KR102161851B1 - 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물 - Google Patents
프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은, 급성 췌장염으로 인한 염증성 인자의 분비 (NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2), 췌장 조직의 손상, 호중구와 대식세포의 침윤 및 아밀라아제 (amylase)와 리파아제 (lipase)의 활성을 억제함으로써, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료 효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 급성 췌장염으로 인한 염증성 인자의 분비 (NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2), 췌장 조직의 손상, 호중구와 대식세포의 침윤 및 아밀라아제 (amylase)와 리파아제 (lipase)의 활성을 억제함으로써, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료 효과를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
급성 췌장염 (acute pancreatitis)은 췌장 내 단백분해효소가 조기 활성화되어 자가소화가 일어나, 췌장에 부종 또는 종창 등을 동반하는 염증성 질환이다.
발병의 원인으로는 담관 질환, 알콜의 과잉 섭취 또는 고지혈증 등으로 인하여 유발되는 것으로 알려져 있다.
급성 췌장염이 발병하면 환자의 약 25%가 위중한 상태에 이르며, 그 중 30~50%가 사망에 이르게 된다.
하지만 급성 췌장염의 발병기전에 대해 명확하게 밝혀진 바가 없어 기본적인 치료만이 이루어지고 있다. 일반적인 치료방법으로 항생제 투여 및 정맥 내 수액 공급 등이 시도되고 있으며, 심할 경우에는 수술을 통해 괴사 조직을 제거하는 방법이 시행되고 있다.
현재까지 급성 췌장염에 대하여 밝혀진 발병기전을 살펴보면, 어떤 트리거링 이벤트로 인해 췌장 내에 있는 소화 전구효소들 (digestive proenzymes)이 활성상태가 되어, 췌장의 선상 세포 괴사 (necrosis), 막 파괴, 부종 (edema) 및 장 출혈 (intestinal hemorrhage) 등의 췌장 손상을 유발시킨다.
또한 이 과정에서 염증 반응이 수반되는데, 투과성 백혈구로 인한 국부적인 췌장 손상은 물론 급성 신부전 및 저혈압 등의 전신 징후까지 수반된다.
이러한 염증 반응은, 인터루킨-1β (interleukin-1β, IL-1β), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 및 TNF-α (tumor necrosis factor-α)와 같은 염증반응 촉진 사이토킨(cytokines)이 주요한 역할을 하게 된다.
한편 본 발명자는 프락시넬론 (Fraxinellone)을 이용하여 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 개발하고자 하는 바, 프락시넬론에 대해 살펴보면 다음과 같다.
프락시넬론은 백선 (Dictamnus dasycarpus)이라는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과의 여러해살이풀의 추출물이다.
백선은 뿌리가 흰색이고, 특유의 양 누린내를 풍기기 때문에 붙여진 이름이며, 한방에서는 습열로 인한 피부발진, 습진, 풍진, 가려움증, 알레르기성 피부염, 신경성 피부염 또는 인후건조에 사용되고 있다.
프락시넬론과 관련된 선행기술에 대해 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1725714호에는 프락시넬론을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 조성물에 대해 기재되어 있다. 그러나 특허문헌 1과 본 발명을 비교해보면, 프락시넬론을 사용한다는 점에서는 유사하나, 본 발명은 프락시넬론을 사용하여 급성 췌장염에 사용한다는 점에서 효과가 상이하다.
본 발명은 한방에서 백선의 추출물인 프락시넬론이 급성 췌장염을 예방, 개선 또는 치료하는데 효과적이라는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하고자 한다.
