kbp의 매우 큰 dsDNA를 genome으로 가지며, 150~167개의 ORF (open reading frame)를 포함하고 있다. 아프리카돼지열병 바이러스 특이 단백질 중에는 캡시드 단백질(capsid protein)인 p72를 암호화한 B646L 구조 단백질 유전자의 C-말단(C-terminal) 지역의 염기 서열 변이에 기초해서, 24개의 유전자형(genotype)으로 분류된다. 24개의 유전자형 모두 사람에게는 감염되지 않으며, 아프리카를 벗어나 전 세계적으로 확산하고 있는 바이러스는 대부분 유전형 II의 고병원성 바이러스이다.African swine fever virus (ASFV) is the only virus belonging to the Asfarviridae family. Among African swine fever virus-specific proteins, 24 genotypes are classified based on nucleotide sequence variation in the C-terminal region of the B646L structural protein gene encoding p72, a capsid protein. All of the 24 genotypes are not infectious to humans, and most of the viruses spreading worldwide outside of Africa are highly pathogenic viruses of genotype II.
한편, 아프리카돼지열병 바이러스의 임상 증상은 돼지열병(classical swine fever)과 아주 유사하고, 두 질병은 일반적으로 실험실 진단에서 변별되어야 하기 때문에 이에 따라 상기 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 감염여부를 확인하기 위한 많은 연구들이 행해져 왔다.On the other hand, since the clinical symptoms of African swine fever virus are very similar to classical swine fever, and the two diseases must generally be differentiated in laboratory diagnosis, there are many methods to confirm infection with the African swine fever virus. Studies have been done.
종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 그러나, 전자현미경을 이용한 진단방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하는 것은 거의 불가능하다. 현재의 일반화된 방법은 혈청학적 방법을 이용한 검사로, 혈액, 소변, 뇌척수액 또는 양수에서 아프리카돼지열병 바이러스의 유전 물질(DNA)을 검출하거나 아프리카돼지열병 바이러스 감염에 반응하여 생성된 혈중 항체를 검출하는 방법이다. 혈청학적 방법 중 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단방법이나 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생하는 문제가 있다. 또한, 바이러스를 대량생산 및 정제하여 동 바이러스를 불활화한 다음, 이를 항원으로 사용하여 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 항체를 검출해야 하기 때문에 상기 항원을 제조하기 위하여는 몇 주 또는 몇 개월이라는 긴 시간과 많은 비용이 소요되는 문제가 있다.As a conventional virus diagnosis method, electron microscopy or serological methods were mainly used. However, the diagnostic method using an electron microscope can confirm the presence of the virus, but it is almost impossible to diagnose the species based on morphological characteristics. The current generalized method is a test using a serological method, which detects the genetic material (DNA) of African swine fever virus in blood, urine, cerebrospinal fluid or amniotic fluid, or detects blood antibodies produced in response to African swine fever virus infection. way. Among serological methods, the ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method has about 1,000 times lower detection sensitivity than the most commonly used diagnostic method or Polymerase Chain Reaction (PCR) diagnostic method, There is a problem in which accurate diagnosis often fails due to unexpected non-specific reactions. In addition, since it is necessary to mass-produce and purify the virus to inactivate the virus and then use it as an antigen to detect an antibody against the African swine fever virus, it takes a long time of several weeks or months to prepare the antigen There is a problem that costs a lot of money.
또한, 혈청학적 방법을 이용한 검사는 돼지에게서 시료를 수득하기 위해 전문가가 전문 장비를 가지고 채취해야 하므로 별도의 시간과 비용이 소요되기 때문에, 돼지 농가에서 쉽게 채취할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있었다.In addition, since a test using a serological method requires an expert to collect a sample from a pig with specialized equipment, which requires additional time and cost, it was necessary to develop a method that can be easily collected from pig farms.
이러한 단점을 극복하기 위해 개발된 재조합효소 중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)은 기존의 PCR 방법과 유사하나, 일정한 온도에서 온도변화 없이 특정 유전자의 증폭이 가능하기 때문에 반응 시간을 단축할 수 있고, 특수한 장비가 필요치 않아서 검사 단가가 저렴하고, 운반성이 뛰어나 현장검사가 가능할 수 있다는 장점을 가진다. 재조합효소 중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)은 박테리오파지 T4 재조합효소를 이용하여 DNA 이중가닥의 해리를 일으키고 동시에 DNA 중합효소와 특정 primer들을 사용하여 특정DNA를 증폭해내는 방법이다. 이는 PCR의 경우와 같이 표적 기질(target template)과 한 쌍의 primer (oligonucleotide)를 사용하여 특정 염기서열의 DNA를 증폭시킬 수 있으나, PCR의 경우와 달리 일정 온도(37℃ - 42℃)의 범위에서 등온조건으로 증폭반응을 일으킬 수 있는 장점이 있다. 현재 RPA는 매우 빠르게 증폭산물을 만들 수 있도록 발전되었으며, 이는 등온조건의 장점과 함께 널리 인식되어 특이유전자 증폭을 통한 특정병원체의 검출법에 다양하게 RPA가 응용되고 있다.The Recombinase Polymerase Amplification (RPA) developed to overcome these disadvantages is similar to the existing PCR method, but it can amplify a specific gene at a constant temperature without temperature change, so the reaction time can be shortened. It has the advantages of low cost of inspection because it does not require special equipment, and excellent portability so that on-site inspection can be performed. Recombinase Polymerase Amplification (RPA) is a method of causing dissociation of DNA double-strands using bacteriophage T4 recombinase and simultaneously amplifying specific DNA using DNA polymerase and specific primers. As in the case of PCR, DNA of a specific base sequence can be amplified using a target template and a pair of primers (oligonucleotide). It has the advantage of being able to cause an amplification reaction under isothermal conditions. Currently, RPA has been developed to produce amplification products very quickly, and it is widely recognized with the advantage of isothermal conditions, and RPA is applied in various ways to detect specific pathogens through specific gene amplification.
