KR102098587B1 - 열용융압출법을 이용하여 제조된 황산아연 나노콜로이드 분산체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 열용융압출법을 이용하여 제조된 황산아연 나노콜로이드 분산체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 제조법에 의해 무기 금속류의 나노분산제형을 개발할 수 있다. 특히, 황산아연의 입자경을 나노 크기 단위까지 감소시킴으로써 경구 투여 후 위장관에서의 흡수율을 증가시키는데 기여할 수 있다. 또한, 체내 흡수율이 증가될 경우 분변 내 포함된 중금속에 의한 환경오염을 줄일 수 있다. 또한, 실험동물에서 경구 투여시 점막독성이 없었기 때문에 안전하게 생체 응용이 가능하다. 따라서, 본 발명은 미량으로 존재하는 동물 체내 아연의 효과적인 공급에 크게 기여할 것이므로, 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

열용융압출법을 이용하여 제조된 황산아연 나노콜로이드 분산체 및 이의 용도{Zinc sulfate nano colloidal dispersion produced by hot-melting extrusion method and uses thereof}
본 발명은 열용융압출법을 이용하여 제조된 황산아연 나노콜로이드 분산체 및 이의 용도에 관한 것이다.
아연(zinc; Zn)은 음식의 미량 영양소 중 하나이고 체내에서 두번째로 높게 존재하는 미량원소이다. 아연의 95% 이상이 세포 안에 존재하지만, 체내의 주요한 저장장소는 존재하지 않는다. 아연에는 촉매 작용, 구조적 작용, 조절 작용의 세 가지 생리학적인 역할이 있다. 아연은 주로 십이지장과 공장에서 수용체를 통해 흡수되는 것으로 알려져 있다. 이 흡수는 피트산, 섬유질, 철에 의해 감소되고, 시트르산에 의해 향상될 수 있다. 세포 및 혈청 내 아연 농도의 항상성은 흡수, 배출, 보유 등의 조절에 의해 유지된다. 아연 부족은 식욕 부진, 미각 장애, 후각 장애, 피부 발진, 감염, 탈모, 발육 부진, 상처 치유 부진 등의 결과를 초래할 수 있다. 그러므로, 아연을 충분히 보충하는 것이 정상적인 생리적 상태를 유지하기 위해 매우 중요하다.
한편, 무기물 결정, 금속, 그리고 염은 소액성(친화성이 약한) 물질로 분류할 수 있다. 이들의 (물과 같은) 용매에서의 친화성은 매우 낮기 때문에, 이러한 물질들을 용매에 분산시키기 위해서는 열역학적 작업이 필수적이다. 금속을 나노 크기 입자로 개발하기 위한 다양한 제조법들이 개발되어 왔다. 열용융압출법은 쉽게 스케일-업 할 수 있는 반복적인 제조 공정이다. 재료는 압출기 안에 들어가 다이로 이동하여 회전하는 스크류에 의해 균일하게 섞이고, 다이에서 압출되어 나온 열용융압출 공정에서 배럴의 온도는 유리전이 온도와 용융 온도 이상으로 설계되고 고분자 첨가물과 약물은 고분자 매트릭스에 분자적 수준으로 분산된다.
솔루플러스(Soluplus, SP)는 열용융압출 공정에서 주요 고분자 기질로 사용되며, SP는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐카프로락탐 및 폴리비닐아세테이트로 구성된 그라프트 중합체이기 때문에 양친매적 특성을 지니고 있다. SP는 결합제, 가용화제, 필름 형성제 및 안정화제로 이용된다. 또한, 자체의 열역학적 특성 때문에 열용융압출 제형을 제조하기 위해 주요 기제로 이용된다. 결정적으로, 열용융압출 공정에서 SP의 이용은 난용성 약물의 용해도와 생체이용률을 향상시킬 수 있다. 지금까지, 열용융압출 기술은 주로 낮은 분자량과 난용성을 가진 유기물질을 적절한 고분자(셀룰로오스 유도체, poly(ethylene-co-vinyl acetate), 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈 및 SP 등)를 사용한 고체분산체를 만들기 위해 사용되어 왔다.
한편, 한국등록특허 제1753222호에는 '용융압출하여 제조된 당귀-고체분산체 및 그 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '열용융압출법을 이용하여 제조된 황산아연 나노콜로이드 분산체 및 이의 용도'는 어디에도 개시되어 있지 않다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 그동안 열용융압출법을 이용해 유기 물질이 포함된 약제학적 제형을 개발한 예는 많았지만, 무기 물질이 포함된 압출물에 대한 보고는 거의 없었기 때문에, 이중 스크류를 사용한 열용융압출법으로 가용화제(SP)와 함께 무기물(황산아연 등)의 균일한 분산체를 제조하는 것이 시도되었다. 단일 스크류 압출기에 비해 이중 스크류 압출기는 다음과 같은 이점을 제공한다; 높은 분산성, 쉬운 재료 공급, 낮은 과열 위험성, 높은 공정 생산성, 공정 파라미터의 효과적인 조정.
상기와 같은 이중 스크류 시스템을 통해 생성되는 강한 힘은 ZnSO4을 SP 기제에 균일하게 분산시킬 수 있고, 동시에, ZnSO4의 나노 크기의 입자는 유기 고분자(SP 등)로 뒤덮이게 되고, ZnSO4 입자 위의 SP 코팅은 표면 에너지와 응집체 발생을 감소시켰다. ZnSO4 마이크로 크기 입자와 비교해서, ZnSO4의 나노 크기 입자는 다음과 같은 이점을 가질 수 있다: 정맥투여 가능성, 효과적인 세포 내로의 이동, 향상된 점막투과성.
본 발명의 열용융압출 공정을 통해 제조된 황산아연 나노콜로이드 분산체(ZnSO4/SP NCs)는 원래의 무기물 형태보다 소량으로도 이유자돈과 육계의 사양성적, 소화율 및 장내 효과 등에 있어서 개선되는 점을 확인하였다. 특히 훨씬 적은 양이 분변으로 배출되는 것을 확인함으로써, 사양성적에 영향을 받지 않고 사료 내 첨가되는 아연의 함량을 줄일 수 있으며, 더 나아가 환경오염 문제도 개선시킬 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황산아연과 가용화제를 혼합한 혼합물을 열용융 압출기를 이용하여 열용융 압출하는 단계를 포함하는 황산아연 나노콜로이드 분산체를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 황산아연 나노콜로이드 분산체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 황산아연 나노콜로이드 분산체를 유효성분으로 함유하는 황산아연 흡수율 개선용 사료첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 제조법에 의해 무기 금속류의 황산아연 나노콜로이드 분산체를 개발할 수 있다. 특히, 황산아연의 입자경을 나노 크기 단위까지 감소시킴으로써 경구 투여 후 위장관에서의 흡수율을 증가시키는데 기여할 수 있다. 또한, 체내 흡수율이 증가될 경우 분변내 포함된 중금속에 의한 환경오염을 줄일 수 있다. 또한, 실험동물에서 경구 투여시 점막독성이 없었기 때문에 안전하게 생체 응용이 가능하다. 따라서, 본 발명은 미량으로 존재하는 동물 체내 아연의 효과적인 공급에 크게 기여할 것이므로, 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 열용융압출법을 이용한 황산아연 나노콜로이드 분산체의 제조 모식도이다.
도 2는 본 발명의 또 다른 구현예에 따른 열용융압출기를 이용한 황산아연 나노콜로이드 분산체의 제조 모식도이다.
도 3은 ZnSO4/SP NCs 분산액의 입자특성이다. 증류수, 인공위액(pH1.2) 및 인공장액(pH6.8)에 분산된 ZnSO4/SP NCs 제형의 입도분포(A) 및 투과전자현미경사진(B)이다.
