KR102145623B1 - 내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법 - Google Patents

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Abstract

내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법에 관한 것으로, 상기 정량분석 방법은, 단 한종의 내부표준물질인 플루오레세인만을 사용하여, 시료내의 다양한 페놀산 화합물을 개별적으로 분리 및 분석할 수 있는 바, 분류를 원하는 모든 물질에 대하여 개별적으로 표준물질을 사용해야만 하는 기존 페놀산 화합물의 정량분석 방법과 달리, 미지 성분 또는 알려진 성분에 구애받지 않고, 페놀산 화합물을 동시에 정량분석할 수 있다. 또한, 고성능액체크로마토그라피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 분석장비로 사용함으로서 수십 수백개의 시료를 분석할수 있으며 분석된 모든 시료에서 나타나는 페놀화합물의 정량값은 내부표준물질을 기준으로 분석값이 자동 또는 일괄적으로 환산이 가능한 장점이 있다.

Description

내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법{Quantitative analysis method of Phenolic acid compounds using internal standard method}
내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법에 관한 것이다.
식물과 식품 등에 널리 존재하는 폴리페놀물질들은 식물체 및 인체의 항산화 효과 및 방어 기작 등의 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다.
일반적으로, 페놀 화합물은 한개 또는 두개 이상의 수산기로 치환된 방향족 환을 가지고 있는 물질로서, 페놀산(phenolic acid) 및 쿠마린류, 플라보노이드류 그리고 탄닌류로 나누며, 그 구조에 따라 이화학적 성질 및 생리적 기능이 달리 나타난다. 이러한 페놀 물질들은 식물체에 특수한 색깔을 부여하고 산화-환원반응 시 기질로 작용하며, 미생물의 공격을 막아 식물 자체를 포호하는 동시에 식품 등에서 떫은 맛, 쓴 맛과 같은 식물성 식품의 고유한 맛에 관계한다.
식물 및 식품에 포함되어 있는 페놀 화합물은 다양한 형태로 존재하며, 또 양에 있어서도 많은 차이를 보여 정성 및 정량 분석 시 어려운 점이 많다.
한편, 일반적으로 내부표준법이란 외부표준법과 대비되는 방법으로서 크로마토그라피라는 분석장비를 사용하여 특정 화합물을 정량시에 전처리가 완료된 시료를 장비에 주입할 때 생길수 있는 시료간의 주입오차를 보정하기 위해서 활용되는 방법이다.
이에, 본 발명자는, 페놀 화합물 중에서도 페놀산 화합물을 정량 분석할 수 있는 방법을 개발하던 중, 내부표준법, 구체적으로는, 플루오레세인(fluorescein)을 내부표준물질로하여, 내부표준물질만을 투여하는 것으로, 시료 내의 페놀산 화합물을 동시에 정량 분석가능함을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.
Korean journal of crop science v.49 suppl.1, 2004년, pp.43 - 50
본 발명의 일 목적은, 플루오레세인을 내부표준물질로 하여, 페놀산 화합물을 정량분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에 따라,
하기 단계를 포함하는 내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법이 제공된다:
하나 이상의 페놀산 화합물이 포함된 시료와 내부표준물질 플루오레세인(fluorescein)을 혼합하여 분석을 위한 혼합시료를 제조하는 단계(단계 1);
상기 혼합시료를 액체 크로마토그래피를 수행하여 흡광도 분석을 통해 혼합시료 내 페놀산 화합물을 분리 분석하는 단계(단계 2);
상기 분석 결과로부터 시료에 포함된 페놀산 화합물과 플루오레세인이 검출되는 지점의 상대적인 거리 및 질량분석을 통해 개별 페놀산 화합물을 동정하는 단계(단계 3); 및
플루오레세인의 투입량을 기준으로 상기 동정된 개별 페놀산 화합물의 함량을 결정하는 단계(단계 4).