이에, 본 발명자는 아프리카돼지열병 바이러스를 RPA 방법을 통해 매우 빠르고 간편하게 검출할 수 있는 검출법을 개발하고자 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 일실시예에서 제작된, 아프리카돼지열병 바이러스 유전자의 p30 gene에 특이적인 프라이머쌍 및 프로브를 이용하면 매우 높은 민감도와 특이도로 아프리카돼지열병 바이러스를 검출할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors have repeatedly conducted intensive research to develop a detection method that can detect African swine fever virus very quickly and easily through the RPA method, and as a result, the p30 gene of the African swine fever virus gene produced in one embodiment of the present invention It was discovered that African swine fever virus could be detected with very high sensitivity and specificity by using a primer pair and probe specific for , and the present invention was completed.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for detecting African swine fever virus, comprising the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a kit for detecting African swine fever virus, including the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing African swine fever virus infection, including the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명의 다른 목적은 (a) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is (a) isolating nucleic acids from a specimen; (b) amplifying a target sequence using the nucleic acid as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And (c) to provide a method for detecting African swine fever virus, comprising the step of detecting the amplification product.
본 발명의 다른 목적은 (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스 감염증 진단방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is (a) isolating nucleic acids from biological samples isolated from mammals other than humans; (b) amplifying a target sequence using the nucleic acid as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And (c) to provide a method for diagnosing African swine fever virus infection, comprising the step of detecting the amplification product.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object of the present invention, the present invention provides a composition for detecting African swine fever virus, comprising a pair of primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 키트를 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a kit for detecting African swine fever virus, including the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a composition for diagnosing African swine fever virus infection, including the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) isolating nucleic acids from a specimen; (b) amplifying a target sequence using the nucleic acid as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And (c) it provides a method for detecting African swine fever virus, comprising detecting the amplification product.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스 감염증 진단방법을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides (a) isolating nucleic acids from biological samples isolated from mammals other than humans; (b) amplifying a target sequence using the nucleic acid as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and (c) detecting the amplification product.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for detecting African swine fever virus, comprising the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명에서 상기 "프라이머(primer)"란 짧은 서열의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서 목적하는 DNA 또는 RNA의 반대편 가닥의 상보적 위치에 특이적으로 부착되어 유전자의 증폭(amplification)을 개시하는 역할을 하는 올리고뉴클레오티드로서, 바람직하게는 아프리카돼지열병 바이러스 유전자의 P30 gene 영역에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열과 각각 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열의 프라이머도 포함될 수 있다. In the present invention, the "primer" is an oligonucleotide, which is a short sequence of nucleotides, and is specifically attached to the complementary position of the opposite strand of the target DNA or RNA to initiate gene amplification. As an oligonucleotide that does, it may preferably be an oligonucleotide that specifically binds to the P30 gene region of the African swine fever virus gene, more preferably as a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: 2, Primers may also include primers having sequences that are 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 99% or more similar to the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
상기 프라이머쌍는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 프라이머는 아프리카돼지열병 바이러스 유전자의 P30 gene를 증폭할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.The primer pair may be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods. These primers can be modified using many means known in the art, as long as they show an effect capable of amplifying the P30 gene of the African swine fever virus gene. Examples of such modifications include methylation, capping, substitution of one or more homologs of the natural nucleotide, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc.) or charged linkages (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.). A nucleic acid can contain one or more additional covalently linked moieties, such as proteins (eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), intercalants (eg, acridine). , proralene, etc.), chelating agents (eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.) and alkylating agents. In addition, the primer of the present invention, if necessary, may include a label that can be directly or indirectly detected by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, or chemical means. Examples of labels include enzymes (eg horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioactive isotopes (eg 32P), fluorescent molecules and chemical groups (eg biotin), and the like. there is.
본 발명의 일 양태에서, 상기 조성물은 프로브(probe)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. In one aspect of the present invention, the composition may be characterized in that it further comprises a probe (probe).
