KR102118181B1 - 식물성 정유를 유효성분으로 포함하는 a형 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 조성물 - Google Patents
식물성 정유를 유효성분으로 포함하는 a형 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유(essential oils)를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus)에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 생물학적 제제인 식물성 정유를 포함하고 있으므로 인체에 부작용이 없어 안전성이 우수하며, 항바이러스 활성이 오셀타미비르(oseltamivir) 보다 뛰어나므로 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료에 있어서 유용하게 활용될 것이다.
Description
본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus)에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유(essential oils)를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 RNA 외피 (enveloped) 바이러스이며 사람과 동물을 감염시켜 높은 이환율과 사망률을 나타내는 호흡기 합병증을 유발한다(Webster RG, Bean WJ, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev 1992;56 (1):152-179.). 인플루엔자 바이러스는 기본적으로 지질 이층 구조 및 외부 당단백질을 갖는 바이러스 외피에 의해 둘러싸인 핵단백질과 결합된 RNA의 내부 뉴클레오캡시드 또는 코어로 구성된다. 바이러스 외피의 내층은 주로 기질 단백질로 구성되며, 외층은 대부분 숙주 유래된 지질 물질로 구성된다. 인플루엔자 바이러스는 두 개의 표면 항원인 당단백질 뉴라미니다제(neuraminidase, NA) 및 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)을 포함하며, 이들은 입자의 표면에서 10 내지 12 nm 길이의 스파이크(spike)로서 나타난다. 인플루엔자 아형(subtype)의 항원 특이성을 결정하는 것이 바로 이러한 표면 단백질, 특히 헤마글루티닌이다.
A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus)의 경우, HA 및 NA 아형의 혈청학 특성에 따라 분류되며, 18개의 HA 아형 (H1 - H18) 및 11개의 NA 아형 (N1 - N11)이 보고되었다(Fouchier RA et al., Characterization of a Novel Influenza A Virus Hemagglutinin Subtype (H16) Obtained from Black-Headed Gulls. J. Virol. 2005:79:2814-2822).
인플루엔자 바이러스는 세계적으로 매년 25 - 50만 명의 목숨을 빼앗고 소아의 10 - 40%가 감염되고 있으며, 국가 경제적 손실을 야기하는 심각한 글로벌 질환을 유발한다. 1918년 스페인 독감 대유행 이후, 1957년 아시아 독감, 1968년 홍콩 독감 등 수십 년 주기로 인플루엔자 대유행이 나타났으며, 2009년 H1N1 인플루엔자 바이러스(2009pdm)의 출현으로 세계적으로 27만명이 감염되었고, 3200명 이상이 사망하였다. 남반구에서 높은 전염성의 새로운 변이주 창궐 가능성 때문에 대유행 대책을 세우고 있음에도 사회적 파장과 우려는 줄지 않고 있다.
인플루엔자는 오한, 발열, 근육통, 기침을 동반하는 급성 호흡기 질환으로 보통 감염자의 기침이나 재채기를 통해 공기 중으로 배출되는 에어로졸(aerosol)을 통해서 인체-인체 전파에 따라 감염된다. 인플루엔자 감염은 오소믹소비리대(orthomyxoviridae)에 속하는 인플루엔자 바이러스에 의하여 야기되며, RNA 바이러스로서 항원 변이가 상대적으로 쉽기 때문에 감염인구 집단 내에서의 반복적인 재감염이 가능하다.
현재, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 바람직한 치료법은 이제 뉴라미니다아제(neuraminidase) 억제제인, 오셀타미비르(oseltamivir)와 자나미비르(zanamivir)의 사용이다. 그러나 오셀타미비르는 심각한 구토증세가 나타나는 부작용이 있으며 자나미비르는 항바이러스 효과는 높지만 생체 이용율이 낮고 신장에서의 배출이 빠르다는 단점이 있으며, 내성 바이러스 균주의 출현으로 인해 한계가 있다(Kiso M, Mitamura, K, Sakai-Tagawa Y, et al. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. Lancet 2004;364 (9436):759-65., Le QM, Kiso M, Someya K, et al. Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus. Nature 2005;437 (7062):1108.). 따라서, 인플루엔자의 예방 및 치료에 효과적인 항인플루엔자 조성물의 개발이 시급한 실정이다.
