KR102162470B1 - 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 c-rapo (kctc13986bp), 비피도박테리움 비피덤 att (kctc13474bp) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 식품 조성물 및 약학 조성물 - Google Patents

비피도박테리움 슈도카테눌라튬 c-rapo (kctc13986bp), 비피도박테리움 비피덤 att (kctc13474bp) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 식품 조성물 및 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 균주와 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주에 의한 쇼그렌증후군의 증상인 침샘염을 억제하고 타액분비량 감소를 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명은 쇼그렌증후군의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으며, 식품, 건강기능식품, 의약품으로 개발될 수 있다.

Description

비피도박테리움 슈도카테눌라튬 C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 ATT (KCTC13474BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 식품 조성물 및 약학 조성물 {Food composition for alleviation of Sjogren's syndrome and pharmaceutical composition with Bifidobacterium pseudocatenulatum C-RAPO (KCTC13986BP), Bifidobacterium bifidum ATT (KCTC13474BP)}
본 발명은 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 식품 조성물 및 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
쇼그렌증후군 (Sjogren's syndrome)은 외분비샘 (exocrine gland)에 림프구가 침윤되어 외분비샘이 파괴되어 구강 건조 및 안구건조 증상이 발생하는 특징을 나타내는 만성적인 자가 면역 질환이다. 쇼그렌증후군은 외분비샘의 기능저하로 인한 구강 건조 및 안구 건조 증상 이외에 전신을 침범할 수 있는 자가면역질환으로 관절염, 폐 침범, 신장 침범, 혈관염, 신경염, 그리고 악성 림프종 등이 발생할 수 있으며 특히 악성 림프종의 발병률은 같은 나이, 성, 인종의 정상인과 비교 시 약 40배가 높다.
쇼그렌증후군의 병리기전은 명확하게 밝혀져 있지는 않으나, 현재까지는 바이러스와 같이 선천 면역계 활성을 유발 시킬 수 있는 인자에 의해 상피세포에서 자가항원을 제공하게 되고, 이에 대한 항체가 만들어지면서 면역글로불린-자가항원으로 구성된 면역 복합체에 의해 비정상적인 자가면역의 활성화가 일어나는 것으로 알려져 있다. 또한, 타액의 구성성분을 발현하며 타액의 방출을 담당하는 타액 샘 (salivary gland)의 말단 구조인 소포(acinus)에서 칼슘 및 신경전달물질에 대한 민감도가 감소하고, M3R 수용체 및 Aquaporin 5 수용체를 공격하는 자가 항체의 생성으로 정상적인 타액 분비가 이루어지지 않는 것이 특징이다.
쇼그렌증후군은 소아를 비롯한 전 연령에서 발생할 수 있으나, 주로 고령에서 증가한다. 외국의 경우 60세 이상 여성에서 약 2-3%의 유병률을 보이며 한국 역시 고령 사회로 진입함에 따라 국내 유병률이 증가할 것으로 추정된다. 쇼그렌증후군의 정확한 국내 유병률은 국내 역학조사가 이루어지지 않아 알려지지 않으나, 외국(그리스, 스웨덴) 통계로는 0.3~3% 정도의 유병률을 보이는 것으로 나타났다.
이러한 쇼그렌증후군을 치료할 수 있는 근본적인 치료법은 아직 없는 상태로서, 각 부위별 증상의 진행을 완화시키고 합병증을 방지하기 위한 보조적인 약물 치료가 전부이며, 구강 건조는 평상시 물을 자주마시거나 스프레이식 인공타액 생성제를 사용하거나, 필로카틴을 투여하기도 한다. 또한 건조한 피부에는 보습을 충분히 하도록 하며, 염증 완화를 위해 비스테로이드 계통의 소염진통제를 사용하고 있다. 하지만, 치료 효과가 미비하고 부작용이 있는 등 쇼그렌증후군의 근본적인 치료 방법은 아니다. 따라서, 효과적인 쇼그렌증후군의 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
대한민국 특허공개공보 제1020160115176호 (공개일자 2016.10.06)에는, 쇼그렌증후군이 유발된 동물모델에 PAX3을 과발현시키면 쇼그렌증후군의 증상이 완화 및 개선되는 것으로 나타났고, 염증성 사이토카인의 생성도 억제되는 PAX3을 유효성분으로하는 쇼그렌증후군 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개공보 제1020090043910호 (공개일자 2009.05.07)에는, 쇼그렌증후군 및 낭창의 예방 및 치료에 효과적인 항체인 항-4-1BB을 함유하는 조성물에 관한 것이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개공보 제1020190106578호 (공개일자 2019.9.18)에는, 부티레이트를 포함하는 쇼그렌증후군의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 다양한 적용에 관한 것이 기재되어 있다.