보다 상세하게는, 급성 췌장염으로 인한 염증성 인자의 분비 (NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2), 췌장 조직의 손상, 호중구 및 대식세포의 침윤, 및 아밀라아제 (amylase) 및 리파아제 (lipase)의 활성을 억제하는 효과를 갖는 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
상기 조성물은 급성 췌장염으로 인한 염증성 인자 (NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2)의 분비, 췌장 조직의 손상, 호중구와 대식세포의 침윤 및 아밀라아제 (amylase)와 리파아제 (lipase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 프락시넬론의 1회 투여 용량은 마우스 복강 투여시 1~5 mg/kg인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 염증성 인자 (NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2)의 분비를 억제하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 급성 췌장염으로 인한 췌장 조직의 손상을 억제하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 급성 췌장염으로 인한 췌장 조직의 호중구 및 대식세포의 침윤을 억제하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 급성 췌장염으로 인한 췌장 조직의 아밀라아제 및 리파아제의 활성을 억제하는 효과를 보유하고 있다.
도 1은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증성 인자의 mRNA 발현에 효과를 나타낸 도면이다.
도 2는 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 3는 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 혈청에 존재하는 아밀라아제와 리파아제에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 4는 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 MPO의 활성에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 5은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 호중구 및대식세포 침윤과 염증성 인자인 IL-1β의 발현에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 6은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장중량/체중 비율 변화에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증성 인자인 캐스페이즈-1에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 8은 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증조절복합체 활성화에 대한 약리학적 억제 및 유전적 억제에 대한 효과를 나타낸 도면이다.
도 9는 프락시넬론이 급성 췌장염 치료에 사용될 수 있는지 가능성을 나타낸 도면이다.
도 2는 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 3는 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 혈청에 존재하는 아밀라아제와 리파아제에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 4는 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 MPO의 활성에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 5은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 호중구 및대식세포 침윤과 염증성 인자인 IL-1β의 발현에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 6은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장중량/체중 비율 변화에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증성 인자인 캐스페이즈-1에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 8은 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증조절복합체 활성화에 대한 약리학적 억제 및 유전적 억제에 대한 효과를 나타낸 도면이다.
도 9는 프락시넬론이 급성 췌장염 치료에 사용될 수 있는지 가능성을 나타낸 도면이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전저인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 실험예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을수 있음을 이해하여야 한다.
실험예 1. 실험동물 사육 및 급성 췌장염 유발
1) 실험동물의 사육
본 실험에 사용한 C57BL/6 마우스 (연령 6~8주, 체중 15-20g)는 오리엔트 바이오 (성남, 경기도, 대한민국)에서 구입하였다.
실험동물은 원광대학교 한의과대학 동물사육실에서 일정한 조건 (온도: 23±2 ℃, 명암: 12 시간 주기)하에서 일반 고형사료 (오리엔트 바이오, 성남)와 물을 충분히 공급하면서 환경 적응을 위해 일주일 동안 적응시킨 후 실험하였다.
2) 급성 췌장염 유발
췌장염을 유발시키기 위해 마우스에 세룰레인 (cerulein) 50 μg/㎏을 1시간 단위로 6번 복강 주사하고, 정상군의 마우스에는 생리식염수만 복강 주사하였다.
첫번째 세룰레인 주사 후 1, 3 및 6시간 되는 시간에 맞춰 마우스에 프락시넬론 1 mg/kg 및 5 mg/kg을 복강 주사하였다.
세룰레인을 마지막으로 주사 한 후 6시간 뒤에 마우스의 복강을 개복하여 췌장을 적출하였다.
생리식염수만 주사된 마우스를 정상군, 세룰레인 50 μg/㎏만 주사된 마우스를 양성대조군, 세룰레인 주사 후 급성 췌장염의 염증을 억제해주는 약물인 파테노라이드 (parthenolide)가 주사된 마우스를 음성대조군, 세룰레인 주사 후 프락시넬론 1 mg/kg이 주사된 마우스를 실험군1, 세룰레인 주사 후 프락시넬론 5 mg/kg이 주사된 마우스를 실험군2로 정하였다.
여기에서, 세룰레인으로 유도한 급성 췌장염 모델은 인간의 급성 췌장염에서 볼 수 있는 병리 조직학적 소견에 대한 재현성이 뛰어나고 경제적이어서, 췌장염의 세포 병리 현상 및 소화효소의 자가 활성화 과정을 연구하는데 적합한 모델로 알려져있다.