본 발명의 내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법은, 단 한종의 내부표준물질인 플루오레세인만을 사용하여, 시료내의 다양한 페놀산 화합물을 개별적으로 분리 및 분석할 수 있는 바, 분류를 원하는 모든 물질에 대하여 개별적으로 표준물질을 사용해야만 하는 기존 페놀산 화합물의 정량분석 방법과 달리, 미지 성분 또는 알려진 성분에 구애받지 않고, 페놀산 화합물을 동시에 정량분석할 수 있다. 또한, 고성능액체크로마토그라피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 분석장비로 사용함으로서 수십 수백개의 시료를 분석할수 있으며 분석된 모든 시료에서 나타나는 페놀화합물의 정량값은 내부표준물질을 기준으로 분석값이 자동 또는 일괄적으로 환산이 가능한 장점이 있다.
도 1은 내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법의 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 사용되는 플루오레세인(fluorecein) 용액의 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서, 액체 크로마토그래피 분석 전 추가적으로 필터를 사용한 여과(부분정제, solid phase extraction, SPE)를 하는 과정을 수행하는 것을 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서, UPLC를 사용하여 나타낸 크로마토그램으로, 플루오레세인이 검출되는 시간대를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서, 질량분석 수행 결과를 나타낸 스펙트럼이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, 하기 단계를 포함하는 내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법을 제공한다.
하나 이상의 페놀산 화합물이 포함된 시료와 내부표준물질 플루오레세인(fluorescein)을 혼합하여 분석을 위한 혼합시료를 제조하는 단계(단계 1);
상기 혼합시료를 액체 크로마토그래피를 수행하여 흡광도 분석을 통해 혼합시료 내 페놀산 화합물을 분리 분석하는 단계(단계 2);
상기 분석 결과로부터 시료에 포함된 페놀산 화합물과 플루오레세인이 검출되는 지점의 상대적인 거리 및 질량분석을 통해 개별 페놀산 화합물을 동정하는 단계(단계 3); 및
플루오레세인의 투입량을 기준으로 상기 동정된 개별 페놀산 화합물의 함량을 결정하는 단계(단계 4).
상기 단계 1은 페놀산 화합물이 포함된 시료와 내부표준물질로서 플루오레세인을 혼합하여 단계 2의 액체 크로마토그래피 수행을 위한 혼합시료를 제조하는 단계이다.
이때, 상기 페놀산 화합물은 식물, 동물 및 미생물이 함유하고 있는 페놀산 구조를 포함하는 유효성분으로, 상기 시료는 미지 성분 또는 알려진 일반 성분의 페놀산 화합물을 함유하는 식물 추출물, 동물 또는 미생물로부터 분리된 미분석된 물질일 수 있다.
상기 단계 1에서, 페놀산 화합물이 포함된 시료는 페놀산 화합물이 포함된 시료가 용해되는 용매라면 한정되지 않고 사용가능하나, 물, 저급 알콜 또는 물과 저급 알콜의 혼합용액에 용해시켜 사용할 수 있으며, 상기 저급알콜은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다. 또한, 상기 플루오레세인은 플루오레세인이 용해되는 용매라면 한정되지 않고 사용가능하나, 물, 저급 알콜 또는 물과 저급 알콜의 혼합용액에 용해시켜 사용할 수 있으며, 상기 저급알콜은 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 50% 메탄올 수용액에 용해시켜 50 내지 150 ppm 농도로 제조하여 사용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 100 ppm 농도로 제조하여 사용할 수 있다.하였으나, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 플루오레세인 용액의 농도가 상기 범위를 벗어나게 되면 페놀산 화합물의 분석이 어려울 수 있다.
단계 2 수행 전, 상기 단계 1을 통하여 제조된 혼합용액을 필터를 사용한 여과(부분정제, solid phase extraction, SPE) 단계를 더 수행할 수 있다.
