KR102154124B1 - 프로피오니박테리움 프레우덴레키 mj2 균주를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 및 비만 관련 대사 이상의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 - Google Patents
프로피오니박테리움 프레우덴레키 mj2 균주를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 및 비만 관련 대사 이상의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프로피오니박테리움 프레우덴레키 (Propionibacterium freudenreichii) MJ2 균주를 유효성분으로 포함하는 비만과 관련되는 대사성 질환 예방, 치료, 또는 개선용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 상기 MJ2 균주는 내장지방 축적 감소 및 지방세포 분화 억제 활성뿐만 아니라, 고지방식이에 의해 증가하는 공복시 혈당, 혈중 지질, 인슐린 및 간 및 지방 조직의 지방 축적을 정상수준으로 회복시키는 효과가 있고, 특히 간 기능 보호에 우수한 효과가 있는바, 비만 또는 고지방식이 등으로 유도되는 각종 대사 이상의 예방, 치료 또는 개선이 가능한 장점이 있으며, 나아가 본 발명의 MJ2 균주는 원유로부터 분리되어 부작용이 없거나 적은 장점이 있는바, 기존의 프로바이오틱스 균주를 대체하는 신규의 프로바이오틱스 균주로서 비만 및 이와 관련된 대사 이상의 예방과 치료를 위한 의약용, 의약외용, 식품 첨가물용, 향장소재용 조성물 등 다양한 방면으로 이용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 프로피오니박테리움 프레우덴레키 (Propionibacterium freudenreichii) MJ2 균주를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사 이상의 예방 또는 개선용 식품 조성물 등에 관한 것이다.
비만은 과다한 지방세포가 생성하는 과도한 지방이 축척됨으로서 유발되며, 비만에 의한 만성 질환의 발생 위험성은 당뇨병 2.7배, 고지혈증 1.6배, 고혈압 2.2배로, 비만은 대사성 질환(metabolic syndrome)과 높은 연관성을 갖는다. 또한 비알콜성 간질환, 관절염, 심혈관계 질환, 및 담석증의 발병 위험 역시 커지며 일부 암의 발생과도 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 특히나 비만한 경우 인슐린 저항성을 높게 나타내며 또한 국민건강보험공단의 “비만의 사회경제적 영향” 연구에 따르면 비만에 의한 사회경제적 손실이 한해 11조5000억원 상당으로 비만은 개인적 그리고 국가적으로 해결해야 하는 중요한 문제이다.
항비만 기전으로는 지방 흡수를 감소시키는 방법, 에너지 섭취량을 감소시키는 방법, 에너지 소비량을 증가시키는 방법, 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제시키는 방법, 지방질 합성을 저해하고 지방질 분해를 증가 시키는 방법 크게 5가지가 있다. 이러한 기전들을 이용한 다양한 항비만 제품들이 시판되고 있다. 질병 예방을 넘어서 미용 목적 등을 위해 항비만 제품 시장의 규모는 증가하고 있는 추세이며 현재 국내 다이어트 시장의 규모는 총 7조6000억원이며 이 중 '다이어트 식품 및 기타'는 3조 2000억원으로 '다이어트 의료'(1조9000억원), '헬스클럽'(2조5000억원)과 비교하여 가장 높은 비율을 차지하고 있다. 이러한 항비만 제품 시장은 지속적으로 증가 추세임에도 불구하고 현재 시판되고 있는 많은 항비만 의약품은 부작용(정신질환 유발 위험성 증가, 심근경색, 뇌졸증, 및 위장관계 관련 부작용 등)을 보이며 제품 허가가 취소되는 경우가 많다. 따라서 식품원료에서 유래된 보다 안전하고 비만 억제에 뛰어난 효과를 보이는 대체물질 개발에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.
그 중 안전한 probiotics를 활용한 연구가 진행 중인데 현재 항비만 효과를 보이는 것으로 밝혀진 프로바이오틱스(Probiotics)의 종류로는 Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve, Akkermansia muciniphila 등이 있다.
지방세포는 지방조직에 분포하는 세포로 에너지를 지방의 형태로 저장하여 에너지 대사의 항상성을 유지하는 역할을 한다. 에너지 축적량에 비해 소비량이 적어질 경우 비만이 유발된다. 따라서 지방세포의 분화는 지방 축적의 원인이 되며 이는 비만과 밀접한 관련이 있다. 지방전구세포에서 지방세포로 분화하는 과정은 지방세포에서 특징적으로 발현되는 전사 인자(Transcription factor)의 발현에 의해 조절되며 분화되는 동안 형태적, 생화학적 변화를 통해 체내 지방을 축적한다. 분화를 조절하는 전사인자로 peroxisome-proliferators activated-receptor-γ (PPAR γ), CCAAT enhancer-binding-proteins (C/EBP) family, Fatty acid synthase (FAS), acetyl-CoA carboxylase (ACC), stearoyl-CoA desaturase-l (SCD-1) 등의 발현이 증가되며 상호작용하여 전사를 유도하여 지방세포의 분화가 이루어진다. 따라서 이러한 전사인자 발현을 억제하는 부작용이 없는 억제제를 이용한 비만 연구가 필요하며 동물 실험을 통해 항비만 효과를 확인하는 연구가 필요하다. 한편, 프로피오니박테리움 프레우덴레키 (Propionibacterium freudenreichii)는 에멘탈치즈 제조의 스타터로 이용되는 균으로 GRAS (Generally recognized as safe)에 등재된 균으로 안전성이 입증되었으며 현재 유럽 등지에서는 식품 원료에 적용되고 있는 균이지만, P. freudenreichii MJ2 strain의 항비만 효과 및 대사성 질환의 예방 또는 개선의 효과에 대해서는 아직 알려진바 없다.
비특허문헌 1: Dahiya, D. K., Puniya, M., Shandilya, U. K., Dhewa, T., Kumar, N., Kumar, S., ... & Shukla, P. (2017). Gut microbiota modulation and its relationship with obesity using prebiotic fibers and probiotics: a review. Frontiers in microbiology, 8, 563.