정유(essential oils)는 항균, 항 곰팡이 및 항 염증 활성을 나타내는 다양한 생물학적 제제로서의 전통적인 역할 이외에도 다기능적인 특성을 보유하고 있는 것으로 알려져 있다(Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. J Appl Microbiol 1999;86 (6): 985-90., Meepagala KM, Sturtz G, Wedge DE. Antifungal constituents of the essential oil fraction of Artemisia dracunculus L. var. dracunculus. J Agric Food Chem 2002;50 (24): 6989-92.).
몇몇 연구는 정유의 항바이러스 활성을 증명했다(Tragoolpua Y, Jatisatienr A. Anti-herpes Simplex Virus Activities of Eugenia caryophyllus (Spreng.) Bullock & S. G. Harrison and Essential Oil, Eugenol. Phytother Res 2007:21 (12):1153-8., Koch C, Reichling J, Schneele J, et al. Inhibitory effect of essential oils against herpes simplex virus type 2. Phytomed 2008;15 (1-2):71-78., Schnitzler P, Schuhmachera A, Astania A, et al. Melissa officinalis oil affects infectivity of enveloped herpesviruses. Phytomed 2008;15 (9):734-740.). 최근 연구에 따르면 유칼립투스(Eucalyptus) 정유는 아데노바이러스(adenovirus)와 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus)에 대한 억제 효과를 나타냈다(Cermelli C, Fabio A, Fabio G, et al. Effect of eucalyptus essential oil on respiratory bacteria and viruses. Curr Microbiol. 2008;56 (1):89-92.). 이전의 연구에서도 Cynanchum stauntonii의 휘발성 오일이 인플루엔자 바이러스에 직접적인 억제 활성을 가지고 있음이 밝혀졌다(Yang ZC, Wang BC, Yang XS, et al. Chemical composition of the volatile oil from Cynanchum stauntonii and its activities of anti-influenza virus. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2005;43 (3-4):198-202.).
이에, 본 발명자들은 A형 인플루엔자 바이러스에 대하여 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내면서도 내성 바이러스 및 인체에 부작용이 없는 생물학적 제제인 정유를 개발하고자 예의 노력한 결과, A형 인플루엔자 바이러스에 대한 62종 정유의 항바이러스 활성을 세포 변성 효과 (cytopathic effect, CPE) 감소 방법으로 분석하여 마조람(Marjoram) (Thymus mastichina L.), 클라리 세이지(Clary sage) (Salvia sclarea L.) 및 아니스(Anise) (Pimpinella anisum L.) 오일에서 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus)에 대하여 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내면서도 내성 바이러스 및 인체에 부작용이 없는 항바이러스 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유(essential oils)를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus)에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른, A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus)에 대한 항바이러스 조성물은 생물학적 제제인 식물성 정유(essential oils)를 포함하고 있으므로 인체에 부작용이 없어 안전성이 우수하며, 항바이러스 활성이 오셀타미비르(oseltamivir) 보다 뛰어나므로 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료에 있어서 유용하게 활용될 것이다.
도 1A는 62종의 식물성 정유 중에서 10종의 정유 및 오셀타미비르(oseltamivir)의 인플루엔자 A/WS/33 바이러스(Influenza A/WS/33 virus)에 대한 항바이러스 활성을 나타낸 도면이다.
도 1B는 62종의 식물성 정유 중에서 10종의 정유의 100 μg/mL의 농도에서 인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 대한 세포 독성을 나타낸 도면이다.
도 2는 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 세포 변성 효과에 대한 정유의 효과를 분석하기 위해 현미경으로 인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 의해 유도된 MDCK 세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 1B는 62종의 식물성 정유 중에서 10종의 정유의 100 μg/mL의 농도에서 인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 대한 세포 독성을 나타낸 도면이다.