상기 단계 2의 액체 크로마토그래피는 고압 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) 기기 또는 초고성능 액체 크로마토그래피(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC) 기기를 사용하여 수행할 수 있고, HPLC 또는 UPLC 분석용 컬럼의 규격은 통상적으로 사용되는 범위 내에서 가능하다. 그러나, 컬럼의 길이와 내경 및 입자크기는 분석시간 및 분리도와 관계가 있는 것이므로, 신속성과 선택성을 고려하여 적절한 범주에서 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 초고성능액체크로마토그래피의 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것이 좋다. 상기 컬럼 중, 도데실실란(C12) 컬럼 또는 옥타실란(C8) 컬럼을 사용할 경우에는, 화학적 성질이 비슷한 성분들끼리 겹쳐져서 분리도가 감소하는 경우가 발생될 수 있기 때문에, 보다 정확한 분석을 위해서는 상대적으로 비극성 성질이 강한 옥타데실실란(C18) 컬럼을 사용하는 것이 더 좋기 때문이다. 상기 옥타데실실란(C18) 컬럼은, 컬럼 내부에 비극성인 탄소 18개 체인이 충진되어 있는 것으로, 극성성분은 비극성의 컬럼 작용기와 결합하지 않기 때문에 빠르게 용출되고 비극성성분은 비극성 작용기와 결합하여 상대적으로 천천히 용출된다.
이 때, 상기 컬럼은 내경은 2.1~50mm, 입자크기 1~3μm인 것을 사용할 수 있으며, CORTECS® UPLC® VanGuardTM 보호컬럼(2.1 × 5 mm; Waters Co.)이 부착된 CORTECS® UPLC® T3 컬럼(2.1 × 150 mm, 1.6 μm; Waters Co.)을 사용할 수 있다.
한편, 크로마토그래피에 주로 사용되는 실리카가 충진된 컬럼, 아미노기(NH2)가 충진된 컬럼 또는 니트릴(CN)기가 충진된 컬럼은 극성이 높아 프로폴리스 성분이 흡착되어 용출되지 않기 때문에 본 발명에서 사용하기에는 바람직하지 않다.
혼합용매가 주입되어 이동할 때의 컬럼 온도는 30~60℃일 수 있고, 시료 주입 전에 컬럼 온도가 이 온도로 준비되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 컬럼 온도가 30℃이나, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 2의 액체 크로마토그래피의 이동상은 통상적으로 이용되는 에탄올, 메탄올 또는 아세토나이트릴 등과 같은 다양한 종류의 유기용매들이 사용 가능하다. 다만, 상기 유기용매들만을 사용한 경우에는 몇몇 극성도가 비슷한 성분들이 분리되지 않는 경우가 발생한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명에서는 상기 이동상으로 유기용매에 물을 일정비율로 섞은 혼합용매를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 극성도가 상대적으로 낮은 아세토나이트릴을 사용할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 상기 단계 2의 이동상로서 포름산(Formic acid, FA), 물 및 인산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 혼합한 용액을 사용할 수 있고, 상기 혼합용매는 A용액과 B용액을 용액 전체 100부피부에 대하여, B용액을 2부피부 내지 90부피부로 포함하는 혼합용매이되, A용액은 0.05-0.3%(w/v)의 포름산 수용액이고, B용액은 0.05-0.3%(w/v) 포름산/아세토니트릴 용액일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는, A용액으로, 0.1%(w/v) 포름산 수용액, B용액으로, 0.1%(w/v) 포름산/아세토니트릴 용액을 사용하였으나, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다. 포름산 용액의 농도가 상기 조건을 벗어나면 시료 내의 페놀산 화합물의 검출이 동시에 되지 않을 수도 있다.
상기 혼합용매는, 전체 혼합용액 100부피부에서, 이동상 B를 2부피%로 시작하여 4분 동안 유지하고, 8분까지 4부피%, 20분까지 7부피%, 32분까지 11부피%, 55분까지 15부피%, 75분까지 25부피%, 85분까지 50부피%로 증가시켰으며, 87분까지 유지하였다. 이어서 90분까지 90부피%로 증가시킨 후 92분까지 유지하다 95분까지 2부피%로 감소시켜 100분까지 유지하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조건을 벗어나면 시료 내의 페놀산 화합물의 검출이 동시에 되지 않을 수도 있다.