비특허문헌 2:(Kobyliak, N., Conte, C., Cammarota, G., Haley, A. P., Styriak, I., Gaspar, L., ... & Kruzliak, P. (2016). Probiotics in prevention and treatment of obesity: a critical view. Nutrition & metabolism, 13(1), 14
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 부작용이 없어 안전하면서도 비만과 그와 관련된 대사 이상의 개선, 예방 또는 치료에 효과가 뛰어난 조성물 및 이를 함유하는 의약품 또는 기능성 식품을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명의 목적은 프로피오니박테리움 프레우덴레키 (Propionibacterium freudenreichii) MJ2 균주를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사 이상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 신규의 프로피오니박테리움 프레우덴레키(Propionibacterium freudenreichii) MJ2 균주(수탁번호 KCCM12272P)을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균주는 지방 축적 억제 및 지방세포의 분화 억제; 체중 및 체지방량을 감소; 혈당 증가 억제; 및/또는 혈장 총 콜레스테롤 증가 억제; 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 프레우덴레키 MJ2 균주를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 프레우덴레키 MJ2 균주를 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사 이상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 MJ2 균주는 원유에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 지방 축적을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 지방세포의 분화를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 체중 및 체지방량을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 혈당 증가를 억제하는 것일 수 있으며, 상기 혈당은 공복시 혈당일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 혈장 총 콜레스테롤 증가를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 혈당 증가 및 혈장 총 콜레스테롤 증가는 고지방식이에 의해 유도되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 인슐린 저항성을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨병, 지방간, 및 고콜레스테롤혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질병일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 비만 관련 대사 이상은 비만, 간 또는 혈중 지질 이상, 공복혈당장애, 내당능장애, 고혈당, 및 간 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 증상일 수 있다.
또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 프레우덴레키 MJ2 균주를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대사성 질환의 예방 또는 치료 약제의 제조를 위한 프로피오니박테리움 프레우덴레키 MJ2 균주의 용도를 제공한다.
본 발명의 신규의 프로피오니박테리움 프레우덴레키 MJ2 균주는 비만과 비만 관련 대사 이상의 주요한 원인인 내장 지방의 감소를 촉진하고, 고지방식이에 의해 증가하는 공복 혈당, 혈중 지질, 인슐린, 간 및 지방 조직의 지방 축적을 감소시키고, 간 기능을 개선시키는 효과가 있는바, 상기 MJ 균주를 포함하는 조성물을 이용하여 비만 또는 고지방식이 등으로 유도되는 각종 대사 이상의 예방, 치료, 또는 개선이 가능하다.
또한, 본 발명의 상기 MJ2 균주는 원유로부터 분리되어 인체에 부작용(예를 들어, 간 독성 또는 배변장애)이 없거나 적은 장점이 있고, 경구 투여에 의해서도 지방 조직의 생성 억제를 효과적으로 달성할 수 있어 차세대 기능성 프로바이오틱스(Probiotics) 균주로 제공될 수 있다. 나아가, 본 발명의 상기 MJ2 균주는 항비만 효과를 갖는 것으로 공지된 Lactobacillus plantarum과 비교하여 보다 우수한 항비만 활성을 갖는 바, 기존의 프로바이오틱스 균주를 대체하는 신규의 프로바이오틱스 균주로서 비만 및 이와 관련된 대사 이상의 예방과 치료를 위한 의약용, 의약외용, 식품 첨가물용, 향장소재용 조성물 등 다양한 방면으로 이용될 것으로 기대된다.
도 1a 및 도 1b는 P. freudenreichii MJ2 균주의 동정 결과이다.
도 2는 P. freudenreichii MJ2 균주의 세포 독성 실험 결과 도면이다.
도 3은 P. freudenreichii MJ2의 지방구 및 지방축적 감소 효과를 확인한 도면이다.
도 4는 P. freudenreichii MJ2를 처리한 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제효과를 확인한 도면이다.
도 5는 P. freudenreichii 균주 중에서도 MJ2 strain의 각별한 지방세포 분화 억제 활성을 확인한 도면이다.
도 6은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 체중 증가의 억제 효과와 식이 섭취량의 변화를 확인한 도면이다.
도 7은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 Food efficiency ratio의 변화를 확인한 도면이다.
도 8은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 체형,간 조직, 및 지방 조직의 형태 및 정량동물실험에서 실시예에 따른 각 그룹의 체형, 간, 지방의 실제 형태와 간 및 지방 조직 무게를 정량적으로 비교 확인한 도면이다.
도 9는 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 혈중 총 콜레스테롤(TCHOL: Total cholesterol), 중성지방(TG: triglyceride), 고밀도 지질단백질(HDL: High-density lipoprotein), 및 저밀도 지질단백질(LDL: Low-density lipoprotein)의 변화를 확인한 도면이다.
도 10은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 공복혈당 및 인슐린의 수준과 인슐린 저항성 변화를 비교 확인한 도면이다.
도 11은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 간 기능 지표 효소인 GOT (Glutamate Oxaloacetate Transaminase) 및 GPT(Glutamate Pyruvate Transaminase)의 혈중 변화를 확인한 도면이다.
도 12a 및 도 12b는 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따라 간 조직 내의 축적된 지방이 정상 수준으로 회복됨을 확인한 도면이다.
도 13은 고지방식이에 따라 발생한 간 지방증이 P. freudenreichii MJ2 투여에 따라 완화됨을 확인한 도면이다.
도 14a 내지 도 14c는 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따라 지방조직의 지방세포의 크기가 감소함을 확인한 도면이다.
도 2는 P. freudenreichii MJ2 균주의 세포 독성 실험 결과 도면이다.
도 3은 P. freudenreichii MJ2의 지방구 및 지방축적 감소 효과를 확인한 도면이다.
도 4는 P. freudenreichii MJ2를 처리한 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제효과를 확인한 도면이다.
도 5는 P. freudenreichii 균주 중에서도 MJ2 strain의 각별한 지방세포 분화 억제 활성을 확인한 도면이다.
도 6은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 체중 증가의 억제 효과와 식이 섭취량의 변화를 확인한 도면이다.
도 7은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 Food efficiency ratio의 변화를 확인한 도면이다.
도 8은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 체형,간 조직, 및 지방 조직의 형태 및 정량동물실험에서 실시예에 따른 각 그룹의 체형, 간, 지방의 실제 형태와 간 및 지방 조직 무게를 정량적으로 비교 확인한 도면이다.
도 9는 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 혈중 총 콜레스테롤(TCHOL: Total cholesterol), 중성지방(TG: triglyceride), 고밀도 지질단백질(HDL: High-density lipoprotein), 및 저밀도 지질단백질(LDL: Low-density lipoprotein)의 변화를 확인한 도면이다.