도 4은 ZnSO4, 솔루플러스(SP) 및 ZnSO4/SP NCs의 분말 X선 회절 양상 결과이다.
도 5는 (A) ZnSO4, (B) 솔루플러스(SP) 및 (C) ZnSO4/SP NCs의 X선 광전자 분광분석 결과이다.
도 6은 (A) ZnSO4, (B) 솔루플러스(SP) 및 (C) ZnSO4/SP NCs의 푸리에 변환 적외선 분광분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 ZnSO4/SP NCs의 안정성을 증류수, pH 1.2 및 pH 6.8 완충액에서 입자의 직경을 측정하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 8은 렛트에 ZnSO4 및 ZnSO4/SP NCs를 경구 투여한 후 소장 점막 조직의 H&E 염색 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황산아연과 가용화제를 혼합한 혼합물을 열용융 압출기를 이용하여 열용융 압출하는 단계를 포함하는 황산아연 나노콜로이드 분산체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 황산아연과 가용화제는 중량 기준으로 2~4:6~8으로 혼합할 수 있고, 바람직하게는 중량 기준으로 3:7로 혼합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 가용화제는 솔루플러스(Soluplus), PEG(polyethylene glycol) 400, PEG 1000, PEG 6000, PEG 8000 또는 PEG 20000일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 혼합물은 계면활성제 및 이온화제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 계면활성제는 Span 80 및 Tween 80이며, 이온화제는 아세트산 또는 오미자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 오미자는 오미자 분말, 오미자 즙 또는 오미자 추출물을 의미하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 열용융 압출은 배럴 온도가 50~60℃이고, 스크류의 속도가 180~220 rpm이며, 압출 속도는 45~55g/min으로 수행하는 것일 수 있고, 바람직하게는 배럴 온도가 55℃이고, 스크류의 속도가 200 rpm이며, 압출 속도는 50g/min으로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 열용융 압출기는 이중 스크류를 포함하며, 직경이 0.8~1.2mm의 압출다이를 포함하는 것이 바람직하다. 단일 스크류 압출기에 비해 이중 스크류 압출기는 다음과 같은 이점을 제공한다; 높은 분산성, 쉬운 재료 공급, 낮은 과열 위험성, 높은 공정 생산성, 공정 파라미터의 효과적인 조정. 상기와 같은 이중 스크류 시스템을 통해 생성되는 강한 힘은 ZnSO4을 솔루플러스(SP) 기제에 균일하게 분산시킬 수 있고, 동시에, ZnSO4의 나노 크기의 입자는 유기 고분자(SP 등)로 뒤덮이게 되고, ZnSO4 입자 위의 SP 코팅은 표면 에너지와 응집체 발생을 감소시켰다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 황산아연(ZnSO4)과 솔루플러스를 중량 기준으로 2~4:6~8으로 혼합한 혼합물을 이중 스크류를 포함하고, 압출다이 직경이 0.8~1.2mm인 열용융 압출기를 이용하여 배럴 온도가 50~60℃이고, 스크류의 속도가 180~220 rpm이며, 압출 속도는 45~55g/min으로 열용융 압출하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 황산아연 나노콜로이드 분산체를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 황산아연 나노콜로이드 분산체에서, 상기 황산아연 나노콜로이드 분산체의 크기는 50~500㎚일 수 있고, 바람직하게는 70~80㎚일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 황산아연 나노콜로이드 분산체를 유효성분으로 함유하는 황산아연 흡수율 개선용 사료첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제 조성물은 이유자돈과 육계의 사양성적, 소화율 및 장내 흡수 효과를 개선시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제는 추가적으로 포유류 또는 양식 어류 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 사료첨가제를 배합한 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제는 사료 조성물 기준으로 1.5~4.5 중량%, 바람직하게는 3 중량% 배합되는 것일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다. 또한, 본 발명은 상기 사료 조성물을 가축 또는 양식어류에게 급이하여 가축 또는 양식어류를 사육하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 시약
ZnSO4·H2O는 티엠씨사(TMC Co., Ltd., Anyang, Korea)에서 구입한 것을 사용하였다. SP는 바스프(BASF SE, Ludwigshafen, Germany)에서 받았다. 다른 모든 화학물질들은 분석 등급을 사용하였으며 화학 중개상에서 구입하였다.
2. ZnSO 4 / SP NCs의 제조 및 입자특성 규명
ZnSO4와 SP(3:7, w/w)는 압출 직전에 섞어 압출기에 넣고 50 g/min의 속도로 압출하였다. 이 혼합물은 원형 사출구(1.0 mm 직경)를 가지는 이중 스크류 열용융 압출기(STS-25HS, Hankook E.M. Ltd., Pyoungtaek, Korea)로 제조하였다. 배럴의 온도는 50~60℃로 유지되었고 스크류의 속도는 200 rpm으로 하였다. 압출물은 실온에서 식힌 뒤 HBL-3500S 그라인더(Samyang Electronics Co., Gunpo, Korea)를 이용하여 분쇄하였다.
ZnSO4/SP NCs의 입자 특성은 ZnSO4 기준 10 mg/mL 농도에서 평가되었다. 증류수(DW), pH 1.2 와 pH 6.8 완충액에서 ZnSO4/SP NCs의 평균 직경, 다분산지수 및 제타 전위를 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)과 레이저 도플러법을 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다(ELS-Z1000; Otsuka Electronics, Tokyo, Japan). 증류수(distilled water; DW), pH 1.2 와 pH 6.8 완충액에서 ZnSO4/SP NCs의 형태학적 모양은 투과전자현미경으로 확인하였다. 분산체를 구리 격자 필름 상에서 2%(w/v) 포스포텅스텐산에 10분간 염색한 뒤 투과전자현미경(JEM 1010; JEOL, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
3. X선 회절분석법(X-ray diffractometry analysis, XRD)
ZnSO4, SP 및 ZnSO4/SP NCs의 X선 회절분석을 Philips X'Pert PRO MPD 회절분석기(PANalytical Corp., Almero, Netherlands)로 진행하였다. 30 mA 및 40 kV에서 10-70° 2θ 범위에서 CuKα-방사선(1.5418 Å)을 사용하였다. 단계 크기 및 스캔 속도는 각각 0.013°와 8.67 sec/단계였다.
4. X선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)
ZnSO4, SP 및 ZnSO4/SP NCs 바깥층의 화학적 구성요소를 분석하기 위한 방법으로 X선 광전자 분광법(K-Alpha+, Thermo Fisher Scientific, East Grinstead, UK)을 사용하였다. X선 광전자 분광 분석으로 ZnSO4, SP 및 ZnSO4/SP NCs의 Zn 2p, O 1s, N 1s, C 1s, Cl 2p 및 S 2p 원자 분율을 확인할 수 있다. 초점 크기는 400 ㎛였다.
5. 적외선 분광법(Fourier-Transform infrared, FT-IR)
FrontierTM FT-IR 분광계(PerkinElmer Inc., Buckinghamshire, UK) 장비에서 감쇠전반사(attenuated total reflectance, ATR) 기법을 이용하여 ZnSO4, SP 및 ZnSO4/SP NCs의 적외선 분광 스펙트럼을 얻었다. 각 시료의 투과율(%)은 400에서 4,000 cm-1까지 스캔하였다.
6. ZnSO 4 /SP NCs의 시험관내 안정성 시험
유체역학적 크기를 측정하는 방식으로 다른 용매(DW, pH１.２ 및 ６.８)에서 ZnSO4/SP NCs를 10 ㎎/㎖ 농도로 분산시킨 후 안정성을 평가하였다. 각각의 조건에서 2시간과 6시간 시점의 ZnSO4/SP NCs의 평균 직경을 동적광산란법(ELS-Z1000; Otsuka Electronics)으로 측정하였다.
