KR20160115176A

KR20160115176A - Pax3을 유효성분으로 포함하는 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160115176A
Application number: KR1020150042337A
Authority: KR
Inventors: 박성환; 조미라; 곽승기; 김성민; 박진실; 문영미; 서현범; 김나래
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2016-10-06
Also published as: KR102262626B1

Abstract

본 발명은 PAX3가 쇼그렌 증후군을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제로서의 가능성을 규명한 것으로, 쇼그렌 증후군이 유발된 동물모델에 PAX3을 과발현시키면 쇼그렌 증후군의 증상이 완화 및 개선되는 것으로 나타났고, 염증성 사이토카인의 생성도 억제되는 것으로 나타났다. 또한 시험관 내 실험 및 쇼그렌 환자 시료를 대상으로 쇼그렌 발병시 PAX3의 발현변화를 분석한 결과, 쇼그렌 증후군 환경이 조성되면 PAX3의 발현이 감소되는 것으로 확인됨에 따라 본 발명의 PAX3는 새로운 쇼그렌 증후군의 치료제 타겟이 될 수 있음을 알 수 있었고, PAX3 및 PAX3의 발현 및 활성 촉진제는 쇼그렌 증후군을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있었다.

Description

PAX3을 유효성분으로 포함하는 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 조성물{C omposition for preventing or treating sjogren's syndrome comprising PAX3}

본 발명은 PAX3을 유효성분으로 포함하는 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

쇼그렌 증후군은 눈물샘(lacrimal gland)과 침샘(salivary gland)에 영향을 미치는 다양성 만성 염증(system chronic inflammatory)질병이다. 쇼그렌 증후군은 미국에 4,000,000명의 환자를 포함하여 전세계 인구의 1-3%에 달하는 가장 널리 분포하는 자가면역질환이다. 쇼그렌증후군을 가지고 있는 환자의 90%이상이 여성이며, 이 질병은 다양한 다른 자가 면역현상과 동반되어 나타날 수도 있다. 쇼그렌 증후군의 생리학적인 원인에 대해서는 정확히 이해되지 않고 있지만 두 개의 구별되는 현상이 일어나는 것으로 보고 있다. 자가 반응성 림프세포의 활성이 유도되는 시작단계와 눈물샘과 침샘에 병원성의 림프세포가 침투하여 누적하게 됨으로써 각각 눈물의 양과 침의 양을 감소시키는 효과시기의 두 가지 구별되는 시기가 있다.

즉, 증상의 진행단계에 따르 1차성 쇼그렌 증후군과 2차성 쇼그렌 증후군으로 구별되는데, 1차성 쇼그렌 증후군은 주로 안구, 구강, 피부 건조증이 나타나며, 눈의 건조감의 느낌이 있고 이물질이 들어있는 듯한 느낌이 들며 더 진행되면 눈이 따갑고 눈물이 나오지 않으며 충혈되거나 피로감이 있다. 그러나 이러한 상태를 그대로 두면 각막과 결막 손상으로 이어지며 입은 침 분비 부족으로 치석이 많이 생기고 충치와 치주염도 자주 발생하게 된다. 또한 피부의 땀샘과 피지선의 분비도 감소하여 피부가 마르는 것도 특징 중 하나이다.

2차성 쇼그렌 증후군은 류마티스 관절염, 루푸스, 전신성 경화증, 피부근염이 동반되기도 하는데 병이 진행되면서 호흡기, 위장, 취장 등 소화기 내분비계 손상과 신장, 심장 등의 신경계에 손상이 온다. 또한 쇼그렌 증후군 환자의 약 5% 정도에서는 림프종이 발생하는 것으로 알려져 있고 쇼그렌 증후군 환자는 일반인에 비해 약 2.7배 정도 사망률이 높은 것으로 알려져 있다.

한편, 이러한 쇼그렌 증후군을 치료할 수 있는 근본적인 치료법은 아직 없는 상태로서 침멉되는 각 부위별 증상의 진행을 완화시키고 합병증을 방지하기 위한 보조적인 약물 치료가 전부이며, 구강 건조는 평상시 물을 자주 마시거나 스프레이식 인공타액 생성제를 사용하도록 하며 필로카틴을 투여하기도 한다. 또한 건조한 피부에는 보습을 충분히 하도록 하며 염증 완화를 위해 비스테로이드 계통의 소염진통제를 사용하고 있으나, 치료 효과가 미비하고 부작용이 있는 등 쇼그렌 증후군의 근본적인 치료 방법이라고 볼 수 없다.

