KR102097669B1 - 탈질 활성이 우수한 신규 탈질균 마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스 dN46-6 - Google Patents

탈질 활성이 우수한 신규 탈질균 마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스 dN46-6 Download PDF

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이영우
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Abstract

본 발명은 수탁번호 KACC 92251P로 기탁된 신규 탈질균 마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스 dN46-6(Microvirgula aerodenitrificans dN46-6) 균주에 관한 것이다.
본 발명의 균주는 호기조건과 혐기조건에서 모두 높은 탈질능을 나타낼 수 있어 별도의 혐기 처리 시설의 구축없이 적용할 수 있으며, 고농도의 유기물 및 질산염이 존재하는 조건에서도 높은 탈질능을 나타낼 수 있어 폐수를 희석하는 과정없이 또는 희석배율을 낮춘 상태로도 적용할 수 있다. 따라서 본 발명의 균주는 수질 정화의 공정 절감 및 처리량 증가에 따른 장점이 있다.

Description

탈질 활성이 우수한 신규 탈질균 마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스 dN46-6{Novel denitrification bacteria Microvirgula aerodenitrificans dN46-6 showing excellent denitrification activity}
본 발명은 수탁번호 KACC 92251P로 기탁된 신규 탈질균 마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스 dN46-6(Microvirgula aerodenitrificans dN46-6) 균주에 관한 것이다.
각종 생활하수 또는 산업폐수(하폐수)의 증가로 인한 환경오염이 사회적인 문제가 되고 있다. 화학약품의 처리를 통한 폐수 처리공정은 이차적인 환경오염 문제를 유발하기 때문에, 생물학적인 방법으로 폐수 및 분뇨를 처리하는 방법이 다양하게 적용되고 있다. 생물학적 질소처리방법은 질소 순환에서 탈질 미생물의 탈질반응을 이용하는 방법과 미생물이 질소를 영양원으로 섭취하는 것을 이용하는 방법이 있다.
탈질은 질산성 산소가 존재하는 상태에서 미생물에 의해 질산성 질소나 아질산성 질소가 질소가스(N2)로 전환되는 과정을 말한다. 탈질균은 유ㅇ무기성 전자공여체를 사용할 수 있는 화학 영양균이며, 종속영양 탈질반응에는 전자공여체로서 유기탄소원을 필요로 하므로, 유기탄소원이 적은 경우에는 적절한 탄소원이 필요하다.
과거에는 용존산소가 존재하지 않은 혐기상태에서 탈질반응이 진행된다고 알려져 왔으나, 최근 많은 연구들을 통해 호기상태에서 탈질을 수행하는 많은 균들이 밝혀져 왔다.
일반적으로 수처리 균주는 고농도의 유기물 및 질소화합물 상태에서 생육이 어려워 폐수를 희석해야 하며, 이에 따른 폐수량의 증가는 시설비와 처리비용에 직접적인 영향을 미치는 문제점이 있다.
이에 본 발명자는 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여, 질소가 고농도로 존재하는 환경에서도 생육 및 탈질반응을 일으킬 수 있으며, 또한 호기 및 혐기조건 모두에서 탈질능력을 발휘할 수 있는 새로운 균주를 발굴하고자 하였다.
Int J Syst Bacteriol, 48 Pt 3, 775-782. doi: 10.1099/00207713-48-3-775. Water Res, 35(1), 189-197.
따라서 본 발명의 주된 목적은 질소가 고농도로 존재하는 환경에서도 생육 및 탈질반응을 일으킬 수 있으며, 또한 호기 및 혐기조건 모두에서 탈질능력을 발휘할 수 있는 새로운 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KACC 92251P로 기탁된 신규 탈질균 마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스 dN46-6(Microvirgula aerodenitrificans dN46-6) 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주의 배양물을 제공한다.
본 발명의 균주는 호기조건과 혐기조건에서 모두 높은 탈질능을 나타낼 수 있어 별도의 혐기 처리 시설의 구축없이 적용할 수 있으며, 고농도의 유기물 및 질산염이 존재하는 조건에서도 높은 탈질능을 나타낼 수 있어 폐수를 희석하는 과정없이 또는 희석배율을 낮춘 상태로도 적용할 수 있다. 따라서 본 발명의 균주는 수질 정화의 공정 절감 및 처리량 증가에 따른 장점이 있다.