단계 2의 흡광도 분석은 자외선 검출기를 250~350 nm 범위에서 사용할 수 있으며, 하이드록시벤조익 애시드계열의 화합물(hydroxybenzoic acids) 및 하이드록시신나믹 애시드계열의 화합물(hydroxycinnamic acid)이 검출될 수 있는 파장인 280, 320 nm를 조사하는 것이 가장바람직하다. 250 nm 미만과 350 nm 초과 파장에서는 페놀산 화합물 또는 내부표준물질이 동시에 검출되지 않을 수 있다.
본 발명에서 페놀산 화합물을 포함하는 시료는 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)를 이용하여 분석할 수 있다.
UPLC의 원리는 각각의 시료가 갖는 물질의 고유한 성질인 극성 분자량 구조 등을 이용하여 컬럼(Column) 내부에 Packing 되어있는 물질과의 흡착정도에 따라 상을 분리하는데 있다. 따라서 프로폴리스 성분들은 컬럼 내의 충진제에 대한 친화력의 차이에 의해 컬럼 통과시간을 달리하게 된다. 또한 화학적 특성에 따라 각 성분들의 고유한 특징인 극성 상태의 차이가 나타나게 되고, 극성의 차이는 충진제에 대한 친화력을 결정하는 요소가 되기 때문에 컬럼을 통과하는데 걸리는 시간, 즉 머무름 시간(retention time)이 서로 달리 나타나게 된다. 상기 컬럼을 통과한 프로폴리스 성분들은 용리 시간에 따라 차례대로 자외부 흡광광도계(UV)상에서 흡광도의 증가인 피크(peak)를 통해 검출된다. 검출된 페놀산 화합물의 성분은 표준 물질과의 용리 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성 분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 시료 내에 포함된 각 종류별 프로폴리스 성분 함량을 계산할수 있다(정량 분석).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석
단계 1: 분석을 위한 혼합시료 준비
분석을 수행하기 위한 33군의 시료를 각각 50% 메탄올에 용해시키고, 수용액에 녹여 초음파로 60분 처리한 후, PTFE 0.22 μm필터로 여과하여 10 ㎎/㎖ 용액을 만들고, 50% 메탄올 수용액에 녹여 농도가 100 ppm인 내부표준물질 플루오레세인(fluorescein) 용액과 혼합한 후고, PTFE 0.22 μm필터로 다시 여과하여 혼합시료를 제조하였다.
제조된 플루오레세인 용액을 도 2에 나타내었으며, 필터를 사용한 여과(부분정제, solid phase extraction, SPE)를 하는 과정을 도 3에 나타내었다.
단계 2: 시료의 UPLC를 사용한 분리 분석
상기 단계 1에서 얻은 혼합시료를 UPLC를 사용하여 흡광도 분석을 통해 분리 분석을 수행하였다.
페놀산 화합물 성분 분석용 액체 크로마토그래피는 초고성능액체크로마토그래피(Waters, ACQUITY UPLCTM stystem, Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하였으며, CORTECS® UPLC® VanGuardTM 보호컬럼(2.1 × 5 mm; Waters Co.)이 부착된 CORTECS® UPLC® T3 컬럼(2.1 × 150 mm, 1.6 μm; Waters Co.)을 사용하였다.
검출 파장은 하이드록시벤조익 애시드계열의 화합물(hydroxybenzoic acids) 및 하이드록시신나믹 애시드계열의 화합물(hydroxycinnamic acid)이 검출될 수 있는 파장인 280, 320 nm를 조사하였다.