7. ZnSO 4 /SP NCs의 점막 독성 시험
개발된 ZnSO4/SP NCs의 생체 내 독성 시험은 수컷의 Sprague-Dawley(SD) 랫트(250 ± 5 g의 체중; Orient Bio, Sungnam, Korea)에서 진행 되었다. 구입한 랫트는 22 ± 2℃의 온도와 55 ± 5%의 적절한 습도가 유지되는 공간에서 사육하였다. 동물실험의 방법은 강원대학교의 실험동물위원회에서 승인을 받았다. 열용융압출 제형의 소장점막에서의 독성을 확인하기 위해서 조직 염색을 시행하였다. ZnSO4 또는 ZnSO4/SP NCs를 ZnSO4 기준 100 mg/kg으로 물에 분산시켜 랫트에게 경구투여하였고 6시간 후에 공장(jejunum)을 적출하였다. 공장의 조직을 4%(v/v) 포름알데히드 액에서 1일 동안 고정시킨 뒤, 증류수로 세척하고, 알코올로 탈수시킨 후, 파라핀으로 고정하였다. 고정된 조직을 5-10㎛의 두께로 자른 뒤 헤마톡실린-에오신(hematoxylin and eosin, H&E) 시약으로 염색하였다. 광학현미경으로 염색한 조직을 관찰하여 개발된 제형의 독성을 평가하였다.
8. 통계처리
통계적 처리는 분산분석(ANOVA)을 이용하여 실행하였다. 모든 시험은 최소 3회 이상 시행하였고, 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
9. 열용융압출 ( HME , Hot Melt Extrusion) 제형으로 가공된 황산아연 (ZnSO 4 HME)을 첨가한 이유자돈의 사양성적, 영양소 소화율, 소장의 형태학적 변화 분석 방법
9-1. 동물, 사료 및 급이
총 200 마리의 이유자돈(요크셔×란드라스×듀록)을 초기 BW 평균 체중을 기초(7.15 ± 0.81 kg)로 4개의 처리구로 나누었다. 각 처리구는 반복구마다 10 마리의 돼지로 5 반복구로 실험하였다. 실험 사료는 NRC (2012)에 의해 제안된 영양소 요구량을 초과하였고, 총 28일 동안 2단계(0 ~ 14일은 단계 1, 15~28일은 단계 2)의 사료로 급이하였고, 사료의 배합비는 표 1에 나타내었다. 처리구는 다음과 같다 : 1) 기초사료 + ZnSO4로부터 100 mg/kg 농도로 Zn을 첨가, 2) 기초사료 + ZnMet로부터 100 mg/kg 농도로 Zn을 첨가, 3) 기초사료 + ZnSO4 HME로부터 50 mg/kg 농도로 Zn을 첨가(ZnSO4 HME 50), 4) 기초사료 + ZnSO4 HME로부터 75 mg/kg 농도로 Zn을 첨가(ZnSO4 HME 75). 본 발명에서 ZnSO4 HME는 상기 ZnSO4/SP NCs와 동일한 것으로, 열용융압출(HME, Hot Melt Extrusion) 제형으로 가공된 황산아연(ZnSO4 HME)을 의미한다.
실험 사료의 구성
첨가물 단계 1 단계 2
옥수수 43.37 50.12
어분(60%) 5.00 3.00
훼이분말 20.00 15.00
대두박 22.03 25.04
Hamlet Protein 300 3.00 2.00
소이-오일 3.76 2.41
염화콜린 (50%) 0.05 0.05
인산이수소칼슘 0.38 0.33
라임스톤 0.67 0.79
소금 0.20 0.20
미네랄 프리믹스1 ) 0.15 0.15
비타민 프리믹스2 ) 0.03 0.03
L-라이신·HCl (98%) 0.52 0.39
DL-메티오닌 (99%) 0.27 0.15
DL-트립토판 (10%) 0.52 0.29
피타제 0.05 0.05
총 100.00 100.00
계산된 구성비 (%)
대사에너지 (kcal/kg) 3,400 3,350
조단백질 22.00 21.00
칼슘 0.80 0.70
유효 인 0.42 0.33
SID3 ) 리신 1.35 1.23
SID 메티오닌 + 시스틴 0.74 0.68
1)사료 1kg당 포함된 양: 45 mg 철, 0.25 mg 코발트, 50 mg 구리, 15 mg 망간, 0.35 mg 요오드, 0.13 mg 셀레늄
2)사료 1kg당 포함된 양:16,000 IU 비티민 A, 3,000 IU 비티민 D3, 40 IU 비티민 E, 5.0 mg 비티민 K3, 5.0 mg 비티민 B1, 20 mg 비티민 B2, 4 mg 비티민 B6, 0.08 mg 비티민 B12, 40 mg 판토텐산, 75 mg 니아신, 0.15 mg 비오틴, 0.65 mg 엽산.
3)이상적인 소화 기준(Standardized ileal digestible)
9-2. 시료 및 측정
돼지의 체중은 실험을 개시할 때와 각 단계(phase)가 종료되는 시점에서 개별적으로 측정되었다. ADG(average daily gain, 일당증체량), ADFI(average daily feed intake, 일당사료섭취량) 및 G:F(gain to feed ratio, 사료효율)를 산정하기 위해, 사료 섭취량은 각 단계의 종료시 계산되었다. 확실한 ATTD(apparent total tract digestibility)에 대한 상이한 처리 효과를 조사하기 위해, 불소화성 표시제로 산화크롬(0.25%)이 각 사료에 첨가되었고, 실험의 각 단계의 마지막 5일 동안 분변을 수집하여 건물(dry matter, DM), 총에너지(gross energy, GE) 및 조단백질(crude protein, CP)의 ATTD를 분석하였다. 분변 샘플은 반복구(pen)에서 모아 60℃에서 72시간 동안 에어 오븐에서 건조하였고, Wiley Mill (Thomas Model 4 Wiley Mill, Thomas Scientific, Swedesboro, NJ)로 분쇄하여 분석에 사용하였다. 급이 이후, 각 실험구(반복 당 2마리 돼지)로부터 10 마리의 돼지를 도살하였고, 반복 당 2마리의 돼지로부터 대정맥을 소듐 헤파린을 포함하는 튜브에 수집하고, 혈액 샘플 10 ml을 수집하였다.
9-3. 화학적 분석
AOAC(Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists International. 18th ed. Gaithersburg, MD, USA)의 방법에 따라 DM (dry matter, 건중량, Method 930.15) 및 CP (crude protein, 조단백질, Method 990.03)에 대한 3 반복구에서 각 샘플을 분석하였다. 사료의 총 에너지(Gross energy) 및 분변(excreta)은 봄베 열량계(Model 1261, Parr Instrument, Molin, IL, USA)를 이용하여 측정하였고, 반면 크롬 농도는 Fenton and Fenton (1979)의 방법(Fenton, T. W. and Fenton, M. 1979 Can. J. Anim. Sci.59(3):631-634)에 따라서 자동화된 분광광도계(Shimadzu, Japan)로 측정하였다. 사료, 분변 및 간에서의 Zn 농도는 ICP(inductively coupled plasma emission spectroscopy)를 이용하여 AOAC(2007)에 의해 준비된 회분으로 결정하였다. 본 연구에 사용된 사료 및 분변 샘플은 Zn 농도 결정을 위해 3 반복구에서 측정되었고, 분쇄한 사료 및 분변 샘플 1g은 600℃, 머플로(muffle furnace)에서 1시간 동안 건조된 회분로 만들었다. 그 후 회분 샘플은 식혀서 10 ml 50% HCl (v/v)을 추가하여 녹이고, 뚜껑을 덮어 밤새 두었다. 각 샘플은 와트만 필터 페이퍼를 사용하여 100 ml 플라스크에서 2~3회 여과하였고, 탈염 이온수로 희석하고, Zn 농도를 ICP로 측정하였다. 간 샘플은 105℃에서 24시간 동안 건조시켰고 스테인레스 스틸 블레이드 그라인더로 분쇄하였다. 1g 간 샘플을 측정하여, 600℃에서 1시간 동안 머플로에서 회분으로 만들었다. 그 후 회분의 간 샘플은 10 ml 50% HCl (v/v)를 첨가하여 녹였고, 뚜껑을 덮어서 밤새 두었다. 샘플은 100ml 플라스크에서 와트만 필터로 2~3회 여과하였고, 탈염 이온수로 희석하고, Zn 농도를 ICP로 측정하였다.