상기 "프로브(probe)"란, 목적하는 유전자에 특이적으로 부착되어 목적 유전자를 확인 및/또는 검출하는 탐침자를 포괄적으로 포함하는 광의의 개념이다. 상기 프로브는 하나 이상 유형의 화학 결합을 통하여, 일반적으로 상보적 염기 쌍형성을 통하여, 보통 수소 결합 형성을 통하여 상보적인 서열의 표적 핵산에 결합하고 따라서 이중나선(duplex) 구조를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 “프로브 결합 부위”에 결합 또는 혼성화한다. 특히, 일단 프로브가 프로브의 상보적인 표적에 혼성화하면 프로브의 검출을 용이하게 하도록 프로브는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 그러나 대안적으로, 프로브는 표지화되지 않을 수 있지만, 표지화된 리간드와의 특이적 결합에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로 프로브는 길이가 적어도 7 내지 15개 뉴클레오티드이다. 다른 프로브는 길이가 적어도 20, 30 또는 40개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 다소 더 길며, 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 더욱 더 길며, 길이가 적어도 100, 150, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 프로브는 또한 상기 값(예컨대, 길이가 15~20개 뉴클레오티드)의 임의의 값으로 한정된 임의의 범위 내에 있는 임의의 길이의 것일 수 있다.The term "probe" is a broad concept that includes a probe specifically attached to a gene of interest to identify and/or detect the gene of interest. The probe is a nucleic acid capable of binding to a target nucleic acid of complementary sequence through one or more types of chemical bonds, usually through complementary base pairing, usually through the formation of hydrogen bonds and thus forming a duplex structure. am. A probe binds or hybridizes to a "probe binding site". In particular, a probe may be labeled with a detectable label to facilitate detection of the probe once it has hybridized to its complementary target. Alternatively, however, the probe may be unlabeled, but detected directly or indirectly by specific binding to a labeled ligand. Probes can vary considerably in size. Generally probes are at least 7 to 15 nucleotides in length. Other probes are at least 20, 30 or 40 nucleotides in length. Other probes are somewhat longer and are at least 50, 60, 70, 80, or 90 nucleotides in length. Other probes are even longer, at least 100, 150, 200 or more nucleotides in length. The probe may also be of any length within any range bounded by any of the above values (eg, 15-20 nucleotides in length).
본 발명에서 상기 “혼성화”는 상보적 염기서열을 가진 단일가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.In the present invention, the "hybridization" means that double-stranded nucleic acids are formed by hydrogen bonding between single-stranded nucleic acids having complementary nucleotide sequences, and is used in a similar sense to annealing. However, in a slightly broader sense, hybridization includes cases in which the base sequences between two single strands are completely complementary (perfect match) as well as exceptional cases in which some base sequences are not complementary (mismatch).
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 프로브는 아프리카돼지열병 바이러스 유전자의 P30 gene에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In a preferred aspect of the present invention, the probe may be a compound, antibody, protein, oligonucleotide, etc. that specifically binds to the P30 gene of the African swine fever virus gene, more preferably comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 It may be an oligonucleotide that
본 발명에서 상기 프로브는 상기 프라이머에 의해 증폭된 증폭산물에 특이적으로 결합하며, 엔도뉴클레아제에 의해 비염기 형태로 치환된 부위를 포함한 3' 부분이 제거되어 증폭산물을 검출하게 할 수 있다. In the present invention, the probe specifically binds to the amplification product amplified by the primer, and the 3' portion including the site substituted in an abasic form by an endonuclease is removed to detect the amplification product. .
본 발명에서 상기 프로브는 3' 말단에 스페이서가 포함되어 엔도뉴클레아제에 의해 3' 부위가 제거되지 않은 상태에서의 불필요한 증폭반응이 일어나지 않도록 이루어지는 것이 바람직할 수 있다. 이때 스페이서는 예를 들어, C3 스페이서(C3 spacer)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, it may be preferable that the probe includes a spacer at the 3' end so as to prevent unnecessary amplification reaction in a state where the 3' region is not removed by an endonuclease. In this case, the spacer may be, for example, a C3 spacer, but is not limited thereto.
본 발명의 상기 프로브는 서열의 중간의 일부 염기가 비염기 형태로 치환될 수 있다. 상기 중간의 비염기 형태는 엔도뉴클레아제의 작용을 위해 구성되는 것으로서 엔도뉴클레아제가 인식하여 절단할 수 있는 통상적인 DNA의 비염기 형태일 수 있으며, 예를 들어 THF(tetrahydrofuran)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the probe of the present invention, some bases in the middle of the sequence may be substituted with non-base forms. The intermediate abasic form is configured for the action of an endonuclease and may be a conventional abasic form of DNA that can be recognized and cleaved by an endonuclease, for example, it may be THF (tetrahydrofuran), It is not limited thereto.
본 발명의 일 양태에서, 상기 프로브는 증폭산물의 검출을 위해 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 포함할 수 있다. In one aspect of the present invention, the probe may include a reporter and a quencher to detect the amplification product.
본 발명에서 상기 프로브는 리포터와 소광자 간 거리가 가까울 때에는 신호 발생이 억제되다가 리포터와 소광자 간 거리가 멀어지면서 신호 세기가 증가한다. 일반적으로 상기 프로브가 상보적 염기서열과 혼성화하였을 때에 리포터와 소광자 간 거리가 가장 멀어지므로 신호 발생 또는 신호 세기 증가를 통해 특정 염기서열을 검출할 수 있다.In the present invention, the signal generation of the probe is suppressed when the distance between the reporter and the photon quencher is short, and the signal intensity increases as the distance between the reporter and the photon quencher increases. In general, when the probe hybridizes with a complementary nucleotide sequence, the distance between the reporter and the quencher becomes the greatest, so that a specific nucleotide sequence can be detected through signal generation or increase in signal intensity.
