KR102083082B1 - Vegf 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VEGF(혈관내피세포 성장인자; Vascular endothelial growth factor) 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지되어 있으며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있는 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 VEGF 단독 처리에 비해 VEGF 흡수를 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색 등의 허혈성 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Prevention or Treatment of Ischemic Disease Comprising Liposome Encapsulated Vascular Endothelial Growth Factor Peptide}
본 발명은 VEGF(혈관내피세포 성장인자; Vascular endothelial growth factor) 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 VEGF 유래 펩타이드를 담지시킨, 평균 100 nm 입자크기인 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 리포좀은 VEGF 유래 펩타이드 흡수를 증가시킬 수 있으므로, 허혈성 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
허혈성 질환(ischemic disease)은 혈류의 흐름이 막혀 일어나는 심혈관 질환을 포함하는 것으로 허혈성 심근경색(myocardial ischemia) 및 허혈성 말초혈관 질환(peripheral vascular disease)이 이에 해당한다. 이러한 허혈성 질환 중 심혈관질환은 우리나라에서 사망의 수위를 다투고 있으며, 이외에도 뇌혈관질환 및 하지허혈질환이 3대 허혈질환에 속한다. 생활습관의 서구화와 고령화시대로 진입한 우리나라는 이러한 허혈질환 발생률이 높아지고 있으며, 치료에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
최근에는 혈관신생의 기전이 밝혀짐에 따라 허혈 부위에 혈관신생에 관련한 인자 (factor)의 유전자 또는 단백질을 투여하여 혈관생성을 유도함으로써 측부혈류를 증가시켜 허혈성 질환을 치료하고자 하는 시도들이 이루어지고 있다. 그 중, VEGF(Vascular endothelial growth factor)는 혈관내피세포를 특이적으로 성장 분화시키는 단백질로 일반적인 혈관형성에 관여한다고 알려져 있으며, 막힌 혈류의 흐름을 원활하게 하기 위해 VEGF 유전자 등 새로운 혈관을 유도하는 유전자들이 상기 허혈성 질환 치료에 이용되고 있다 (Yla-Herttuala S and Alitalo K, Nat Med ., 9(6):694-701, 2003; Khan TA et al., Gene Ther ., 10(4):285-91, 2003).
하지만, VEGF와 같은 혈관신생 재조합 단백질(peptide)을 투여하는 방법은 다음과 같은 문제점이 있다. 1) 주사한 혈관신생 단백질은 다른 조직으로 이동하거나 활성을 잃어버리기 때문에 혈관신생의 효과를 보기 위해 고순도의 단백을 다량 사용하여야 하므로 막대한 비용이 든다. 2) 측부혈관의 형성을 위하여 단백질을 적은 용량으로 지속적으로 투여하는 것이 바람직하지만, 자주 주사하여야 하는 문제점이 있다. 위와 같은 문제점은 혈관신생 단백질을 주사부위에 머물면서 서서히 방출시킬 수 있는 전달시스템으로 해결될 수 있다. 그리고, 이러한 주사 전달시스템의 생체 내 분포를 정확하게 모니터링 함으로써 치료효과를 효율적으로 예측할 수 있는 추적 전략이 필요하다.