9-4. 소장 형태
각각의 장 샘플에 대한 3개의 단면을 스탠다드 파라핀 앰배딩 방법(Uni et al., Poult. Sci. 77:75-82)을 이용하여 azure A 및 eosin으로 염색한 후 준비하였다. 각각의 장의 단면을 분석하기 위해 3 반복구에서 잘 정렬된 크립트-융모 그룹(총 10개)이 선택되었다. CD(Crypt depth)는 인접한 융모 사이의 함입 깊이로 특정하였으며, VH(Villus height)는 융털 크립트 접합부에서 융모의 끝단까지로 결정하였다. 이미지 프로세싱 및 분석 시스템을 이용함으로써, 모든 형태학적 특징은 10㎛ 증가분(Media Cyber genetics, Optimus software version 6.5, North Reading, MA, USA)까지 CD 및 VH가 측정되었다.
9-5. 통계 분석
현재 실험 데이터의 통계 분석은 무작위적 블록 디자인에서 SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC, USA)의 GLM 과정을 이용하여 수행하였다. 처리구간의 유의차는 Tukey's Honestly 유의차 테스트를 이용하여 구분하였다. 축사(pen)는 사양성적, 영양소 소화율 및 분변의 아연 농도에 대한 실험적 단위로 고려되었다. 반면 돼지 개체는 소장의 형태 및 간의 Zn 농도의 분석을 위한 실험 단위로 사용되었다. 0.05 미만의 확률은 유의적인 것으로 분석했다.
10. 열용융압출 (HME, Hot Melt Extrusion) 제형으로 가공된 황산아연( ZnSO 4 HME )을 첨가한 육계 의 사양성적, 영양소 소화율, 소장의 형태학적 변화 분석 방법
10-1. 육계, 사료 및 급이
육계의 사양성적에서 사료에 첨가된 아연 농도 및 원료의 영향을 조사하고자 하였다. 총 525 마리의 육계를 공시하여 7개의 처리구로 실험을 진행하였다. 각 처리구당 반복은 5반복으로 반복 당 15 수의 육계를 공시하여 실험을 진행하였다. 실험 사료는 두 단계로 35일 동안 급이하였다(1-21일, 단계 I 및 22-35일, 단계 II). 단계 I에서, 3100 kcal/kg ME 및 21.50% CP를 포함하는 사료로 급이하였고, 단계 II에서는 3200 kcal/kg ME 및 19.50% CP를 포함하는 사료로 급이하였다. 사료에는 Ross 308 nutrition specification (Aviagen, R. 2014)의 영양 요구량에 맞추거나 이를 초과하기 위해 비타민, 미네랄 및 AA를 첨가하였다(표 2). 본 발명에서 ZnSO4 HME는 상기 ZnSO4/SP NCs와 동일한 것으로, 열용융압출(HME, Hot Melt Extrusion) 제형으로 가공된 황산아연(ZnSO4 HME)을 의미한다.
실험 사료의 배합비 구성
첨가물 단계 I (d 1-21) 단계 II (d 22-35)
함량 (%)
옥수수 50.67 57.71
대두박 40.05 28.37
옥수수글루텐박 - 5.00
동물성지방 5.23 5.02
염화콜린 (50%) 0.05 0.05
라임스톤 1.45 1.36
염 0.3 0.3
MDCP 1.45 1.33
비타민 프리믹스1 0.10 0.10
미네랄 프리믹스2 0.15 0.15
트레오닌 (98%) 0.13 0.10
라이신 (55%) 0.06 0.21
메티오닌 (80%) 0.31 0.25
피타제 0.05 0.05
총 100.00 100.00
계산된 화학조성
대사에너지 (kcal/kg) 3100 3200
조단백질 (%) 21.50 19.50
칼슘 (%) 0.89 0.79
유효 인 (%) 0.44 0.40
리신 (%) 1.15 1.03
메티오닌 (%) 0.56 0.51
아연 (mg/kg) 32.95 25.20
1)사료 1kg당 포함된 양: 9,000IU 비타민 A (팔미테이트), 1,800IU 비타민 D3 (콜레칼시페롤), 30mg 비타민 E (dl-α-토코페릴아세테이트), 1mg 비타민 K3 (메나디온), 1mg 비타민 B1 (티아민), 10mg 비타민 B2 (리보플라빈), 4mg 비타민 B6 (피리독신), 0.02mg 비타민 B12 (시아노코발라민), 30mg 니아신, 12mg 판토텐산, 0.50mg 폴산, 0.20mg 비오틴.
2)사료 1kg당 포함된 양: 80mg Fe, 20mg Cu, 120mg Mn, 1.40mg I, 및 0.30mg Se.
10-2. 실험 과정 및 샘플링
실험 시작일, 21일 그리고 35일째에 육계 무게를 각각 측정하였다. 남은 잔량의 사료는 각 단계의 육계 무게를 측정한 후에 측정하였고, 섭취한 사료량은 단계 I, 단계 II 및 전 기간 동안 측정되었다. 육계의 총 증체량, 사료 섭취량 및 사료 요구율(FCR)은 죽은 육계의 무게로 수집되었다.(제거) 사료의 영양소 함량 분석을 위해 각 사양 단계 별 사료를 샘플링 하여 수행하였다. 18~33일까지 분변 샘플의 수집을 용이하게 하기 위해 각 반복구로부터 두 마리의 육계를 각각의 케이지(2마리/케이지)에 가두었다. 소화되지 않은 성분으로 2.5 g/kg 크롬을 포함하는 사료가 급이되었다. 분변 샘플의 수집을 용이하게 하기 위해 각 반복구로부터 두 마리의 육계를 각각의 케이지(2마리/케이지)에 분리하여 가두었고, 분변 샘플은 18-21일 및 33-35일 동안 각각의 케이지로부터 개별적인 트레이를 사용하여 수집하였다. 분변 샘플은 60℃, 72시간 동안 열기건조기로 건조시켰고, 깃털 샘플은 분리하였고, Wiley mill (Thomas Wiley® Mill, Model 4, Thomas scientific, USA)에서 1mm 스크린으로 분쇄했다. 영양소 함량은 다음과 같이 계산했다: 영양소 함량(%) = 100 - [100 Х (사료 내 % Cr/분변 내 % Cr) Х (분변 내 % 영양소/사료 내 % 영양소)].