도 2는 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 세포 변성 효과에 대한 정유의 효과를 분석하기 위해 현미경으로 인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 의해 유도된 MDCK 세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus)에 대하여 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내면서도 내성 및 인체에 부작용이 없는 생물학적 제제인 정유를 개발하고자, 인플루엔자 A/WS/33 바이러스(Influenza A/WS/33 virus)에 대한 62종 정유의 항바이러스 활성 및 세포 독성을 세포 변성 효과 (cytopathic effect, CPE) 감소 방법으로 분석하였다. 그 결과, 마조람(Marjoram) (Thymus mastichina L.), 클라리 세이지(Clary sage) (Salvia sclarea L.) 및 아니스(Anise) (Pimpinella anisum L.) 오일이 시판 중인 인플루엔자 바이러스 치료제인 오셀타미비르(oseltamivir) 보다 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내면서도 세포 독성이 없는 것을 확인하였다(도 1).
따라서, 본 발명은 일 관점에서 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유(essential oils)를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 항바이러스 조성물은 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에 투여되는 의약 조성물의 형태이거나 식품 조성물, 식기, 주방용품, 생활용품, 기타 각종 물건의 세척제, 소독제, 통상의 항바이러스제 등 통상적으로 알려진 모든 형태로 제조될 수 있으며, 이 경우 조성물 총 중량에 대하여 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유(essential oils)를 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus)의 아형(subtype)에는 H1N1, H1N2, H2N2, H2N3, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H7N9, H9N2 또는 H10N7 등을 포함하며, 바람직하게는 H1N1인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, A형 인플루엔자 H1N1 바이러스(Influenza A virus subtype H1N1)의 구체적인 종류로는 A/PR/8(H1N1), A/WSN/33(H1N1), A/Bervig-Mission/1/18(rvH1N1), A/Singapore/6/86(H1N1) 등이 있다.
본 발명의 용어 "인플루엔자 A/WS/33 바이러스 (Influenza A/WS/33 virus)"란, A형 인플루엔자 중에서 18개의 HA 아형(subtype) 중 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 단백질이 1형이고(H1), 11개의 NA 아형(subtype) 중 뉴라미니다제(neuraminidase, NA) 단백질이 1형인(N1)인 H1N1 바이러스이며, Strain이 A/WILSON-SMITH/33인 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 대하여 본 발명에서 제공하는 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유(essential oils)를 유효성분으로 포함하는 조성물이 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 확인되었으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유(essential oils)를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, A형 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 생길 수 있는 질병에는 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴, 조류독감, 돼지독감, 염소독감 등이 포함된다.
본 발명에서 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염을 원인으로 하는 호흡기 질환에 걸린 개체에서 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 인플루엔자 바이러스 감염을 원인으로 하는 호흡기 질환의 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다.
이에, 본 명세서에서 용어 "치료" 또는 "치료제"는 "치료 보조" 또는 "치료 보조제"의 의미를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제형화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때의 제형은 통상의 방법에 따라 산제(powders), 과립제(granules), 정제(tablet), 캡슐제(capsules), 현탁액(suspension), 에멀젼(emulsion), 시럽(syrup), 에어로졸(aerosol) 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, EastonPA)에 개시되어 있는 것을 사용할 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제(pill), 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium Carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트(Magnesium Stearate), 탈크(talc) 같은 윤활제들도 사용된다.
경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(Macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지(laurinum), 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 최적의 투여량은 피검체에서 적합한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 그 범위가 다양하며, 상기 사항을 고려하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여용 경로를 통하여 투여할 수 있으며, 일반적으로 활성 성분으로서 본 발명에 따른 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유(essential oils)를 치료 유효량으로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또다른 관점에서, 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유(essential oils)를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "식품"이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서의 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품, 음료 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
62종의 식물성 정유 샘플 및 인플루엔자 A/WS/33 바이러스의 준비
62종의 식물성 정유(essential oils)는 UNIQ F&F Co., Ltd (서울, 대한민국)로부터 구입하였으며, 하기 표 1에 나열하였다. 샘플들은 서울대학교 식물 표본관(Seoul National University herbarium)에 보관하였으며, 이들 오일을 10 mg/mL의 최종 농도가 되도록 dimethylsulfoxide (DMSO)에 용해시킨 후 사용 전까지 -20 ℃에서 보관하였다.