본 발명의 일 양태에서, 상기 리포터는 FAM, TET, JOE, YAKYE, HEX, CY3, ATTO550, TAM, ROX, TxRed, CY35, LC610, LC640, ATTO647N, CY5, 및 ATTO680 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형광 물질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one aspect of the present invention, the reporter is one or more fluorophores selected from the group consisting of FAM, TET, JOE, YAKYE, HEX, CY3, ATTO550, TAM, ROX, TxRed, CY35, LC610, LC640, ATTO647N, CY5, and ATTO680 It may be characterized as a material, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 소광자는 TAM, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BHQ650, DAB, 및 Eclip으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another aspect of the present invention, the quencher may be at least one selected from the group consisting of TAM, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BHQ650, DAB, and Eclip, but is not limited thereto.
보다 구체적으로, 상기 프로브는 검출을 용이하게 하기 위하여 말단 부위 또는 중간 부위에 하나 이상의 표지를 포함할 수 있으며, 상기 표지는 바람직하게는 형광 모이어티이며, 더욱 바람직하게는 다민, 쿠마린, 시아닌, EvoBlue, 옥사진, 카르보피로닌(carbopyronin), 나프탈렌, 바이페닐, 안트라센(anthracene), 페난트렌, 파이렌, 카르바졸 등을 기본 백본으로 가지는 형광 색소 또는 이의 유도체 같은 형광 모이어티가 선택적으로 연결 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 형광 모이어티, 즉 리포터는 Cy5.5 (694), Cy7 (773), ATTO 390™ (479), ATTO 425™ (484), ATTO 465™ (508), ATTO 488™ (523), ATTO 495™ (527), ATTO 520™ (538), ATTO 532™ (553), ATTO Rho6G™ (570), ATTO 550™ (576), ATTO 565™ (592), ATTO Rho3B™ (565), ATTO Rho11™ (608), ATTO Rho12™ (532), ATTO Thio12™ (579), ATTO 610™ (634), ATTO 611 X™ (681), ATTO 620™ (643), ATTO Rho14™ (625), ATTO 633™ (657), ATTO 647™ (669), ATTO 647 N™ (669), ATTO 655™ (684), ATTO Oxa12™ (663), ATTO 700™ (719), ATTO 725™ (752), ATTO 740™ (764), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), EvoBlue10™, EvoBlue30™, MR121, Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), 로다민(Rhodamine) 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), 피코에리트린 R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), 피로닌 Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-피코시아닌 (642), C-피코시아닌 (648), TOPRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), 티아디카르보시아닌 (671), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar650 (566), Quasar570 (667), Quasar670 (705), Quasar705 (610) 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 또한, 상기 형광 모이어티 유도체는 본 발명의 검출을 방해하지 않는 한 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다. 또는, 형광 빛을 흡수하여 퀀칭시킬 수 있는 소광체, 즉, 퀀처가 선택적으로 연결 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 퀀처는 답실(Dabsyl), BHQ(Black Hole Quencher)-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Iowa Black®FQ, Iowa Black®RQ, QXLTM 490, IRDye QC-1, Deep Dark QuencherII, Deep Dark QuencherI, Eclipse® Dark Quencher, ATTO 540Q, ATTO 580Q, ATTO 612Q 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 퀀처 유도체는 본 발명의 검출을 방해하지 않는 한 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다. 또는 상기 표지는 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파 등 검출이 가능한 시그널을 제공할 수 있는 표지라면 제한이 없다.More specifically, the probe may include one or more labels at its distal or middle region to facilitate detection, and the label is preferably a fluorescent moiety, more preferably damine, coumarin, cyanine, or EvoBlue. , a fluorescent moiety such as a fluorescent dye having an oxazine, carbopyronin, naphthalene, biphenyl, anthracene, phenanthrene, pyrene, carbazole, etc. as a basic backbone or a derivative thereof is optionally linked, or can be conjugated. For example, the fluorescent moiety of the present invention, i.e. the reporter, is Cy5.5 (694), Cy7 (773), ATTO 390™ (479), ATTO 425 ™ (484), ATTO 465 ™ (508), ATTO 488 ™ (523), ATTO:495™ (527), ATTO:520™ (538), ATTO:532™ (553), ATTO:Rho6G™ (570), ATTO:550™ (576), ATTO:565™ (592), ATTO:Rho3B™ ( 565), ATTO'Rho11™ (608), ATTO'Rho12™ (532), ATTO'Thio12™ (579), ATTO'610™ (634), ATTO'611 X™ (681), ATTO'620™ (643), ATTO'Rho14™ ( 625), ATTO 633™ (657), ATTO 647™ (669), ATTO 647 N™ (669), ATTO 655™ (684), ATTO Oxa12™ (663), ATTO 700™ (719), ATTO 725™ ( 752), ATTO740™ (764), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), EvoBlue10™, EvoBlue30™, MR121, Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522) , Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronine Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red ™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-Phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TOPRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC (5) (665 ), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanin (671), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar650 (566), Quasar570 (667), Quasar670 (705), Quasar705 (610) and It may be linked with a derivative or conjugate thereof, but is not limited thereto. The number in parentheses is the maximum wavelength of emission expressed in nanometers. In addition, the fluorescent moiety derivative may additionally include a free carboxyl group, an ester (eg, N-hydrosuccinimide (NHS) ester) or a maleimide derivative as long as the detection of the present invention is not hindered. Alternatively, a quencher capable of quenching by absorbing fluorescence light, that is, a quencher may be selectively linked or conjugated. For example, the quencher of the present invention is Dabsyl, BHQ (Black Hole Quencher) -0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Iowa Black®FQ, Iowa Black®RQ, QXLTM 490, IRDye QC -1, Deep Dark QuencherII, Deep Dark QuencherI, Eclipse® Dark Quencher, ATTO 540Q, ATTO 580Q, ATTO 612Q, and derivatives or conjugates thereof, but are not limited thereto. In addition, the quencher derivative may additionally include a free carboxyl group, an ester (eg, N-hydrosuccinimide (NHS) ester) or a maleimide derivative as long as the detection of the present invention is not hindered. Alternatively, the label is not limited as long as it can provide a detectable signal such as radioactivity, colorimetry, weight measurement, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, and hybridization radio frequency.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 프로브는 5'- TAGCGGTCGTAACAATTCTACCGCTATTGA [FAM_dT] A [THF] TC [BHQ1_dT] CAACAGAAAACCAAT-[C3 spacer]인 것을 특징으로 할 수 있다. In a preferred aspect of the present invention, the probe may be 5'-TAGCGGTCGTAACAATTCTACCGCTATTGA [FAM_dT] A [THF] TC [BHQ1_dT] CAACAGAAAACCAAT-[C3 spacer].