아연 농도를 측정하기 위해, 35일째에 각각의 반복구(pen)에서 무작위적으로 선발된 건강한 육계 2마리를 대상으로 항응고제로 소듐 헤파린(Becton Dickinson, NJ)을 포함하는 일회용 진공채혈기 튜브에 정맥으로부터 혈액 샘플(10 ml)을 수집하였다. 혈청 샘플은 원심분리 후에 수집되었고(4℃, 3,000 × g에서 15분), 분리된 혈청 샘플은 이후 아연 농도를 측정하기 위해 -20℃에 보관하였다. 실험의 마지막 날(35일), 35 마리의 육계(1마리/반복구)가 무작위로 선발되었고, 실험을 위해 희생되었다. 간 및 오른쪽 경골은 각각의 케이지(처리당 5마리)의 평균 무게에 해당하는 1마리 육계로부터 수집되었다. 장 절편(십이지장, 공장 및 회장)의 부위로부터 형태학적 변화를 분석하기 위해 수집하여 생리식염수로 내용물을 제거하고, 20 g/l 파라포름알데하이드, 15 g/l 아크롤레인 및 30 g/l 글루타르알데히드를 포함하는 고정 스탠다드 용액(pH 7.3, 0.1 M 콜리딘 버퍼)에 담궈놓은 후 실험을 계속하였다.
10-3. 화학적 분석
AOAC (2007)의 방법에 따라서, DM (Method 930.15) 및 CP (Method 990.03)에 대한 3 반복구에서 각 샘플을 분석하였다. 사료의 총 에너지(Gross energy) 및 분변은 봄베 열량계를 이용하여 측정하였고, 반면 크롬 농도는 Fenton and Fenton (1979)의 방법에 따라서 자동화된 분광광도계 (Shimadzu, Japan)로 측정하였다.
10-4. 아연 결정
사료, 분변, 혈청, 간 및 경골에서 아연 농도는 AOAC (2007) 방법에 의해ICP(inductively coupled plasma emission spectroscopy)를 이용한 회분(dissolved ashes)로 결정하였다. 본 연구에 사용된 사료 및 분변 샘플은 Zn 결정을 위해 3 반복구를 측정하였고, 분쇄한 사료 및 분변 샘플 1g은 600℃에서 머플로(muffle furnace)에서 1시간 동안 회분으로 만들었다. 그 후 회분 샘플은 식혀서 10 ml 50% HCl (v/v)을 추가하여 녹이고, 뚜껑을 덮어 밤새 두었다. 각 샘플은 와트만 필터 페이터를 사용하여 100 ml 에서 2~3회 여과하였고, 탈염 이온수로 희석하고, Zn 농도를 ICP로 측정하였다. 혈청 샘플 1ml는 자기 도가니에서 측정되었고, 105℃에서 4시간 동안 건조시키고, 600℃ 머플로에서 1시간 동안 회분으로 만들었다.
간 샘플은 105℃에서 24시간 동안 건조시켰고 스테인레스 스틸 블레이드 그라인더로 분쇄하였다. 1g 간 샘플을 측정하여, 600℃에서 1시간 동안 머플로에서 회분으로 만들었다. 경골로부터 부드러운 조직을 모두 제거한 후, 뼈는 105℃에서 24시간 동안 건조시켰고 600℃에서 1시간 동안 머플로에서 회분으로 만들었다. 그후 건조되고 회분으로 변한 혈청, 간 및 0.5 g 경골 샘플은 10 ml 50% HCl (v/v)을 첨가하여 녹이고, 밤새 뚜껑을 덮어두었다. 그 후 건조된 회분의 간 샘플은 10 ml 50% HCl (v/v)를 첨가하여 녹였고, 뚜껑을 덮어서 밤새 두었다. 샘플은 100ml 플라스크에서 Whatman filter로 2~3회 여과하였고, 탈염 이온수로 희석하고, Zn 농도를 ICP로 측정하였다.
10-5. 소장 형태
각각의 장 샘플에 대한 3개의 단면을 스탠다드 파라핀 앰배딩 방법(Uni et al., 1998)을 이용하여 azure A 및 eosin으로 염색한 후 준비하였다. 각각의 장의 단면을 분석하기 위해 3 반복구에서 잘 정렬된 크립트-융모 그룹(총 10개)이 선택되었다. CD(Crypt depth)는 인접한 융모 사이의 함입 깊이로 특정하였으며, VH(Villus height)는 융털 크립트 접합부에서 융모의 끝단까지로 결정하였다. 이미지 프로세싱 및 분석 시스템을 이용함으로써, 모든 형태학적 특징은 10㎛ 증가분(Media Cyber genetics, Optimus software version 6.5, North Reading, MA, USA)까지 CD 및 VH가 측정되었다.
10-6. 통계 분석
현재 실험 데이터의 통계 분석은 무작위적 블록 디자인에서 SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC, USA)의 GLM 과정을 이용하여 수행하였다. 처리구간의 유의차는 Tukey's Honestly 유의차 테스트를 이용하여 구분하였다. 사료에서 ZnSO4 HME 농도(0, 25, 50, 75 및 100%)의 증가 효과는 일차(linear) 및 이차(quadratic)의 차이를 평가하기 위해 직교 다향식(orthogonal polynomials) 결과를 이용하여 비교하였다. 축사는 사양성적, 영양소 소화율 및 분변의 아연 농도에 대한 실험적 단위로 고려되었다. 반면 육계 개체는 소장의 형태 및 간의 Zn 농도의 분석을 위한 실험 단위로 사용되었다. 0.05 미만의 확률은 유의적인 것으로 분석했다.
실시예 1. ZnSO 4 /SP NCs의 제조 및 입자특성 분석
본 발명에서는 열용융압출법에 의해 SP를 고분자 기제 및 안정화제로 사용하고 ZnSO4가 봉입된 나노전달체를 제조하였다. 본 발명에서 ZnSO4의 물에서의 분산액은 입자 크기가 5 ㎛ 이상이었다. 나노 전달체의 제조는 ZnSO4의 세포내 도입 및 점막 투과도를 증가시켜 줄 것으로 기대된다. 열용융압출법이 ZnSO4의 나노전달체를 제조하는데 이용되었다. 회전하는 스크류가 ZnSO4와 SP를 다이 쪽으로 밀어내며 그 물질들은 균일하게 혼합하고 압출과정에서 연화된다(도 1). 열용융압출 과정 중 가해지는 압력과 열은 ZnSO4 분자를 기질인 SP에 균일하게 분산시킬 수 있다. 즉, SP의 양친매성을 고려할 때 ZnSO4는 SP에 둘러싸이는 구조를 갖게 된다. 열용융압출 이후, 압출물은 분쇄되었고 수용액에 분산되었다. 표 3에 나온 것처럼 ZnSO4/SP NCs 분산액의 입자 직경은 75 nm였다. 다분산지수(약 0.1)을 고려할 때, ZnSO4/SP NCs의 입도분포는 좁은 것으로 판단된다. ZnSO4/SP NCs를 증류수에 분산시켰을 경우 제타 전위는 0에 가까웠다. 비슷한 ZnSO4/SP NCs 분산액의 입자 직경이 pH 1.2에서는 관찰되었으나, pH 6.8에서는 약간의 응집체가 관찰되었다(도 3). ZnSO4/SP NCs의 원형 모양은 투과전자현미경 사진에서도 나타났다(도 3).
ZnSO4/SP NCs 입자의 특징
제형 평균직경 (nm) 다분산지수 제타전위 (mV)
ZnSO4/SP NCs 75 ± 2 0.10 ± 0.01 1.0 ± 1.3
ZnSO4/SP NCs는 입자의 특징을 평가하기 위해 DW에 10 mg/mL로 분산시켰음. 데이타는 평균±표준편차(SD) (n ≥ 3)를 나타냄.