도 1은 본 발명 균주의 16S rDNA 염기서열의 상동성을 Genbank database를 이용하여 분석한 결과이다.
도 2는 질산염이 100ppm인 호기조건에서 본 발명 균주의 생장곡선과 질산염 감소율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 질산염이 1,000ppm인 호기조건에서 본 발명 균주의 생장곡선과 질산염 감소율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 질산염이 5,000ppm인 호기조건에서 본 발명 균주의 생장곡선과 질산염 감소율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 질산염이 100ppm인 혐기조건에서 본 발명 균주의 생장곡선과 질산염 감소율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 질산염이 1,000ppm인 혐기조건에서 본 발명 균주의 생장곡선과 질산염 감소율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 질산염이 5,000ppm인 혐기조건에서 본 발명 균주의 생장곡선과 질산염 감소율을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스 dN46-6(Microvirgula aerodenitrificans dN46-6)는 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 수탁번호 KACC 92251P로 기탁되어 있다.
상기 본 발명의 균주는 경기도 내 폐수처리장의 잉여슬러지로부터 질산염(NO3)이 함유된 고체배지에 희석 도말하는 방법을 통해 분리되었다.
상기 분리 과정 중 다양한 속(genus)의 균들이 분리되었는데, 이중에서 본 발명의 균주가 생육속도 및 탈질능이 가장 우수한 것으로 나타났다.
본 발명 균주의 탈질능은 Durham 방법을 통해 확인하였는데, 이 방법은 potassium nitrate가 포함된 Reasoner's 2A 액체배지(R2A broth)(Potassium nitrate 1g, Proteose peptone 0.5g, Casamino acids 0.5g, Yeast extract 0.5g, Dextrose 0.5g, Soluble starch 0.5g, Dipotassium phosphate 0.3g, Sodium pyruvate 0.3g, Magnesium sulfate per 7H2O 0.05g, per liter)를 유리관에 담고, 그 안에 durham 튜브를 넣은 후 균주를 7일간 배양하여, 튜브 내에 가스가 생성되는지 확인하는 실험방법이다.
본 발명 균주의 16S rDNA 서열은 서열번호 1로 표시될 수 있다.
본 발명의 균주는 간상의 형태를 나타내고, 그람음성이며, 세포의 크기는 0.4 ~ 0.6 X 1.2 ~ 2.5㎛ 정도이다.
본 발명의 균주는 0 ~ 4.5%(w/v) NaCl의 존재 하에서 생육할 수 있으며, pH 6.0 ~ 8.0의 조건, 15 ~ 40℃의 온도조건에서 생육할 수 있다.
본 발명의 균주는 산화효소 활성 및 카탈라아제 활성을 나타낼 수 있고, D-galactose 및 D-glucose를 탄소원으로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 균주는 탈지분유를 분해할 수 있는 것으로 나타났다. 탈지분유는 주로 고분자로 이루어져 있어 이를 분해할 수 없는 미생물들이 많은데, 본 발명의 균주는 탈지분유를 분해할 수 있기 때문에 이를 생장 또는 탈질을 위한 탄소원으로 이용할 가능성이 높다. 따라서 탈지분유를 포함시켜 제제화하는데 있어서 큰 장점이 될 수 있다.
본 발명의 균주를 배양할 경우, 바람직하게는 25 ~ 30℃의 온도조건, pH 6.5 ~ 7.5 범위에서 배양하는 것이 좋고, 배양배지로는 R2A, Tryptic Soy Broth (TSB)(Tryptone 17g, peptone 3g, dextrose 2.5g sodium chloride 5g, dipotassium phosphate 2.5g) 등을 사용할 수 있다.
상기와 같은 조건에 따라 본 발명의 균주를 배양하면 본 발명의 균주 배양물을 제조할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 본 발명 균주의 분리 및 분류학적 동정
