KR101725714B1

KR101725714B1 - 프락시넬론을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 조성물

Info

Publication number: KR101725714B1
Application number: KR1020160007477A
Authority: KR
Inventors: 곽승기; 박성환; 조미라; 이재선; 정승민
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2017-04-11

Abstract

본 발명은 프락시넬론(Fraxinellone) 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물은 Th17 세포 분화와 이에 관여하는 전사인자의 활성을 감소시킬 수 있고, 형질세포(plasma cell)의 분화와 이의 항체생산을 억제할 수 있으며, 파골세포(osteoclast)의 분화를 억제하는 효과가 뛰어나 골질환의 치료제로서 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

프락시넬론을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 조성물{Composition for treating or preventing bone disease comprising fraxinellone}

본 발명은 프락시넬론(fraxinellone)을 유효성분으로 포함하는 골질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 Th17 세포 분화와 이에 관여하는 전사인자 활성 감소, 형질세포(plasma cell) 분화와 항체생산 억제 효과, 및 파골세포(osteoclast) 분화 억제 효능을 갖는 프락시넬론을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

평균수명이 늘어남에 따라 65세 이상의 고령인구가 급격히 증가하여 최근 우리나라는 고령화 사회에서 고령사회에 진입하였다. 이에 노인층에서 다발되는 골 질환 환자도 급격하게 증가하고 있는 추세이다. 대표적인 골 질환으로서 골다공증(osteoporosis)의 유병건수는 1998년에서 2007년까지 약 5배 정도 증가하였다. 현대사회에서는 젊은 연령층과 남자들도 골다공증 증세를 보이는 골감소증이 나타난다는 보고가 있으며, 발병연령이 점차 연령이 낮아지는 추세이다. 골다공증 외에, 퇴행성 골관절염은 심한 통증과 장애를 일으키는 노인성 고관절 만성 전신성 염증성 질환이다. 퇴행성 골관절염은 보통 50세 이전에는 발병빈도가 낮으나 50세가 지나면 발병빈도가 급속히 증가하게 되어 고령화 사회에서 심각한 문제로 대두되고 있다. 일례로 2007년 한 해 동안 골다공증으로 인한 골절은 10만 건 이상 보고된바 있다.

한편 우리 몸을 이루고 있는 뼈는 정상적인 인체 조직처럼 일생 동안 오래된 뼈가 새로운 뼈로 바뀌는 과정을 거치는데, 이것을 뼈의 리모델링이라고 한다. 뼈의 리모델링은 뼈의 형성(bone formation)을 일으키는 조골세포(osteoblast)와 뼈의 파괴(bone destruction)를 일으키는 파골세포(osteoclast)가 균형을 이루면서 진행되는데, 청소년기에는 뼈의 형성이 보다 활발하게 일어나 성장이 이루어지고, 성인이 되면 뼈의 형성과 파괴가 균형을 이루면서 두드러지는 성장 없이 뼈의 리모델링이 지속되지만, 노년기가 되게 되면 뼈의 파괴가 우세해지면서 퇴화가 진행된다. 이러한 뼈의 재형성은 조골세포 및 파골세포로 구성된 골 다세포성 단위체(bone multicellular unit: BMU)에서 일어나며 이들 세포는 각각 조골 형성과 골 흡수 과정에서 중요한 역할을 한다.

파골세포는 척추동물의 뼈가 성장하는 과정에서 불필요하게 된 뼈 조직을 파괴 또는 흡수하는 대형의 다핵세포로, 파골세포의 활동이 너무 활발하면 뼈의 밀도가 낮아 골다공증과 같은 질병의 원인이 된다. 이러한 파골세포로 분화하기 위해서 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)이 필요하고, 파골전구세포의 증식을 위해서는 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)가 필요하다. RANKL이 수용체인 RANK와 결합하면 파골세포의 분화가 시작된다. RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6)와 같은 어댑터 분자들이 활성화 된다. TRAF 패밀리 멤버로 알려져 있는 TRAF2, TRAF5, TRAF6는 파골세포의 분화에 필요한 NF-κB와 AP-1(activator protein-1)와 같은 전사인자를 활성화시킨다. 파골세포 분화를 위한 RANKL 신호에 의해 TRAF6가 활성화되면 PI3K, TAK1, Akt/PKB, 그리고 JNK, ERK, p38을 포함하는 MAPKs, NF-κB, c-Fos, Fra-1, CREB, NFATc1 등이 활성화된다. 이러한 유도는 TRAF6-NF-κB와 RANKL-RANK 신호를 통한 c-Fos 경로에 의해 일어난다. 그리고 이들에 의해 카텝신 K(cathepsin K, CTK), TRAP(tartrate-resistant acid phospatase), 칼시토닌 수용체(calsitonin receptor, CTR) 및 파골세포-연관 수용체(osteoclast-associated receptor, OSCAR)등의 파골세포-특이적 유전자들이 발현된다. 이러한 RANKL/RANK/TRAF6 축과 NFATc1 등은 성숙한 파골세포로 분화하는데 반드시 필요하고, 관련된 분자는 뼈 질환 약물의 표적이 될 수 있다. 그러나 RANKL/RANK 체계와 이하 단백질 인산화효소와 전사인자들은 파골세포 형성뿐만 아니라 면역 체계와 같은 생물학적 과정에도 관여하므로, 이러한 인자들이 치료제의 표적이 되면 큰 부작용을 나타낼 수 있어서 주의가 요구된다.

한편, 파골세포는 암의 골 전이와도 관련이 있는 것으로 나타난다. 대부분의 유방암, 전립선암 또는 다발성 골수종 환자들에서 골 전이가 일어나는데, 이는 유방암 환자나 전립선암 환자의 사망률이 높아지는 주된 이유로 이해된다. 유방암에서 관찰되는 골 전이는 대부분 뼈를 파괴하는 골 용해성 골 전이(osteolytic metastasis)로서 유방암 세포가 뼈에 직접적인 영향을 미치는 것이 아닌 파골세포를 자극함으로써 일어나는 것으로 알려져 있다. 반면, 전립선암에서 관찰되는 골 전이는 골조성 골 전이(osteoblastic metastasis)이다. 골조성 골 전이 또한 골 용해와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 뼈로 전이해 온 암세포들은 뼈 주위의 미세 환경에서 증식하여 파골세포나 조골세포의 활성을 자극함으로써 골 용해성 골 전이로 진행될지 골조성 골 전이로 진행될지를 결정한다. 유방암 환자의 약 80%가 암세포의 골 전이가 발생되며, 전이된 유방암 세포는 파골세포를 활성화시킨다. 활성화된 파골세포는 뼈 주위의 미세 환경의 균형을 파괴시켜 골 용해(osteolysis)를 야기 시키고 이러한 현상으로 인해 병적 골절이 자주 발생할 뿐만 아니라, 백혈구 감소증(leukoerythroblastic anaemia), 뼈의 기형, 고칼슘혈증(hypercalcemia), 통증(pain), 신경압박 증후군(nerve compression syndromes)등의 뼈와 관련된 질환이 발생된다.