실시예 2. 고체 특성 평가
ZnSO4의 SP에서의 분산은 X선 회절분석법에 의해 평가되었다(도 4). 복수의 뾰족한 피크가 ZnSO4의 그래프에서 나타났으며 이는 결정성을 나타낸다. 이와는 대조적으로, SP의 X선 회절분석 결과에서는 뾰족한 피크가 거의 나타나지 않았다. 이는 SP의 무정형을 의미하며 이전 연구결과와 일치한다(Lee et al., Drug Des. Devel. Ther. 2015, 9, 2745-2756). SP의 시차주사열량계 분석 결과에 따르면, 광범위한 피크가 70℃ 근처에서 나타났으며 이 온도 근처에서 유리 상태에서 유동 상태로의 전환을 의미한다(Lee et al., Drug Des. Devel. Ther. 2015, 9, 2745-2756). ZnSO4/SP NCs의 뾰족한 피크 강도는 ZnSO4의 피크 강도보다 약해졌고, ZnSO4와 SP간 상호 작용을 의미한다. SP의 양친매성 때문에 그것은 ZnSO4 분자의 외부 표면에 코팅될 수 있다.
ZnSO4와 SP간의 상호작용은 또한 X선 광전자 분광 분석을 통해 연구되었다(도 5). 시험 재료의 외곽 층 화학적 조성은 X선 광전자 분광 분석을 통해 밝혀질 수 있다. 도 5와 같이, ZnSO4 중 Zn 2p의 구성비율은 12.76%였다. S 2p와 O 1s 피크는 SO4 2-이온의 존재를 의미한다. SP에서 C 1s, N 1s 및 O 1s의 조성비는 각각 67.29%, 0.51% 및 32.20%였다(도 5). ZnSO4/SP NCs의 경우 Zn 2p와 S 2p 원소 함량은 0.61% 및 0.66%로 감소했다. ZnSO4와 비교했을 때 ZnSO4/SP NCs의 Zn 2p와 S 2p 함량의 급감은 ZnSO4/SP NCs에 존재하는 SP층을 의미한다.
ZnSO4/SP NCs의 제조는 적외선분광법에 의해 또한 확인되었다(도 6). SO4 2- 이온은 4개의 진동준위(v1, v2, v3, v4)를 갖고 있고 해당 피크가 ZnSO4의 스펙트럼에 나타났다. 3117 cm-1 근처의 광범위한 피크는 물 분자에 기인한다. SP의 카르보닐기는 1800-1400 cm-1 사이에서 나타났다. 1731 cm-1 및 1628 cm-1에서 나타난 피크들은 OCOCH3 및 CON 또는 아미드기를 의미한다. 이 두 피크들은 ZnSO4/SP NCs의 스펙트럼에도 나타났지만 ZnSO4와 SP간의 상호작용 때문에 파수 및 강도가 변하였다. 이는 열용융압출법에 의해 ZnSO4가 SP에 균일하게 분산된 것을 의미한다.
실시예 3. ZnSO 4 /SP NCs의 안정성
개발된 ZnSO4/SP NCs의 안정성은 증류수, pH 1.2 및 pH 6.8 완충액에서 평가되었다(도 7). SP의 양친매성은 수용액에서 ZnSO4의 균일한 분산에 기여한다. 그러나, 약제학적 염 및 효소의 존재 또는 다양한 pH는 ZnSO4/SP NCs 분산액의 안정화 및 유지에 영향을 줄 수 있다. 일반적으로 pH 1.2 및 6.8은 인공 위액 및 인공 장액 환경을 의미한다. 제조한 ZnSO4/SP NCs의 구조적 안정성은 각각의 용매에서의 입자 직경을 측정하는 것으로 평가되었다. 도 7과 같이, 증류수와 pH 1.2 용액에서는 6시간이 지나도 입자 직경이 크게 변하지 않았다. pH　6.8 완충액에서는 ZnSO4/SP NCs의 입자 직경이 증류수 및 pH 1.2 용액에서 측정한 값들보다 더 컸다. 그러나 6시간이 지나니 입자 직경이 약 100 nm 정도로 감소하였다. pH 6.8 완충액에 함유된 약제학적 염이 NC의 응집체 형성에 영향을 미쳤으나 시간이 지나면서 영향력이 감소하는 것처럼 관찰되었다. pH 6.8 완충액에서 ZnSO4/SP NCs의 초기 입자 직경이 224nm였지만 이 크기도 나노전달체의 점막 전달에 적합한 것으로 판단된다. pH 1.2와 6.8에서의 제조된 ZnSO4/SP NCs의 나노 크기 유지는 경구 투여 후 소장 점막으로 효율적인 전달을 하는데 기여할 수 있다.
실시예 4. ZnSO 4 /SP NCs의 소장 점막 독성 평가
개발된 ZnSO4/SP NCs 제형의 소장 점막에 대한 독성은 랫트에 경구 투여한 후 평가되었다. 상피세포에서의 독성을 평가하기 위해 공장 절편을 H&E 염색하였다(도 8). 아연은 소장 점막에 존재하는 밀착 결합(tight junction)에 영향을 주고 소장의 상피 세포 단층막의 방어 역할을 변화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Wang et al., Dig. Dis. Sci. 2013, 58, 7787). 또한, 고농도의 아연에서는 세포자살 등 여러 기전을 통해 소장 세포에 독성을 유발할 수 있다(Zodl et al., J. Inorg. Biochem. 2003, 97, 324-330). ZnSO4와 ZnSO4/SP NCs를 각각 처리한 그룹 간에 상피세포의 형태간에 큰 차이는 없었다(도 8). 단회 투여 후에 급성 독성은 없는 것으로 판단된다. 양친매성 SP는 ZnSO4/SP NCs 제조과정에서 표면 장력을 감소시켜 ZnSO4/SP NCs의 유체역학적 크기를 줄이는데 기여하는 것으로 보인다. 그러나, ZnSO4/SP NCs의 제조 과정에서 SP의 독성은 고려되어야 한다. 제조회사의 결과에 따르면 SP의 LD50 값은 5g/kg 이상인 것으로 알려졌다(Lee et al., Drug Des. Devel . Ther . 2015, 9, 2745-2756). SP의 LD50 값을 고려할 때, SP는 현재 투여량에서 안전하게 사용될 수 있을 것으로 추정된다. ZnSO4/SP NCs의 분산성과 안전성은 성공적인 생체 적용을 의미한다.
여기까지, 본 발명의 내용을 요약하면 다음과 같다 : 열용융압출법으로 제조한 ZnSO4의 NC 제형을 제조하였고 제형의 물리화학적 특성을 평가하였다. ZnSO4 분산액의 수 마이크론 크기는 열용융압출 과정에 의해 나노 크기 단위로 감소하였다. ZnSO4는 SP에 균일하게 분산되었고, 75 nm 입자직경, 0.1의 다분산지수, -1 mV 제타전위를 갖는 ZnSO4/SP NCs가 제조 되었다. 열용융압출 과정에 의해 ZnSO4는 양친매성 SP 분자에 의해 둘러싸여진 것으로 판단된다. SP로 코팅된 ZnSO4는 X선 회절분석, X선 광전자 분광분석, 적외선 분광분석법 등에 의해 확인되었다. ZnSO4/SP NCs 분산액의 유체역학적 크기가 인공 위장관액 환경에서 6시간 동안 유지된 결과는 나노 입자 안정성 유지를 의미한다. ZnSO4/SP NCs를 랫트에 경구 투여시, 소장 상피점막에 심각한 독성을 유발하지 않았다. 이러한 결과들은 제조한 ZnSO4/SP NCs 제형이 효과적이고 안전하게 적용될 수 있음을 의미한다.