폐수처리장에서 채취한 잉여슬러지를 modification R2A plate(Potassium nitrate 1g, Proteose peptone 0.5g, Casamino acids 0.5g, Yeast extract 0.5g, Dextrose 0.5g, Soluble starch 0.5g, Dipotassium phosphate 0.3g, Sodium pyruvate 0.3g, Magnesium sulfate per 7H2O 0.05g, agar 1.5%, pH 6.8, per liter)에 serial dilution 기법으로 도말 접종하였다. 30℃에서 3일 이상 배양한 후, 형성된 단일 집락을 취하여 단일 집락이 되도록 반복 계대배양하였으며 계통분석을 수행하기 위해 16S rDNA 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 분석하기 위해 R2A 배지에서 키운 균주의 genomic DNA를 DNA-extraction kit(Solgent)로 추출하고 16S rDNA 785F(5'-GGA TTA GAT ACC CTG GTA-3'; 서열번호 2), 16S rDNA 907R(5'-CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT-3'; 서열번호 3) 및 16S rDNA 1492R(5'-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3'; 서열번호 4) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 시퀀싱을 마크로젠(주)에 의뢰하여 분석하였다.
16S rDNA 염기서열(서열번호 1)을 Genbank database 서치로 추론하여 Microvirgula aerodenitrificans 와 99%의 상동성을 가지는 것으로 분석되었다(도 1 참조). 이에 본 발명자들은 상기 본 발명에서 동정한 균주를 "마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스(Microvirgula aerodenitrificans) dN46-6"로 명명하였고, 이를 2018년 11월 5일자로 한국농업미생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KACC 92251P).
분리한 dN46-6 균주의 형태학적 특성 및 생화학적 특성을 조사하여 다음 표 1에 나타내었다.
특성 dN46-6 균주
형태 간상(rod-shaped)
그람 염색 -
세포크기 (μm) 0.4-0.6 x 1.2-2.5
NaCl 범위 (최적, %) 0-4.5 (0)
pH 범위 (최적) 6.0-8.0 (6.5-7.5)
온도 범위 (최적, ℃) 15-40 (25-30)
산화효소(oxidase) 활성 +
카탈라아제(catalase) 활성 +
탄소원 활용
D-Galactose +
D-glucose +
탈질화 :
질산염(nitrate) → 아질산염(nitrite) +
아질산염(nitrite) → N2 +
또한, 상기 균주의 탈지분유 분해능을 확인하기 위해, R2A 배지 조성에 skim milk(BD BactoTM)를 8g/L로 첨가한 고체배지에 dN46-6 균주를 도말하여 30℃에서 3일간 배양한 후, 콜로니가 생성된 곳에 투명한 환의 생성여부를 확인한 결과, 탈지분유 분해능이 확인되었다.
실시예 2. 본 발명 균주의 생장 곡선과 시간경과에 따른 질산염 감소 측정
분리된 본 발명 dN46-6 균주의 생육 속도를 측정하기 위해 30℃에서 7일간 상기 potassium nitrate가 첨가된 R2A배지에 배양하여 생장 곡선을 그리고, 질산염(nitrate) 농도 변화를 humas kit(HS-NO3(N)-CA)로 측정하였다. 질산염(NO3) 농도별 100ppm, 1,000ppm, 5,000ppm이 함유되어 있는 각각의 배지에서 생장 곡선은 12시간 마다 흡광도(optical density 600nm)로 측정하였고, 질산염 농도도 함께 측정하였다.
시간이 경과하여 균이 자랄수록 질산염 농도는 감소하였으며, 다른 배지 조건에서 배양하였을 때에도 시간에 따라 질산염 농도가 감소하는 결과를 얻을 수 있었다. 측정한 결과를 도 2 내지 7에 나타내었다.
각 농도(100, 1,000, 5,000ppm)별로 질산염(NO3)이 함유된 배지에 본 발명의 dN46-6 균주를 접종한 후 30℃에서 진탕 배양하여 시간별 배지 중에 잔존하는 질산염 농도를 측정한 결과, 본 발명의 dN46-6 균주는 배지에 함유된 질산염의 농도가 낮을수록 빠른 속도로 질산염을 제거하는 것으로 나타났으며, 높은 질산염 농도 조건에서도 우수한 탈질 활성을 나타내었다. 또한, 호기조건에서도 탈질이 신속히 일어나지만 혐기조건일 경우에는 더욱 빠른 속도로 탈질이 이루어지는 것을 확인하였다. 이 결과는 본 발명의 마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스 dN46-6 균주가 고농도의 질소 및 유기물 조건에서도 별도의 희석없이 적용할 수 있는 장점을 갖는다는 것을 의미한다.
농업생명공학연구원 KACC92251P 20181105