이를 위해 다양한 연구가 이루어지고 있으며, VEGF가 도입된 아데노바이러스 유전자 전달체(Ad.VEGF)를 허혈성 심근 및 근육세포 모델을 대상으로 실험된 결과, 혈관이 크게 증가하는 것이 확인되었으나(Mkinen K et al., Mol . Ther ., 6, 127-133, 2002), 바이러스 벡터 시스템의 경우 안정성의 문제가 남아있다. 따라서, 인체에 안전하고, VEGF 흡수량을 증가시킬 수 있는 전달시스템의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명에서는 VEGF 흡수량을 증가시켜 허혈성 질환의 치료효과를 높이기 위해 예의 노력한 결과, 평균 100 nm 입자크기인 50 내지 200 nm 크기의 입자분포를 가지며, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)로 표면이 개질되어 있고, 2.5 × 10-10M 농도 이상의 VEGF 유래 펩타이드를 담지시킨 리포좀을 약물전달체로 사용하면, 허혈병변에서 VEGF 흡수량이 증가하여 허혈성 질환의 치료효과가 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 허혈성 질환에 대한 치료효과를 증가시킬 수 있는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하며, 상기 리포좀은 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있고, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 VEGF 유래 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 VEGF 유래 펩타이드가 2.5 × 10-10M 농도 이상으로 담지된 리포좀이 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 리포좀은 (a) L-α-포스파티딜 콜린(L-α-phosphatidylcholine; Egg PC), 콜레스테롤(cholesterol; CH) 및 폴리에딜렌 글리콜 (PEG2000)이 결합되어 있는 PEG2000-DSPE {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]을 유기용매에 용해시킨 다음, 증발시켜 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 지질 박층(lipid thin film)을 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 박층을 VEGF 유래 펩타이트가 포함된 용액에 완전히 수화시켜 VEGF 유래 펩타이트가 담지된 리포좀을 제조하는 단계; (c) 상기 리포좀을 다공성 막을 통해 압출시켜 평균 입자크기가 90 내지 110 nm 이며, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 VEGF 유래 펩타이트가 담지된 리포좀을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계에서 L-α-포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 PEG2000-DSPE를 50 : 40 : 10 비율로 용해시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 유기용매는 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 증발은 45 내지 55℃에서 3시간 내지 5시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계의 수화 과정은 VEGF 유래 펩타이드가 포함된 PBS 버퍼 용액에서 35 내지 39℃에서 1시간 내지 2시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 1800g/mol 내지 2200g/mol일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 허혈성 질환은 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실실예에 따르면, 상기 조성물은 주사제형일 수 있다.
본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지되어 있으며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있는 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 VEGF 단독 처리에 비해 VEGF 흡수를 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색 등의 허혈성 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 심근경색질환을 유발한 쥐의 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 심장 관류(perfusion) 변화를 측정한 데이터이다.
도 2는 심근경색질환을 유발한 쥐의 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈조직을 적출하여 면역염색을 통해 측정한 전체 혈관의 수(total vessel count)를 나타낸 데이터이다.
도 3은 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}의 VEGF 섭취량을 비교하기 위하여, 99mTc-HMPAO로 표지한 리포좀을 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 주입한 다음, 30분 및 90분 경과 후 관찰한 감마영상을 나타낸 데이터이다.
도 4는 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}의 평균 입자크기를 100 nm, 300 nm 및 600 nm을 가지도록 준비하여 입자크기 분석 장치인 동적 광산란분석기(dynamic light scattering; DLS, Malvern Instruments Limited, Melvern, 영국)로 측정한 입자분포 데이터이다.
도 5는 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)} 크기를 다르게 하고 99mTc-HMPAO로 표지하여 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 각각 주입한 다음, 90분 경과 후 얻은 감마영상으로부터 허혈병변이 있는 심장에서 흡수량을 관찰한 데이터이다.
도 6은 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 99mTc-HMPAO 및 99mTc-DTPA으로 각각 표지하여 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 주입한 다음, 90분 경과 후 감마영상으로부터 허혈병변이 있는 심장에서 흡수량을 비교한 데이터이다.
도 7은 각각 다른 농도의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 심장을 적출하여 관류(perfusion)을 측정한 데이터이다.
도 8은 각각 다른 농도의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 심근경색 질환 모델을 가진 쥐에 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 심장을 적출하여 면역염색을 통해 측정한 전체 혈관의 수(total vessel count)를 나타낸 데이터이다.
도 9는 심근경색모델을 가진 쥐에 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 각각 다른 농도의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 심장을 적출하여 면역염색을 통해 조직을 관찰한 이미지이다.
도 10은 중뇌동맥협착 모델을 가진 쥐의 총경동맥(common carotid artery)을 통해 대조군(PBS) 및 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 뇌의 관류(perfusion)를 측정한 데이터이다.
도 11은 중뇌동맥협착 모델을 가진 쥐의 총경동맥(common carotid artery)을 통해 대조군(PBS) 및 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 뇌를 적출하여 면역염색을 통해 측정한 전체 혈관의 수(total vessel count)를 나타낸 데이터이다.