본 발명에서는 우수한 쇼그렌증후군 효능을 갖는 신규의 유산균을 제공하고, 이를 예방 및 치료용 약학 조성물, 식품 조성물로 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은, 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은, 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 균주 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주에, 쇼그렌증후군의 증상인 침샘염을 억제하고 타액분비량 감소를 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명은 쇼그렌증후군의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으며, 식품, 건강식품, 의약품으로 개발될 수 있다.
도 1은 본 발명의 10주령 타액분비량(SFR)에 의한 군분리를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 부형제 및 시험물질 투여에 의한 침샘염 단위면적당 foci 수를 그래프로 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 부형제 및 시험물질 투여에 의한 침샘염 단위 면적당 foci 수를 염증 점수 (Inflammation score)로 점수화한 그래프를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 침샘조직 병리 분석결과 (H&E) 부형제 투여군(Vehicle) 침샘염의 침샘조직 슬라이드를 40배율로 촬영한 결과 사진이다.
도 5는 본 발명의 침샘조직 병리 분석결과 (H&E) 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO 투여군의 침샘조직 슬라이드를 40배율로 촬영한 결과 사진이다.
도 6은 본 발명의 침샘조직 병리 분석결과 (H&E) 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO 투여군의 침샘조직 슬라이드를 40배율로 촬영한 결과 사진이다.
도 7은 본 발명의 침샘조직 병리 분석결과 (H&E) 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT 투여군의 침샘조직 슬라이드를 40배율로 촬영한 결과 사진이다.
도 8은 침샘조직 내 T세포 침윤 분석 결과로서, 18주령 마우스의 침샘조직을 적출하여 파라핀블록으로 제작한 다음 조직절편을 CD3항체로 면역조직화학염색 시행 후 200배율에서 현미경으로 촬영한 뒤 Image J 소프트웨어를 이용하여 양성부위를 검은 색으로 masking하고 (도 8에서 왼쪽) pixel수를 산출하였다. 단위면적(area)당 CD3 양성부위 면적을 평균±표준편차로 표시하였다 (도 8에서 오른쪽).
도 9는 침샘조직 내 B세포 침윤 분석결과로서, 18주령 마우스의 침샘조직을 적출하여 파라핀블록으로 제작한 다음 조직절편을 B220항체로 면역조직화학염색 시행 후 200배율에서 현미경으로 촬영한 뒤 Image J 소프트웨어를 이용하여 양성부위(도 9에서 왼쪽)를 masking하고 pixel수를 산출하였다. 단위면적(area)당 B220 양성부위 면적을 평균±표준편차로 표시하였다(도 9에서 오른쪽).
도 10은 본 발명의 부형제 및 시험물질 투여에 의한 NOD/ShiLtJ 주령 별 타액 분비량을 측정하여 타액 분비 기능에 대한 영향을 수치화한 결과 그래프 그림이다.
도 11은 본 발명의 Vehicle 군의 주령에 따른 타액 분비량을 개체의 타액분비량으로 수치화하여 나타낸 그래프 그림이다.
도 12는 본 발명의 C-RAPO 군의 주령에 따른 타액 분비량을 개체의 타액분비량으로 수치화 하여 나타낸 그래프 그림이다.
도 13은 본 발명의 RAPO 군의 주령에 따른 타액 분비량을 개체의 타액분비량으로 수치화하여 나타낸 그래프 그림이다.
도 14는 본 발명의 ATT 군의 주령에 따른 타액 분비량을 개체의 타액분비량으로 수치화하여 나타낸 그래프 그림이다.