이처럼 뼈의 리모델링 과정에서 균형을 이루지 못하게 되면 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 혹은 파골세포에 의해 뼈의 밀도가 낮아져 생기는 골다공증, 조골세포의 활동이 너무 활발하여 뼈의 밀도가 높아지는 골 석화증 및 변형성 뼈 염이라고 불리는 파제트 병(Paget's disease)과 같은 골 질환이 생기게 된다.

한편, 이러한 골질환의 발생원인으로 조골세포 및 파골세포의 불균형 이외에도, 과도한 면역반응이 유력하게 거론되고 있다. 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료방법으로는 면역억제제를 단독 또는 병용 투여함으로써 상기 질환에 의해 야기되는 각종 증상을 완화 내지 감소시키는 것이다. 면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 류마티스 관절염 등과 같은 골 질환 이외에도, 장기이식, 루푸스, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료 시 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다(Wollenberg 2008).

따라서 최근에는 면역반응을 적정수준으로 조절하거나, 파골세포를 효과적으로 억제하고 이를 이용하여 골조직의 기능을 강화하거나 손상을 치료하고자 하는 노력이 증가하고 있다. 대표적으로 위와 같은 골다공증 및 암세포의 골 전이에 의해 초래되는 뼈의 손상에는 포사맥스(Fosamax, 성분명:alendronate)와 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate)과 같이 파골세포의 기능을 약화하고 사멸을 유도해 뼈의 손실을 느리게 하거나 멈추게 하는 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열의 치료제가 이용되고 있으며, 한편으로는 사이클로스포린 A와 FK506과 같이 T 세포의 활성화를 억제하거나 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 등이 사용된다. 그러나 최근 비스포스포네이트를 복용하는 환자에서 턱뼈의 괴사(osteonecrosis), 중증 심방세동, 뼈나 관절의 무력화 또는 근골격의 통증이 발생하는 사례가 해마다 증가되고 있다 (Coleman RE., Br J Cancer, 98:1736-1740(2008). 또한, 면역억제제를 사용하더라도 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 따라서 부작용이 적으면서 보다 효과적으로 골 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 치료제의 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.

대한민국특허 10-2015-0057908

본 발명자들은 골 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있으며 치료제를 개발하고자 노력하던 중, 프락시넬론이 골 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내(in vitro)에서 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 미분화 T 세포에 처리하는 단계를 포함하는 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 미분화 B 세포에 처리하는 단계를 포함하는 B 세포의 형질세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간을 제외한 골 질환이 유발된 개체에 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 골관절염, 골석화증, 파제트 병, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골 질환, 대사성 골 질환, 암세포의 골 전이에 의해 초래되는 뼈의 손상 및 면역염증반응을 통한 골 파괴 질환인 류마티스 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 Th17 세포 분화에 관여하는 전사인자 등의 인산화를 억제하여 골질환의 치료 효과를 갖는 것일 수 있다. 이때, Th17 세포 분화 억제는 STAT3의 트레오닌 및 세린기를 인산화 억제, 또는 IκB의 인산화 억제를 통하여 달성될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 B 세포의 형질세포(plasma cell) 분화 및 이의 항체생산을 억제하여 골질환의 치료 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 파골세포(osteoclast)의 분화를 억제시켜 골질환의 치료 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 파골세포의 분화는 RANKL의 자극으로 유도된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 미분화 T 세포에 처리하는 단계를 포함하는 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 미분화 B 세포에 처리하는 단계를 포함하는 B 세포의 형질세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 골 질환이 유발된 개체에 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 프락시넬론(Fraxinellone) 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물은 Th17 세포 분화와 이에 관여하는 전사인자의 활성을 감소시킬 수 있고, 형질세포(plasma cell)의 분화와 이의 항체생산을 억제할 수 있으며, 파골세포(osteoclast)의 분화를 억제하는 효과가 뛰어나 골 질환의 치료제로서 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 관절염 동물 모델에 프락시넬론을 투여한 후, (A) 관절염 지수 평가 (B) 관절조직 염색 (C) 혈청 내 IgG 및 IgG2a 양 (D) 관절 내 염증성 사이토카인의 양을 통하여 관절염 치료 효과를 분석한 것이다.
도 2는 프락시넬론을 처리한 T 세포에서 (A) CD4⁺IL-17⁺ T세포 발현 (B) 사이토카인의 양 측정 (C) Th17 세포 분화 (D) STAT3 및 IκB의 인산화 감소에 의한 신호전달 억제 효과를 분석한 것이다.
도 3은 프락시넬론을 처리한 후 LPS로 자극시킨 각 군의 비장 세포에서 (A) blimp-1 및 AID의 발현 (B) 프락시넬론의 농도에 따른 IgG의 생성 양을 관찰한 것이다.
도 4는 정상 마우스의 골수유래 대식세포를 분화시키고 RANKL로 자극시킨 후, (A) 분리된 골수세포를 파골세포로 분화하여 TRAP 염색 및 TRAP 양성세포의 계수 (B) (A)의 분화된 파골세포에서 파골세포 분화 관련 인자의 mRNA 발현을 관찰한 것이다.
도 5는 인간 말초혈액유래 대식세포를 분화시키고 RANKL로 자극시킨 후, (A) 분리된 골수세포를 파골세포로 분화하여 TRAP 염색 및 TRAP 양성세포의 계수 (B) (A)의 분화된 파골세포에서 파골세포 분화 관련 인자의 mRNA 발현을 관찰한 것이다.

본 발명은 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공함에 특징이 있다.

본 발명자들은 골 질환을 치료할 수 있는 새로운 치료제를 발굴하기 위해 연구하던 중, 프락시넬론이 골질환의 새로운 치료제로서 활용 가능함을 확인하였다.

본 발명의 조성물에 함유된 유효성분인 프락시넬론은 하기 화학식 1로 표시되는 구조식을 갖는 화합물로서 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz)의 근피에서 발견되는 리모노이드의 자연 분해에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다.