도 12는 중뇌동맥협착 모델을 가진 쥐에 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 각각 다른 농도의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 각각 주입한 뒤, 일주일 경과 후 허혈병변이 있는 뇌를 적출하여 면역염색을 통해 조직을 관찰한 이미지이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 허혈성 질환의 치료를 위해 VEGF를 이용한 치료가 각광을 받고 있으나, VEGF와 같은 혈관신생 재조합 단백질을 투여하는 방법은 고순도의 단백질을 다량 투여하거나, 적은 용량으로 지속적으로 투여해야하는 문제가 있으므로, 혈관신생 단백질을 주사부위에 머물면서 서서히 방출시키거나 병변조직에서 흡수량을 증가시킬 수 있는 전달시스템 구축이 필요하다.
본 발명은 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있고, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm인 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 제공하며, 상기 리포좀은 VEGF 유래 펩타이드 흡수를 증가시킬 수 있으므로, 허혈성 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하며, 상기 리포좀은 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있고, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함한다.
상기 VEGF 유래 펩타이드는 일반적으로 상업적으로 판매되고 있는 것을 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Ac-MRIKPHQGQHI-NH2(서열번호 1)의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 사용할 수 있다.
상기 리포좀은 (a) L-α-포스파티딜 콜린(L-α-phosphatidylcholine; Egg-PC), 콜레스테롤(cholesterol; CH) 및 PEG2000-DSPE {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]을 유기용매에 용해시킨 다음, 증발시켜 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 지질 박층(lipid thin film)을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 박층을 VEGF 유래 펩타이트가 포함된 용액에 완전히 수화시켜 VEGF 유래 펩타이트가 담지된 리포좀을 제조하는 단계;
(c) 상기 리포좀을 다공성 막을 통해 압출시켜 평균 입자크기가 90 내지 110 nm 이며, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 VEGF 유래 펩타이트가 담지된 리포좀을 수득하는 단계;
를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 방법을 좀 더 구체적으로 설명하면, 상기 (a) 단계에서 L-α-포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 PEG2000-DSPE는 50 : 40 : 10 비율이 되도록 혼합하는 것을 특징으로 하며, 상기 (a) 단계의 유기용매는 통상적으로 사용하는 용매를 제한 없이 사용할 수 있으나, 알코올, 메탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부탄올 또는 헥산 등의 단독 또는 혼합 형태인 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 클로로포름 및 메탄올이 7:3으로 혼합된 용매를 사용할 수 있다. 또한, 상기 (a) 단계에서 증발은 45 내지 55℃에서 3시간 내지 5시간 동안 수행될 수 있다.
상기 (a) 단계의 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 1800g/mol 내지 2200g/mol이며, 바람직하게는 2000 g/mol의 분자량을 가진 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 수 있으며, 상업적으로 판매되고 있는 것을 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 (b) 단계에서, 수화 과정은 35 내지 39℃에서 1시간 내지 2시간 동안 수행할 수 있으며, 바람직하게 VEGF 유래 펩타이드가 포함된 PBS 버퍼 용액에 지질박층을 수화시켜 리포좀을 제조할 수 있다.
또한, 상기 (c) 단계에서 압출은 400 nm, 200 nm, 100 nm 및 50 nm의 다공크기를 가지는 폴리카보네이트 막을 이용하여 수행할 수 있으며, 압출 과정 후, 리포좀에 담지 되지 않은 VEGF를 제거하기 위해 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 추가적으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 상기 방법으로 제조한 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀이 허혈성 질환에 대한 치료 효능을 증가시키는지 확인하기 위해 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군과 비교실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, PBS 용액을 주입한 대조군에 비하여 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군은 관류(perfusion)의 개선효과 및 전체 혈관의 수가 유의성 있게 증가하지 않은 것을 확인한 반면, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀(LP-VEGF) 처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 관류가 개선되고 전체 혈관의 수가 증가한 것을 확인하였다.
도 3은 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀에 99mTc-HMPAO로 표지하여 주입한 다음 얻은 감마영상으로부터, 시간 경과에 따른 허혈 병변에서 흡수량 변화를 확인한 결과로, 심장의 혈액풀(blood pool)에 의한 영향을 배제하고, 허혈병변에서의 흡수에 의한 결과를 비교하기 위해 리포좀 주입 90분 이후에 결과값을 비교하는 것이 적합한 것을 확인하였다.
도 4는 100 nm, 300 nm 및 600 nm의 평균 입자크기를 가지는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)} 각각에 대한 입자분포를 나타낸 것으로, 평균입자 크기가 100 nm인 경우 50 ~ 200 nm의 입자분포를 가지는 것을 확인하였다.