본 발명의 일 양태에서, 상기 프라이머 세트는 바람직하게는 등온증폭 용도이며, 더욱 바람직하게는 재조합효소 중합효소 증폭반응(Recombinase polymerase amplification)용일 수 있으나, 현장에서 단시간 내에 유전자를 증폭 및 검출 가능한 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. In one aspect of the present invention, the primer set is preferably for isothermal amplification, more preferably for recombinase polymerase amplification, but if the method can amplify and detect the gene in a short time in the field Not particularly limited.
상기 "재조합효소 중합효소 증폭법(RPA)"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단할 수 있는 장점이 있다.The "recombinase polymerase amplification method (RPA)" refers to a technology that can confirm DNA and RNA amplification, and unlike conventional PCR, it uses a DNA binding protein and a recombinase to rapidly and accurately ) is a technique that can amplify Since the RPA method can be amplified even under isothermal conditions using mesophilic polymerase, it has the advantage of detecting and diagnosing viruses in a short time with an isothermal device without special equipment.
본 발명은 또한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for detecting African swine fever virus, including the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명의 일 양태에서 상기 키트에는 전술한 프로브가 추가로 포함될 수 있다. In one aspect of the present invention, the kit may further include the aforementioned probe.
상기 키트는 RPA 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 상기 각각의 프라이머쌍 및 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The kit may be a kit containing essential elements necessary for performing the RPA assay, and in addition to the respective primer pairs and probes, a test tube or other suitable container, a reaction buffer (pH and magnesium concentration vary), deoxynucleotide ( dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water and sterile water, but are not limited thereto.
본 발명은 또한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for diagnosing African swine fever virus infection, comprising the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명은 또한 (a) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법을 제공한다. (a) isolating nucleic acids from a specimen; (b) amplifying a target sequence using the nucleic acid as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And (c) it provides a method for detecting African swine fever virus, comprising detecting the amplification product.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 증폭은 재조합효소 중합효소 증폭일 수 있다. 상기 증폭은 30 내지 45도씨에서 5 내지 30분간 수행될 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 40도씨에서 5 내지 25분간 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 35 내지 40도씨에서 5 내지 20분간 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 35 내지 40도씨에서 10 내지 20분간 수행될 수 있다. In the present invention, the amplification of step (b) may be recombinase polymerase amplification. The amplification may be performed at 30 to 45 ° C for 5 to 30 minutes, preferably at 30 to 40 ° C for 5 to 25 minutes, more preferably at 35 to 40 ° C for 5 to 20 minutes. And, most preferably, it can be carried out at 35 to 40 degrees Celsius for 10 to 20 minutes.
본 발명의 일 양태에서, 상기 (c) 단계의 검출은 프로브를 이용하여 측면흐름검출법을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one aspect of the present invention, the detection in step (c) may be performed through a lateral flow detection method using a probe, but is not limited thereto.
본 발명의 일 양태에서, 상기 검체는 임상시료일 수 있다. In one aspect of the present invention, the sample may be a clinical sample.
상기 임상시료는 생물학적 시료와 동일한 의미로 해석될 수 있으며, 아프리카돼지열병 바이러스 감염이 의심되는 개체, 즉, 사람 등 포유동물로부터 분리된 시료일 수 있다. 이의 비제한적인 예시로서 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 모피, 소변 등이 포함될 수 있다. The clinical sample may be interpreted in the same sense as a biological sample, and may be a sample isolated from an individual suspected of being infected with the African swine fever virus, that is, a mammal such as a human. Non-limiting examples thereof may include blood, plasma, serum, bone marrow, tissue, cells, saliva, sputum, fur, urine, and the like.
본 발명은 또한 (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스 감염증 진단방법을 제공한다. (a) isolating nucleic acids from biological samples isolated from mammals other than humans; (b) amplifying a target sequence using the nucleic acid as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and (c) detecting the amplification product.
본 발명이 제공하는 프라이머쌍을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법에 따르면 재조합효소 중합효소 증폭법에 따라 검체 내 아프리카돼지열병 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있어, 아프리카돼지열병 바이러스 감염증 진단 및 바이러스 검출에 매우 유용하게 활용될 수 있다. According to the composition containing the primer pair provided by the present invention and the African swine fever virus detection method using the same, the African swine fever virus in a sample can be rapidly detected with very high sensitivity and specificity according to the recombinase polymerase amplification method, It can be very useful for diagnosing African swine fever virus infections and detecting viruses.