<화학식 1>

프락시넬론에는 신경보호 및 혈관이완 작용이 있는 것으로 알려져 있으나, 프락시넬론의 골 질환과 관련된 효과는 전혀 규명되어 있지 않다.

본 발명의 일실시예들을 통해 확인한 프락시넬론의 약리학적 효능으로는, 프락시넬론이 STAT3 및 IκB로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사인자의 인산화를 억제함으로써 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 감소 또는 억제시킬 수 있으며, B 세포의 형질세포로의 분화 또한 감소 또는 억제시킬 수 있고, RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)로 유도된 파골세포의 분화를 억제하여 골 흡수를 억제할 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명은 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용한 상기 프락시넬론은 화학적 합성 방법에 의해 합성된 것을 사용할 수 있으며 또는 천연물로부터 분리 및 정제한 것으로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 프락시넬론은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명의 프락시넬론 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 '담체'란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 말한다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 프락시넬론 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기에서 '약학적으로 허용 가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 자가면역 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명자들은 본 발명에서 규명한 프락시넬론이 골 질환 치료에 효과적임을 실험을 통해 입증하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 프락시넬론은 STAT3 및 IκB 등의 인산화를 억제시켜 미분화 T 세포의 Th17로의 분화를 효과적으로 억제시켰고, 항체 생산 B 세포의 형질세포로의 분화를 감소시키거나 억제하는 활성도 우수한 것으로 나타났다. 또한, 프락시넬론은 파골세포 분화를 효과적으로 억제하고 관절파괴를 효과적으로 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서 '골 질환'이란 조골세포의 부족 또는 파골세포의 분화에 의한 골 형성에 문제가 발생하여 생기는 질환으로서 이에 제한되지는 않으나, 골다공증, 골 관절염, 골 석화증, 파제트 병, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골 질환, 대사성 골 질환, 암세포의 골 전이에 의해 초래되는 뼈의 손상 및 면역염증반응을 통한 골 파괴 질환인 류마티스 관절염을 포함한다.

본 발명에서 상기 '예방'은 본 발명에 따른 프락시넬론 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 상기 '치료'는 본 발명에 따른 프락시넬론 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명에 따른 골질환의 치료 또는 예방용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 프락시넬론 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 골질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 프락시넬론 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 0.5μg/kg 내지 2000μg/kg의 양으로 투여 개체에게 투여할 수 있으며, 바람직하게는 2.5mg/kg 내지 15mg/kg의 양으로 투여할 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 자가면역질환 증상의 정도, 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

따라서 본 발명은 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 약제를 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공할 수 있다.

나아가 본 발명은 인간을 제외한 골 질환이 유발된 개체에 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공할 수 있다.

앞에서도 기술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 골질환의 치료방법은 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 방법을 통해 수행할 수 있는데, 적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 투과점막, 또는 장 투여 격막 내, 직접 심실 내, 복강 내, 또는 안(眼) 내 주사뿐만 아니라, 근육 내, 피하, 정맥, 골수 주사를 포함한 비경구 전달을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, 파골세포는 골의 발생 또는 재생 시 나타나는 세포로서, 골 조직의 한 측에서는 골이 형성되고 한편, 반대 측에서는 골조직의 파괴 또는 흡수가 진행된다. 앞서 종래기술에서도 개시한 바와 같이, 뼈의 형성에는 크게 두 종류의 세포, 즉, 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)가 관여하며 서로 밀접한 연관성으로 골의 항상성이 유지된다. 예를 들어, 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand), 및 그의 유도 수용체인 OPG(osteoprotegerin)과 같은 물질의 분비를 통해 골 흡수를 담당하는 파골세포의 분화를 조절함으로써 체내의 골 항상성을 유지하도록 하는데, 즉, RANKL이 파골 전구세포 표면 수용체인 RANK에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화 되어 골 흡수가 일어나며, OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제된다(Theill LE. et al., Annu Rev Immunol., 20:795-823(2002); Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev., 11:527-532(2001)). 따라서 전구세포로부터 형성되는 파골세포는 오래된 뼈를 흡수 또는 파괴하며, 뼈에 축적된 소량의 칼슘을 혈류로 방출시켜 신체기능을 유지하는 역할을 한다. 그러나 과도하게 활성화 된 파골세포는 뼈 주위 미세 환경의 균형을 파괴시켜 골을 용해시키므로 이로 인한 병적 골절, 백혈구 감소증, 뼈의 기형, 고칼슘혈증, 통증, 신경압박 증후군 등, 뼈와 관련된 질환을 발생시킨다(Roodman GD., N Engl J Med., 350:1655-1664(2004)).

따라서 파골세포의 과도한 분화 및 활성은 골질환의 원인이 될 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 '조골세포'는 골을 형성하는 입방형의 세포로, 골 형성 및 재형성 작용을 하는 세포를 의미한다. 조골세포는 파골세포에 의해 분해된 부분에 콜라겐을 격자모양으로 만들고 거기에 칼슘, 마그네슘, 인 등을 부착시켜 골 기질을 새롭게 만들어 궁극적으로 골을 형성하는 역할을 한다.

그러므로 본 발명은 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골 질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공할 뿐만 아니라, 프락시넬론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 '투여'는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 치료방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

나아가 본 발명은 프락시넬론 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 골질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 골 질환 예방 또는 치료 방법은 골 질환이 발생한 임의의 개체에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시 예 1>

프락시넬론 화합물의 관절염 치료 효과 분석

<1-1> 콜라겐 유도 관절염 확립 및 프락시넬론의 투여

콜라겐 유도 관절염 동물모델을 제조하기 위하여 7주령의 수컷 DBA/1J 마우스는 분양 후 1주간 동물실험실의 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 동물실험실의 온도는 22.0±2℃이었고, 하루 중 12시간은 200~300 Lux로 조명하고, 나머지 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 상기 적응된 DBA/1J 마우스에 Complete Freund's Adjuvant(CFA, Chondrex Inc., Redmond, WA)와 100μg의 제2형 콜라겐(Chondrex)을 1:1(w/v)로 혼합한 뒤 꼬리부분에 피내주사 하였다(1차 면역유도주사). 이로부터 2주 후, 마우스의 한쪽 뒷다리 발바닥에 Incomplete Freund's Adjuvant(IFA, Chondrex)와 100μg의 제2형 콜라겐을 1:1 (v/v)로 혼합한 뒤 피하주사 하였다(2차 면역유도주사). 2차 면역유도주사 후 곧바로 프락시넬론(fraxinellone) 7.5mg/kg 혹은 0.9% 염화나트륨 생리식염수를 마우스의 복강 내로 200μl 씩 주입하였다.