따라서 보다 근본적이면서 효과적인 새로운 쇼그렌 증후군의 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 공개특허 2007-7004071A

이러한 점에서 본 발명의 목적은 PAX3 단백질 또는 PAX3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 PAX3 단백질 또는 PAX3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PAX3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PAX3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것일 수 있다.

또한 본 발명은, PAX3 유전자 또는 PAX3 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리하는 단계; 및 PAX3 유전자의 발현양 또는 PAX3 단백질의 양 또는 PAX3 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 쇼그렌 증후군 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PAX3 유전자의 발현양 또는 PAX3 단백질의 양 또는 PAX3 단백질 활성이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 후보물질을 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PAX3 유전자의 발현양 또는 PAX3 단백질의 양 또는 PAX3 단백질의 활성은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.

도 1은 PAX3 유전자가 도입된 재조합 벡터의 벡터지도를 나타낸 것이다.
도 2는 쇼그렌 증후군 마우스 모델을 대상으로 PAX3 유전자가 도입된 재조합 벡터를 주입하여 PAX3을 과발현시킨 후, 침샘 분비량의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 휴먼 침샘 세포주를 대상으로 PAX3 유전자가 도입된 재조합 벡터를 도입한 후, 세포 내에서 PAX3 과발현에 따른 염증성 사이토카인인 IL-1의 발현 감소 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 마우스의 비장세포 및 CD4+ T 세포를 대상으로 쇼그렌 증후군 병인 요인인 IL-21 사이토카인을 처리한 후, 세포내에서 PAX3의 발현 변화를 RT-PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정상인(건강인)과 쇼그렌 증후군 환자로부터 수득한 침샘과 귀밑샘을 대상으로 마이크로 어레이 분석을 통해 PAX3의 발현 변화를 RT-PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 PAX3가 쇼그렌 증후군의 치료제로서 사용 가능함을 규명한 점에 특징이 있다.

PAX3는 전사 인자 중 하나로서 이 유전자에 돌연변이가 발생하게 되면 바르덴부르크 증후군(Waardenburg syndrome)이 유발되는 것으로 알려져 있을 뿐, PAX3 유전자의 생체 내 주요 기능에 대해서는 거의 연구된 바가 없다.

이러한 점에서 본원발명은 PAX3의 새로운 용도를 규명한 점에 의의가 있으며 특히 쇼그렌 증후군의 치료를 위한 용도로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 쇼그렌 증후군이 유발된 마우스 모델을 대상으로 PAX3 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 마우스에 주입하여 PAX3를 과발현 시킨 결과, 침샘 분비량이 증가되어 쇼그렌 증후군의 증상이 개선되어 질환의 치료 가능성을 확인할 수 있었다(실시예 2 참조).

또한, 시험관 내에서 인간의 침샘 세포주를 대상으로 LPS 처리를 통해 염증 환경을 조성한 후, PAX3 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 상기 세포를 형질전환 시켜 세포주 내에서 PAX3를 과발현시킨 결과, 염증성 사이토카인의 생성이 억제되는 것으로 나타났다(실시예 3 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 PAX3 또는 PAX3의 발현 또는 활성 촉진제를 쇼그렌 증후군의 새로운 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 PAX3이 실제로 쇼그렌 증후군과 직접적인 관련성이 있는지 확인하기 위해 시험관 내에서 쇼그렌 증후군이 유발되는 환경, 즉 주요병인 사이토카인인 IL-21을 세포에 처리한 후, 세포내에서 PAX3의 발현변화를 분석한 결과, 쇼그렌 증후군 발병 환경이 조성되면 PAX3의 발현이 감소되는 것으로 나타났고, 실제적으로 임상 결과를 통해서도 쇼그렌 환자의 침샘과 귀밑샘에서 정상인에 비해 PAX3의 발현이 감소되는 것으로 나타났다(실시예 4 및 65 참조).

따라서 본 발명은 PAX3 단백질 또는 PAX3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

바람직하게, 상기 PAX3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 PAX3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 상기 PAX3 단백질은 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 PAX3와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 PAX3의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 PAX3의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 PAX3의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 PAX3의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른단백질과융합으로만들어진융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.