세룰레인을 1시간 간격으로 6번 투여하는 이유는, 세룰레인이 콜레시스토키닌 아날로그로서 췌장의 수용체를 통해 염증을 발생시키는 기전에 근거하고, 세룰레인의 반감기가 굉장히 짧기 때문이다.
복강 주사로 프락시넬론을 주입하는 이유는, 복막의 흡수 면적이 넓어 흡수가 빠르고, 반응의 발현이 신속하게 나타나며, 주사한 양이 모두 흡수되기 때문에 사용용량의 정확성을 확보할 수 있기 때문이다.
실험예 2. 췌장 조직 내 염증성 인자의 mRNA 발현 측정
급성 췌장염이 유발되면 NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2와 같은 염증성 인자들이 췌장 조직에 염증을 유발하는 주요 매게체로 작용한다.
① NLRP3 : NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3)
② PY-CARD : PYD 및 CARD 도메인 (PYD and CARD domain)
③ caspase-1 : 캐스페이즈 1
④ IL-1β : 인터루킨-1β (interleukin-1β)
⑤ IL-18 : 인터루킨-18 (interleukin-18)
⑥ CCL2 : 케모카인 C-C 모티프 리간드 2 (chemokine C-C motif ligand 2)
⑦ CXCL2 : 케모카인 C-X-C 모티프 리간드(chemokine C-X-C motif ligand 2)
프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증성 인자의 생성에 미치는 영향을 관찰하기 위해, NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2의 mRNA 발현을 측정하였다.
세룰레인을 마지막으로 주사 한 후 6시간 뒤에 마우스의 복강을 개복하여 췌장을 적출하였다.
1) RNA 추출
적출된 췌장 조직에 이지 블루 (Easy Blue, intron) 용액 1 ml를 주입하여 조직을 용해시킨 후, 클로로포름 (chloroform) 100 ul를 처리하고 볼텍싱 (vortexing) 하였다.
볼텍싱한 췌장 조직을 15,000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 분리하여, -20℃에 보관된 이소프로판올 (isopropanol)과 1:1로 섞은 뒤 15,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 버렸다.
남은 침전물에 80% 에탄올 1 ml로 2회 워싱한 뒤 침전물을 건조시켰다.
건조된 침전물에 디에틸 피로카보네이트 (diethyl pyrocarbonate, DEPC)처리한 증류수 100 ul를 넣어 RNA를 용해시키고 플루오로미터 (fluorometer)를 이용하여 정량하였다.
2) 실시간 정량적 역전사 중합 효소 연쇄반응 (real time PCR)
이렇게 얻어진 RNA에서 mRNA를 분리하고, cDNA 합성 kit (Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA로 합성하였다.
합성된 cDNA를 TaqMan quantitative RT-PCR kit (Applied Biosystems) 및 StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems)을 사용하여 PCR 하였다.
PCR에 사용된 각 프라이머 (primer)와 프로브 (probe)는 Applied Biosystems에서 구입하여 사용하였다.
도 1은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증성 인자의 mRNA 발현에 효과를 나타낸 도면으로, (A)는 NLRP3의 mRNA 발현정도를 나타낸 것이며, (B)는 PY-CARD의 mRNA 발현정도를 나타낸 것이며, (C)는 캐스페이즈-1의 mRNA 발현정도를 나타낸 것이며, (D)는 IL-1β의 mRNA 발현정도를 나타낸 것이며, (E)는 IL-18의 mRNA 발현정도를 나타낸 것이고, (F)는 CCL2의 mRNA 발현정도를 나타낸 것이고, (G)는 CXCL2의 mRNA 발현정도를 나타낸 것이다.
그 결과, 정상군에 비해 세룰레인을 투여한 양성대조군에서 NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2의 mRNA 발현이 증가하였다.