본 발명은 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주를 제공한다. 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP)는 하기 본 발명에서 수행하는 실험에 의할 경우, 쇼그렌증후군의 염증세포침윤 감소 및 타액분비량 증가의 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다. 좀 더 구체적으로 설명하자면, 침샘조직 H&E 염색하는 병리학적 분석실험에서 부형제 투여군 대비 시험약물 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 투여군에서 침샘염에 대한 치료효능이 있는 것을 확인할 수 있었고, 침샘조직내 T세포/B세포 침윤분석 실험에서는 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP)을 50 mg/kg/day 용량으로 투여했을 때 침샘 조직 내 염증세포침윤이 감소하며 이때 T세포 및 B세포의 침윤이 감소하는 것으로 나타났다.
또한, 타액분비량 실험에서는 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP)가 50 mg/kg/day 투여에 의해 타액분비량의 감소가 억제되는 것, 즉 쇼그렌증후군의 타액분비량 감소 현상을 억제할 수 있음을 명확히 확인할 수 있었다.
비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 모두 쇼그렌증후군의 억제에 효과가 있음을 확인할 수 있었으나, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP)의 경우, 침샘염에 대한 치료 효능 및 타액분비량 감소 억제 효과가 둘 다 확인되어 더 바람직한 것으로 판단되었다.
비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 특정 제형에 반드시 한정되는 것은 아니고, 일 예로 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태로 제제화한 것일 수 있다. 또한, 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하여 일반 식품 형태로 제조한 것일 수 있다.
비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 약학 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를들어, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
또한, 상기와 같은 방법으로 제형화된 약학 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서의 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
본 실험의 설명에 앞서 약어들을 정리하여 표로 나타내었다.
약어 원어(Definition of Terms) 한글
B Bifidobacterium 비피도박테리움
NOD Non-obese diabetic 비 비만 당뇨병
Ig Immunoglobulin 면역글로불린
SFR Saliva flow rate 타액 분비량
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 효소 면역 측정법
CD Cluster of differentiation 세포표면항원무리(분화클러스터)
FSC-A Forward scatter-Average 전면 산란광 평균
SSC-A Side scatter-Average 측면 산란광 평균
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate 포볼12-미리스테이트 13-아세트산
IL Interleukin 인터루킨
mpk mg/kg 킬로그램 당 밀리그램
H&E Hematoxylin & Eosin 헤마토실린과 에오신
IHC Immunohistochemistry 면역조직화학염색
본 발명의 실험에 사용되는 실험균주 및 부형제를 하기 표로 나타내었다.
1) 실험 균주
명칭 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO
(KCTC13986BP)
제조번호 201908
입수일 2019.09.04
입수량 80 tubes
성상 아이보리색 분말
함량 10 ~ 15mg /tube
유효일자 2021.08
보관조건 -70도
공급원 (주)비피도
기탁번호 KCTC13986BP
공개 대한민국 특허출원 10-2019-0126394를 통해 공개됨
명칭 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT (KCTC13474BP)
제조번호 201908
입수일 2019.09.04
수량 80 tubes
성상 아이보리색 분말
함량 10 ~ 15mg /tube
유효일자 2021.08
보관조건 -70도
공급원 (주)비피도
기탁번호 KCTC13474BP
공개 대한민국 특허출원 10-2018-0012354를 통해 공개됨
명칭 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO (KCTC13773BP)
제조번호 201908
입수일 2019.09.04
수량 80 tubes
성상 아이보리색 분말
함량 10 ~ 15mg /tube
유효일자 2021.08
보관조건 -70도
공급원 (주)비피도
기탁번호 KCTC 13773BP
공개 대한민국 특허출원 10-2018-0160170를 통해 공개됨
2)부형제
명칭 생리식염수
제조번호 KAH5134 3B
제조사 중외제약
보관조건 실온보관
본 발명 실험의 재료는 하기 정보 조건으로 실험하였다.