또한, 도 5는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 크기가 허혈병변에서의 리포좀 흡수에 미치는 영향을 확인한 것으로, 리포좀의 평균 입자 크기가 큰 경우, 허혈병변에서의 흡수량이 급격히 감소하는 것을 확인하였으며, 평균입자 크기가 100 nm 근처일 때 가장 높은 흡수율을 보이는 것을 확인하였다. 리포좀의 평균입자 크기가 50 nm 미만인 경우에는 VEGF 담지율이 매우 적고 리포좀 구조 파열에 의한 담지된 VEGF가 방출되기 힘들어 치료효과가 낮은 문제점이 있다.
본 발명의 다른 일양태에서는 허혈병변에서 실제로 리포좀에 담지된 VEGF 또는 리포좀이 어느 정도 흡수되는지 확인하기 위해 방사선 표지방법을 다르게 하여 리포좀의 흡수량을 비교하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 99mTc-HMPAO로 표지한 값과 DTPA를 이용하여 99mTc룰 표지한 값의 차이가 리포좀에서 방출된 99mTc-HMPAO의 값으로 허혈병변에서 방출과 흡수가 높게 일어남을 알 수 있으며, 허혈병변에서 리포좀의 흡수가 일어나는 것을 확인하였다. 이는 실제 리포좀에 담지된 VEGF가 허혈병변에서 높은 비율로 방출되며 리포좀이 허혈병변에서 흡수되어 허혈병변의 치료 효과를 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 VEGF 유래 펩타이드는 2.5 × 10-10M 농도 이상으로 포함될 수 있으며, 도 7 내지 도 9에 나타난 바와 같이, 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도를 다르게 하여 관찰한 결과, 관류개선 효과 및 전체 혈관 수 증가 효과 모두 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도 차이에 의한 유의한 효과는 관찰되지 않았다.
즉, 본 발명의 2.5 × 10-10 M 농도 이상의 VEGF 유래 펩타이드가 리포좀에 담지되어 있고, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지며, 평균 입자크기가 90 내지 110 nm 이고, 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 리포좀은 허혈병변에서 효과적인 치료효과를 보이는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 허혈성 질환은 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서는 상기 도 1 내지 도 9의 결과를 통해 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 심근경색 질환에 매우 효과적인 치료효과를 확인하였다. 또한, 심근경색질환 이외의 다른 허혈성 질환에 대한 치료효과를 확인하기 위해, 도 10 내지 도 12에 나타난 바와 같이 중뇌동맥협착 질환(transient middle cerebral artery occlusion; MCAO)에 대한 치료효과를 확인한 결과, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀(LP-VEGF) 처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 관류가 개선되고 전체 혈관의 수가 증가한 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 심근경색 질환뿐만 아니라 중뇌동맥협착 질환에서도 높은 치료효과를 보였으며, 이는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 다양한 허혈병변 질환에 치료효과를 가진다는 것을 의미한다.
본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 허혈성 질환 치료효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 허혈성 질환 치료를 위하여 주사제 제형으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 직접 병소에 주사하거나, 또는 병소에 근접한 동맥 또는 정맥에 주사하여 병소에 전달할 수 있다. 비경구 투여를 위한 본 발명의 조성물로는 멸균 수성 또는 비수성 액제, 분산제, 현탁제, 또는 유제 뿐만 아니라 멸균 액제 또는 현탁제로 사용하기 직전에 재조제하는 멸균 산제가 있다. 적합한 멸균 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 생리식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 혼합물, 식물성 오일(예를 들어, 올리브 오일), 주사가능한 유기 에스터(예를 들어, 에틸올레이트)가 있다. 예를 들어, 분산제 및 현탁제의 경우에는 레시틴과 같은 피복재를 사용하여 적절한 특정 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 허혈성 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 제조
본 발명에서는 VEGF에 의한 허혈성 질환의 치료효과를 증가시키위해 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀(liposome; LP)를 제작하였다.