통계 유의성을 검증하기 위하여, 데이터는 GraphPad Prism (Version 5 for Windows; GraphPad Software, San Diego, CA)을 이용하여 분석하였다. 실험결과는 평균±표준 오차로 나타냈으며, 통계적 유의성은 Mann-Whitney U test 혹은 one-way analysis of variance (ANOVA)-bonferroni's multiple comparison tests를 이용하여 분석하였다. 본 실시 예 전체에 걸쳐 P 값이 0.05보다 이하일 때 유의하다고 기술하였다.

<1-2> 관절염의 평가

본 발명의 프락시넬론 처리에 따른 관절염의 치료 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시 예<1-1>을 통해 제작된 마우스(프락시넬론이 주입된 관절염 마우스)를 관찰하며 관절염증의 임상수치(clinical score)를 측정하였다. 관절염의 병변은 참고문헌에 근거하여 다음의 기준으로 평가한다.

0점: 부종이나 종창이 없음;

1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적;

2점: 발목관절에서 족근 골에 걸친 경한 부종과 발적;

3점: 발목관절에서 족근 골에 걸친 중등도의 부종과 발적;

4점: 발목에서 다리전체에 걸쳐 부종과 발적이 있고 관절경직이 나타남.

따라서 관절염 병변의 최고점수는 2차 면역유도주사 된 뒷다리의 점수를 제외한 12점이며, 첫 번째 주사시점으로부터 7주까지 일주일에 3회씩 실시하였고, 평가 자료는 실험과 관계없는 3인이 작성하였다. 생리식염수 투여 군과 프락시넬론 투여 군 간에 평균 관절염지수를 비교하였다.

그 결과, 도 1A에서 볼 수 있듯이 면역유도주사 후 35일 내지 56일 사이에 프락시넬론(7.5mg/kg) 투여 군에서 0.9% 염화나트륨 생리식염수를 투여했던 대조군에 비해 관절염 지수가 통계적으로 유의하게 낮음을 확인하였다. (**, p<0.01, ***, p<0.001)

<1-3> 관절의 조직학적 변화( Figure 1b)

본 발명의 프락시넬론 처리에 따른 관절염의 치료 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시 예 <1-1>을 통해 제작된 마우스(프락시넬론이 주입된 관절염 마우스)를 희생하여 관절파괴 정도를 면역조직화합염색법을 통하여 분석하였다. 구체적으로는 1차 면역유도주사 8주 후에 마우스의 앞다리를 제거하여 피부 가죽을 벗겨낸 뒤 10% 포르말린 용액에 하루 동안 담근 후 Calci-Clear Rapid (National Diagostics, Atlanta, Gerogia)로 7시간 동안 탈회하였다. 수세 및 탈수 후 파라핀으로 포매하였고, 7μm의 두께로 절편을 제작하여 Harris hematoxylin (영동제약, 용인)-eosin(Muto Pure chemical, Tokyo) 염색을 시행하였다.

그 결과, 도 1B에서 볼 수 있듯이, 면역유도주사 후 56일째 얻은 마우스의 앞발 조직 절편의 현미경 상에서 프락시넬론 투여군의 염증세포 침윤이 대조군에 비하여 현저히 감소함을 관찰하였다.

<1-4> 면역글로불린G 측정

관절염 마우스에 프락시넬론을 주입한 시점으로부터 8주 후에 마우스의 안와 혈청을 채취하여 마우스의 IgG 및 IgG2a의 양을 ELISA Quantitation Kits (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)를 이용해 측정하였다. 구체적인 측정방법은 다음과 같다.

실시 예 <1-1>에 기재된 바와 같이 1차 면역유도주사한 후 8주 뒤에 안와 채혈을 통해 얻은 혈청을, 1% 우혈청 알부민과 0.05% Tween20(amresco, Solon, OH)이 포함된 Tris-완충용액(pH 8.0)용액으로 1:100,000, 1:50,000의 비율로 희석하였고, 배양액에서 얻은 상등액은 원액으로 IgG와 IgG2a 측정에 사용하였다. 총 IgG 및IgG2a의 양은 마우스 IgG 또는 IgG2a ELISA Quantitation Kits (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)를 이용해 측정하였고 측정방법은 다음과 같다. 0.05M 농도의 소듐 카보네이트(sigma) 용액 (pH9.6)에 affinity purified goat anti-mouse IgG 항체 또는 anti-mouse IgG2a 항체를 100배 희석하여 1μg/ml의 농도로 ELISA용 96웰플레이트(Nunc)에 분주하고 실온에서 한 시간 동안 방치하였다. 50mM의 Tris(amresco), 0.14M의 염화나트륨(amresco), 0.05% Tween20(amresco)가 포함된 완충용액(pH 8.0)으로 4회 세척한 다음 1% 우혈청 알부민, 50mM Tris, 0.14M 염화나트륨이 포함된 완충용액(pH8.0)을 200μl/well로 분주하고 실온에서 30분간 비특이 반응을 억제시켰다. 세척용 완충용액으로 4회 세척한 다음 mouse reference serum을 500ng/ml로 희석한 용액(희석액: 50mM Tris, 0.14M 염화나트륨, 0.05% Tween20, 1% 우혈청알부민)을 2배 단계 희석하여 IgG 측정을 위한 표준용액으로 사용하였으며, 250ng/ml로 희석한 용액을 2배 단계 희석하여 IgG2a 측정을 위한 표준용액으로 사용하였다. 희석된 생쥐의 혈청 또는 비장세포 배양 상등액을 표준용액과 함께 플레이트에 넣고 실온에서 한 시간 동안 반응시킨 뒤, 4회 세척 후 HRP가 부착된 anti-mouse IgG 항체 또는 anti-mouse IgG2a 항체를 희석용액으로 100,000배 희석한 뒤 플레이트에 50 μl/well로 분주하고 실온에서 한 시간 동안 반응 시켰다. 5회 세척 후 Tetramethylbenzidine substrate 용액(ebioscience, San Diego, CA)을 50μl/well씩 넣고 약 5분간 반응시킨 뒤 0.18M H₂SO₄를 50μl/well씩 넣어 반응을 멈추고 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 농도의 표준용액에 대한 흡광도 값으로 대조하여 정량하였다.