1) 시험계 동물 정보
종 및 계통 NOD/ShiLtj mouse
공급원 중앙실험동물(주)
선정사유 제1형 당뇨병을 유발하는 다발성 모델임. 이 마우스에서 발생하는 당뇨는 insulitis로 특징되며 췌장에 림프구성 염증을 일으킴. 약 12주령이 되면 인슐린 분비가 급격히 줄어들며 이러한 현상은 암컷에서 보다 빨리 진행 됨. 결과적으로 당뇨가 발병한 개체에 한해 혈장 내 글루코스의 농도가 250 mg/dL에 이름. 약 12주령부터 침샘을 분비하는 침샘 상피세포가 변형되기 시작하며 16주령에 이르면 림프구성 염증이 심화되고 침의 분비가 감소하므로 쇼그렌증후군의 동물 모델로도 사용 됨
입수일 2019.08.29
성별 암컷
입수 시 동물 수 및 체중범위 40수, 19-21g
투여개시 시 동물 수 및 체중범위 40수, 22-24g
2) 시험군 구성 설정
(1) 시험군의 구성
군 성별 동물수
(마리)		 동물번호 투여경로
/횟수		 투여액량 투여량
(mg/kg)
G1
Vehicle 		Female 8 V
경구투여
1회/일,
총 45회
100 μL /20~25 g 		-
G2
B. pseudocatenulatum C-RAPO		 Female 8 L 50 mg/kg
G3
B. longum RAPO		 Female 8 R 50 mg/kg
G4
B. bifidum ATT		 Female 8 A 50 mg/kg
(2)개체번호
개체표식
Vehicle(V) 1X 1L 1R 1B 2X 2L 2R 2B
C-RAPO(L) 1X 1L 1R 1B 2X 2L 2R 2B
RAPO(R) 1X 1L 1R 1B 2X 2L 2R 2B
ATT(A) 1X 1L 1R 1B 2X 2L 2R 2B
(3) 군 분리
시험물질 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO (KCTC13773BP) 및 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT (KCTC13474BP)의 투여에 앞서 타액 분비량이 유의하게 감소하기 전인 10주령의 NOD/ShiLtJ 마우스의 SFR측정 결과를 바탕으로 군 분리를 시행하였다. Pilocarpine activation 방법으로 10분간 얻어지는 타액량(μL)을 체중(g)과 시간(minute)으로 나누어 SFR을 계산하여 비교하였다. 10주령의 SFR은 평균과 표준편차가 각각, G1: 0.673±0.120μL/g/min, G2: 0.672±0.120μL/g/min, G3: 0.671±0.129μL/g/min, G4: 0.673±0.133μL/g/min이 되도록 최대한 균등하게 배정하였다.
10주령 타액분비량(SFR)에 의한 군 분리는 도 1과 같이 나타났다. 도 1은, 본 발명의 10주령 타액분비량(SFR)에 의한 군분리를 나타낸 그림이다. 즉, 10주령의 동물들은 타액 분비량 측정 후, 각 군의 평균 타액 분비량 및 이에 대한 표준편차 (standard deviation, SD) 값이 최대한 균일하게 분포하도록 분배하여 '시험군의 구성' (표 7)을 한 것이다.
(4) 투여물질의 조제
시험물질은 10~15 mg/tube로 분주된 채 반입되어 투여직전 생리식염수로 10mg/ml의 농도로 희석해서 사용하였다. 매일 해당 용량으로 조제하여 투여하고 남은 물질은 즉시 폐기하였다. 시험물질 주입은 10주령 타액분비량 측정 후 익일부터 시작하였다.
(5) 투여
사람에게 적용되는 임상 예정 경로로 부형제 및 시험물질을 경구투여 하였다. 경구투여(시험물질)은 경구투여용 존데를 장착한 주사기를 이용하여 위 내에 직접 투여하였다. 또한 복강주사(타액유도물질, pilocarpine)을 손으로 마우스 보정 후 주사기를 이용하여 0.1 mg/100μL씩 복강 내 직접주사하였다.
(6) 투여횟수 및 투여시간
부형제 및 시험물질은 1일 1회, 9주간 총 45회 투여하였다. 타액유도물질(pilocarpine)은 2주 1~2회 (타액 분비량 분석 시, 일부 개체 익일 재측정), 마우스의 사료는 자유 섭취하도록 하였다.
3) 시험방법 및 시험항목
(1) 체중측정
10주령부터 18주령까지 2주 간격으로 측정하였다.