도 10은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 공복혈당 및 인슐린의 수준과 인슐린 저항성 변화를 비교 확인한 도면이다.
도 11은 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따른 간 기능 지표 효소인 GOT (Glutamate Oxaloacetate Transaminase) 및 GPT(Glutamate Pyruvate Transaminase)의 혈중 변화를 확인한 도면이다.
도 12a 및 도 12b는 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따라 간 조직 내의 축적된 지방이 정상 수준으로 회복됨을 확인한 도면이다.
도 13은 고지방식이에 따라 발생한 간 지방증이 P. freudenreichii MJ2 투여에 따라 완화됨을 확인한 도면이다.
도 14a 내지 도 14c는 고지방식이 비만 유도 동물에서 P. freudenreichii MJ2 투여에 따라 지방조직의 지방세포의 크기가 감소함을 확인한 도면이다.
본 발명자들은 기존의 비만 치료제가 가지는 부작용과 한계를 극복하기 위하여 새로운 비만 치료 방법을 연구하였다. 그 결과, 원유에서 분리된 신규의 P. freudenreichii MJ2 균주를 동정하고, 상기 균주가 지방세포의 분화를 억제하고, 과잉 지질의 축적을 감소시키며, 고지방식이에 의한 체중, 혈당, 혈중 콜레스테롤, 및 인슐린 저항성의 증가를 억제하는 활성과 더불어 간 기능의 보호 및 간에 축적되는 지질의 양을 감소시키는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 P. freudenreichii MJ2 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(16S rDNA)의 서열은 서열번호 1로 표시된다.
이에, 본 발명자들은 P. freudenreichii MJ2 균주를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 대사 이상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하며, 상기 대사성 질환 또는 대사 이상은 비만 또는 고지방식이에 의해 유도되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 프로피오니박테리움 프레우덴레키 (Propionibacterium freudenreichii) MJ2 균주는 원유에서 분리하여 동정한 신규의 균주로서, 16s rDNA sequencing (universal primer : 1492R)을 통해 서열을 분석한 결과 P. freudenreichii균으로 확인되였다(실시예 1 참조).
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 MJ2 균주를 3T3-L1 세포에 처리하고 Oil red O 염색을 통해 지방구의 크기를 관찰한 결과, 식염수를 처리한 음성 대조군과 종래 비만 치료용 프로바이오틱 L. plantarum을 처리한 양성 대조군보다 상기 MJ2 균주를 처리한 경우의 지방 축적이 현저하게 감소됨을 확인하였으며, 보다 구체적으로 처리한 MJ2 균주의 농도 의존적으로 지방 축적이 감소됨을 확인하였다(실시예 3 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 P. freudenreichii MJ2 균주와 동일한 종의 상이한 strain에 속하는 P. freudenreichii KCTC 1063를 각각 지방전구세포에 처리하여 지방세포로의 분화 정도를 관찰한 결과, 지방전구세포에 처리한 MJ2 균주의 농도 의존적으로 지방세포 분화 마커의 발현이 감소되었으며, 상기 MJ2 균주에 의한 지방세포 분화 억제의 정도는 상기 KCTC 1063 균주보다 현저하게 큰 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 MJ2 균주의 프로바이오틱스로서의 항비만 효과를 평가하기 위하여, 식이성 비만 유도 마우스 모델을 이용하여 실험을 진행하였다. 구체적으로 정상식이군, 고지방식이군, MJ2 균주 처리군, 사균-MJ2 균주 처리군, 및 L. plantarum 처리군으로 분류하여 체중변화를 측정한 결과, 생균 및 사균 MJ2 처리에 의한 고지방식이 비만 유도 마우스의 체중 증가 억제 효과가 뛰어남을 확인하였고, 나아가 상기 각 군의 마우스의 하루 평균 식이 섭취량의 비교를 통해 상기 체중 증가 억제의 효과는 사료섭취량 감소에 의함이 아님을 확인하였고, 상기 각 군의 마우스의 간과 지방의 무게 측정 결과 생균 및 사균 MJ2 처리군은 대조군과 비교하여 지방과 간의 무게가 유의하게 감소하였는바, 상기 MJ2 균주는 고지방식이에 따른 간 및 지방의 중량 증가를 효과적으로 억제함을 확인하였다(실시예 5 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 고지방식이 비만 유도 마우스의 혈당, 혈중 콜레스테롤, 간 기능 지표 효소인 GOT 및 GPT, 및 인슐린 저항성의 지표인 HOMA-IR을 측정한 결과, 고지방식이에 의해 증가하는 혈당, 혈중 콜레스테롤, 및 HOMA-IR의 수준이 MJ2 균주의 처리에 따라 일반 식이군 수준으로 회복하고, 간 기능 지표 효소인 GOT 및 GPT의 관찰 결과를 통해 MJ2 균주가 간 기능 보호에 우수한 효과가 있음을 확인하였다(실시예 6 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 고지방식이 비만 유도 마우스의 간 및 지방 조직을 분리하여 그 형태학적 변화를 관찰한 결과, 상기 MJ2 균주의 처리에 따라 고지방식이에 의한 간 조직의 지방 축적 증가가 감소되며, 고지방식이에 의한 지방세포의 크기 증가가 MJ2 균주 처리에 의해 일반 식이군 수준으로 회복됨을 확인하였다(실시예 7 참조).
따라서, 본 발명의 실시예 결과를 통하여, P. freudenreichii MJ2는 지방 축적 감소 및 지방세포 분화 억제 효과가 있으며, 나아가 고지방식이 급여로 인한 혈당, 혈중 총 콜레스테롤, 및 인슐린 저항성의 증가를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었는바, 본 발명의 P. freudenreichii MJ2 균주는 비만의 예방 또는 치료에 나아가 혈중 지질 이상, 공복혈당장애, 내당능장애, 고혈당 등의 대사 이상 증상의 완화 및 개선의 용도에 이용될 수 있으며, 제2형 당뇨병, 심혈관계 죽상경화, 고혈압 등을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 이때, 상기 대사성 질환은 비만에 의해 유도되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 P. freudenreichii MJ2 균주는 간에 독성이 없으면서도 고지방식이에 따른 간 조직의 지방구 축적 및 그 크기의 증가를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였는바, 상기 MJ2 균주는 지방간의 예방 또는 치료에 효과적일 수 있으며, 본 발명에서 지방간이란 지방의 과도한 섭취나 내인적 간내 지방합성 증가 또는 그 배출이 감소되는 등의 원인으로 간 조직 내의 지방이 과도하게 축적되는 것이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 지방의 과도한 섭취에 의한 비알콜성 지방간을 의미한다.