그 결과, 도 1C에서 볼 수 있듯이, 면역유도주사 후 56일째 안와 채혈을 통해 얻은 생쥐의 혈청 내 총 IgG와 IgG2a의 양이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

<1-5> 비장세포의 분리 및 자극

1차 면역유도주사한 뒤 8주 후에 생쥐의 비장을 적출하여 가위로 잘게 자르고 40μm의 cell strainer (BD Falcon, Bedford, MA)로 걸러내 비장세포를 얻었다. 적혈구를 제거하기 위해 원심분리 하여 얻은 비장세포를 2.06% Tris, 0.83% NH₄Cl 용액에 부유시켜 실온에서 5분간 반응시킨 후, 40μm의 cell strainer에 다시 통과시켰다. 생쥐 비장세포는 10% 우태아혈청(Gibco, Grand Island, NY)이 포함된 RPMI1640(Gibco)배지로 부유시켜 배양하였다. 24웰플레이트에 Purified anti mouse CD3e antibody(BD)를 1μg/ml의 농도로 분주하여 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 방치한 뒤 잔여물을 걷어내고 1 x 10⁶ cells/ml 농도의 비장세포를 분주해 자극했으며, 3일 뒤 상등액을 얻어 사이토카인 측정에 사용하였다.

<1-6> 세포독성 측정

실시 예 <1-5>에서 얻은 비장세포를 1 x 10⁶ cells/ml의 농도로 96웰플레이트에 200μl씩 분주하여 프락시넬론을 40μM 및 80μM의 농도로 24시간 동안 자극한 뒤, Cell counting kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, MD)을 10μl/well로 처리하고 2시간 후에 450nm의 흡광도 값을 측정하였다. 세포독성은 대조군인 0.01% dimethylsulfoxide (sigma)로 자극한 세포의 흡광도 값을 100%로 환산했을 때 프락시넬론으로 자극한 세포의 흡광도 값을 생존율(%)로 하여 측정하였다.

그 결과, 40μM 및 80μM의 프락시넬론을 처리한 세포의 생존율이 각각 90.81% 및 86.96%인 것으로 나타났다.

<1-7> 사이토카인의 측정

Anti-mouse TNF-a 항체, anti-mouse IFN-g 항체, anti-mouse IL-17 항체와 비오틴(biotin)으로 표지 된 각 항체는 R&D systems(Minneapolis, MN)으로 부터 구입하여 실시 예 <1-5>에서 얻은 상등액 내에 존재하는 각 사이토카인을 측정하였다. 0.05M 농도의 탄산나트륨(sigma) 용액(pH9.6)에 각 정제된 anti-TNF-a 항체(1μg/ml), anti-IFN-g 항체(1μg/ml), anti-IL-17 항체(2μg/ml)를 희석하여 ELISA용 96웰플레이트(Nunc)에 분주하고 냉장고에서 16시간 동안 방치하였다. 이 후 플레이트 내의 용액을 버리고 흡습지에 거꾸로 뒤집어 가볍게 쳐서 잔여용액을 말끔히 버린 후, 실온으로 맞춰 둔 1% 우혈청 알부민(amresco)과 0.05% Tween20(amresco)이 포함된 인산완충용액을 200μl/well로 분주하고 실온에서 2시간 동안 비특이 반응을 억제하였다. 다음으로, 플레이트를 비우고 재조합 TNF-a(R&D)는 2ng/ml의 농도부터 2배 단계 희석한 용액, 재조합 IL-17(R&D)은 1ng/ml의 농도부터 2배 단계 희석한 용액, 재조합 IFN-g(R&D)는 10ng/ml의 농도부터 5배 단계 회석 한 표준용액을 제조했다. 이들과 함께 배양 상등액을 플레이트에 50μl/well로 분주한 뒤 실온에서 2시간 반응시켰다. 0.05% Tween20이 포함된 인산완충용액을 well당 200ul씩 분주하고 2분간 방치하는 세척단계를 총 4회 실시하였다. 이후 비오틴이 부착된 anti-TNF-a 항체(300ng/ml), anti-IL-17 항체(200ng/ml), anti-IFN-g 항체(200ng/ml)를 well당 50μl/well로 분주 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 총 4회의 세척을 시행 후, Extravidin-HRP(Sigma)를 1:10000배의 비율로 1% 우혈청 알부민과 0.05% Tween20(amresco)이 포함된 인산완충용액에 희석하여 50μL/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 다음으로 Tetramethylbenzidine substrate 용액(ebioscience, San Diego, CA)을 50μl/well씩 넣고 약 5분간 반응시킨 뒤 1N H₂SO₄를 50μl/well씩 넣어 반응을 멈추고 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 재조합 TNF-a, IFN-g, IL-17 단백질을 이용한 대조샘플로 각각 정량하였다.

그 결과, 도 1D에서 볼 수 있듯이, 면역유도주사 후 56일째 각 군에서 얻은 비장세포에서 aCD3 자극에 대한 염증성 사이토카인 TNF-a의 양이 프락시넬론 투여 군에서 감소하였으며, 특히 IFN-g의 양은 현저하게 감소하였음을 확인하였다.

<실시 예 2>

프락시넬론 화합물의 Th17 분화 억제효과 분석

<2-1> CD4 ⁺ T 세포의 분리 및 자극

생쥐의 비장세포를 실시 예 <1-5>에서 기술한 방법대로 분리 한 다음, 인산완충용액으로 세척하고 CD4 마이크로비드(miltenyi biotec, Germany)를 10⁷개의 세포당 10μl씩 혼합하여 4℃에서 15분간 반응시켰다. 5% 우혈청 알부민(amresco)과 1mM EDTA(sigma)가 포함된 인산완충용액으로 세척 후 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI1640 배지로 재부유시켜, 10⁶ 개의 세포로 분주한 뒤 anti-CD3e 단클론 항체 (0.5μg/mL), anti-CD28 단클론 항체(1μg/mL)(BD Pharmingen, San Diego, CA), 재조합 TGF-β(2 ng/mL), IL-6(20 ng/mL), anti-IFN-γ 항체(2 μg/mL), anti-IL-4 항체(2μg/mL)(R&D Systems)로 자극하여 Th17 세포로 분화를 유도하였다. 이때, 프락시넬론을 각 농도로 30분간 전처리하여 Th17 분화조절 여부를 확인하고자 하였다. 이때 얻어진 상등액은 IL-17 농도를 측정하는데 사용하였다. 본 실험에서 분리된 순수의 CD4⁺ T 세포는 98% 이상이었다.