도 1은는 아프리카돼지열병바이러스 Target p30 유전자DNA sequence에서 conserved region을 조사한 것이다.
도 2는 아프리카돼지열병바이러스 DNA를 단계희석하여 아프리카돼지열병 바이러스 P30 유전자를 타켓으로 하는 실시간 RPA의 검출민감도를 측정한 결과이다. 실시간 RPA의 검출민감도는 10개이다.
도 3은 아프리카돼지열병바이러스 야외형분리주에 대한 아프리카돼지열병 바이러스 P30 유전자를 타켓으로 하는 RPA를 이용한 검사 결과이다.
도 4는 시판되고 있는 기존의 real-time PCR키트를 이용하여 아프리카돼지열병바이러스 야외주에 대한 실험결과이다.
도 5는 아프리카돼지열병 바이러스 야외주에 대한 RPA와 기존의 real-time PCR와 상호상관성과 두 검사키트의 결과비교이다.1 is an examination of the conserved region in the African swine fever virus Target p30 gene DNA sequence.
2 is a result of measuring the detection sensitivity of real-time RPA targeting the African swine fever virus P30 gene by serially diluting the African swine fever virus DNA. The detection sensitivity of real-time RPA is 10.
3 is a test result using RPA targeting the African swine fever virus P30 gene for the field-type isolate of the African swine fever virus.
4 is an experimental result for an African swine fever virus outdoor strain using a commercially available real-time PCR kit.
Figure 5 is a comparison of the results of the RPA and the existing real-time PCR and cross-correlation of the African swine fever virus field strain and the two test kits.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the present invention is not limited thereto.
실시예 1: 아프리카돼지열병 바이러스 검출용 프라이머의 제작Example 1: Preparation of primers for detecting African swine fever virus
아프리카돼지열병 바이러스 특이적인 검출용 프라이머를 제작하기 위하여, 일차적으로 바이러스의 유전 정보를 이용하여 다중 정렬(multiplealignment)을 수행하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다. 아프리카돼지열병 바이러스의 유전자 중 p30 (CP204L)를 선택하였다. 이는 기존에 아프리카돼지열병바이러스의 genotyping에 많이 사용되고 있는 p70(B646L)보다 유전자보다 시컨스가 잘 보존(conserved)되 있다는 보고가 있어서 이다(King et al. 2003) In order to prepare African swine fever virus-specific detection primers, multiple alignment was performed primarily using genetic information of the virus. The results are shown in Figure 1. Among the genes of African swine fever virus, p30 (CP204L) was selected. This is because it has been reported that sequences are better conserved than genes than p70 (B646L), which has been widely used for genotyping of African swine fever virus (King et al. 2003).
Primer3 프로그램을 이용하여 프라이머와 프로브를 디자인한 결과 한 부위에서만 프라이머가 선별되었다. 검출용 프로브는 올리고뉴클레오티드 골격에 dT-fluorophore(FAM-dT)와 이에 상응하는 dT-quencher(BHQ-dT) 그룹을 abasic 뉴클레오타이드 유사체(tetrahydrofuran residue; THF, 혹은 dSpacer)에 인접하도록 제작하였고, 중합효소에 의한 중합반응(연장)을 방지하기 위하여 3' 말단에는 3'-modification 그룹인 C3-spacer를 배치함으로써, 프로브 결합시 형광의 발생을 통하여 아프리카돼지열병 바이러스를 검출할 수 있도록 제작하였다. 아프리카돼지열병 바이러스의 P30 gene에 특이적인 프라이머쌍 및 프로브의 서열은 하기 표 1과 같다.As a result of designing primers and probes using the Primer3 program, primers were selected only at one site. The detection probe was prepared so that the dT-fluorophore (FAM-dT) and the corresponding dT-quencher (BHQ-dT) group were adjacent to the abasic nucleotide analog (tetrahydrofuran residue; THF, or dSpacer) on the oligonucleotide backbone, and the polymerase In order to prevent polymerization (extension) by , a C3-spacer, a 3'-modification group, was placed at the 3' end so that ASF virus could be detected through the generation of fluorescence when the probe was bound. Sequences of primer pairs and probes specific to the P30 gene of African swine fever virus are shown in Table 1 below.
실시예 2: 아프리카돼지열병 바이러스 P30 gene RPA용 target 유전자 제작Example 2: Production of target gene for African swine fever virus P30 gene RPA
RPA용 진단용 프로브와 프라이머의 성능 테스트를 위해서 아프리카돼지열병 바이러스의 핵산이 있으나 정량적인 검사를 위하여 21 아프리카돼지열병 바이러스의 consensus sequence 부위를 Integrated DNA Technologies (IDT, 미국)에 의뢰하여 DNA fragmen 제작하여 실험에 사용하였다(볼드체).To test the performance of diagnostic probes and primers for RPA, there is African swine fever virus nucleic acid, but for quantitative examination, 21 African swine fever virus consensus sequence parts were requested to Integrated DNA Technologies (IDT, USA) to produce DNA fragments for experimentation (bold).