본 발명에서 “개체”란 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에서 예방이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 지방조직의 비대, 지방 축적, 또는 그에 따른 대사 이상을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 치료란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 비만과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 비만 또는 고지방식이에 의해 유도되는 대사 이상과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 “비만 관련 대사 이상(obesity-associated metabolic disorders)”이란 비만 또는 고지방식이로부터 유래되는 포도당, 지방, 단백질 등의 대사 이상에서 기원하는 증상을 말하며, 주로 포도당과 지방대사의 이상으로 유발되는 비만, 간 및 혈중 지질 이상, 공복혈당장애, 내당능장애, 고혈당, 및 간 손상 등을 통칭하며, 보다 구체적으로 '간 손상'이란 간(liver)이 외인적 또는 내인적 요인에 의해 그 기능을 다하지 못하는 것을 의미하며, '혈중 지질 이상'이란 정상 상태보다 혈중 총 콜레스테롤, 저밀도 지질단백질-콜레스테롤, 또는 중성지방이 증가하거나 고밀도 지질단백질-콜레스테롤이 감소하는 것을 의미하며, '간 지질 이상'이란 간내의 중성지방이 축적되는 것을 의미하고, '고혈당'이란 혈당이 증가하는 현상을 의미한다. 한편, '공복혈당장애'란 공복시 혈당이 100 mg/dL 이상인 경우를 의미하고, '내당능장애'란 포도당 내성을 담당하는 인슐린의 분비 또는 작용에 장애가 발생한 경우 및 인슐린에 대한 길항호르몬의 과잉을 의미하는 것으로서, 상기 공복혈당장애 및 내당능장애는 당뇨병의 전단계 증상으로 이해된다.
본 발명에서 “체지방”이란 신체를 구성하는 지방조직을 의미하며 피하조직, 유선, 및 신장주위 등에 널리 분포하고, 저장지방으로 에너지에 이용되는 것 이외에 내장 보호와 체온 조절기능을 한다. 저장지방이 과잉으로 축적된 상태를 비만이라고 하며 비만에서는 합병증 예방 관점에서 체중보다 체지방의 양이 중요시된다. 피하지방보다 복강 내 내장지방의 축적이 당, 지질대사이상, 고혈압, 및 관상동맥질환과의 관련이 깊다고 알려져 있다. 본 발명에서 체지방은 피하지방과 내장지방을 모두 포함한다.
본 발명에서 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 "담체(carrier)"란 비이클(vehicle)이라고도 불리며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
또한, 본 발명에 따른 P. freudenreichii MJ2를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은 P. freudenreichii MJ2를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 또한, P. freudenreichii MJ2는 비만 또는 비만 관련 대사 이상 증상의 개선을 목적으로 식품에 첨가될 수 있다. 본 발명에 있어서 식품은 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함한다. 본 발명의 P. freudenreichii MJ2를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 P. freudenreichii MJ2를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 P. freudenreichii MJ2 는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실험방법 및 재료]
1. 세포 배양
P. freudenreichii MJ2는 경기도 김포 목장으로부터 조달한 raw milk에서 single colony를 3회 purification 하는 과정을 통해 후보균주를 선정한 뒤, 16s rDNA sequencing을 이용해 동정한 균으로 RCM (Reinforced Clostridial medium broth, Thermo Fishier scientific, Waltham, MA, USA) 배지에서 GasPak (BD, Franklin Lakes, NJ, USA)을 이용하여 37 ℃ 환경에서 48시간 동안 배양하였다. 원심분리로 균을 회수 후 생리식염수로 2회 세척한 후 80 ℃에서 30분간 사균 처리하였다. Reference로 사용한 P. freudenreichii KCTC 1063 균주도 상기와 동일한 방법에 따라 배양 및 사균 처리 후 사용하였다.
3T3-L1 preadipocyte (지방전구세포) (American Type Culture Collection, USA)는 10% BCS (bovine calf serum) 및 1% 항생제 (penicillin-streptomycin)를 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) 배지(HyClone, Logan, UT, USA)를 이용하여 5% CO2, 37℃ 환경에서 배양하였다. 2일마다 신선한 배지로 교환하여 배양하면서 지방구 축적 억제 및 지방세포로의 분화 억제 시험을 실시하였다.
2. 세포 독성 시험 (MTT assay)
세포 독성 시험을 위해 사용된 MTT assay는 살아있는 세포가 대사활동을 통해 tetrazolium salt를 분해하면 생성되는 formazan의 생성 정도를 흡광도를 이용해 측정하는 방법으로 세포의 생존 지표로 사용하였다. 3T3-L1 세포를 5 × 104 cells/well 의 농도로 96 well plate에 접종 후 24시간 배양하였다. 그리고 배지에 P. freudenreichii MJ2를 첨가하고 24시간 후에 MTT 시약 (DAEJUNG, Siheung, Korea)을 이용하여 세포 생존을 측정하였다. 흡광도는 microplate reader (SpectraMax 340PC, Molecular Devices, CA, USA)를 이용해 측정하였다.
3. 지방구 축적 시험
3T3-L1 세포를 지방세포로 유도하기 위해 10% FBS (Fetal bovine serum) 및 1% 항생제 (Penicillin-streptomycin)를 포함하는 DMEM 배지에 MDI(5 μg/mL insulin, 0.5 mM IBMX 및 1.0 μM dexamethasone)를 처리하고 동시에 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2를 처리한 뒤 2일간 분화를 유도하였다. 분화 유도된 3T3-L1 세포를 생리식염수로 세척 후 10% 포르말린으로 1시간 고정시켰다. 고정된 세포를 ddH2O로 2회 세척 후 60% 이소프로파놀에 5분간 처리 후 Oil Red O 용액 (60% 이소프로파놀에 용해)으로 30분간 염색하였다. 염색 후 ddH2O로 4회 세척 후 현미경으로 세포를 관찰하고 100% 이소프로파놀 용액으로 탈염색시켜 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. 지방세포 분화 관련 유전자 발현 측정
분화 유도된 세포로부터 총 mRNA를 AccuZol reagent (Bioneer, Daejun, Korea)를 사용하여 추출 후 NanoDrop (ND-1000, Thermo Scientific)으로 정량하였다. mRNA 1 μg을 Revert Aid First Strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 역전사시켜 cDNA를 제조 하였다. Quantitative RT-PCR (qPCR)은 StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 기기를 이용하여 수행하였으며 qPCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다. PCR 반응은 95℃에서 10분 반응 시킨 후 95 ℃에서 15초, 60 ℃에서 15초, 72 ℃에서 20초간 반응을 40회 반복하였다. ATPF1 (ATP synthase F1 complex) 유전자를 endogenous control로 사용하였으며, 분화를 유도하고 아무것도 처리하지 않은 sample (Differentiation control)의 유전자 발현량을 1로 상대정량(2-ΔΔCt method)하였다.