<2-2> 유세포분석

IL-17의 세포 내 분포를 확인하기 위해, 자극이 끝난 세포에 25ng/ml 농도의 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)와 250 ng/mL ionomycin (Sigma Aldrich, St Louis, MO), 0.67μl/ml의 Golgi-Stop(BD)을 동시에 처리하고 4시간 후에 세포를 회수하여 1.8ml 튜브로 옮겼다. 3% 우태아 혈청이 포함된 인산완충액으로 세척 후, 0.2μg의 PerCP로 표지 된 anti-CD4 항체 (Biolegend, San Diego, CA)로 4℃에서 30분간 형광염색 하였다. 3% 우태아 혈청이 포함된 인산완충액으로 세척 후 1ml의 IC fixation 용액(ebioscience)을 넣고 4℃에서 30분간 반응 후 permeabilization 용액(ebioscience)으로 세척하였다. 0.125μg의 FITC로 표지 된 anti-IL-17 항체 (eBioscience)로 4℃에서 30분간 반응 후 permeabilization 용액(ebioscience)으로 세척하였다. LSR II fortessa(BD) 장비와 FACS DIVA version 10.0(BD Biosciences) 소프트웨어로 CD4⁺IL-17⁺세포의 분포를 분석하였다.

그 결과, 도 2A에서 볼 수 있듯이, Th17 분화유도 후 2일 째, 5.2%의 CD4⁺IL-17⁺T세포가 관찰되었다. 이에 프락시넬론을 각각 30μM, 40μM, 및 50μM로 전처리하면 CD4⁺IL-17⁺T세포는 각각 4.6%, 4.3%, 및 4.1%로 용량 의존적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다.

<2-3> 유전자 발현

동물모델을 대상으로 프락시넬론 처리의 효과를 알아보기 위해, 상기 동물모델에서 비장 세포의 RNA를 추출하여 IL-17 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.

Th17 세포로 분화를 유도한지 3일 후, 세포를 1.8ml 튜브로 회수하여 8000rpm, 4℃에서 8분간 원심분리 하였다. 상등액을 걷어 내고 남은 펠렛에 1ml의 RNAiso Plus(Takara, Otsu, Japan)를 넣고 녹였다. 클로로포름을 200μl/tube씩 넣고 잘 흔들어 섞은 뒤 5분간 얼음위에 방치하였다. 13000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 한 뒤, 위층에 뜬 상등액을 400μl씩 회수하여 차게 식혀둔 새 1.8ml 튜브로 옮겼다. 동량의 isopropanol(sigma)을 튜브마다 넣어 위아래로 잘 흔들어 RNA를 침전시켰다. 13000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 한 뒤, 상등액은 버리고 남은 펠렛에 1ml의 75% 에탄올(sigma)을 넣고 10000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 한 뒤 상등액을 버리는 세척단계를 2회 실시하였다. 남은 펠렛이 담긴 튜브를 거꾸로 뒤집어 10분간 말린 후, nuclease free water(ambion) 20 μl씩 튜브에 넣고 55℃에서 10분간 방치하여 RNA를 녹였다. NanoDrop(version 2.0)으로 정량한 후, 2μg의 RNA를 0.2ml 튜브에 덜어내어 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)를 사용하여 cDNA를 합성하였으며 방법은 다음과 같다. Random hexamer 1200pmol/2μl를 2 μg의 RNA와 혼합한 뒤 총 부피를 13μl/tube로 맞추고 65℃에서 10분간 반응시켰다. 그 동안 역전사효소희석 완충액 4μl/tube, deoxynucleotide mixture 2 μl /tube, RNase 억제제 0.5μl/tube, 역전사효소 0.5μl/tube를 섞어 두고 반응이 끝난 RNA-Hexamer가 담긴 튜브에 7μl씩 분주하였다. 그리고 이들을 25℃에서 10분, 55℃에서 30분, 85℃에서 5분, 4℃에서 10분간 차례로 반응시켜 cDNA를 얻었다. 1μl의 cDNA와 0.2pmole의 sense primer, 0.2 pmole의 antisense primer, 10μl의 LightCycler480 SYBR Green I Master (Roche), 8.6μl의 nuclease free water를 혼합하여 실시간 유전자 증폭을 수행했으며 LightCycler 480 II(Roche) 장비를 사용하였다. 증폭에 사용된 primer 염기서열은 다음과 같으며 반응 온도는 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 10초간 사이클을 50회 반복하였다. 하기 표 1은 real-time RT-PCR에 사용된 primer 염기서열 목록을 나타낸 것이다.

타겟유전자 증폭배율, 2^-( ^ddCp ⁾의 상대정량은 다음과 같이 계산되었다. ddCp= dCp_(stimulated) - dCp₍ _unstimulated ₎, dCp =Cp₍ _target ₎ - Cp_(β- _actin ₎, Cp는 threshold를 교차하는 지점을 장비의 소프트웨어가 2nd derivative max 법으로 자동 계산한 값이다. Melting curve analysis를 통해서 증폭된 산물의 순도가 일정하였으며 비특이적 산물이 없음을 확인하였다.

Th17 분화유도 후 2일 째 얻은 상등액에서 IL-17의 생성을 측정하였다. Th17분화 유도 군에 대한 대조군은 aCD3 단클론 항체에 대한 단독 자극으로 시험되었다. 그 결과, 도 2B에서 볼 수 있듯이, aCD3 처리한 대조군에서 IL-17의 생성량은 관찰되지 않았으며, Th17 분화 유도 시 7.8±0.06 ng/ml으로 나타났고, 프락시넬론을 전처리한 군에서는 4.2±0.10 ng/ml로 통계적으로 유의하게(p<0.001) 감소하였다. 또한, Th17 분화유도 2일 째 얻은 세포에서 RNA를 추출한 뒤 시행한 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응법을 통해 IL-17과 Th17세포 분화에 관여하는 전사인자인 RORgt의 mRNA 수준을 비교하였다. 프락시넬론을 전처리한 군의 각 mRNA 수준이 통계적으로 유의하게 (p<0.001) 감소하였다.