아프리카돼지열병바이러스 P30 (CP204L) 염기서열 (DB/HLJ/2018 ASFV)African swine fever virus P30 (CP204L) sequence (DB/HLJ/2018 ASFV)
atggatttta ttttaaatat atccatgaaa atggaggtca tcttcaaaac ggatttaaga tcatcttcac aagttgtgtt tcatgcgggt agcctgtata attggttttc tgttgagatt atcaatagcg gtagaattgt tacgaccgct ataaaaacat tgcttagtac tgttaagtat gatattgtga aatctgctcg tatatatgca gggcaagggt atactgaaca tcaggctcaa gaagaatgga atatgattct gcatgtgctg tttgaagagg agacggaatc ctcagcatct tcggagaaca ttcatgaaaa aaatgataat gaaaccaatg aatgcacatc ctcctttgaa acgttgtttg agcaagagcc ctcatcggag gtacctaaag actccaagct gtatatgctt gcacaaaaga ctgtgcaaca tattgaacaa tatggaaagg cacctgattt taacaaggtt attagagcac ataattttat tcaaaccatt tatggaaccc ctctaaagga agaagaaaaa gaggtggtaa gactcatggt tattaaactt ttaaaaaaaa aataaa atctgctcg tatatatgca gggcaagggt atactgaaca tcaggctcaa gaagaatgga atatgattct gcatgtgctg tttgaagagg agacggaatc ctcagcatct tcggagaaca ttcatgaaaa aaatgataat gaaaccaatg aatgcacatc ctcctttgaa acgttgtttg agcaagagcc ctcat cggag gtacctaaag actccaagct gtatatgctt gcacaaaaga ctgtgcaaca tattgaacaa tatggaaagg cacctgattt taacaaggtt attagagcac ataattttat tcaaaccatt tatggaaccc ctctaaagga agaagaaaaa gaggtggtaa gactcatggt tattaaactt ttaaaaaaaa aataa
실시예 3: 제조된 프라이머 및 프로브의 검출 민감도Example 3: Detection sensitivity of prepared primers and probes
상기 실시예 1에서 제조한 RPA용 프라이머와 프로브의 성능 테스트를 위해서 상기 실시예 2에서 제작한 아프리카돼지열병 바이러스의 target gene 인공합성 핵산을 이용하여 최소검출 한계를 측정하였다. 아프리카돼지열병바이러스의 농도가 5 x 106/uL가 되도록 계산한 다음 5 x 100/uL 까지 열단계씩 희석하여 39℃에서 20분 반응을 T8 UV scanner에서 수행한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 5 x 106/uL까지 20분내에 검출이 가능한 것으로 확인되었다. 반면, 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 primer와 probe set v2의 경우, 유전자가 증폭되지 않았다(data not shown).To test the performance of the primers and probes for RPA prepared in Example 1, the minimum detection limit was measured using the artificial nucleic acid target gene of the African swine fever virus prepared in Example 2. The concentration of African swine fever virus was calculated to be 5 x 10 6 /uL, then diluted in ten steps to 5 x 10 0 /uL, and a reaction was performed at 39 ° C for 20 minutes in a T8 UV scanner. As a result, as shown in FIG. Likewise, it was confirmed that up to 5 x 10 6 /uL could be detected within 20 minutes. On the other hand, in the case of primer and probe set v2 for African swine fever virus, the gene was not amplified (data not shown).
이후, 결과는 primer와 probe set v1을 이용한 것이며, 이 Mia 등(2019, Frotiens in Microbiology)결과는 타 보고와 비교하여 볼 때, 2배 정도 더 민감하다고 할 수 있다.After that, the results were obtained using the primer and probe set v1, and the results of Mia et al. (2019, Frotiens in Microbiology) can be said to be about twice as sensitive compared to other reports.
실시예 4: 제조된 프라이머 및 프로브의 야외 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 민감도Example 4: Sensitivity of Prepared Primers and Probes to Outdoor African Swine Fever Virus
상기 실시예 1에서 제조한 RPA용 프라이머와 프로브의 성능 테스트를 위해서 국립 러시아 수의과학연구소에서 공식적으로 분양을 받은 31개의 야외분리주(표 2)를 이용하여 민감도를 측정하였다. In order to test the performance of the primers and probes for RPA prepared in Example 1, the sensitivity was measured using 31 outdoor isolates (Table 2) officially sold by the Russian National Institute of Veterinary Science.
아프리카돼지열병 바이러스 야외주에 대한 분석을 실시한 결과 31개 중 30개에서 양성결과를 나타내었으며(도 3), 검출시간은 평균 365초(10분 5초)이었다. 상기 실시예 1에서 제조한 RPA용 프라이머와 프로브의 야외 바이러스주에 대하여 민감도 96.8%이었으며, 이는 기존의 real-time PCR과 동일한 결과를 나타내었으며(표 3), 두 검사법 간에 높은 연관성을 나타내었다 (도 5). 반면에 기존에 사용되고 있는 real-time PCR의 검출시간은 약 1시간 30분이 소요되었다.As a result of the analysis of the African swine fever virus outdoor strain, 30 out of 31 showed positive results (FIG. 3), and the average detection time was 365 seconds (10
실시예 4: 제조된 프라이머 및 프로브의 검출 특이도Example 4: Detection specificity of prepared primers and probes
상기 실시예 1에서 제조한 RPA용 프라이머와 프로브의 특이도를 조사하기 위하여 Adenovirus, Japanase Encephalitis virus, Rotavirus, Dengue virus, Influenza virus, Hepatitis virus에 대한 핵산을 분리 정제하여 상기 실시예 1에서 제조된 프라이머쌍 및 프로브의 검출 특이도를 평가한 결과, 다른 바이러스는 어느 하나도 검출하지 않는 것으로 확인되어 특이도가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다(표 4).In order to investigate the specificity of the primers and probes for RPA prepared in Example 1 above, nucleic acids for Adenovirus, Japanase Encephalitis virus, Rotavirus, Dengue virus, Influenza virus, and Hepatitis virus were separated and purified, and the primers prepared in Example 1 As a result of evaluating the detection specificity of the pair and the probe, it was confirmed that no other viruses were detected, indicating that the specificity was very high (Table 4).