실시예 5. 사료내 열용융압출 ( HME , Hot Melt Extrusion) 제형으로 가공된 황산아연(ZnSO 4 HME)의 첨가가 이유자돈의 사양성적, 영양소 소화율, 소장의 형태학적 변화 및 분중 아연 배출에 미치는 영향
5-1. 사양성적(Growth performance) 및 영양소 소화율
ADG(average daily gain, 일당증체량), ADFI(average daily feed intake, 일당사료섭취량) 및 G:F(gain to feed ratio, 사료효율)에 대한 결과는 표 4에 나타내었다. ADG, ADFI 및 G:F은 단계 1에서 처리구에서 영향을 나타내지 못했다. ADG는 ZnSO4가 첨가된 사료에 비해 ZnSO4 HME 75에서 향상되었다. G:F는 단계 2에서 ZnSO4 HME 75 (p<0.085)에 의해 증가되었다. 표 5에서 영양소의 ATTD(apparent total tract digestibility)에 대한 ZnSO4 HME 공급의 효과를 나타내었다. 단계 1(p>0.05)에서 DM, GE, 및 CP의 ATTD에 대한 ZnMet의 효과는 없었다. 그러나, 단계 2(p=0.014)에서 CP의 ATTD를 ZnSO4 HME 75가 개선시켰다. 본 발명에서 ZnSO4 HME는 상기 ZnSO4/SP NCs와 동일한 것으로, 열용융압출(HME, Hot Melt Extrusion) 제형으로 가공된 황산아연(ZnSO4 HME)을 의미한다.
이유 자돈의 사양성적에 대한 규정 사료 내 아연 농도의 영향
Item1 ) ZnSO4 ZnSO4 HME2 ) SEM3 ) p-value
50 75
단계 1 (0-14 d)
ADG (g) 247 243 254 4.48 0.744
ADFI (g) 351 363 395 4.25 0.269
G:F 0.71 0.67 0.64 0.01 0.171
단계 2 (15-28 d)
ADG (g) 501b 506b 536a 5.67 0.009
ADFI (g) 821 813 816 4.25 0.895
G:F 0.61 0.62 0.66 0.01 0.085
Overall (0-28 d)
ADG (g) 373b 374b 395ab 3.81 0.013
ADFI (g) 586 588 606 5.84 0.579
G:F 0.64 0.64 0.65 0.01 0.406
데이터는 반복(pen)당 10 마리 돼지의 5개 반복구의 평균값.
1)Zn 함량 (mg/kg 사료): ZnSO4, 100 mg; ZnSO4 HME 50, 50 mg; ZnSO4 HME 75, 75 mg.
2)열용융압출법(Hot melt extrusion)으로 Zn 황산염을 제조함
3)표준편차
ab상이한 첨자를 가진 컬럼의 평균값은 유의차를 나타냄(p<0.05)
이유 자돈의 영양소 소화율에 대한 규정 사료 내 아연 농도의 영향
Item1 ) ZnSO4 ZnSO4 HME2 ) SEM3 ) p-value
50 75
단계 1 (d 14)
DM 83.79 83.32 84.24 1.17 0.988
GE 82.63 82.17 84.25 1.23 0.938
CP 76.16 75.43 76.73 1.65 0.993
단계 2 (d 28)
DM 82.37 81.70 83.34 1.20 0.955
GE 81.92 81.27 82.27 1.23 0.988
CP 73.52b 73.93b 76.77a 0.57 0.014
데이터는 반복(pen) 당 10 마리 돼지의 5개 반복구의 평균값.
1)Zn 함량 (mg/kg 사료): ZnSO4, 100 mg; ZnSO4 HME 50, 50 mg; ZnSO4 HME 75, 75 mg.
2)열용융압출법(Hot melt extrusion)으로 Zn 황산염을 제조함
3)표준편차
ab상이한 첨자를 가진 컬럼의 평균값은 유의차를 나타냄(p<0.05)
5-2. 소장의 형태학적 변화
십이지장 및 회장에서 VH, CD 및 VH:CD 비율에 대한 ZnSO4 HME의 영향은 없었다(p>0.05)(데이터 미제시). ZnSO4 HME 75 (p=0.044)가 공급된 돼지 급이 사료에서 공장의 융털 길이(villus height, VH)는 증가되는 영향을 보였다(표 6).
이유 자돈의 소장(공장) 형태에 대한 규정 사료 내 아연 농도의 영향
Item1 ) ZnSO4 ZnSO4 HME2 ) SEM3 ) p-value
50 75
VH(Villus height) 670ab 646b 696a 6.68 0.044
CD(Crypt depth) 341 364 349 12.10 0.935
VH:CD 1.97 1.84 2.01 0.07 0.854
데이터는 반복(pen) 당 10 마리 돼지의 5개 반복구의 평균값.
1)Zn 함량 (mg/kg 사료): ZnSO4, 100 mg; ZnSO4 HME 50, 50 mg; ZnSO4 HME 75, 75 mg.
2)열용융압출법(Hot melt extrusion)으로 Zn 황산염을 제조함
3)표준편차
ab상이한 첨자를 가진 컬럼의 평균값은 유의차를 나타냄(p<0.05)
5-3. 아연의 함유 및 배출
간 및 분변에서 아연 농도를 표 7에 나타내었다. ZnSO4 HME 50이 공급된 돼지 급이 사료은 간에서 유의적으로 Zn 농도가 더 낮았다(p=0.037). 분변에서 아연 농도는 ZnSO4에서 ZnSO4 HME 50 또는 ZnSO4 HME 75보다 유의적으로 더 높았다.
이유 자돈의 간 및 분변에서 규정 사료 내 아연 농도의 영향
Item1 ) ZnSO4 ZnSO4 HME2 ) SEM3 ) p-value
50 75
간 (mg/kg)4) 175.26ab 166.58b 177.68ab 2.36 0.037
분변 (mg/kg)5) 867.53a 443.08c 739.83b 44.05 <0.001
1)Zn 함량 (mg/kg 사료): ZnSO4, 100 mg; ZnSO4 HME 50, 50 mg; ZnSO4 HME 75, 75 mg.
2)열용융압출법(Hot melt extrusion)으로 Zn 황산염을 제조함
3)표준편차
4)데이터는 반복(pen) 당 2 마리 돼지의 5개 반복구의 평균값
5)데이터는 반복(pen) 당 10 마리 돼지의 5개 반복구의 평균값.
ab상이한 첨자를 가진 컬럼의 평균값은 유의차를 나타냄(p<0.05)
실시예 6. 사료내 열용융압출(HME, Hot Melt Extrusion) 제형으로 가공된 황산아연(ZnSO 4 HME)의 첨가가 육계의 사양성적, 영양소 소화율, 소장의 형태학적 변화 및 분중 아연 배출에 미치는 영향
6-1. 사양성적(Growth performance) 및 영양소 소화율
육계의 사양성적에 있어 규정 사료에서의 아연 농도의 영향을 표 8에 나타냈다. ZnS (inorganic) 및 ZnSO4 HME (inorganic HME produced)을 첨가한 사료는 총 증체량 및 사료요구율(FCR)에 있어서 유의적 효과를 나타냈다(P<0.05). 아연을 포함하는 사료를 공급한 그룹에서 총 증체량은 대조구에 비해 더 높고, 사료요구율은 더 낮았다. 게다가, 육계는 ZnSO4 HME 첨가량이 증가할수록 총 증체량 및 사료 이용 효율이 일직선으로(linearly) 개선되는 것을 확인하였다(linear, P<0.05).