(2) 면역글로불린 분석
10주령부터 18주령까지 2주 간격으로 안와채혈하고 그로부터 얻은 혈청으로 측정하였다. 혈청은 1% bovine serum albumin이 포함된 Tris buffer용액으로 50,000배 희석 후 측정에 사용하였다. ELISA 기법으로 측정하며 사용된 제품은 다음과 같고 측정 방법은 제조사의 추천을 따랐다.
시료명 판매사 Cat. No 사용량
Mouse IgG ELISA Quantitation set Bethyl lab. E90-131 1
TMB substrate solution ThermoFisher 00-4201-56 1
(3) 타액분비량(SFR, Saliva flow rate) 분석
타액유도물질제조 : Pilocarpine hydrochloride (Sigma, Cat. No.P6503)을 증류수에 1 mg/ml의 농도로 녹였다. 0.22μm 주사기 필터로 걸렀다.
타액 수집 : 마우스 당 pilocarpine 용액을 0.1ml씩 복강주사 후 곧바로 1분간 isoflurane으로 호흡마취 한다. 마우스를 손으로 보정하고 200μL 용량의 마이크로피펫을 사용하여 마우스 입안에 고이는 침을 10분간 tube에 모았다. 수집된 침은 8000rpm에서 5분간 원심분리한 뒤, 200μL 용량의 마이크로피펫을 사용하여 volume을 측정하고 기록하였다. 타액 분비량을 타액량(μL)/체중(g)/1분(minute)의 단위로 산출하여 비교하였다. 분리된 타액 상등액은 -20℃에서 냉동보관하였다. 그룹내 평균 이하의 타액분비량(SFR)을 보이는 개체는 익일 재측정하여 보정하였다.
(4) 조직분석(Hematoxylin & Eosin)
18주령 마우스의 안락사 후에 목부위를 절개하여 salivary gland (침샘)을 적출하고 포르말린 용액에 담가 고정하였다. 파라핀블록으로 제작하였다. 전 수의 침샘 절편 슬라이드를 3부위 각각 3장씩 Hematoxylin & Eosin 염색하였다. 40배율 현미경 촬영 후 조직내 림프구가 20개 이상 모인 foci를 계수하여 점수화 하였다.
염증 점수 (Inflammation scoring) : 0점 foci 없음, 1점 foci 1개, 1.5점 foci 2개, 2점~ 2.5점 foci 3~5개, 3점 foci 6~9개.
(5) 조직 면역화학 염색 (T세포 / B세포 분석, IHC)
18주령 동물을 안락사 후, 침샘을 적출하여 파라핀 블록을 제작하였다. 시험된 전 수의 침샘 절편 슬라이드 1장씩 IHC 염색하였다. 항체는 T세포 검출용으로 anti-CD3 (Abcam Cat. No. ab16669), B세포 검출용으로 anti-B220(BD Cat. No. 550286)을 사용하였다. 200배율 현미경 상에서 슬라이드 내 전체 foci를 각각 촬영후 Image J 소프트웨어 (NIG, MD, USA)를 이용하여 갈색으로 염색된 CD3 혹은 B220의 양성부위를 마스킹하였다. Foci가 있는 현미경시야 중 CD3 혹은 B220의 면적을 pixel 수로 산출하고, 이때 foci가 없는 부위 면적은 0으로 처리한 후 평균 CD3 혹은 B220의 면적을 그룹간 비교하였다.
(6) 유세포 분석
시험약물 주입이 종료된 18주령 동물 모델에서 heparin 처리된 capillary tube를 이용해 얻은 혈액으로부터 세포를 분리한 뒤, 적혈구를 ACK lysis buffer로 제거하고, 10% RPMI1640 배지에 부유시킨 다음 PMA, ionomycin 그리고 monensin (BD golgistop)을 4시간 동안 자극하였다. 세포를 회수하여 세척한 후 Fixable viability dye-e780, CD3-Pacific Blue, CD4-PerCP/Cy5.5 및 permeabilization 과정을 거친후 IL-17A-FITC 항체와 반응시켰다. FSC-A vs SSC-A 에서 lymphocyte, FSC-A vs Fixable viability dye eFluor780 에서 live cell(e780 negative)을 gating 하고 CD3+CD4+IL-17A+ 세포를 분석한다. (BD LSRII fortessa)
시료명 판매사 Cat.No 사용량
PMA Sigma-Aldrich P8139 25 ng/mL
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634 250 ng/mL
Golgistop BD biosciences 554724 0.67 μL/ 106 cells/mL
Fixable viability dye eFlour780 Thermo 65-0865-18 0.1 μL/106 cells
Anti-mouse CD3 V450 Thermo 48-0033-82 0.25 μg/test
Anti-mouse CD4 PerCP/Cy5.5 Thermo 45-0042-82 0.25 μg/test
Anti-mouse IL-17A Alexa488 Biolegend 506910 0.25 μg/test
(7) 통계학적인 방법
모든 데이터는 평균과 표준편차(Mean±SD)로 표시하였으며, 부형제 투여군과 시험물질 투여군의 두 군간 비교를 위해 GraphPad PRISM Version 8.2 (GraphPad Software, USA) 분석프로그램의 Man Whitney test를 이용하였고, ,* P < 0.05 이하인 경우 통계적 유의성 있는 것으로 판정하였다.