| Gene | Primer | Sequence |
| PPAR γ | Forward | 5' AGA CAT CAG CGC CTA CAT CG 3' |
| Reverse | 5' GCT CCC GGG TAG TCA AAG TC 3' | |
| C/EBP α | Forward | 5' TGG ACA AGA ACA GCA ACG AG 3' |
| Reverse | 5' TCA CTG GTC AAC TCC AGC AC 3' | |
| FAS | Forward | 5' GCT GCT GTT GGA AGT CAG C 3' |
| Reverse | 5' AGT GTT CGT TCC TCG GCG TG 3' | |
| SCD-1 | Forward | 5' TGA CTA TCA TCA TGC CGG CC 3' |
| Reverse | 5' CTT TGA CAG CCG GGT GTT TG 3' | |
| ACC | Forward | 5' TGA CCG TGG GCA CAA AGT T 3' |
| Reverse | 5' AGG AGG AAC CGC ATT TAT CGA 3' | |
| ATPF1 | Forward | 5' TG GCG ACA GGC TGG ACT CAG 3' |
| Reverse | 5' GC TGC CCG AAG TCT TCT CAG CG 3' |
5.
P. freudenreichii
MJ2 투여에 의한 체중 변화 측정
4주령 C57BL6(주식회사 코아텍, 수컷)를 사용하였다. 일정한 온도 24 ± 1 ℃와 습도 55%에서 사육하였으며, 모든 동물은 물과 사료에 자유롭게 접근할 수 있게 하였으며, 고려대학교 동물윤리위원회 승인(KUIACUC-2018-0007)을 받아 진행하였다. 구입한 후 1주간 적응기를 지낸 뒤, 그룹별(n=6)로 무작위로 배분하였으며 다음과 같은 그룹으로 실험을 진행하였다. 일반식이 대조군(NFD; normal fat diet), 고지방식이 대조군(HFD; high fat diet), live P. freudenreichii MJ2 처리군(MJ2), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 처리군(hkMJ2: heat-kill MJ2), 양성대조군으로 사용된 live L. plantarum 처리군(LP)으로 그룹을 나눴다. 음성대조군을 제외한 나머지 그룹은 6주간 고지방식이를 통해 비만을 유발하였고, 7주차부터 8주간 각 시험 물질을 투여하였다. 일반식이 대조군(일반식이, 10% 지방 칼로리, D12450B Research diet)과 고지방식이 대조군 및 시험 물질 투여군(60% 지방 칼로리, D12492 Research diet)은 매일 1회 경구 투여를 실시하였다. 각 시험 물질 투여군은 P. freudenreichii MJ2 108 CFU/㎖, 열처리한 P. freudenreichii MJ2 108 CFU/㎖, L. plantarum 108 CFU/㎖를 투여하였으며 일반식이 대조군 및 고지방식이 대조군은 생리식염수를 사용하였다. 체중과 식이 섭취량은 일주일 간격으로 측정하였으며 Food efficiency ratio는 '증가 체중(g/day) / 식이 섭취량(g/day)'으로 계산하였다.
6.
P. freudenreichii
MJ2를 투여한 비만 쥐에서의 혈액학적 분석
15주간의 실험 종료 후, 채혈 전 24시간 동안 금식하였으며, 심장 채혈을 통해 SST gel tube에 채취한 혈액을 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 획득하였다. 상기 획득된 혈청은 FUJI DRY-CHEM 4000i(FUJIFILM Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 GOT(Aspartate aminotransferase), GPT(Alanine transaminase), TCHO(Total cholesterol), TG(Triglyceride), HDL(High-density lipoprotein)의 혈액 내 변화를 분석하였고, LDL(Low-density lipoprotein)은 'LDL=[TC-(HDL+(TG/5))' 식으로 계산하였다. Ultrasensitive mouse insulin ELISA kit (Crystal Chem, Elk Grove Village, IL, USA)을 이용해 공복 인슐린을 측정하였고 전혈로 Accu-chek (Roche diabetes care GmbH, Mannheim, Germany)을 이용하여 공복 혈당을 측정하였으며 공복 혈당과 공복 인슐린을 이용하여 인슐린 저항성의 간접 지표인 HOMA-IR을 HOMA Calculator v2.2.3을 이용하여 계산하였다.
7.
P. freudenreichii
MJ2를 투여한 비만 쥐에서의 조직학적 분석
각 그룹별 간과 부고환 지방은 채취하는 즉시 10% 포르말린으로 고정하였다. 간의 Oil red O 염색은 액체 질소로 동결시킨 조직을 5 μm로 박절하여 Distilled water로 수세한 뒤, Propyloene glycol와 Oil red O 용액으로 염색하였다. 염색 후 다시 수세한 뒤, Mayer's hematoxylin 용액으로 염색하였다. 지방의 H&E 염색은 Xylene과 다양한 농도의 Alcohol로 탈수와 함수를 진행하였으며 Hematoxylin, Eosin 용액을 이용해 염색하였다. 염색 후 조직 표본은 200 배율에서 관찰되었으며 Image J (Softonic, Barcelona, Spain)를 이용하여 지방의 양과 지방조직의 세포 크기를 측정하였다.
6. 통계 처리
통계 분석은 SigmaPlot Version 10.0 및 SPSS version 21를 이용하여 수행하였다. One-way analysis of variation(ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과 유의한 차이가 있는 시험군을 확인하기 위해 Tukey HSD를 실시하였다(p < 0.05).
[실험 결과]
실시예 1.