본 발명이 제공하는 프라이머쌍을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법에 따르면 재조합효소 중합효소 증폭법에 따라 검체 내 아프리카돼지열병 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있어, 아프리카돼지열병 바이러스 감염증 진단 및 바이러스 검출에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다. According to the composition containing the primer pair provided by the present invention and the African swine fever virus detection method using the same, the African swine fever virus in a sample can be rapidly detected with very high sensitivity and specificity according to the recombinase polymerase amplification method, It can be used very usefully for diagnosing African swine fever virus infection and virus detection, so industrial applicability is very high.
<110> UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY WONJU CAMPUS <120> Composition for recombinase polymerase amplification reaction for real time detection of African swine fever virus <130> NP21-0086 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2P30v1 Forward primer <400> 1 agatcatctt cacaagttgt gtttcatgcg ggtag 35 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2P30v1 Reverse primer <400> 2 cgagcagatt tcacaatatc atacttaaca gtact 35 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2P30v1 Probe <400> 3 tagcggtcgt aacaattcta ccgctattga taatctcaac agaaaaccaa t 51 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2P30v2 Forward primer <400> 4 aatgaaacca atgaatgcac atcctccttt gaaa 34 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2P30v2 Reverse primer <400> 5 tttgtgcaag catatacagc ttggagtctt taggt 35 <210> 6 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2P30v2 Probe <400> 6 gtataattgg ttttctgttg agattatcaa tagcggtaga attgttacga cc 52 <110> UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY WONJU CAMPUS <120> Composition for recombinase polymerase amplification reaction for real time detection of African swine fever virus <130> NP21-0086 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 2P30v1 forward primer <400> 1 agatcatctt cacaagttgt gtttcatgcg ggtag 35 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 2P30v1 reverse primer <400> 2 cgagcagatt tcacaatatc atacttaaca gtact 35 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 2P30v1 Probe <400> 3 tagcggtcgt aacaattcta ccgctattga taatctcaac agaaaaccaa t 51 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 2P30v2 forward primer <400> 4 aatgaaacca atgaatgcac atcctccttt gaaa 34 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 2P30v2 reverse primer <400> 5 tttgtgcaag catatacagc ttggagtctt taggt 35 <210> 6 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 2P30v2 Probe <400> 6 gtataattgg ttttctgttg agattatcaa tagcggtaga attgttacga cc 52
Claims (18)
A composition for detecting African swine fever virus, comprising a pair of primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
The composition according to claim 1, wherein the composition further comprises a probe.
The composition according to claim 2, wherein the probe comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
3. The composition of claim 2, wherein the probe comprises a reporter and a quencher.
The method of claim 4, wherein the reporter is one or more fluorescent substances selected from the group consisting of FAM, TET, JOE, YAKYE, HEX, CY3, ATTO550, TAM, ROX, TxRed, CY35, LC610, LC640, ATTO647N, CY5, and ATTO680 A composition characterized in that.
The composition according to claim 4, wherein the quencher is at least one selected from the group consisting of TAM, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BHQ650, DAB, and Eclip.
The composition according to claim 4, wherein the probe is 5'-AAGGCCACAAGCAACTTCAATGAGAATTGG [FAM-dT] A [THF] G [BHQ1-dT] CTATAAGGATGTGGC-[3'-block].
According to claim 1, wherein the composition is characterized in that the composition for recombinase polymerase amplification (Recombinase polymerase amplification).
A kit for detecting African swine fever virus, comprising a pair of primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
10. The composition of claim 9, wherein the kit further comprises a probe.
A composition for diagnosing African swine fever virus infection, comprising a pair of primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
12. The composition of claim 11, wherein the composition further comprises a probe.
(b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법.
(a) isolating nucleic acids from the specimen;
(b) amplifying a target sequence using the nucleic acid as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and
(c) a method for detecting African swine fever virus, comprising the step of detecting the amplification product.
The detection method according to claim 13, wherein the amplification is recombinase polymerase amplification.
14. The method of claim 13, wherein the detection is performed using a probe.
The detection method according to claim 13, wherein the sample is a clinical sample.
[Claim 14] The detection method according to claim 13, wherein the amplification is performed at 30 to 45 degrees Celsius.
(b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스 감염증 진단방법. (a) isolating nucleic acids from a biological sample isolated from a non-human mammal;
(b) amplifying a target sequence using the nucleic acid as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and
(c) a method for diagnosing African swine fever virus infection, comprising the step of detecting the amplification product.
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