또한 상기 PAX3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로(Nabel, E. G. et al., Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질주입(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질주입(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질주입(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질주입(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 목적세포 내로 도입할 수 있다(Wu. et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu. et al., Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한 상기 PAX3를 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직 또는 표적세포를 치료하기 위한 유효량으로 직접 주사할 수 있다.

나아가, 본 발명은 PAX3를 이용한 쇼그렌 증후군 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 S쇼그렌 증후군 질환 치료제의 스크리닝 방법은, PAX3유전자 또는 PAX3 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리하는 단계; 및 PAX3 유전자의 발현양 또는 PAX3 단백질의 양 또는 PAX3 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 상기 방법은 새로운 쇼그렌 증후군 질환의 치료제를 PAX3를 이용하여 발굴할 수 있는 방법으로서, 상기 후보물질이란 PAX3 유전자의 발현양, PAX3 단백질의 양 또는 PAX3 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화합물, 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 또는 천연물 추출물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 후보물질의 처리는 바람직하게 PAX3 유전자 또는 PAX3 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리한 후 배양하는 과정으로 수행할 수 있다.

또한, 상기에서 PAX3 단백질의 세포 내 수준 증가의 의미는 PAX3 유전자의 발현이 증가되거나 또는 PAX3 단백질의 분해가 억제되어 PAX3 단백질의 양이 증가되는 것을 말한다. 상기 PAX3 유전자 발현은 PAX3 유전자의 전사 및 단백질로의 번역 과정을 포함한다. 따라서 상기 후보물질이 세포 내에서 PAX3 유전자의 발현 및 단백질의 수준을 증가시킬 경우, 상기 후보물질을 STAT3의 활성화와 관련된 질환을 치료할 수 있는 신규 치료제로 판단할 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 상기 단백질의 양 또는 단백질의 활성 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

이와 같이, 상기 PAX3 유전자의 발현양 또는 PAX3 단백질의 양 또는 PAX3 단백질의 활성을 측정하는 방법은 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 사용할 수 있는데, 바람직하게 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 쇼그렌 증후군의 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 면역질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

PAX3가 도입된 재조합 벡터 제조

PAX3가 과발현된 재조합 벡터를 제조하였는데, 이를 위해 먼저 CMV IE (human cytomegalovirus immediate early promoter) 프로모터 하에 PAX 유전자를 삽입하는 클로닝을 수행하여 재조합 벡터를 제조하였는데, 구체적으로 addgene에서 구입한 벡터(addgene, #25427)에 제한효소를 이용하여 PAX3 유전자를 도입하여 재조합 벡터인 pCMV14/3xFLAG-Pax3를 제조하였고 HIT Competent Cells™-DH5α (RBC, RH617)을 이용하여 형질전환 하였다. 형질전환 후 형성되는 콜로니를 팁으로 선별하여 LB broth에 Ampicillin을 넣고 16시간 배양하였다. 배양한 LB broth를 대상으로 NucleoBond Xtra Maxi EF kit (BMS, MN740424.10)를 이용하여 PAX3 DNA를 추출하였고 벡터 내에 PAX3 유전자가 제대로 도입되어 있는지 확인하였다. 본 실시예에서 제조한 재조합 벡터인 pCMV14/3xFLAG-Pax3의 벡터 map은 도 1에 나타내었다.

<실시예 2>

동물모델을 대상으로 한 PAX3 과발현에 따른 쇼그렌 질환 치료효과 분석

본 발명자들은 PAX3에 의한 쇼그렌 질환의 치료 효과를 분석하기 위해 쇼그렌 증후군 동물모델인 NOD/shilt을 The Jackson Laboratory 로부터 구입(001976)하여 사용하였다. 쇼그렌 마우스 모델에 상기 실시예 1에서 제조한 PAX3 과발현 벡터를 주입하여 마우스 내에서 PAX3 단백질을 과발현시키고 마우스의 침샘 분비량을 분석하였다. 이는 쇼그렌의 주요 증상은 침샘이나 눈물샘이 마르는 증상을 보이므로 침샘 분비량이 증가되면 쇼그렌 증상이 개선되는 것으로 알 수 있다.

분석결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, PAX3 과발현 벡터 주입 후 12주후에 상기 벡터를 주입하지 않은 쇼그렌 발병 마우스에 비해 침샘 분비가 34%나 증가한 것으로 나타났다.