Family | Species | Oil | Part |
Myrtaceae | Pimenta dioica (L.) Merr. | Pimento berry | flower |
Myrtaceae | Melaleuca alternifolia (Maid. & Bet.) Cheel | Tea tree | leaf |
Oleaceae | Eugenia caryophyllata Thumb. | Clove bud | bud |
Oleaceae | Eugenia caryophyllata Thumb. | Clove leaf | leaf |
Pinaceae | Pinus sylvestris L. | Pine | needle |
Poaceae | Cymbopogon nardus L. | Citronella java | leaf |
Poaceae | Pelargonium graveolens L. | Geranium | flower |
Poaceae | Cymbopogon martinii Stapf. | Palmarosa | grass |
Rutaceae | Citrus bergamia Risso | Bergamot | peel |
Rutaceae | Citrus paradisi Macfadyen | Grapefruit | fruit |
Rutaceae | Citrus sinensis (L .) Osbeck | Orange | peel |
Rutaceae | Citrus limonum L. | Lemon | peel |
Rutaceae | Citrus aurantifolia Swing. | Lime | peel |
Rutaceae | Citrus reticulata Blanco | Mandarine | peel |
Rutaceae | Citrus aurantium L. | Neroli | flower |
Santalaceae | Santalum album L. | Sandalwood | wood |
Rosaceae | Rosa damascene Mill. | Rose | flower |
Asteraceae | Chamomilla recutita (L.) Rauschert | Chamomile blue | flower |
Asteraceae | Artemisia dracunculus L. | Estragon | leaf |
Poaceae | Cymbopogon citratus (DC) Stapf. | Lemongrass | whole plant |
Myrtaceae | Pimenta racemosa (Mill.) J.W.Moore | Bay | leaf |
Lauraceae | Litsea cubeba L. | Litsea cubeba | fruit |
Clusiaceae | Calophyllum inophyllum L. | Tamanu | fruit |
Rutaceae | Zanthoxylum armatum | Xanthoxylum | seed |
Myrtaceae | Eucalyptus citriodora | Eucalyptus (citriodora) | leaf |
Zingiberaceae | Zingiber officinale Roscoe | Ginger | rhizome |
인플루엔자 A/WS/33 바이러스(Influenza A/WS/33 virus)는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 제공받았으며 Madin-Darby canine kidney (MDCK) 세포에서 37 ℃로 배양하였다. MDCK 세포는 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 0.01 % 항생제-항진균 용액이 첨가된 최소 필수 배지 (MEM)에서 보관하였다. 항생제-항진균 용액, 트립신-EDTA, FBS 및 MEM은 Gibco BRL (Grand Island, NY)로부터 공급받았다. 조직 배양 플레이트는 Falcon (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에서 구입하였다. Sulforhodamine B (SRB)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다. 오셀타미비르(oseltamivir) (F. Hofmann-La Roche Ltd, Switzerland)는 의사의 지시에 따라 한국의 약국에서 구입하였다.
항바이러스 활성 및 세포 독성 분석
1. 실험방법
인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 대한 62종 식물성 정유의 항바이러스 활성 및 세포 독성에 대한 분석을 위하여, 최근에 보고된 세포 변성 효과 (CPE) 감소 방법을 이용하였다(Choi HJ, Kim JH, Lee CH, et al. Antiviral activity of quercetin 7-rhamnoside against porcine epidemic diarrhea virus. Antiviral res 2009;81 (1):77-81.). 오셀타미비르는 양성 대조군, dimethyl sulfoxide (DMSO)는 음성 대조군으로 사용되었다.