ZnSO4 HME 50%은 기초 사료 및 ZnSO4 HME 25% (P<0.05)보다 총 증체량 및 사료 효율을 개선시켰고, ZnSO4 HME 75% 및 100%인 더 높은 농도와 비교하여 유사한 결과를 나타냈다. ZnSO4 HME50%의 성장율 및 사료 이용 효율은 ZnS 100%, ZnSO4 HME 100%와 비교하여 유의차가 없었다. 그러나 아연 농도뿐만 아니라 아연 원료(ZnS이거나 또는 ZnSO4 HME)도 사육 전 기간 동안 사료 섭취량에 어떠한 영향도 끼치지 않았다(P>0.05).
이를 통해, 육계 사료 내 ZnSO4 HME 50%를 첨가하였을 때, 사양성적, 소화율, 장내 효과 등이 ZnSO4 HME 75% 및 100%를 첨가했을 때와 비슷하다는 결론을 얻었다. 이를 통해 우리는 사양성적에 영향을 받지 않고 사료 내 첨가되는 ZnSO4 HME의 함량을 줄일 수 있을 것이다.
육계의 사양성적에 대한 규정 사료 내 아연 농도의 영향
Item1 ZnS Control ZnSO4 HME2 SEM3 P-value4
25 50 75 100 Treatments Linear Quadratic
Overall (d 1~35)
증체량 (g/bird) 1,958a 1,882b 1,891b 1,960a 1,980a 1,990a 7.68 <0.001 <0.001 0.235
사료섭취량 (g/bird) 2,993 3,025 2,968 2,979 3,019 3,008 8.94 0.215 0.958 0.645
사료요구율
(FCR)		 1.53b 1.61a 1.57a 1.52b 1.53b 1.51b 0.01 <0.001 <0.001 0.224
1Zn 아연 (mg/kg 사료): 대조구, 0; ZnS (Zinc sulfate; inorganic), 110 mg; ZnSO4 HME, 25% (27.5 mg), 50% (55 mg); 75% (82.5 mg); 100% (110 mg).
2)열용융압출법(Hot melt extrusion)으로 Zn 황산염을 제조함
3)표준편차
4)일차, 이차: Zn 농도
ab상이한 첨자를 가진 컬럼의 평균값은 유의차를 나타냄(p<0.05)
6-2. 육계의 분변, 혈청, 간 및 경골에서의 아연 농도의 영향
육계의 분변, 혈청, 간 및 경골의 규정 사료에서의 아연 농도의 영향을 표 9에 나타냈다. 아연 원료(ZnS이거나 또는 ZnSO4 HME)에 상관없이 분변, 혈청, 간 및 경골에서 대조구보다 아연 농도가 증가되었다(P<0.05). 무기물인 ZnS은 다른 모든 처리구보다 분변에서 아연 농도가 높았다. 그러나, 같은 처리 농도인 ZnSO4 HME 100%에서는 ZnS 보다 훨씬 적은 양이 분변으로 배출되는 것을 확인함으로써, 사양성적에 영향을 받지 않고 사료 내 첨가되는 ZnSO4 HME의 함량을 줄일 수 있으며, 더 나아가 환경오염 문제도 개선시킬 수 있다.
또한, 혈청, 간 및 경골에서 아연 농도는 ZnS 100% 처리 그룹보다 ZnSO4 HME 100% 처리구 그룹에서 더 높게 유지되었다. 이를 통해 ZnSO4 HME이 아연의 체내 흡수율을 개선시키는 점을 알 수 있다.
육계의 분변, 혈청, 간 및 경골에 대한 규정 사료 내 아연 농도의 영향
Item1 ZnS Control ZnSO4 HME2 SEM3 P-value4
25 50 75 100 Treatments Linear Quadratic
분변 Zn (mg/kg) 524.46a 169.28e 183.57e 272.62d 328.94c 422.89b 19.38 <0.001 <0.001 <0.001
혈청 Zn (mg/L) 2.00ab 1.25d 1.66c 1.71bc 2.14a 2.13a 0.06 <0.001 <0.001 0.281
간 Zn (mg/kg) 113.73b 102.76c 113.19b 117.18b 134.44a 137.30a 2.21 <0.001 <0.001 0.003
경골 Zn (mg/kg) 183.48a 144.19d 148.40d 161.96c 173.68b 185.28a 2.68 <0.001 <0.001 <0.001
1Zn 아연 (mg/kg diet): 대조구, 0; ZnS (Zinc sulfate; inorganic), 110 mg; ZnSO4 HME, 25% (27.5 mg), 50% (55 mg); 75% (82.5 mg); 100% (110 mg).
2)열용융압출법(Hot melt extrusion)으로 Zn 황산염을 제조함
3)표준편차
4)일차, 이차: Zn 농도
ab상이한 첨자를 가진 컬럼의 평균값은 유의차를 나타냄(p<0.05)
6-3. 소장의 형태학적 변화
육계의 소장 형태에 있어 규정 사료에서의 아연 농도의 영향을 표 10에 나타냈다. 35일째, ZnS, ZnSO4 HME을 포함한 육계 사료는 공장(jejunum)의 VH 및 VH:CD을 증가시켰다(P<0.05). 더욱이, 공장(jejunum)의 CD에 대한 아연은 유의한 영향을 나타냈다(P<0.05). 육계는 ZnSO4 HME의 첨가 농도가 증가될수록 공장의 VH를 개선시켰다(linear & quadratic, P<0.05). 공장의 VH:CD는 ZnSO4 HME가 첨가된 사료에서 일차로 증가하였다. 게다가 첨가된 육계 사료에서 ZnSO4 HME의 농도는 공장의 CD(crypt depth)에서 이차적 효과를 나타냈다(quadratic, P<0.05). 본 연구는 공장의 VH:CD가 ZnSO4 HME 75 및 100%와 비교하여 ZnSO4 HME 50%에서 통계적인 유의차는 없는 점을 확인하였다.
육계의 소장 형태에 대한 규정 사료 내 아연 농도의 영향
Item1 ZnS Control ZnSO4 HME2 SEM3 P-value4
25 50 75 100 Treatments Linear Quadratic
VH(Villus height) 1,319a 1,187bc 1,132c 1,182bc 1,281a 1,275ab 14.40 <0.001 0.001 0.001
CD(Crypt depth) 194a 174ab 159ab 140b 144b 170ab 4.39 0.003 0.147 0.019
VH:CD 6.88c 6.87c 7.16bc 8.55ab 8.91a 7.65abc 0.18 0.002 0.009 0.246
1Zn 아연 (mg/kg diet): 대조구, 0; ZnS (Zinc sulfate; inorganic), 110 mg; ZnSO4 HME, 25% (27.5 mg), 50% (55 mg); 75% (82.5 mg); 100% (110 mg).
2)열용융압출법(Hot melt extrusion)으로 Zn 황산염을 제조함
3)표준편차
4)일차, 이차: Zn 농도
ab상이한 첨자를 가진 컬럼의 평균값은 유의차를 나타냄(p<0.05)

Claims (11)

  1. 황산아연(ZnSO4)과 솔루플러스를 2~4:6~8의 중량비로 혼합한 혼합물을 이중 스크류를 포함하고, 압출다이 직경이 0.8~1.2 mm인 열용융 압출기를 이용하여 배럴 온도가 50~60℃이고, 스크류의 속도가 180~220 rpm이며, 압출 속도는 45~55 g/min으로 열용융 압출하는 단계를 포함하는 황산아연 나노콜로이드 분산체를 제조하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항의 방법에 의해 제조된 73~77 nm 크기의 황산아연 나노콜로이드 분산체.
  10. 삭제
  11. 제9항의 황산아연 나노콜로이드 분산체를 유효성분으로 함유하는 황산아연 흡수율 개선용 사료첨가제 조성물.
KR1020180057037A 2017-08-21 2018-05-18 열용융압출법을 이용하여 제조된 황산아연 나노콜로이드 분산체 및 이의 용도 KR102098587B1 (ko)

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