VEGF 유래 펩타이드는 Ac-MRIKPHQGQHI-NH2(서열번호 1)의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 펩트론(peptron; 한국)으로부터 구매하여 사용하였다. L-α-포스파티딜 콜린(L-α-phosphatidylcholine; Egg-PC), 콜레스테롤(cholesterol; CH) 및 L-글루타티온(L-glutathione)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich Chemical Co., 미국)으로부터 구매하여 사용하였으며, PEG2000-DSPE {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], DTPA-DSPE {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid}은 아반티(Avanti Polar Lipids, Inc. 미국)로부터 구입하여 사용하였으며, 고순도의 클로로포름(extra pure chloroform) 및 고순도의 메탄올(extra pure methanol)은 덕산 화학(Duck-San Pure Chemical Co., Ltd, 한국)으로부터 구매하여 사용하였다.
Egg-PC : 콜레스테롤 : PEG2000-DSPE가 50 : 40 : 10 비율이 되도록 지질 박층 수화/압출(lipid thin-film hydration/extrusion) 방법을 사용하여 리포좀을 제조하였다. 상기 방법을 간략하게 설명하면, 먼저 상기에 언급한 지질 비율이 되도록 Egg-PC, 콜레스테롤 및 PEG2000-DSPE를 클로로포름/메탄올(7:3) 혼합용액에 용해시킨 다음, 51℃에서 4시간 동안 증발(evaporation)시켜 폴리에킬렌 글리콜로 표면이 개질된 지질박층을 수득하였다. 상기 수득한 박층을 PBS 버퍼 용액(pH 7.4)을 사용하여 37℃에서 1시간 30분 동안 완전히 수화시켜 리포좀(liposome; LP)을 제조하였으며, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}은 VEGF 유래 펩타이드가 포함된 PBS 버퍼 용액을 사용하여 제조하였다.
그 다음, 제조된 리포좀 및 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 작은 단일 라멜라 소포체(small unilamellar vesicles)를 얻기 위해 아반티 미니 압출기(Avanti mini extruder; Avanti Polar Lipids, Inc. 미국)를 사용하여 400 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm의 다공크기를 가지는 폴리카보네이트 막을 통해 20회 이상 압출하였다.
상기에서 압출하여 제조한 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀에서 담지되지 않은 VEGF를 제거하기 위해 PD Midi-Trap G-25 컬럼(column)을 사용하여 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 수행하였다.
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀에서 VEGF 유래 펩타이드의 담지 효율(loading efficiency)은 수화 전 및 수화 후 과정에서 VEGF 유래 펩타이드 용액의 농도 차이를 이용하여 측정하였으며, VEGF 유래 펩타이드의 영역(area)은 C18 실리카 겔 컬럼(5 ㎛, 10 × 250 mm; YMC, 일본)를 이용한 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC, Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 확인하였다.
VEGF 유래 펩타이드 및 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 심근경색 질환에 대한 치료 효능 평가
본 발명에서는 실시예 1에서 제조한 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀이 허혈성 질환에 대한 치료 효능을 증가시키는지 확인하기 위해 VEGF 유래 펩타이드 단독처리군과 비교실험을 수행하였다.
먼저, 8주령 쥐(Sprague-Dawley)를 ㈜오리엔트 바이오로부터 구입하여 온도 22±3℃, 상대습도 60±20%, 환기횟수 10-20회/시간(hour), 조명 12 시간(AM 08:00 점등, PM 08:00 소등), 멸균 사료 및 급수 공급의 환경에서 3일간의 순화기간 경과 후 심근경색 질환(myocardial infarction) 모델을 유발하고(Hwang HS et al., Radiology, 273(1):160, 2014) 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 대조군(PBS), VEGF 유래 펩타이드(VEGF) 및 실시예 1의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}을 200 ㎕로 각각 주입한 뒤, 일주일 동안 수술 전과 같은 사육 환경에서 사육하였다. 일주일 후, 심장 관류 이미지 측정 시약(myocardial perfusion imaging agent)인 99m테크네슘 테트로포스민(99mTc-tetrofosmin)를 사용하여 심장 방사선자동사진(autoradiography)을 수득한 다음, 하기 수학식 1의 방법을 사용하여 상대적 관류(relative perfusion)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
[수학식 1]
상대적 관류(%) ={(심장 허혈 부위의 99mTc-tetrofosmin 활성 값)/격막의 99mTc-tetrofosmin 활성값)} × 100
또한, 허혈병변이 있는 심장 조직을 적출한 후, 포르말린 고정 및 파라핀 포매(paraffin-embedding) 과정을 통해 수득한 조직을 수화시킨 다음, 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor) 면역조직염색(immunohistochemical stainning)을 수행하였으며, 광학현미경을 사용하여 무작위로 5곳의 영상을 수득하였다. 수득된 영상으로부터 전체 혈관 수(total vessel count)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다. 상기 영상은 200×의 HPF(High Power Field)에서 관찰하였다.