<2-4> 말초유래 단핵구세포 분리 및 Th17 세포분화유도

정상인의 말초혈액 20cc를 얻어 같은 양의 인산완충용액에 희석 후, 10ml의 ficoll-paque 용액(GE Healthcare)위에 분주하였다. 2000 rpm으로 30분간 실온에서 원심분리 하고 나서 혈장과 ficoll-paque 용액 사이에 생긴 buffy coat 층의 세포를 취해서 새 튜브로 옮기고 10ml의 인산완충용액으로 세척한 뒤 CD4 마이크로비드(miltenyi biotec, Germany)를 10⁷개의 세포 당 10μl씩 혼합하여 4℃에서 15분간 반응시켰다. 5% 우혈청 알부민과 1mM EDTA가 포함된 인산완충용액으로 세척 후 10% RPMI1640 배지로 재부유시켜, 10⁶개의 세포로 분주한 뒤 anti-CD3e 단클론 항체 (0.5μg/mL) (BD), anti-CD28 단클론 항체 (1μg/mL) (BD), 재조합 TGF-β(2ng/mL), IL-6(20ng/mL), anti-IFN-γ 항체(2μg/mL), anti-IL-4 항체(2μg/mL)(R&D Systems)로 자극하여 Th17 세포로 분화를 유도하였다. 이때, 프락시넬론을 각 농도로 30분간 전처리하여 Th17 분화조절 여부를 확인하고자 하였다. 이때 얻어진 상등액은 IL-17 농도를 측정하는데 사용하였다.

정상인의 말초혈액에서 분리한 CD4⁺ T세포를 이용하여 Th17 세포 분화를 유도하였다. 그 결과, 도 2C에서 볼 수 있듯이, 마찬가지로 프락시넬론에 의해 Th17세포의 분화가 억제되었다. (Th17: 4.7±1.1 %, 프락시넬론 전처리 군: 2.0±0.6 %, ** p<0.01)

<2-5> 신호전달 메커니즘

생쥐의 비장세포를 앞서 기술한 방법으로 CD4 양성 세포를 분리하였다. 이에 프락시넬론으로 30분간 전처리한 뒤, 20ng/ml의 IL-6(R&D)로 30분 간 자극 후 인산완충액으로 세척하였다. 원심분리 후 얻은 pellet에 50μl의 Halt protease and phosphatase inhibitor cocktail(Thermo scientific, Waltham, MA)이 포함된 RIPA 용액으로 섞은 뒤 12000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상등액에서 단백질을 추출하였다. BCA법으로 단백질을 정량 후, 전기영동을 위해서 50μg의 단백질을 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel에서 100V로 1시간 30분 동안 전기영동 하였고, 전기영동이 끝난 후 겔상의 단백질은 polyvynilidene fluoride membrane(Biorad, Hercules, CA)으로 100V에서 1시간 동안 옮겨졌다. 5% 탈지유(Dako)와 0.1% Tween20(amresco)이 포함된 Tris 용액으로 membrane상의 비특이적 반응을 차단시킨 뒤, 다음과 같은 항체로 4℃에서 16시간 동안 교반시켰다: anti-pSTAT3 _Y705 항체(Cell Signaling Technology, CST, Boston, MA, USA, 1000배 희석), anti-pSTAT3 _S727 항체(CST, 1000배 희석), anti-STAT3 항체(CST, 2000배 희석), anti-pIκBa 항체(CST, 1000배 희석), anti-IκBa 항체(CST, 2000배 희석), anti-beta actin 항체(sigma, 5000배 희석). 다음 날, 0.1% Tween20이 포함된 Tris 용액으로 세척 후, horseradish peroxidase로 표지된 goat anti-rabbit IgG (Thermo scientific) 또는 goat anti-mouse IgG (Santacruz)를 2000배 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween20이 포함된 Tris 용액으로 membrane을 10분씩 3회 세척한 다음 SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate (Thermo scientific)로 발광시켰고 이를 Amersham imager 600 (GE Healthcare Bioscience, Pittsburgh, PA) 장비를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 2D에서 볼 수 있듯이, 프락시넬론은 생쥐의 CD4⁺T 세포에서 Th17세포의 분화에 필요한 전사인자인 STAT3의 트레오닌 및 세린기의 인산화를 모두 억제하였음을 확인할 수 있었다. IκB의 인산화는 이에 결합되어 있던 NF-κB를 핵 내로 이동시켜 염증신호를 전달하는데, 프락시넬론은 CD4⁺T 세포에서 IL-6자극을 통한 IκB의 인산화도 억제시켰다. 한편 대조군인 beta actin의 단백질 양은 변화시키지 않았음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

프락시넬론의 형질세포( plasma cell )분화 및 항체생산 억제효과 분석

<3-1> B 세포의 분리 및 자극

실시 예 <1-5>에서 얻은 생쥐의 비장세포를 인산완충용액으로 세척하고 CD19 마이크로비드(miltenyi biotec, Germany)를 10⁷개의 세포 당 10μl씩 혼합하여 4℃에서 15분간 반응시켰다. 5% 우혈청 알부민과 1mM EDTA가 포함된 인산완충용액으로 세척 후 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI1640 배지로 재부유시켜, 10⁶개의 세포로 분주한 뒤, 프락시넬론을 각각 10μM, 20μM, 30μM, 및 40μM의 농도로 30분간 전처리하고 나서 1μg/ml의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS, Sigma)로 자극하였다. 4일 후, 세포를 회수하여 RNA를 추출하고 상등액은 따로 보관하여 IgG를 측정하는데 사용하였다. 이 때 IgG농도는 희석하지 않은 상등액에서 측정하였다.

그 결과, 도 3A에서 볼 수 있듯이, 생쥐의 비장세포에서 LPS로 염증신호전달 및 형질세포로 분화를 유도할 때 프락시넬론이 형질세포의 분화 시 증가하는 인자라고 알려진 mRNA 수준에서 blimp-1과 AID의 발현을 조절함을 확인하였다. (media 대비 LPS처리군의 Blimp-1 발현비율 7.8배, LPS + 프락시넬론 처리군의 발현비율 4.1배, media 대비 LPS처리군의 AID 발현비율 18.3배, LPS + 프락시넬론 처리군의 발현비율 2.5배)

형질세포는 염증신호에 반응하여 분화 된 후 IgG를 생성하는데, 도 3B에서 볼 수 있듯이, 프락시넬론은 이를 10μM 내지 40μM의 농도에서 농도 의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다. (media 처리군: 0.4 ± 0.02 ng/ml; LPS 처리군: 116.0±4.60 ng/ml; LPS + 프락시넬론 10μM 처리군: 112.6±5.39 ng/ml; LPS + 프락시넬론 20μM 처리군: 96.3±4.62 ng/ml; LPS + 프락시넬론 30μM 처리군: 58.8±1.15 ng/ml; LPS + 프락시넬론 40μM 처리군: 47.2±2.07 ng/ml)