2. 결과
도 1에 나타난 바와 같이, 62종의 식물성 정유 중에서 10종의 정유는 인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 대해 30% 이상의 항바이러스 활성을 나타냈으며, 100 μg/mL의 농도에서는 세포 독성이 없었다. 그 중에서도 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise) 오일은 오셀타미비르 보다 높은 항인플루엔자 A/WS/33 바이러스 활성을 나타냈으며, 항바이러스 활성은 52% 이상이었고 100 μg/mL의 농도에서는 세포 독성이 없었다. 그러나 도 1B에 나타난 바와 같이, 오셀타미비르는 동일한 농도에서 세포 독성을 보였다.
인플루엔자 바이러스에 의해 유도된 MDCK 세포의 형태학적 변화에 대한 정유의 효과 분석
1. 실험방법
인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 세포 변성 효과에 대한 정유의 효과를 분석하였다. 간단히 말하면, MDCK 세포를 웰(well)당 2 x 104 세포의 농도로 96-웰 배양 플레이트 상에 분주(seeding)하였다. 다음날 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 그리고 나서, 희석된 바이러스 현탁액 0.09 mL 및 정유 100 μg/mL를 함유하는 typ-in-EDTA가 보충된 배지 0.01 mL를 첨가 하였다. 37 ℃, 5% CO2에서 2일간 배양한 후, 32 × 10 배율의 현미경 (AXIOVERT10, ZEISS, Germany)에서 세포의 형태를 관찰하고 영상을 기록하였다.
2. 결과
도 2에 나타난 바와 같이, 마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise) 오일은 인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 의해 유도된 형태학적(morphological) 변화를 감소시키는 것을 확인하였다. MDCK 세포에 인플루엔자 A/WS/33 바이러스를 감염시키고 2일 후에, 모의 세포(mock cell) (도 2A) 또는 100 μg/mL의 정유 (도 2E, 2G 및 2I)를 처리 한 세포는 전형적인 spread-out 모양과 정상적인 형태를 나타냈다. 100 μg/mL 농도의 정유를 처리한 경우, 세포 독성의 징후는 관찰되지 않았다. 그러나 오셀타미비르는 100 μg/mL의 농도에서 MDCK 세포에 약하게 독성을 나타냈다 (도 2C). 정유를 처리하지 않은 경우, 인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 의한 감염은 심각한 세포 변성 효과를 초래하는 것으로 나타났다 (도 2B). 감염된 MDCK 세포에 정유를 첨가하면 가시적인 세포 변성 효과가 형성되는 것을 억제하는 것을 확인하였다 (도 2F, 2H 및 2J). 그러나 인플루엔자 A/WS/33 바이러스에 감염된 MDCK 세포에서 오셀타미비르를 첨가하면 세포 변성 효과가 약하게 예방되는 것을 확인하였다 (도 2D). 따라서 바이러스 감염의 세포 변성 효과는 정유의 존재로 예방할 수 있다고 판단된다.
마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise) 오일의 화학적 조성 분석
1. 실험방법
마조람(Marjoram), 클라리 세이지(Clary sage) 및 아니스(Anise) 오일의 화학적 조성을 분석하기 위하여 가스 크로마토그래피-질량 분석법(gas chromatograph-mass spectrometer , GC-MS)을 이용하였다.
(1) 가스 크로마토그래피 (GC-FID)
가스 크로마토그래피 분석은 DB-1MS 컬럼 (30m × 0.25mm i.d., 0.25um 필름 두께, J & W Scientific, Folsom, CA)이 장착된 Agilent 6890N 상에서 수행하였다. 오븐 온도는 40 ℃에서 1분간 등온선으로, 그리고 나서 6 ℃/분의 속도로 250 ℃까지 상승시키고 이 온도에서 4분간 유지하였다. 헬륨은 분할(split) 모드 (50:1 비율)에서 1.5 mL/분의 속도로 운반 기체로서 사용되었다. 식물성 정유의 성분은 GC retention indice (RI)를 비교하여 분석하였다. 정유와 지방족 탄화수소 혼합물 (C8-C20, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 함께 주입함으로써 식물성 정유를 구성하는 각각의 RI를 얻었다. RI는 van Den Dool과 Kratz (1963) [13]에 의해 제안된 방정식을 사용하여 계산하였다.