이동상은 A용액: 0.1% FA(포름산, Formic acid) in water, B용액: 0.1% FA in ACN을 사용하였고, 이동상 B를 2%로 시작하여 4분 동안 유지하고, 8분까지 4%, 20분까지 7%, 32분까지 11%, 55분까지 15%, 75분까지 25%, 85분까지 50%로 증가시켰으며, 87분까지 유지하였다. 이어서 90분까지 90%로 증가시킨 후 92분까지 유지하다 95분까지 2%로 감소시켜 100분까지 유지하였다. 유속은 0.35 mL/min, 컬럼 오븐온도는 30oC, 시료 주입량은 1 μL로 설정하였다. 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
분석 결과, 도 4에 나타난 바와 같이,
12분에 플루오로세인 피크가 검출되었으며, 시야 내에 플루오레세인과 페놀산 화합물의 피크가 동시에 관찰되는 것을 알 수 있다.
통상적으로, 플루오레세인은 페놀산 화합물과 동시에 검출되지 않으나, 본 발명의 따른 조건으로 분석을 수행할 경우, 도 4와 같이, 플루오레세인과 페놀산 화합물이 동시에 검출되어 플루오레세인을 내부표준물질로 사용가능한 것이다.
다른 조건을 사용할 경우, 플루오레세인의 피크가 12분에 나타나지 않는 바, 페놀산 화합물 정량 분석에 있어서, 플루오레세인을 내부표준물질로 사용할 수 없다.
단계 3: 페놀산 화합물 동정
상기 단계 2에서 혼합시료를 UPLC를 수행하여 흡광도 분석을 통해 분리 분석한 개별 페놀산 화합물의 검출 피크와 플루오레세인의 검출 피크가 나타난 지점의 상대적 거리 및 질량분석을 통해 개별 페놀산 화합물을 동정하였다.
질량분석은 diode array detector(DAD)가 연결된 QToF 질량분석기(Xevo G2 QToF, Waters MS Technologies, Manchester, UK)을 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 검출 방식은 positive ion 모드를 사용하였으며, capilary 전압은 3.5 kV, sampling con 전압은 40 V, ion source 온도는 120oC로 설정하였다. Desolvation gas의 온도와 유속은 각각 500oC, 1020 L/hrs로 설정하였으며, 질량 스캔 범위는 m/z 50-1000으로 설정하였으며 selected ion monitroing (SIM) mode를 사용하였다.
상기 단계 3에서 페놀산 화합물을 동정한 결과를 질량분석 스펙트럼을 이용하여
단계 4: 동정된 개별 페놀산 화합물의 함량 결정
플루오레세인의 투입량을 기준으로 상기 동정된 개별 페놀산 화합물의 함량을 결정하여, 시료 내 포함된 개별 페놀산 화합물을 최종적으로 정량분석하였다.
구체적으로, 플루오레세인이 크로마토그램상에서 차지하는 일정 면적을 다른 페놀화합물 성분이 차지하는 면적과 비교하여 하기 수학식 1과 같이 비례식으로 환산하여 함량을 결정하였다.
[수학식 1]
Y=aX + b
상기 수학식 1에서, Y는 페놀산 화합물의 함량이고, X는 HPLC 분석시의 크로마토그램상에서 각 피크가 차지하는 면적을 의미하며, a 및 b는 상수이다.