<실시 예 4>

프락시넬론의 마우스 파골세포( mouse osteoclast cell )분화 억제효과 분석

<4-1> 마우스 파골세포 분화 유도

정상 C57BL/6 생쥐의 femus와 tibia에서 추출한 골수를 얻어 10% 우태아 혈청이 포함된 α-minimal essential medium (Gibco) 에 배양하여 다음 날 비부착 세포를 수집하였다. 수집된 각 세포들은 새로운 배양접시로 옮겨 각각 10 ng/ml 농도의 재조합 M-CSF(R&D Systems, Minneapolis, MN)으로 3~4일간 자극하였다. 이후 얻어진 부착성 세포들을 다양한 농도의 프락시넬론과 M-CSF (10ng/ml), NF-κB 리간드의 용해성 수용체 활성화제(25ng/ml, peprotech, Korea)로 자극하여 파골세포로의 분화를 유도하였다. 이때 이틀마다 배지를 교환하면서 같은 자극을 시행하였으며, 배양 4일에서 6일 사이에 세포를 회수하여 RNA를 추출하거나, 4% p-포름알데히드로 고정하고 tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP, sigma)염색을 시행하였다. 파골세포 분화를 유도가 끝난 배양 플레이트에 배지를 제거한 뒤 인산완충용액으로 2회 세척하고 10% 포르말린 인산완충용액을 넣고 10분 이상 실온에서 고정하였다. 이후 증류수로 3회 세척한 뒤 TRAP 혼합용액- Fast Garmet GBC Base solution(50μl), Sodium Nitrite Solution(50μl), 37℃의 3차 멸균증류수(4.55ml), Naphthol AS-BI Phosphate solution(50μl), Acetate solution(200μl), Tartrate solution(100μl) 을 넣고 37℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시켰다. 3차 멸균수로 2회 세척 후 3차 멸균수를 플레이트에 채워 마르지 않게 하면서 TRAP 양성 세포 중 3개 이상의 핵을 가지고 있는 다핵세포의 수를 현미경상에서 계수하였다.

<4-2> TRAP 양성세포의 계수

마우스의 파골세포에 있어, 정상 생쥐의 골수유래 대식세포를 분화시킨 뒤 RANKL자극을 주고 파골세포의 분화를 유도할 때, 프락시넬론을 전처리하여 농도 의존적으로 3개 이상의 핵을 가진 TRAP 양성세포가 감소함을 현미경 상에서 확인하고 이를 계수하여 그래프로 표시하였다.

그 결과, 도 4A에서 볼 수 있듯이, RANKL을 자극하지 않은 세포에서는 TRAP 양성세포가 관찰되지 않았으며, RANKL로 자극한 세포는 보라색을 띠는 TRAP 양성 세포를 관찰할 수 있었다. 이 중 핵을 3개 이상 가지는 TRAP 양성세포의 계수는 프락시넬론 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다. (RANKL: 770개, RANKL + 프락시넬론 10μM: 538개, RANKL + 프락시넬론 20μM: 423개, RANKL + 프락시넬론 30μM: 298개, RANKL + 프락시넬론 40μM: 259개)

<4-3> 파골세포 분화 관련 유전자 분석

파골세포분화 유도 4일 후 얻은 세포에서 RNA를 추출하여 카텝신 K(CTK), 칼시토닌 수용체(CTR), 파골세포-연관 수용체(OSCAR), 인테그린 베타3 (ITGB3), TRAP, 매트릭스 메탈로프로티나제-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)의 발현을 mRNA 수준에서 측정한 결과, 도 4B에서 볼 수 있듯이, ITGB3를 제외한 나머지 파골세포 분화에 관련한 유전자들이 감소하는 경향이 있음을 확인하였다.

<실시 예 5>

프락시넬론의 인간 파골세포( human osteoclast cell )분화 억제효과 분석

<5-1> 인간 파골세포 분화 유도

인간의 말초유래 단핵구 세포를 얻어 10% 우태아 혈청이 포함된 α-minimal essential medium (Gibco)에 배양하여 다음 날 부착세포를 수집하였다. 수집된 각 세포들은 실시 예 <4-1>의 과정과 동일하게 자극 (단, 100 ng/ml 농도의 재조합 M-CSF 사용) 및 분화 유도되었다. 인간세포의 경우 6일에서 8일 사이에 세포를 회수하였다. 이후의 과정은 실시 예 <4-1>의 과정과 동일하게 실시하였다.

<5-2> TRAP 양성세포의 계수

인간 말초혈액유래 대식세포를 분화시킨 뒤 RANKL자극을 주고 파골세포의 분화를 유도할 때, 프락시넬론 40μM을 전처리하여 3개 이상의 핵을 가진 TRAP 양성세포가 감소함을 현미경 상에서 확인하고 이를 계수하여 그래프로 표시하였다.

그 결과, 도 5A에서 볼 수 있듯이, 보라색을 띠는 TRAP 양성 세포의 수가 RANKL로 자극한 세포보다 프락시넬론을 40μM 처리한 세포에서 현저하게 감소하였음을 확인할 수 있었다. (RANKL: 751개, RANKL + 프락시넬론 40μM: 173개)

<5-3> 파골세포 분화 관련 유전자 분석

파골세포분화 유도 후 얻은 세포에서 RNA를 추출하여 MMP-9, CTK, ITGB3, 그리고 파골세포 분화에 관여하는 전사인자인 NFATc1과 c-fos의 발현을 mRNA 수준에서 측정한 결과, 도 5B에서 볼 수 있듯이, MMP-9, CTK, NFATc1의 유전자들이 감소하는 경향을 확인하였다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 프락시넬론이 Th17 세포 분화와 이에 관여하는 전사인자의 활성을 감소시킬 수 있고, 형질세포(plasma cell)의 분화와 이의 항체생산을 억제할 수 있으며, 파골세포의 분화를 억제시킬 수 있는 활성이 있음을 확인할 수 있었고, 종합적으로 프락시넬론을 골 질환을 위한 새로운 치료제로서 사용가능하다는 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

프락시넬론 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
상기 프락시넬론은 투여 개체에 7.5 mg/kg의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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프락시넬론 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물.
시험관 내(in vitro)에서 프락시넬론 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 미분화 T 세포에 처리하는 단계를 포함하는 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
시험관 내(in vitro)에서 프락시넬론 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 미분화 B 세포에 처리하는 단계를 포함하는 B 세포의 형질세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
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