(2) 가스 크로마토그래피-질량 분석법 (GC-MS)
3가지 오일은 DB-5 MS 칼럼 (30 ㎛ × 0.25 ㎜ 내경, 0.25 ㎛ 필름 두께, J & W Scientific, Folsom, CA)이 장착된 가스 크로마토그래피(Agilent 6890N)-질량 분석기 (Agilent 5973N MSD)상에서 분석하였다. 오븐 온도는 이전 분석과 같이 프로그래밍하였다. 헬륨은 1.0 mL/분의 속도로 운반 기체로서 사용되었다. GC 컬럼의 유출물은 이송 라인(250 ℃)을 통해 MS의 공급원으로 직접 도입되었다. 이온화 전압은 70 eV이고 이온 소스 온도는 230 ℃였다. 스캔 범위는 41-450 amu였다. 각 피크의 질량 스펙트럼을 NIST MS 라이브러리의 실제 샘플과 비교하여 화합물을 실험적으로 확인하였다.
2. 결과
3가지 정유의 화학적 조성을 표 2 내지 4에 기재하였다. GC 및 GC-MS 분석에 의해 마조람(Marjoram) 오일에서 총 10가지 화합물을 확인하였다(표 2). 확인된 화합물 중 1,8-시네올(cineole) (64.61%)이 가장 많이 함유된 화합물이었고 리나로올(linalool) (15.28 %)과 β-pinene(피넨) (5.81%) 순서였다(표 2). 클라리 세이지(Clary sage) 오일의 화학적 조성은 linalayl acetate (61.16%), 리나로올 (22.06 %) 및 α-테르피네올(Terpineol) (4.21 %)으로 나타났다(표 3). 아니스(Anise) 오일의 화학적 조성은 트랜스-아네톨(trans-Anethole) (82.78%), 에스트라골(estragole) (8.21 %) 및 리나로올 (2.74 %)이었다(표 4).
No. | Compound | Retention time (min) |
Relative composition ratio, % |
1 | α-pinene | 928 | 4.21 |
2 | Sabinene | 962 | 1.82 |
3 | β-pinene | 967 | 5.81 |
4 | β-myrcene | 981 | 1.02 |
5 | ρ-cymene | 1,010 | 0.94 |
6 | 1,8-cineole | 1,018 | 64.61 |
7 | Linalool | 1,084 | 15.28 |
8 | Terpinen-4-ol | 1,159 | 1.29 |
9 | α-terpineol | 1,170 | 2.40 |
10 | Bornylacetate | 1,435 | 2.61 |
Total | 100.0 |
No. | Compound | Retention time (min) |
Relative composition ratio, % |
1 | β-myrcene | 981 | 1.53 |
2 | Linalool | 1,084 | 22.06 |
3 | α-Terpineol | 1,170 | 4.21 |
4 | Cinnamaldehyde | 1,234 | 1.81 |
5 | Linalayl acetate | 1,240 | 61.16 |
6 | Geranyl acetate | 1,360 | 2.40 |
Total | 93.17 |
No. | Compound | Retention time (min) |
Relative composition ratio, % |
1 | α-Pinene | 928 | 0.85 |
2 | Limonene | 1,019 | 2.55 |
3 | Linalool | 1,084 | 2.74 |
4 | Estragole | 1,173 | 8.21 |
5 | 4-Allylanisole | 1,211 | 1.21 |
6 | trans-Anethole | 1,259 | 82.78 |
7 | Charvicol | 1,650 | 1.08 |
Total | 99.41 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- (i) 1,8-시네올(cineole), 리나로올(linalool), β-피넨(β-pinene), α-피넨(α-pinene), 보리닐아세테이트(Bornylacetate), α-테르피네올(α-terpineol), 사비넨(Sabinene), 테르피넨-4-올(Terpinen-4-ol), β-미르센(β-myrcene) 및 ρ-시멘(ρ-cymene)을 포함하는 마조람(Marjoram) 정유(essential oils);
(ii) 리날라일아세테이트(Linalayl acetate), 리나로올(linalool), α-테르피네올(α-terpineol), 제라닐아세테이트(Geranyl acetate), 신남알데하이드(Cinnamaldehyde) 및 β-미르센(β-myrcene)을 포함하는 클라리 세이지(Clary sage) 정유; 및