그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
시료 D3Ga D3G C3Ga+D3A C3G+Pt3Ga Pt3G C3A Pn3Ga+Pn3A Pn3G+M3Ga M3G M3A Pt3,6AcG M3,6AcGa M3,6AcG C3Sa5Rh C3G C3Rt C3X Pg3G Pg3Rt
Patriot 99.9 155.8 92.6 121.6 127.3 29.6 26.5 128.3 227.8 49.2 20.3 9.3 40.3 0 0 0 0 0 0
Nelson 117.2 67.0 87.8 75.5 57.3 12.6 30.8 105.9 97.2 52.6 0.5 1.3 0.6 0 0 0 0 0 0
Legacy 411.3 14.8 192.3 221.2 13.0 23.7 68.3 315.5 15.9 106.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Bluegold 229.4 80.2 181.6 132.0 62.7 21.0 74.0 213.9 102.7 131.2 15.9 21.5 33.6 0 0 0 0 0 0
Darrow 56.5 32.6 56.5 39.4 28.7 8.4 24.3 77.9 64.4 67.4 1.4 2.7 5.3 0 0 0 0 0 0
Chandler 146.3 71.9 95.3 81.8 56.0 10.2 32.1 114.9 91.7 54.6 0 0 1.1 0 0 0 0 0 0
Elizabeth 448.7 15.5 216.5 205.9 11.2 19.9 73.9 277.4 13.4 116.1 0.4 7.0 0.4 0 0 0 0 0 0
Bluecrop 355.6 12.3 193.1 193.9 10.9 24.9 80.3 328.7 15.6 152.7 0.2 0 0 0 0 0 0 0 0
청양 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 792.8 278.2 0 2.1 0
정금 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1789.0 430.5 0 5.0 0
한국 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 572.7 0 49.0 0 0
미국 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 512.1 0 43.2 0 0
고창 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 559.2 465.9 1511.4 0 0 13.8
Ca 4x 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1076.3 579.7 0 10.2 0
미국13호 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1567.9 882.2 0 42.3 0
과상2호 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1416.2 863.2 0 21.9 0
대당상 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1136.8 760.6 0 26.6 0
사원뽕 20호 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1540.4 540.0 0 38.2 0
대성뽕 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2110.5 1113.7 0 22.0 0
흑남벼-1 0 0 0 0 0 0 0 2.7 0 0 0 0 0 0 57.87 0 0 0 0
흑남벼-2 0 0 0 0 0 0 0 2.7 0 0 0 0 0 0 56.63 0 0 0 0
흑남벼-3 0 0 0 0 0 0 0 2.6 0 0 0 0 0 0 56.19 0 0 0 0
흑진주벼-3 0 0 0 0 0 0 0 24.7 0 0 0 0 0 0 368.34 0 0 0 0
신자미(생) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
신자미(찐) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
신자미(굽) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
블랙초크-1 0 0 1342.7 0 0 419.1 0 0 0 0 0 0 0 0 60.1 0 69.6 0 0
블랙초크-2 0 0 1333.2 0 0 412.7 0 0 0 0 0 0 0 0 57.7 0 68.8 0 0
블랙초크-3 0 0 1432.3 0 0 447.7 0 0 0 0 0 0 0 0 63.6 0 74.7 0 0
블랙초크-4 0 0 1423.7 0 0 441.9 0 0 0 0 0 0 0 0 61.3 0 76.5 0 0
자색당근-1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
상기 표 1에서,
Patriot은 블루베리 중 패트리어트 품종을 의미하고;
Nelson 블루베리 중 넬슨 품종을 의미하고;
Legacy 블루베리 중 레가시 품종을 의미하고;
Bluegold 블루베리 중 블루골드 품종을 의미하고;
Darrow는 블루베리 중 다로우 품종을 의미하고;
Chandler는 블루베리 중 챈들러 품종을 의미하고;
Elizabeth는 블루베리 중 엘리자베스 품종을 의미하고;
Bluecrop는 블루베리 중 블루크롭 품종을 의미하고;
청양은 복분자 중 청양 품종을 의미하고;
정금 6은 복분자 중 정금 6 품종을 의미하고;
한국은 블랙 라즈베리 중 한국 품종을 의미하고;
미국은 블랙 라즈베리 중 미국 품종을 의미하고;
고창은 블랙 라즈베리 중 미국 품종을 의미하고;
Ca 4x은 오디 중 Ca 4x 품종을 의미하고;
미국13호는 오디 중 미국13호 품종을 의미하고;
과상2호는 오디 중 과상2호 품종을 의미하고;
대당상는 오디 중 대당상 품종을 의미하고;
사원뽕 20호는 오디 중 사원뽕 20호 품종을 의미하고;
대성뽕은 오디 중 대성뽕 품종을 의미하고;
흑남벼-1은 흑미 중 흑남벼-1 품종을 의미하고;
흑남벼-2는 흑미 중 흑남벼-2 품종을 의미하고;
흑남벼-3은 흑미 중 흑남벼-3 품종을 의미하고;
흑진주벼-3은 흑미 중 흑진주벼-3 품종을 의미하고;
신자미(생)는 자색고구마 중 신자미 품종을 가공하지 않은 생것을 의미하고;
신자미(찐)는 자색고구마 중 신자미 품종을 찐것을 의미하고;
신자미(굽)는 자색고구마 중 신자미 품종을 구운것을 의미하고;
블랙초크-1는 블랙초크 중 블랙초크-1 품종을 의미하고;
블랙초크-2는 블랙초크 중 블랙초크-1 품종을 의미하고;
블랙초크-3는 블랙초크 중 블랙초크-1 품종을 의미하고;
블랙초크-4는 블랙초크 중 블랙초크-1 품종을 의미하고;
자색당근-1는 자색당근 중 자색당근-1 품종을 의미한다.