P. freudenreichii
MJ2의 분리 및 동정
P. freudenreichii MJ2의 분리 및 동정을 위해 경기도 김포 목장으로부터 조달된 raw milk에서 NGS (next generation sequencing) 방법으로 P. freudenreichii균이 있음을 확인 후 VELA medium을 사용하여 30 ℃, anaerobic condition에서 7일간 배양한 뒤, single colony를 purification 과정을 통해 후보균주를 선정하여 16s rDNA sequencing (universal primer : 1492R)을 이용하여 P. freudenreichii MJ2를 동정하였다(도 1a 및 도 1b 참조).
실시예 2.
P. freudenreichii
MJ2의 세포독성 확인
P. freudenreichii MJ2의 세포 독성을 평가하기 위해 3T3-L1 세포가 대사활동으로 생성해 낸 formazan의 양을 지표로 이용하였다. 3T3-L1 세포에 P. freudenreichii MJ2를 농도별로 가한 후 formazan 유리 정도를 측정한 결과, 105 CFU/㎖ (98.6 ± 1.6%), 106 CFU/㎖ (102.5 ± 2.3%), 107 CFU/㎖ (103.3 ± 6.7%), 108 CFU/㎖ (108.6 ± 3.1%)에서 모두 대조군 (100%)과 비교하였을 때, 유의적인 변화가 없었다(도 2 참조). 상기로부터 P. freudenreichii MJ2는 사용한 농도범위내에서 세포 독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3.
P. freudenreichii
MJ2 투여에 따른 지방구 축적 억제 효과 확인
P. freudenreichii MJ2의 지방구 축적 억제 활성을 평가하기 위해 3T3-L1 세포를 MDI (insulin, dexamethasone, 및 isobutylmethylxanthin)로 분화 유도 후 ORO(Oil Red O) 염색 후 관찰한 결과 MDI로 분화가 유도된 것을 NDC (Non differentiation control)를 통해 확인하였고 P. freudenreichii MJ2 처리군에서 농도의존적으로 지방구가 현저히 감소하는 것이 관찰되었으며 양성대조군으로 사용된 L. plantarum 처리군보다 지방구가 현저히 감소하는 것을 관찰하였다(도 3 참조). 또한 지방에 대해 정량적 측정의 결과 용매로 사용된 생리식염수만 처리한 시료 결과를 100%로 하여 환산한 결과 P. freudenreichii MJ2를 107 CFU/㎖ (67.2 ± 8.2%), 108 CFU/㎖ (53.2 ± 9.6%) 처리한 그룹에서 지방축적이 감소하였다 (도 3 참조). 양성대조군으로 사용한 L. plantarum은 107 CFU/㎖ (98.7 ± 12%), 108 CFU/㎖ (91.8 ± 5.9%)를 보여 P. freudenreichii MJ2가 더 우수한 지방축적 억제 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4.
P. freudenreichii
MJ2 투여에 따른 지방세포 분화 억제 효과 확인
P. freudenreichii MJ2의 지방세포 분화에 관련된 유전자의 발현 저하 활성을 평가하기 위해 3T3-L1 세포를 MDI로 분화 유도 후 유전자 발현을 qPCR 분석을 수행한 결과 Adipogenesis와 관련된 peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPAR γα (C/EBP α), Lipogenesis와 관련된 Acetyl-CoA carboxylase (ACC), Fatty acid synthase (FAS), Stearoyl-CoA desaturase (SCD-1) 모두 P. freudenreichii MJ2 처리 농도의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었다(도 4 참조). 용매로 사용된 생리식염수만 처리한 시료 결과를 1로 환산하여 상대적인 유전자 발현을 비교한 결과, PPAR γ의 경우 106 CFU/㎖ (0.51 ± 0.24), 107 CFU/㎖ (0.45 ± 0.15), 108 CFU/㎖ (0.19 ± 0.05)로 감소하였고, C/EBPα의 경우 106 CFU/㎖ (0.51 ± 0.25), 107 CFU/㎖ (0.44 ± 0.1), 108 CFU/㎖ (0.19 ± 0.04)로 감소함을 보였다 (도 4 참조). 또한 FAS의 경우 106 CFU/㎖ (0.54 ± 0.24), 107 CFU/㎖ (0.47 ± 0.23), 108 CFU/㎖ (0.25 ± 0.06)로 감소하였고, ACC의 경우 106 CFU/㎖ (0.78 ± 0.28), 107 CFU/㎖ (0.63 ± 0.79), 108 CFU/㎖ (0.51 ± 0.2)로 감소하였으며, SCD-1의 경우 106 CFU/㎖ (0.88 ± 0.15), 107 CFU/㎖ (0.55 ± 0.04), 108 CFU/㎖ (0.33 ± 0.19)로 감소함을 보였다(도 4 참조).
P. freudenreichii MJ2와 reference P. freudenreichii KCTC 1063의 항비만 효과 비교를 위해 동일한 조건으로 분화를 유도하고 유전자 발현을 qPCR 분석한 결과, PPAR γ와 SCD-1의 발현 감소에 있어 MJ2 균주가 KCTC 1063 보다 유의하게 상기 분화 마커의 발현 감소 폭이 큼을 알 수 있었다. 구체적으로, PPAR γ의 경우 MJ2 (0.15 ± 0.03), KCTC (0.39 ± 0.15)로 감소하였으며, SCD-1의 경우 MJ2 (0.23 ± 0.04), KCTC (0.40 ± 0.07)로 감소함을 보였다(도 5 참조).
실시예 5.
P. freudenreichii
MJ2 투여에 따른 체중 증가 억제 효과 확인
실시예와 같이 일반식이 대조군, 고지방식이 대조군, 각 시험물질 투여군의 체중 변화와 식이 섭취량을 일주일 단위로 측정하였을 때, 최종 체중이 일반식이 대조군 (30.3 ± 0.9 g), 고지방식이 대조군 (43.7 ± 1.9 g), P. freudenreichii MJ2 (34.8 ± 0.9 g), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (36.8 ± 0.9 g), L. plantarum (38.5 ± 0.8 g)으로 시험물질 투여군에서 전체적으로 체중이 낮은 것을 확인할 수 있었고, 특히 P. freudenreichii MJ2 투여군에서 가장 낮은 체중 증가를 확인할 수 있었다(도 6 참조).