<110> Hankyong Industry Academic Cooperation Center <120> Novel denitrification bacteria Microvirgula aerodenitrificans dN46-6 showing excellent denitrification activity <130> PA-D18251 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1459 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Microvirgula aerodenitrificans dN46-6 <400> 1 atgaacgctg gcggcatgct ttacacatgc aagtcgaacg gtaacagggg agcttgctcc 60 cgctgacgag tggcgaacgg gtgagtaatg catcggaacg tgccgaatag tgggggataa 120 cgcaccgaaa ggtgtgctaa taccgcatac gccctgaggg ggaaagtggg ggaccgcaag 180 gcctcacgct aatcgagcgg ccgatgtcgg attagctagt tggtggggta aaggctcacc 240 aaggcgacga tccgtagcgg gtctgagagg atgatccgcc acactgggac tgagacacgg 300 cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aattttggac aatgggggaa accctgatcc 360 agccatgccg cgtgtctgaa gaaggccttc gggttgtaaa ggacttttgt ccgggaggaa 420 accctgatcg ttaatagcgg tcgggactga cagtaccgga agaataagca ccggctaact 480 acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta 540 aagcgtgcgc aggcggtgag ataagtcagc tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact 600 gcggccgaaa ctgtctcgct agagtacgtc agaggggggt ggaattccac gtgtagcagt 660 gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccaa tggcgaaggc agccccctgg gatgatactg 720 acgctcatgc acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccc 780 taaacgatgt cgactagccg ttggagacct cggtctttgg tggcgcagct aacgcgtgaa 840 gtcgaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga cgggggcccg 900 cacaagcggt ggatgatgtg gattaattcg atgcaacgcg aaaaacctta cctacccttg 960 acatgccagg aacctcccgg agatgggagg gtgcccgaaa gggaacctgg gcacaggtgc 1020 tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080 cccttgccat tagttgccat cattaagttg ggcactttaa tgggactgcc ggtgacaaac 1140 cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcct catggccctt atgggtaggg cttcacacgt 1200 catacaatgg tcggtacaga gggttgcgaa gccgcgaggt gaagctaatc ccagaaaacc 1260 gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc 1320 gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380 atgggagtgg aatccgccag aagtgggtag ggtaaccgta aggagcccgc ttaccacggt 1440 aggtttcatg actggggtg 1459 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for 16S rDNA of Microvirgula aerodenitrificans dN46-6 <400> 2 ggattagata ccctggta 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for 16S rDNA of Microvirgula aerodenitrificans dN46-6 <400> 3 ccgtcaattc ctttragttt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for 16S rDNA of Microvirgula aerodenitrificans dN46-6 <400> 4 cggttacctt gttacgactt 20

Claims (2)

  1. 수탁번호 KACC 92251P로 기탁된 마이크로비르굴라 에어로디니트리피칸스 dN46-6(Microvirgula aerodenitrificans dN46-6) 균주.
  2. 삭제
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