<실시예 3>

Human 침샘 세포주를 대상으로 한 PAX3 과발현에 따른 항염 효과 분석

나아가 본 발명자들은 휴먼 침샘 세포주(Human Salivary Gland cell line, 시그마, 95031024)를 대상으로 실시예 1의 재조합 벡터를 형질도입하여 세포 내에서 PAX3가 과발현되도록 한 후, LPS를 100 ng/ml 농도로 처리하여 염증 환경을 조성하였다. 이후 세포를 수득하여 세포 내에 염증성 사이토카인인 IL-1의 mRNA 정도를 분석하였다. 이때 대조군으로는 상기 재조합 벡터로 형질전환하지 않은 휴먼 침샘 세포를 사용하였다.

분석결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 PAX3가 과발현된 세포에서는 염증성 사이토카인인 IL-1의 생성이 대조군에 비해 현저하게 감소되는 것으로 나타났다.

<실시예 4>

쇼그렌 증후군 환경에서의 PAX3 발현변화 분석

상기 실시예들의 결과를 통해 본 발명자들은 PAX3가 쇼그렌을 치료할 수 있는 치료제로서의 사용 가능성을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 시험관 내에서 쇼그렌 증후군 발병 조건을 형성하였을 때, 세포 내에서 PAX3의 발현이 감소되고 있는지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

이를 위해 쇼그렌 증후군의 주요 병인 사이토카인인 IL-21을 마우스의 비장세포와 비장에서 분리된 CD4+ T세포에 1ng/ml 및 10ng/ml의 농도로 처리하여 시험관 내에서 쇼그렌 증후군과 비슷한 조건을 만들었다. 이때 상기 비장세포는 C57BL/6 마우스를 안락사 하여 비장을 분리한 뒤 티징 슬라이드로 마우스의 비장을 갈고, Ack lysis buffer를 사용하여 적혈구를 제거한 뒤 strainer로 걸러서 세포를 얻어서 사용하였고, 상기 CD4+ T 세포는 위에서 얻은 비장 세포를 CD4 bead와 CD4+ selection column을 사용하여 비장세포 내 CD4+ T 세포를 분리하여 사용하였다.

이후, IL-21이 처리된 비장세포와 CD4+ T세포의 세포 용해물을 수득한 후, PAX3 유전자를 증폭할 수 있는 하기 프라이머들을 사용하여 RT-PCR을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다

프라이머 서열

PAX3 센스 프라이머 : 5'- GCC TCA GAC CGA CTA TGC TC - 3'

PAX3 안티센스 프라이머 : 3'- AAT AGG GCT GAG ATG TGG GC -5'

분석결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 IL-21의 처리에 의해 쇼그렌증후군 환경에 조성된 세포에서는 PAX3의 유전자 발현이 감소되는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 PAX3가 쇼그렌과 직접적으로 관련성이 있다는 것으로 알 수 있으며 쇼그렌 질환이 유발되면 PAX3의 발현 감소 또는 활성 감소가 일어날 수 있다는 것을 알 수 있었고, 반면 이러한 결과를 통해 PAX3의 발현 또는 활성을 촉진할 경우 쇼그렌 증후군을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 5>

쇼그렌 환자의 시료를 대상으로 PAX3 유전자 발현변화 분석

시험관 내에서 확인된 상기 실시예 4의 결과가 실제 임상에서도 동일한 결과로 나타나는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

즉, 건강한 정상인과 쇼그렌 증후군 환자로부터 수득한 침샘조직과 귀밑샘조직을 대상으로 PAX3의 유전자 발현 정도를 마이크로 어레이를 통해 분석하였다. 이때 상기 침색조직(GSE7451)은 건강인과 1차성 쇼그렌 증후군 환자 각각 10명에게서 수득한 것을 사용하였으며, 귀밑샘 조직(GSE40611)은 17명의 1차성 쇼그렌 환자와 14명의 건강인에게서 수득한 것을 사용하였다.

분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 실제적으로도 쇼그렌 환자의 침샘과 귀밑샘에서 PAX3의 유전자 발현이 정상인에 비해 감소되어 있는 것으로 나타났다.