이후의 모든 통계 분석은 SAS ver. 9.2 (SAS Institute, Cary, 미국)을 사용하여 수행하였으며, 차이의 유의성은 Duncan의 다중 테스트 및 ANOVA을 사용하여 결정하였으며, p<0.05에서 유의한 차이를 평가하였다. 모든 데이터는 5% 범위에서 유의성이 있었으며, 평균값±표준편차로 표기하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, PBS 용액을 주입한 대조군에 비하여 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군은 관류(perfusion)의 개선효과를 보이는 것으로 확인되었지만 유의한 결과는 관찰되지 않은 반면, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의한(P=0.003) 관류개선 효과를 보이는 것을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 전체 혈관의 수를 비교한 결과 대조군에 비하여 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군은 전체 혈관의 수가 유의성 있게 증가하지 않은 것을 확인한 반면, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)}처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 전체 혈관의 수가 증가한 것을 확인하였다.
이는 리포좀이 약물전달체로서 허혈병변 조직에 흡수되어, 허혈병변 조직에 흡수되는 VEGF 유래 펩타이드가 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군에 비해 향상된 것으로, 이로 인해 심장의 관류 증가 및 전체 혈관 수가 증가하여 허혈병변에 대한 치료효과가 증가한 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 VEGF 유래 펩타이드 단독 처리군에 비해 허혈성 질환의 치료 효과를 향상시키는 것을 확인하였다.
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 주입 후, 시간 경과에 따른 허혈 병변에서 흡수량 변화 확인
본 발명에서는 심근경색 모델을 가진 쥐에 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 주입한 다음, 시간 경과에 따른 허혈 병변에서 흡수량 변화를 확인하고자 하였다.
먼저, 실시예 1에서 제조한 리포좀을 99mTc-HMPAO(hexamethyl propylene amine oxime)으로 표지시킨 다음, 실시예 2에서 유도한 심근경색질환 모델 쥐의 apical puncture를 통하여 상기 리포좀을 주입하였다.
주입 30분 및 90분 경과 후에 감마영상을 Symbia TruePoint SPECT-CT gamma camera system (Siemens Healthcare, Erlangen, Germany)을 이용하여 감마영상을 얻고 허혈병변에서 VEGF 흡수량을 비교하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 리포좀 주입 30분 후에 관찰한 감마영상에서는 허혈병변이 있는 심장에서 5.28%의 높은 섭취율을 보이는 것을 확인하였다. 심장은 혈액풀(blood pool)이 많은 조직이기 때문에 허혈병변 부위에 흡수되지 않은 99mTc-HMPAO 또는 리포좀에 의한 영향을 배제하기 위해 상기 영향이 사라지기에 충분한 시간인 주입 90분 후에 감마 영상을 관찰하였다. 그 결과, 허혈병변이 있는 심장으로의 흡수율은 4.95%로 주입 30분 후에 비해 다소 감소하였으나, 상당히 높은 값을 나타낸 것을 확인하였다.
본 발명에서는 이후의 실험에서 심장의 혈액풀(blood pool)에 의한 영향을 배제하고, 허혈병변에서의 흡수에 의한 결과를 비교하기 위해 리포좀 주입 90분 이후에 수득한 값을 비교하였다.
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 크기에 따른 허혈병변에서 흡수량 비교
본 발명에서는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 크기가 허혈병변에서의 흡수에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
먼저, 실시예 1과 동일한 방법으로 100 nm, 300 nm 및 600 nm의 평균 입자크기를 가지는 VEGF 유래 펩타이드가 담지되고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀를 제조한 다음, 흡수율 측정을 위해 99mTc-HMPAO(hexamethyl propylene amine oxime)으로 리포좀을 표지하였다.