[실시예 1: 본 발명 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 ( B. pseudocatenulatum ) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 ( B. bifidum ) ATT (KCTC13474BP) 투여 후 침샘조직 병리분석- H&E 염색 분석]
본 실시예에서는, 선별된 균주 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO (KCTC13773BP) 및 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT (KCTC13474BP) 투여로 NOD/ShiLtJ 마우스의 침샘조직 내 염증 침윤에 대한 영향을 평가하기 위한 실험을 진행하였다.
18주령 마우스의 침샘조직을 분석하였다. 18주령 시험 종료시 마우스를 안락사하여 침샘을 적출한 뒤 파라핀 블록을 제작하였다. 100μm 이상 떨어진 부위의 침샘 조직 슬라이드 3장씩 Hematoxylin & Eosin 법으로 염색하였다. 이후, 침샘 조직 슬라이드 내 20개 이상의 림프구가 모인 foci가 가장 많이 관찰되는 구역을 슬라이드마다 40배율로 촬영하고, foci 개수를 기록한 뒤 기준에 따라 염증 점수 (Inflammation score)로 수치화하여 비교 분석하였다. 염증 점수 (Inflammation scoring : 0점 foci 없음, 1점 foci 1개, 1.5점 foci 2개, 2점~ 2.5점 foci 3~5개, 3점 foci 6~9개). 침샘 조직 내 단위면적 당 foci 개수 분석결과 V군 9±2개, C-RAPO군 5±3개, ATT군 7±4개로 나타났다.(도 2)
도 2는 본 발명의 부형제 및 시험물질 투여에 의한 침샘조직 내 단위면적당 foci 수를 그래프로 나타낸 그림이다. 이를 염증 점수 (Inflammation score)로 환산했을 때 각각 V 3.2±0.50, C-RAPO 2.3±0.99, RAPO 3.2±0.49, ATT 2.8±0.94 이고, 결과 값을 평균±표준편차로 나타냈다(도 3). 도 3은 본 발명의 부형제 및 시험물질 투여에 의한 침샘조직 내 단위 면적당 foci 수를 염증 점수 (Inflammation score)로 점수화한 그래프를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 침샘조직 병리 분석결과 (H&E) 부형제 투여군(Vehicle)의 침샘조직 슬라이드를 40배율로 촬영한 결과 사진이다 (도 4에서 세로 축의 1, 2, 3은 샘플 번호로 같은 실험을 3회 한 것을 의미함. 이하 사진에서도 동일함). 도 5는 본 발명의 침샘조직 병리 분석결과 (H&E) 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 투여군의 침샘조직 슬라이드를 40배율로 촬영한 결과 사진이다. 도 6은 본 발명의 침샘조직 병리 분석결과 (H&E) 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO (KCTC13773BP) 투여군의 침샘조직 슬라이드를 40배율로 촬영한 결과 사진이다. 도 7은 본 발명의 침샘조직 병리 분석결과 (H&E) 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT (KCTC13474BP) 투여군의 침샘조직 슬라이드를 40배율로 촬영한 결과 사진이다.
본 실험의 통계분석 결과, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 투여군에서 침샘염에 대한 치료 효능이 나타난 것으로 평가할 수 있었다.