세룰레인을 투여한 뒤 파테노라이드가 투여된 음성대조군에서는 NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2의 mRNA 발현이 감소하였다.
세룰레인을 투여한 뒤 프락시넬론이 투여된 실험군에서는 NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2의 mRNA 발현이 감소하였다.
실험예 3. 췌장 조직의 손상에 대한 조직학적 관찰
프락시넬론이 급성 췌장염으로 인해 손상된 마우스의 췌장 조직에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 세룰레인을 마지막으로 주사한 후 6시간 뒤에 마우스의 췌장 조직을 적출하였다.
적출된 췌장 조직을 4% 포르말린 (formalin) 용액을 사용하여 고정시킨 다음 일반적인 조직표본 제작방법으로 헤마톡시린 (hematoxyli)과 에오신 (eosin) 염색을 시행하였다.
카메라부착 광학현미경 (Olympus BX51)을 사용하여 췌장의 조직학적 구조 및 염증 정도를 관찰하였다.
도 2는 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에 미치는 효과를 나타낸 도면으로, (A)는 췌장 조직을 200배율에서 촬영한 광학현미경사진이고, (B)는 프락시넬론이 췌장 조직의 부종 및 염증에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
그 결과, 정상군에서는 췌장의 전형적인 조직 구조를 관찰할 수 있었지만, 세룰레인을 투여한 양성대조군에서는 조직 사이에 염증성 세포들의 침윤과 부종으로 인한 조직 사이의 간격이 증가되었다.
그러나 세룰레인 투여 후 프락시넬론을 투여한 실험군에서 염증은 감소하였지만, 부종에는 별다른 효과가 관찰되지 않았다.
실험예 4. 혈청에 존재하는 아밀라아제 및 리파아제 정량분석
급성 췌장염이 유발되면 췌장 조직에 아밀라아제 및 리파아제와 같은 효소들이 증가하게 된다.
프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에 아밀라아제 및 리파아제에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 마우스에서 채취한 혈액에 존재하는 아밀라아제와 리파아제의 농도를 분석하였다.
세룰레인을 마지막으로 주사한 지 6시간 후에 마우스를 마취시켰으며 시린지 (syringe)를 이용하여 마우스의 심장에서 혈액을 채취하였다.
채취한 혈액은 3,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 혈청만 분리하였으며, 분리된 혈청에서 아밀라아제 및 리파아제를 정량하기 위해 어세이 키트 (assay kit, Bio Assay Systems)를 사용하였다.
도 3는 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 혈청에 존재하는 아밀라아제와 리파아제에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
그 결과, 정상군에 비해 세룰레인을 투여한 양성대조군에서 아밀라아제 및 리파아제의 농도가 증가하였다.
세룰레인 투여 후 프락시넬론을 투여한 실험군에서는 아밀라아제 및 리아파제의 농도가 감소하였다.
실험예 5. 췌장 조직의 호중구 침윤 정도 분석 (MPO 분석)
염증이 유발되면 호중구의 침윤이 증가하게 되는데, 호중구에서 발현하는 효소인 미엘로퍼옥시다아제 (myeloperoxidase, MPO)를 측정하여 호중구의 침윤정도를 확인할 수 있다.
프락시넬론이 급성 췌장염시 췌장 조직의 호중구 침윤 (neutrophil infiltration)에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 세룰레인을 마지막으로 주사한 후 6시간 뒤에 마우스의 췌장 조직 및 폐 조직을 적출하여 MPO 활성을 측정하였다.
세룰레인을 마지막으로 주사 한 후 6시간 뒤에 마우스의 복강을 개복하여 췌장을 적출하였다.
pH 7.4의 20 mM 인산염 버퍼 (phosphate buffer)에 췌장 조직을 담가 균질화한 뒤, 10,000 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리하였다.