또한, 상기 표 1에서,
D3Ga은 delphinidin 3-galactoside이고;
D3G은 delphinidin 3-glucoside이고;
C3Ga은 cyanidin 3-galactoside이고;
D3A은 delphinidin 3-arabinoside이고;
C3G은 cyanidin 3-glucoside이고;
Pt3Ga은 petunidin 3-galactoside이고;
Pt3G은 petunidin 3-glucoside이고;
C3A은 cyanidin 3-arabinoside이고;
Pn3Ga은 peonidin 3-galactoside이고;
Pn3A은 peonidin 3-arabinoside이고;
Pn3G은 peonidin 3-glucoside이고;
M3Ga은 malvidin 3-galactoside이고;
M3G은 malvidin 3-glucoside이고;
M3A은 malvidin 3-arabinoside이고;
Pt3,6AcG은 petunidin 3-(6-acetoyl)glucoside이고;
M3,6AcGa은 malvidin 3-(6-acetoyl)galactoside이고;
M3,6AcG은 malvidin 3-(6-acetoyl)glucoside이고;
C3Sa5Rh은 cyanidin 3-sambubioside-5-rhamnoside이고;
C3Rt은 cyanidin 3-rutinoside이고;
C3X은 cyanidin 3-xyloside이고;
Pg3G은 pelargonidin 3-glucoside이고;
Pg3Rt은 pelargonidin 3-rutinoside이다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이,
본 발명의 내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법을 통하여, 33종의 시료에 대하여 다양한 구조의 페놀산 화합물들을 개별적으로 분리하였으며, 각각의 함량을 정량하였다.
따라서, 본 발명의 내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법은, 단 한종의 내부표준물질인 플루오레세인만을 사용하여, 시료내의 다양한 페놀산 화합물을 개별적으로 분리 및 분석할 수 있는 바,
분류를 원하는 모든 물질에 대하여 개별적으로 표준물질을 사용해야만 하는 기존 페놀산 화합물의 정량분석 방법과 달리, 미지 성분 또는 알려진 성분에 구애받지 않고, 페놀산 화합물을 동시에 정량분석할 수 있다. 또한, 고성능액체크로마토그라피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 분석장비로 사용함으로서 수십 수백개의 시료를 분석할수 있으며 분석된 모든 시료에서 나타나는 페놀화합물의 정량값은 내부표준물질을 기준으로 분석값이 자동 또는 일괄적으로 환산이 가능한 장점이 있다.
아울러, 종래방법으로는 페놀산 화합물과 동시 검출이 불가능하였던 플루오레세인을 본 발명의 정량분석 방법에서는 내부표준물질로 사용할 수 있는 것이 특징이며, 또한, 단일 표준물질로 제한 없는 페놀산 화합물을 동시 검출할 수 있다는 장점이 있고, 본 발명의 정량분석 방법 조건에서만 페놀산 화합물을 플루오로세인으로 검출할 수 있는 특징이 있다.