한편, 하루 평균 식이 섭취량의 경우에는 일반식이 대조군 (2.4 ± 0.1 g/day), 고지방식이 대조군 (2.2 ± 0.1 g/day), P. freudenreichii MJ2 (2.3 ± 0.2 g/day), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (2.2 ± 0.2 g/day), L. plantarum (2.3 ± 0.1 g/day)으로 그룹간에 큰 차이를 보이지 않았다(도 6 참조).
상기로부터, P. freudenreichii MJ2는 고지방 식이에 의한 체중 증가를 억제하고, 상기 체중 증가 억제는 사료섭취량의 감소에 의함이 아님을 확인할 수 있었다.
또한, Food efficiency ratio의 경우 일반식이 대조군 (6.5 ± 0.3%), 고지방식이 대조군 (12.7 ± 0.9%), P. freudenreichii MJ2 (8.5 ± 0.4%), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (10 ± 0.5%), L. plantarum (10 ± 0.5%)로 고지방식이 대조군과 비교하여 모든 그룹에서 유의하게 감소하였다(도 7 참조).
간과 지방의 무게도 일반식이 대조군 (간: 0.96 ± 0.05 g, 지방: 1.09 ± 0.04 g), 고지방식이 대조군 (간: 1.63 ± 0.16 g, 지방: 2.97 ± 0.13 g), P. freudenreichii MJ2 (간: 0.87 ± 0.05 g, 지방: 2.06 ± 0.15 g), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (간: 0.94 ± 0.03 g, 지방: 2.54 ± 0.11 g), L. plantarum (간: 0.97 ± 0.05 g, 지방: 2.69 ± 0.18 g)으로 고지방식이 대조군과 비교했을 때, 유의하게 감소하였다(도 8 참조).
실시예 6.
P. freudenreichii
MJ2 투여에 따른 혈중 콜레스테롤, 혈당, 인슐린 저항성 지표 인자, 및 간독성 지표 인자 지수의 변화 확인
비만이 유도된 쥐에게 시험물질을 투여한 결과 혈액 내 콜레스테롤, 글루코오스, 간독성 관련 인자를 상기 실험방법 5와 같이 분석한 결과, 양성 대조군에 비해서 혈중 총 콜레스테롤(TCHO) 양이 일반식이 대조군 (169.2 ± 16.8 mg/dl), 고지방식이 대조군 (242.3 ± 16.1 mg/dl), P. freudenreichii MJ2 (172.1 ± 15.6 mg/dl), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (201.7 ± 11.7 mg/dl), L. plantarum (196.5 ± 13.6 mg/dl)으로, MJ2 투여에 따라 혈중 총 콜레스테롤이 감소함을 확인할 수 있었다.
또한, LDL(저밀도 지질단백질)의 전체 지방에서의 비중이 일반식이 대조군 (16.9%), 고지방식이 대조군 (20.0%), P. freudenreichii MJ2 (17.8%), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (21.8%), L. plantarum (19.7%)로, MJ2에 따라 전체 지방에서 LDL의 비중이 감소함을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
공복 혈당의 경우 일반식이 대조군 (139.7 ± 4.1 mg/dl), 고지방식이 대조군 (212 ± 19.9 mg/dl), P. freudenreichii MJ2 (156.7 ± 3.8 mg/dl), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (171 ± 4.2 mg/dl), L. plantarum (201.3 ± 15 mg/dl)이며, 공복 인슐린의 경우 일반식이 대조군 (0.32 ± 0.02 ng/ml), 고지방식이 대조군 (1.46 ± 0.11 ng/ml), P. freudenreichii MJ2 (0.63 ± 0.05 ng/ml), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (0.92 ± 0.01 ng/ml), L. plantarum (0.62 ± 0.005 ng/ml)으로 측정되어, MJ2 투여에 따라 공복시 혈당 및 인슐린 모두 고지방식이 대조군과 비교했을 때 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 MJ2 균주를 투여한 그룹에서 유의하게 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조).
한편, 인슐린 저항성을 간접적으로 나타내는 지표인 HOMA-IR 결과값 또한 음성대조군 (1.3 ± 0.1), 고지방식이 대조군 (6.3 ± 0.3), P. freudenreichii MJ2 (2.6 ± 0.2), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (3.8 ± 0.05), L. plantarum (2.7 ± 0.1)으로 고지방식이 대조군에서 인슐린 저항성이 강하게 나타났으며 시험물질 투여 그룹에서는 인슐린 저항성이 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조).
또한, 혈중 간 기능 지표 효소인 GOT 및 GPT의 경우 일반식이 대조군 (GOT: 108.2 ± 13.3 U/L, GPT: 34.2 ± 7.3 U/L), 고지방식이 대조군 (GOT: 165.8 ± 4.5 U/L, GPT: 134.7 ± 15.5 U/L), P. freudenreichii MJ2 (GOT: 91.5 ± 5.7 U/L, GPT: 32.3 ± 3.2 U/L), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (GOT: 94.5 ± 9.0 U/L, GPT: 45.3 ± 3.6 U/L), L. plantarum (GOT: 136 ± 15.8 U/L, GPT: 60.3 ± 9.0 U/L)로 일반식이 대조군과 비교했을 때, 시험물질 투여 그룹에서 감소된 것을 확인하였며, 특히 MJ2 균주를 투여한 그룹에서 간 독성 지표 인자가 유의하게 크게 감소한 것을 확인하였다(도 11 참조).
상기로부터, MJ2 균주의 투여에 의해 고지방 식이에 따라 증가하는 혈당 및 혈중 콜레스테롤 감소 효과, 간 기능 보호 효과, 인슐린 저항성 감소 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7.
P. freudenreichii
MJ2 투여에 따른 간 조직 및 지방 조직의 형태학적 변화 확인
간 및 지방조직의 조직학적 검사의 결과로써, 간에서 Oil red O 염색을 통해 지방이 시험물질 투여에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었으며 배경 염색으로 사용된 Mayer's hematoxylin 염색을 통해 간의 조직학적 손상 정도를 육안으로 비교하였다. Oil red O 염색의 정량적 측정값은 일반식이 대조군 (2.7 ± 0.6%), 고지방식이 대조군 (20.7 ± 0.9%), P. freudenreichii MJ2 (4.2 ± 0.5%), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (7.2 ± 0.9%), L. plantarum (4.9 ± 0.6%)으로 고지방식이 대조군과 비교하였을 때, 간내 지방이 시험물질을 처리한 모든 그룹에서 크게 감소함을 확인하였다(도 12a 및 도 12b 참조).