[실시예 2: 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 ( B. pseudocatenulatum ) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 ( B. bifidum ) ATT (KCTC13474BP) 투여 후, 침샘조직 병리분석- 침샘조직 내 T세포/B세포 침윤 분석]
본 실시예 2에서는 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO (KCTC13773BP) 및 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT (KCTC13474BP) 투여로 NOD/ShiLtJ 마우스의 침샘조직 내 면역세포(T세포 및 B세포) 침윤에 대한 영향을 평가하기 위하여 18주령 마우스의 침샘조직을 분석하였다.
18주령 마우스 시험 종료 시, 마우스를 안락사하여 침샘을 적출한 뒤 파라핀블록을 제작하고, 침샘 조직 슬라이드 1장씩 각각 CD3 (T세포 marker) 또는 B220 (B세포 marker)항체를 이용하여 면역조직화학염색법(IHC)으로 염색하였다. 이후 침샘 조직 슬라이드 내 모든 foci를 200배율로 촬영하고, 각 foci에서 CD3 (T세포) 또는 B220 (B세포)가 갈색으로 표지된 부분을 Image J 소프트웨어를 이용해 pixel수로 산출하였으며, foci가 없는 구역은 '0'으로 표시한 뒤 평균값을 비교하였다. 개체 별 대표 염색결과를 1장씩 표시하였다.
침샘 조직 내 단위면적 당 T세포 침윤 면적 분석 결과 (도 8), V(대조군) 755±314.8 pixels, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO 투여군 488±277.8 pixels, 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO 투여군 826±404.5 pixels, 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT 투여군 862±384.6 pixels로 나타났으며, 통계분석 결과 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 투여군에서 침샘조직 내 T세포 침윤이 감소하는 경향을 보였다. 도 8은 침샘조직 내 T세포 침윤 분석 결과로서, 18주령 마우스의 침샘조직을 적출하여 파라핀블록으로 제작한 다음 조직절편을 CD3항체로 면역조직화학염색 시행 후 200배율에서 현미경으로 촬영한 뒤 Image J 소프트웨어를 이용하여 양성부위를 검은 색으로 masking하고 (도 8에서 왼쪽) pixel수를 산출하였다. 단위면적(area)당 CD3 양성부위 면적을 평균±표준편차로 표시하였다 (도 8에서 오른쪽) (그래프에서 ns(non-significant)의 의미는 유의차가 없다는 의미임. 이하 그래프에서도 동일함).
한편, 조직 내 단위면적 당 B세포 침윤 면적 분석 결과 (도 9), V(대조군) 689±406.9 pixels, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO 투여군 331±187.6 pixels, 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO 투여군 844±527.9 pixels, 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT 투여군 753±510.5 pixels 로 나타났으며, 통계분석 결과 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 투여군에서 침샘조직 내 B세포 침윤이 통계적으로 유의하게 감소하였다 (V vs. C-RAPO, *P<0.05). 도 9는 침샘조직 내 B세포 침윤 분석결과로서, 18주령 마우스의 침샘조직을 적출하여 파라핀블록으로 제작한 다음 조직절편을 B220항체로 면역조직화학염색 시행 후 200배율에서 현미경으로 촬영한 뒤 Image J 소프트웨어를 이용하여 양성부위(도 9에서 왼쪽)를 masking하고 pixel수를 산출하였다. 단위면적(area)당 B220 양성부위 면적을 평균±표준편차로 표시하였다(도 9에서 오른쪽).
상기의 실험 결과로부터, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 을 50mg/kg/day 용량으로 투여했을 때, 침샘 조직 내 염증세포침윤이 감소하며, T세포 및 B세포의 침윤이 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (특히, B세포 침윤은 유의성 있게 감소함). 이로부터 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP)에 침샘염 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
[실시예 3: 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 ( B. pseudocatenulatum ) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 비피덤 ( B. bifidum ) ATT (KCTC13474BP) 투여 후, 타액분비량 분석]
본 실험은, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP), 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO (KCTC13773BP) 및 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT (KCTC13474BP) 투여로 NOD/ShiLtJ 마우스의 타액 분비 기능에 대한 영향을 평가하기 위하여 분당 타액 분비량을 측정하여 수치화하였다.
도 10은 본 발명의 부형제 및 시험물질 투여에 의한 NOD/ShiLtJ 주령 별 타액 분비량을 측정하여 타액 분비 기능에 대한 영향을 수치화한 결과 그래프이다.