상층액을 제거한 뒤, 펠렛 (pellet)을 50 mM 인산염 버퍼와 0.5% 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (hexadecyltrimethylammonium bromide, HTAB)가 첨가된 용액에 재현탁시켰다.
재현탁된 용액을 10,000 ×g, 4℃에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 펠렛을 얻었다.
펠렛에 1.6 mM TMB 및 80 mM 소듐 포스페이트 버퍼 (sodium phosphate buffer, pH 5.4)에 재현탁시켰다.
재현탁된 용액을 37℃에서 110초 동안 반응시키고 2 mol/L 황산 (H2SO4)을 첨가하여 반응을 종결시켰으며, 리더 (reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 4는 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 MPO의 활성에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
그 결과, 정상군에 비해 세룰레인을 투여한 대조군에서 MPO 활성이 증가하였으나, 세룰레인 투여 후 프락시넬론을 투여한 실험군에서 MPO 활성이 감소하였다.
실험예 6. 면역형광법 (Immunofluorescence)
프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직의 호중구 및 대식세포 침윤과 염증성 인자인 IL-1β의 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 호중구 및 대식세포 (CD11b mac-1)의 침윤정도와 IL-1β의 발현정도를 면역형광법으로 측정하였다.
세룰레인을 마지막으로 주사 한 후 6시간 뒤에 마우스의 복강을 개복하여 췌장을 적출하였다.
동결절편된 마우스의 췌장 조직 (두께 9 μm)을 4℃에서 1차 항체로 염색한 후, 알렉사 플루오르 488 (Alexa Fluor 488) 또는 594-부착 2차 항체를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
췌장 조직의 핵을 4′, 6-디아미디노-2-페닐인돌 (4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)로 대조염색 한 뒤, 염색된 부분을 공초점레이저현미경 (confocal laser microscope, Olympus)를 사용하여 관찰하였다.
도 5은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 호중구 및 대식세포 침윤과 염증성 인자인 IL-1β의 발현에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
그 결과, 정상군에서는 정상적인 호중구 및 대식세포가 파란색으로 염색되었으며 IL-1β의 발현이 거의 없었다. 세룰레인을 투여한 양성대조군에서는 파괴된 호중구 및 대식세포가 빨간색으로 염색되었으며 IL-1β의 발현이 증가된 것을 관찰할 수 있었다.
세룰레인 투여 후 프락시넬론을 투여한 실험군은 양성대조군과 비교하였을 때, 손상된 호중구 및 대식세포의 비율과 IL-1β 발현이 감소하였다.
실험예 7. 췌장중량/체중 비율 측정
급성 췌장염을 유발하게 되면 일반적으로 마우스의 체중은 감소하고 췌장의 무게는 부종으로 인해 증가하기 때문에, 마우스의 췌장중량/체중 비율은 췌장염의 염증을 파악할 수 있는 중요한 지표가 된다.
프락시넬론이 마우스의 췌장중량/체중 비율 변화에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 세룰레인을 마지막으로 주사한 후 6시간 뒤에 마우스의 췌장을 적출하여 마우스 체중에 대한 마우스 췌장의 중량 비율 (췌장중량/체중)을 측정하였다.
도 6은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장중량/체중 비율 변화에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
그 결과, 정상군에 비해 세룰레인을 투여한 양성대조군에서 췌중중량/체중 비율이 증가하였다.
세룰레인 투여 후 프락시넬론을 투여한 실험군에서는 췌장중량/체중 비율이 양성대조군과 비교하였을 때, 별다른 효과가 관찰되지 않았다.
실험예 8. 웨스턴 블로팅 (Western blotting)
급성 췌장염이 유발되면 염증성 인자인 캐스페이즈-1이 췌장 조직에 염증을 유발한다.
프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증성 인자인 캐스페이즈-1 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 캐스페이즈-1 발현정도를 웨스턴 블로팅법으로 측정하였다.
세룰레인을 마지막으로 주사 한 후 6시간 뒤에 마우스의 복강을 개복하여 췌장을 적출하였다.