또한, 간조직 염색 결과 간 지방증 중 세포내 과잉 지질에 의해 세포질에 쌓인 지질이 핵을 누르는 Macrovesicular steatosis이 진행된 것을 고지방식이 대조군에서 확인할 수 있었고 그에 비하여 시험물질 투여군에서는 간 지방증이 완화된 것을 확인할 수 있었다(도 13 참조).
또한, 지방조직의 hematoxylin & eosin (H&E) 염색 결과 지방세포의 크기는 일반식이 대조군 (11396 ± 508 μm2 × 103), 고지방식이 대조군 (40050 ± 1634 μm2 × 103), P. freudenreichii MJ2 (18615 ± 874 μm2 × 103), 사균 처리한 P. freudenreichii MJ2 (26441 ± 1032 μm2 × 103), L. plantarum (30739 ± 1478 μm2 × 103)으로 고지방식이 대조군에 비하여 모든 시험물질 투여군이 감소하였으며, 특히 P. freudenreichii MJ2의 지방세포 크기는 다른 시험물질 투여군과 비교하였을 때도 유의하게 감소한 것을 확인하였다(도 14a 내지 도 14c 참조).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Buisness Foundation
<120> A composition for preventing, treating, or improving metabolic
syndrome and obesity-related metabolic syndrome comprising the
Propionibacterium freudenreichii MJ2 strain as an active
ingredient
<130> DHP19-171
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1242
<212> DNA
<213> Propionibacterium freudenreichii MJ2_16S rDNA
<400> 1
tgaattaagt tccaccttcg acggctcccc ccaaaaggtt gggccaccgg cttcgggtgt 60
taccgacttt catgacttga cgggcggtgt gtacaagccc cgggaacgta ttcaccgcag 120
cgttgctgat ctgcgattac tagcgactcc gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa 180
tccgaactga gaccggcttt ctgagattcg ctcaccctca caggctcgca actctttgta 240
ccggccattg tagcatgcgt gaagccctgg acataagggg catgatgact tgacctcatc 300
cccaccttcc tccgagttgg ccccggcggt ctccaatgag tccccagccg aactgctggc 360
aacattggac gagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct 420
gacgacagcc atgcaccacc tgtgtaccag ccaaaaaggc acgcccatct ctgaacgctt 480
ccagtacatg tcaaacccag gtaaggttct tcgcgttgca tcgaattaat ccgcatgctc 540
cgccgcttgt gcggggcccc gtcaattcct ttgagtttta gccttgcggc cgtactcccc 600
aggcggggta cttaatgcgt tagctacggc acggaccccg tggaagggac ccacacctag 660
tacccaccgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaagc ctgtttgctc cccacgcttt 720
cgcttctcag cgtcaggaaa tgtccagaga accgccttcg ccactggtgt tcttcccgat 780
atctgcgcat tccaccgctc caccgagagt tccattctcc cctacattcc tcaagtcaac 840
ccgtatcgaa agcaagccca gagttaagcc ctggaatttc acttccgacg tgatcaaccg 900
cctacaagct ctttacgccc aataattccg gacaacgctc gcaccctacg tatcaccgcg 960
gctgctggca cgtagttagc cgggtgcttc ttctccccac taccgtcact tgcgcttcgt 1020
catggatgaa agcggtttac acccgaaagg ccgtcatccc gcacgcggcg ttgctgcatc 1080
aggcttggcg cccattggtg catattcccc cactgctgcc tcccgtaagg agtctggacc 1140
gtatcctcag tccaatggtg gctgttcacc cttctcagcg cctaccgtgc tgccttgtag 1200
acaataccca cacagctgaa ttgtccggcg agaaacgaat tc 1242
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPAR-gamma_primer_F
<400> 2
agacatcagc gcctacatcg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPAR-gamma_primer_R
<400> 3
gctcccgggt agtcaaagtc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C/EBP-alpha_primer_F
<400> 4
tggacaagaa cagcaacgag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C/EBP-alpha_primer_R
<400> 5
tcactggtca actccagcac 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAS_primer_F
<400> 6
gctgctgttg gaagtcagc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAS_primer_R
<400> 7
agtgttcgtt cctcggcgtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SCD-1_primer_F
<400> 8
tgactatcat catgccggcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SCD-1_primer_R
<400> 9
ctttgacagc cgggtgtttg 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACC_primer_F
<400> 10
tgaccgtggg cacaaagtt 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACC_primer_R
<400> 11
aggaggaacc gcatttatcg a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATPF1_primer_F
<400> 12
tggcgacagg ctggactcag 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATPF1_primer_R
<400> 13
gctgcccgaa gtcttctcag cg 22
Claims (14)
- 지방 축적 억제 및 지방세포의 분화 억제; 체중 및 체지방량 감소; 혈당 증가 억제; 또는 혈장 총 콜레스테롤 증가 억제; 효과를 갖는 프로피오니박테리움 프레우덴레키(Propionibacterium freudenreichii) MJ2 균주(수탁번호 KCCM12272P).
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 프로피오니박테리움 프레우덴레키 MJ2 균주.
- 프로피오니박테리움 프레우덴레키(Propionibacterium freudenreichii) MJ2 균주(수탁번호 KCCM12272P)를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨병, 지방간, 및 고콜레스테롤혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질병인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 조성물은 지방 축적을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 조성물은 지방세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 조성물은 체중 및 체지방량을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 조성물은 혈당 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 조성물은 혈장 총 콜레스테롤 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 프로피오니박테리움 프레우덴레키(Propionibacterium freudenreichii) MJ2 균주(수탁번호 KCCM12272P)를 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사 이상의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
상기 비만 관련 대사 이상은 비만, 간 또는 혈중 지질 이상, 공복혈당장애, 내당능장애, 고혈당, 및 간 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 증상인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 조성물은 지방 축적을 억제하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 조성물은 지방세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 조성물은 체중 및 체지방량을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 조성물은 혈당 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 조성물은 혈장 총 콜레스테롤 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
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| KR20100119875A (ko) * | 2008-03-07 | 2010-11-11 | 유키지루시 뉴교 가부시키가이샤 | 아디포넥틴의 분비 촉진 및/또는 감소 억제용 제제 |
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-
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Non-Patent Citations (2)
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