또한, 도 11은 본 발명의 Vehicle 군의 주령에 따른 타액 분비량을 개체의 타액분비량으로 수치화하여 나타낸 그래프 그림이다. 도 12는 본 발명의 C-RAPO 군의 주령에 따른 타액 분비량을 개체의 타액분비량으로 수치화하여 나타낸 그래프 그림이다. 도 13은 본 발명의 RAPO 군의 주령에 따른 타액 분비량을 개체의 타액분비량으로 수치화하여 나타낸 그래프 그림이다. 도 14는 본 발명의 ATT 군의 주령에 따른 타액 분비량을 개체의 타액분비량으로 수치화하여 나타낸 그래프 그림이다.
도 11에서 보는 바와 같이, 부형제(V) 투여에 의한 타액분비량은, 10주령부터 18주령까지 2주 간격으로 측정하였으며, 10주령부터 타액 분비량에 대한 모니터링을 시작한 이래로, 10주령 SFR 0.673±0.12, 18주령 SFR 0.489±0.039 μL/g/min 로 나타났으며, 초기 10w에 비해 18w에서 침분비량이 유의성 있는 감소를 보였다 (도 12, 10w 대비 18w *P<0.05). 이와 같은 결과는 부형제(V) 투여에 의해 침분비량이 유의성 있게 감소한 것을 확인한 것으로, 시간의 경과에 따라 침분비량이 감소해야 하는 쇼그렌증후군 모델이 정상적으로 작동하고 있음을 보여준다.
또한, 도 12에서 보는 바와 같이, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 투여에 의한 타액분비량은 10주령 SFR 0.672±0.12, 18주령 SFR 0.520±0.114 μL/g/min 으로 타액분비량이 다소 감소하였으나, 통계적으로 유의성은 확인되지 않았다 (ns는 유의성 없음을 의미함). 이와 같은 결과는 C-RAPO 균주가 초기 10w에 비해 18w에서 침분비량이 유의성 있게 차이나지 않았음을 의미하는 것으로, C-RAPO 균주에 침분비량 감소 억제능 즉 쇼그렌증후군으로 말마암은 침분비량 감소에 대한 억제능이 있음을 보여주는 결과이다.
또한, 도 13에서 보는 바와 같이, 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RAPO (KCTC 13773BP) 투여에 의한 타액분비량은 10주령 SFR 0.671±0.129, 18주령 SFR 0.447±0.254 μL/g/min으로 나타났으며 통계적으로 유의하게 타액분비량이 감소하였다(도 14, 10 w 대비 18w *P<0.05). 이와 같은 결과는 RAPO 투여에 의해 침분비량의 감소가 억제되지 못한 것을 확인한 것으로, 쇼그렌증후군에 따른 침분비량 감소에 대한 억제 효능이 없음을 의미한다.
또한, 도 14에서 보는 바와 같이 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT (KCTC13474BP) 투여에 의한 타액분비량은 10주령 SFR 0.673±0.133, 18주령 SFR 0.619±0.127 μL/g/min으로 나타났으며, 통계적으로 유의성은 확인되지 않았다 (ns는 유의성 없음을 의미함). 이와 같은 결과는 ATT 균주가 초기 10w에 비해 18w에서 침분비량이 유의성 있게 차이나지 않았음을 의미하는 것으로, ATT 균주에 침분비량 감소 억제능 즉 쇼그렌증후군으로 말마암은 침분비량 감소에 대한 억제능이 있음을 보여주는 결과이다.
이상의 타액분비량 실험을 통한 결과로, 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP)와 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT (KCTC13474BP) 50 mg/kg/day 투여로 타액분비량의 감소가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (B. pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 균주 및 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주에, 쇼그렌증후군의 증상인 침샘염을 억제하고 타액분비량 감소를 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

  1. 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 식품 조성물.
  2. 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 (Bifidobacterium pseudocatenulatum) C-RAPO (KCTC13986BP) 균주를 포함하는 쇼그렌증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주를 더욱 포함하는 쇼그렌증후군 억제용 식품 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) ATT (KCTC13474BP) 균주를 더욱 포함하는 쇼그렌증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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