췌장 조직을 균질화시켜 용출액을 얻은 뒤, 용출액에 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS), 20% 글리세롤 (glycerol) 및 10% 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol)을 첨가한 뒤 끓였다.
끓인 용출액에서 획득한 단백질은 10% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)으로 분리하였으며 니트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)에 옮겼다.
단백질이 옮겨진 멤브레인을 실온에서 2시간동안 PBS-트윈-20 (PBST)가 첨가되어있는 5% 탈지유 (skim milk)로 차단한 후, 1차 항체를 첨가하고 4℃에서 밤새배양하였다.
배양액을 3회 세척한 후, 2차 항체를 첨가하여 1시간동안 실온에서 배양하였다.
이렇게 얻어진 단백질은 화학발광측정 시스템 (chemiluminescence detection system, Amersham)을 사용하여 관찰하였다.
도 7은 프락시넬론이 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증성 인자인 캐스페이즈-1에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
그 결과, 정상군에서는 절단형 (cleavage) 캐스페이즈-1의 발현이 적었지만, 세룰레인을 투여한 양성대조군에서는 절단형 캐스페이즈-1의 발현이 증가하였다.
세룰레인 투여 후 프락시넬론을 투여한 실험군은 절단형 캐스페이즈-1의 발현이 감소하였다.
실험예 9. 약리학적 및 유전적 억제에 따른 염증조절복합체에 미치는 영향 분석
염증조절복합체 (inflammasome) 활성화에 대한 약리학적 억제 및 유전적 억제에 대한 영향을 관찰하기 위해, 염증조절복합체의 약리학적 억제제인 파테노라이드와 IL-1 수용체 대항물질 (IL-1 receptor antagonist, IL-1RA)이 결여된 마우스를 사용하여 실험을 진행하였다.
IL-1 수용체 대항물질 (IL-1 receptor antagonist, IL-1RA)이 결여된 마우스에 세룰레인을 주사하여 급성췌장염을 유발시킨 마우스를 실험군3으로 정하였다.
세룰레인을 마지막으로 주사한 후 6시간 뒤에 마우스의 복강을 개복하여 췌장을 적출하였다.
실험예 2 내지 8과 동일한 방법으로 정상군, 양성대조군, 음성대조군 및 실험군3의 췌장 조직에서 염증성 인자의 발현, 췌장 조직의 손상, 아밀라아제 및 리파아제의 농도, MPO의 활성, 호중구와 대식세포의 침윤정도 및 췌장중량/질량 비율을 관찰하였다
도 8은 급성 췌장염에 걸린 마우스의 췌장 조직에서 염증조절복합체 활성화에 대한 약리학적 억제 및 유전적 억제에 대한 효과를 나타낸 도면으로, (A) 염증성 인자인 CCL2 및 CXCL2의 발현정도를 나타낸 것이고, (B)는 췌장 조직을 200배율에서 촬영한 광학현미경 사진과 췌장 조직의 부종 및 염증에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (C) 마우스 혈청에 존재하는 아밀라아제와 리파아제에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (D)는 MPO 활성에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (E)는 호중구 및 대식세포를 DAPI로 염색한 뒤 촬영한 공초점레이저현미경 사진이며, (F)는 마우스의 췌장중량/체중 비율 변화에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
그 결과 양성대조군과 비교하였을 때, 염증조절복합체의 약리학적 억제 (음성대조군) 및 유전적 억제 (실험군3)는 염증성 인자의 발현, 췌장 조직 내의 염증, 아밀라아제 및 리파아제 농도, MPO 활성, 호중구 및 대식세포의 침윤을 억제하였지만, 부종과 췌장중량/체중 비율에 대해서는 별다른 효과를 나타내지 않았다.