Claims (9)

  1. 하기 단계를 포함하는 내부표준법을 사용한 페놀산 화합물의 정량분석 방법이되,
    상기 페놀산 화합물은 delphinidin 3-galactoside, delphinidin 3-glucoside, cyanidin 3-galactoside, delphinidin 3-arabinoside, cyanidin 3-glucoside, petunidin 3-galactoside, petunidin 3-glucoside, cyanidin 3-arabinoside, peonidin 3-galactoside, peonidin 3-arabinoside, peonidin 3-glucoside, malvidin 3-galactoside, malvidin 3-glucoside, malvidin 3-arabinoside, petunidin 3-(6-acetoyl)glucoside, malvidin 3-(6-acetoyl)galactoside, malvidin 3-(6-acetoyl)glucoside, cyanidin 3-sambubioside-5-rhamnoside, cyanidin 3-rutinoside, cyanidin 3-xyloside, pelargonidin 3-glucoside 및 pelargonidin 3-rutinoside로부터 선택되는 2종 이상의 페놀산 화합물인 것을 특징으로 하는, 페놀산 화합물의 정량분석 방법:
    상기 2종 이상의 페놀산 화합물이 포함된 시료와 내부표준물질 플루오레세인(fluorescein)을 혼합하여 분석을 위한 혼합시료를 제조하는 단계(단계 1);
    상기 혼합시료를 액체 크로마토그래피를 수행하여 흡광도 분석을 통해 혼합시료 내 페놀산 화합물을 분리 분석하는 단계(단계 2)이되,
    상기 흡광도 분석은 자외선 검출기를 250 ~ 350 nm 범위에서 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 페놀산 화합물을 분리 분석하는 단계;
    상기 분석 결과로부터 시료에 포함된 페놀산 화합물과 플루오레세인이 검출되는 지점의 상대적인 거리 및 질량분석을 통해 개별 페놀산 화합물을 동정하는 단계(단계 3); 및
    플루오레세인의 투입량을 기준으로 상기 동정된 개별 페놀산 화합물의 함량을 결정하는 단계(단계 4).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플루오레세인은 메탄올 또는 에탄올에 용해시켜 50-150 ppm 농도로 제조하여 사용하는 것을 특정으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 플루오레세인은 50% 메탄올 수용액에 용해시켜 100 ppm 농도로 제조하여 사용하는 것을 특정으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 페놀산 화합물은 식물, 동물 및 미생물이 함유하고 있는 페놀산 구조를 포함하는 유효성분인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 2의 액체 크로마토그래피는 고압 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) 또는 초고성능 액체 크로마토그래피(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    단계 2의 액체 크로마토그래피의 이동상은 포름산(Formic acid, FA), 물 및 인산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 혼합한 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 이동상은 A용액과 B용액을 용액 전체 100부피부에 대하여, B용액을 2부피부 내지 90부피부로 포함하는 혼합용매이되, A용액은 0.05-0.3%(w/v)의 포름산 수용액이고, B용액은 0.05-0.3%(w/v) 포름산/아세토니트릴 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    단계 2의 액체 크로마토그래피는 1-100분간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101802097B1 (ko) 2016-12-14 2017-11-28 (재) 순천천연물의약소재개발연구센터 페놀산 프로파일을 이용한 와송의 채취 시기 판별 방법
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Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2624704A4 (en) * 2010-10-04 2014-05-28 Dianaplantsciences S A S Production and Extraction of Procyanidins from Plant Cell Culture
KR101390818B1 (ko) * 2012-08-27 2014-05-02 한국과학기술연구원 생체 시료 내 페놀 화합물 동시 분석 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017205985A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Valorbec Societe En Commandite System and method for the transfer of fluid from one flow to another
KR101802097B1 (ko) 2016-12-14 2017-11-28 (재) 순천천연물의약소재개발연구센터 페놀산 프로파일을 이용한 와송의 채취 시기 판별 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
V Kontrimaviciute 등, Journal of Chromatography B, 843권, 2006년, 페이지 131-141.(2006.12.31.)*

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