따라서 쇼그렌 증후군이 발병하면 PAX3의 발현이 감소된다는 것을 알 수 있었고 PAX3의 발현 또는 활성 촉진제가 쇼그렌 증후군의 치료제가 될 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> C omposition for preventing or treating sjogren's syndrome comprising PAX3 <130> pn1503-072 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> PAX3 amino acid sequence <400> 1 Arg Lys Gln Ala Gly Ala Asn Gln Leu Met Ala Phe Asn His Leu Ile 1 5 10 15 Pro Gly Gly Phe Pro Pro Thr Ala Met Pro Thr Leu Pro Thr Tyr Gln 20 25 30 Leu Ser Glu Thr Ser Tyr Gln Pro Thr Ser Ile Pro Gln Ala Val Ser 35 40 45 Asp Pro Ser Ser Thr Val His Arg Pro Gln Pro Leu Pro Pro Ser Thr 50 55 60 Val His Gln Ser Thr Ile Pro Ser Asn Ala Asp Ser Ser Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Cys Leu Pro Ser Thr Arg His Gly Phe Ser Ser Tyr Thr Asp Ser Phe 85 90 95 Val Pro Pro Ser Gly Pro Ser Asn Pro Met Asn Pro Thr Ile Gly Asn 100 105 110 Gly Leu Ser Pro Gln Val Met Gly Leu Leu Thr Asn His Gly Gly Val 115 120 125 Pro His Gln Pro Gln Thr Asp Tyr Ala Leu Ser Pro Leu Thr Gly Gly 130 135 140 Leu Glu Pro Thr Thr Thr Val Ser Ala Ser Cys Ser Gln Arg Leu Glu 145 150 155 160 His Met Lys Asn Val Asp Ser Leu Pro Thr Ser Gln Pro Tyr Cys Pro 165 170 175 Pro Thr Tyr Ser Thr Ala Gly Tyr Ser Met Asp Pro Val Thr Gly Tyr 180 185 190 Gln Tyr Gly Gln Tyr Gly Gln Ser Lys Pro Trp Thr Phe 195 200 205 <210> 2 <211> 910 <212> DNA <213> PAX3 DNA sequence <400> 2 ggaggaaaca agctggagcc aatcaactga tggctttcaa ccatctcatt ccggggggat 60 tccctcccac cgccatgccg accctgccaa cataccagct gtcggagacc tcttaccagc 120 ccacgtctat tccacaagcc gtgtcagatc ccagtagcac cgtccacaga cctcagccgc 180 ttcctccgag cactgtacac caaagcacta ttccttcgaa cgcagacagc agctctgcct 240 actgcctccc cagcaccagg catggatttt caagctatac agacagcttt gtgcctccat 300 cggggccctc caaccccatg aaccccacca tcggcaatgg cctttcacct caggtaatgg 360 gacttctgac caaccacggt ggggtaccgc accagcctca gaccgactat gctctctccc 420 ctctcactgg gggcctggaa cccacgacca cggtgtcagc cagctgcagt cagagactgg 480 aacatatgaa gaatgtggac agtctgccca catctcagcc ctattgtccc cccacctata 540 gcaccgcagg ctacagtatg gaccctgtca caggctacca gtatgggcag tatggacaaa 600 gtaagccttg gacgttcgaa gatctgatat cggtaccagt cgactctaga ggatcccggg 660 ctgactacaa agaccatgac ggtgattata aagatcatga catcgactac aaggatgacg 720 atgacaagta gtgatcccgg gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc tctcctggcc 780 ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag ttgcatcatt 840 ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga ggggggtggt atggagcaag 900 gggcaagtgg 910

Claims

PAX3(Paired box gene 3) 단백질 또는 PAX3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 PAX3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 PAX3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
PAX3 유전자 또는 PAX3 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리하는 단계; 및
PAX3 유전자의 발현양 또는 PAX3 단백질의 양 또는 PAX3 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 쇼그렌 증후군 치료제 스크리닝 방법.
제5항에 있어서,
상기 PAX3 유전자의 발현양 또는 PAX3 단백질의 양 또는 PAX3 단백질 활성이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 후보물질을 쇼그렌 증후군의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 쇼그렌 증후군 치료제 스크리닝 방법.
제5항에 있어서,
상기 PAX3 유전자의 발현양 또는 PAX3 단백질의 양 또는 PAX3 단백질의 활성은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 쇼그렌 증후군 치료제 스크리닝 방법.