실험예 10. 프락시넬론의 급성 췌장염 치료 가능성 분석
프락시넬론이 급성 췌장염 치료에 사용될 수 있는지 가능성을 분석하기 위해, 첫번째 세룰레인 주사 후 1, 3 및 5시간이 되는 때에 맞춰 마우스에 프락시넬론 5 mg/kg을 복강 주사하였다 (실험군2).
실험예 3, 4 및 7과 동일한 방법으로 실험군2의 췌장 조직의 손상, 아밀라아제 및 리파아제의 농도 및 췌장중량/질량 비율을 관찰하였다
도 9는 프락시넬론이 급성 췌장염 치료에 사용될 수 있는지 가능성을 나타낸 도면으로, (A)는 췌장 조직을 200배율에서 촬영한 광학현미경 사진과 췌장 조직의 부종 및 염증에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (B)는 마우스 혈청에 존재하는 아밀라아제와 리파아제에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (C)는 마우스의 췌장중량/체중 비율 변화에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
그 결과 양성대조군과 비교하였을 때, 첫번째 세룰레인 주사 후 1 시간 후에프락시넬론을 주사한 실험군2에서 췌장 조직 내의 염증, 아밀라아제 및 리파아제 농도를 억제하였지만, 부종과 췌장중량/체중 비율에 대해서는 별다른 효과를 나타내지 않았다.
실험예 11. 통계 분석
모든 실험 결과는 3회이상 실시하여 그 평균값을 기초로 ±표준오차)로 나타내었다.
실험 결과에 대한 통계처리는 SPSS 분석프로그램 (v22.0)의 one way ANOVA에 준하였고, Duncan 방법으로 사후검증을 하였다.
P-valus가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
따라서, 실험예의 결과를 종합해 보았을 때, 프락시넬론은 급성 췌장염으로 인한 염증성 인자의 분비 (NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2), 췌장 조직의 손상, 호중구 및 대식세포의 침윤, 및 아밀라아제 (amylase) 및 리파아제 (lipase)의 활성을 억제함으로써, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료에 효과적인 조성물이라는 것을 알 수 있었다.
실시예 1. 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물
본 실시예에 따른 조성물은 상기 실험예의 실험 결과에 근거하여, 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방 또는 개선을 위한 약학적 조성물이다.
유효성분의 농도는 상기 실험예에 근거하여 볼 때, 마우스 복강 투여시 1~5 mg/kg 기준으로 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화할 수 있다.
상기 담체, 부형제 또는 희석제로는 토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여 형태는 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등을 사용하여 조제될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여 형태는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
실시예 2. 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물
본 실시예에 따른 조성물은 상기 실험예의 실험 결과에 근거하여, 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물이다.
유효성분의 농도는 상기 실험예에 근거하여 볼 때, 마우스 복강 투여시 1~5 mg/kg 기준으로 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품 보조 첨가제를 추가하여 식품류, 음료, 껌, 차 또는 비타민 복합제와 같은 건강기능식품을 제조할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 다른 성분을 사용하는 것에 있어 제한이 없으며, 향미제 또는 천연탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 향미제는 타우마틴, 스테비아 추출물, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린 또는 아스파르탐 등 을 유리하게 사용할 수 있다.
상기 천연탄수화물은 포도당, 과당, 말토스, 슈크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린, 자일리톨, 소르비톨 또는 에리트리톨 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제, 천연 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
Claims (4)
- 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 조성물은, 급성 췌장염으로 인한 급성 췌장염으로 인한 염증성 인자의 분비 (NLRP3, PY-CARD, 캐스페이즈-1, IL-1β, IL-18, CCL2 및 CXCL2), 췌장 조직의 손상, 호중구와 대식세포의 침윤 및 아밀라아제 (amylase)와 리파아제 (lipase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 프락시넬론의 1회 투여 용량은 마우스 복강 투여시 1~5 mg/kg인 것을 특징으로 하는, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
- 프락시넬론을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 건강기능식품 조성물.
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| KR101725714B1 (ko) | 2016-01-21 | 2017-04-11 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 프락시넬론을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 조성물 |
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