(iii) 트랜스-아네톨(trans-Anethole), 에스트라골(Estragole), 리나로올(linalool), 리모넨(Limonene), 4-알릴라니솔( 4-Allylanisole), 차비콜(Charvicol) 및 α-피넨(α-pinene)을 포함하는 아니스(Anise) 정유로 구성된 군에서 선택되는 식물성 정유를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스(Influenza A virus)에 대한 항바이러스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 A형 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 H1N1 바이러스(Influenza A virus subtype H1N1)인 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 마조람(Marjoram) 정유, 클라리 세이지(Clary sage) 정유 및 아니스(Anise) 정유로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유를 0.001 중량% 내지 99.9 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
- (i) 1,8-시네올(cineole), 리나로올(linalool), β-피넨(β-pinene), α-피넨(α-pinene), 보리닐아세테이트(Bornylacetate), α-테르피네올(α-terpineol), 사비넨(Sabinene), 테르피넨-4-올(Terpinen-4-ol), β-미르센(β-myrcene) 및 ρ-시멘(ρ-cymene)을 포함하는 마조람(Marjoram) 정유(essential oils);
(ii) 리날라일아세테이트(Linalayl acetate), 리나로올(linalool), α-테르피네올(α-terpineol), 제라닐아세테이트(Geranyl acetate), 신남알데하이드(Cinnamaldehyde) 및 β-미르센(β-myrcene)을 포함하는 클라리 세이지(Clary sage) 정유; 및
(iii) 트랜스-아네톨(trans-Anethole), 에스트라골(Estragole), 리나로올(linalool), 리모넨(Limonene), 4-알릴라니솔( 4-Allylanisole), 차비콜(Charvicol) 및 α-피넨(α-pinene)을 포함하는 아니스(Anise) 정유로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 A형 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 H1N1 바이러스인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- (i) 1,8-시네올(cineole), 리나로올(linalool), β-피넨(β-pinene), α-피넨(α-pinene), 보리닐아세테이트(Bornylacetate), α-테르피네올(α-terpineol), 사비넨(Sabinene), 테르피넨-4-올(Terpinen-4-ol), β-미르센(β-myrcene) 및 ρ-시멘(ρ-cymene)을 포함하는 마조람(Marjoram) 정유(essential oils);
(ii) 리날라일아세테이트(Linalayl acetate), 리나로올(linalool), α-테르피네올(α-terpineol), 제라닐아세테이트(Geranyl acetate), 신남알데하이드(Cinnamaldehyde) 및 β-미르센(β-myrcene)을 포함하는 클라리 세이지(Clary sage) 정유; 및
(iii) 트랜스-아네톨(trans-Anethole), 에스트라골(Estragole), 리나로올(linalool), 리모넨(Limonene), 4-알릴라니솔( 4-Allylanisole), 차비콜(Charvicol) 및 α-피넨(α-pinene)을 포함하는 아니스(Anise) 정유로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유를 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 식품은 식품 첨가제, 음료 또는 음료 첨가제인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 A형 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 H1N1 바이러스인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물은 마조람(Marjoram) 정유, 클라리 세이지(Clary sage) 정유 및 아니스(Anise) 정유로 구성된 군으로부터 선택되는 식물성 정유를 0.001 중량% 내지 99.9 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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WO2004110401A2 (en) | 2003-06-10 | 2004-12-23 | Lectec Corporation | Inhalation antiviral patch |
JP2013523622A (ja) * | 2010-03-26 | 2013-06-17 | ケサ アリアンス エス エー | インビボでの治療上の使用のためのウイルス阻害剤組成物 |
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