도 4는 100 nm, 300 nm 및 600 nm의 평균 입자크기를 가지는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 각각에 대한 입자분포를 나타낸 것으로, 평균입자 크기가 100 nm인 경우 50 ~ 200nm의 입자분포를 가지는 것을 확인하였다.
그 다음, 실시예 2에서 유도한 심근경색질환 모델 쥐의 애피컬 펑쳐(apical puncture)를 통하여 상기에서 제조된 크기가 다른 리포좀을 각각 200 ㎕씩 주입한 다음, 90분이 경과한 후 얻은 감마영상을 통하여 흡수량을 비교하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 리포좀의 입자크기에 따라 허혈병변에서의 흡수율이 차이가 나는 것을 확인하였으며, 평균입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지는 리포좀이 가장 높은 흡수율을 보이는 것을 확인하였다.
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀에서 방출된 VEGF와 리포좀의 허혈병변에서 흡수량 비교
본 발명에서는 방사선 표지방법을 달리하여 리포좀에서 방출된 VEGF 흡수량과 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 흡수량을 비교하였다.
먼저, 실시예 1의 방법으로 평균입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지며 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀을 준비하는 과정에서 L-글루타티온(L-glutathione)이 용해된 용액을 이용하여 수화시켜 리포좀을 제조한 다음 99mTc-HMPAO(hexamethyl propylene amine oxime)와 혼합하여 30분 동안 충분히 교반하여 99mTc-HMPAO가 표지된 리포좀을 얻었다. 원심분리기를 이용하여 PBS로 세척하고 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 PD Midi-Trap G-25 컬럼(column)을 사용하여 리포좀에 담지되지 않은 99mTc-HMPAO를 제거하였다. 또 다른 방법으로는, 리포좀 지질층 구성물인 PE에 DTPA(diethylene tetramine penta-acetic acid)가 결합된 DTPA-PE {1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid}를 아반티(Avanti Polar Lipids, Inc. 미국)로부터 구입하여 사용하여 리포좀을 제조한 후 0.1N HCl 용액에 녹인 소량의 SnCl2 (Sigma Aldrich)를 이용하여 99mTc을 표지하였다.
상기 두가지 방법으로 표지된 각각의 리포좀은 실시예 2에서 유도한 심근경색질환 모델 쥐의 apical puncture를 통하여 200 ㎕씩 주입한 다음, 90분이 경과한 후 얻은 감마영상으로부터 흡수량을 비교하였다.
리포좀에 99mTc-HMPAO를 처리하면 99mTc-HMPAO는 VEGF 유래 펩타이드와 유사하게 리포좀 구조 안에 담지되어 표지가 된다. 반면에 리포좀 구조 성분인 PE에 결합된 DTPA에 99mTc를 표지시키면 리포좀 구조에 결합된 99mTc-DTPA 형태로 표지가 된다.
도 6에 나타난 바와 같이, 감마영상에서 관찰한 99mTc-HMPAO로 표지된 리포좀의 허혈병변에서 흡수율은 섭취된 리포좀 안에 담지되어있는 99mTc-HMPAO에 의한 값과 리포좀에서 방출되어 허혈병변에 흡수된 99mTc-HMPAO에 의한 값을 합한 값이다.
반면, DTPA를 이용하여 99mTc를 표지시킨 흡수율은 허혈병변에 흡수된 리포좀에 의한 값으로 99mTc-HMPAO로 표지된 리포좀에 비해 작은 값을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 허혈병변에서 리포좀의 흡수가 일어난 것을 의미하는 것으로, 99mTc-HMPAO로 표지한 값과 DTPA를 이용하여 99mTc룰 표지한 값의 차이가 리포좀에서 방출된 99mTc-HMPAO의 값으로, 리포좀에 담지된 99mTc-HMPAO의 방출과 흡수가 높게 일어남을 확인하였다.
리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드 농도에 따른 허혈성 질환의 치료 효능 평가
본 발명에서는 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도에 따른 허혈성 질환의 치료 효과를 확인하고자 하였다.
먼저, VEGF 유래 펩타이드 농도가 2.5 × 10-10 M, 5.0 × 10-10 M 및 5.4 × 10-9 M이 되도록 실시예 1과 동일한 방법으로 평균입자 크기가 100 nm이며, 50~200 nm 입자분포를 가지고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀을 제조하였다.
상기의 리포좀은 실시예 2에서 유도한 심근경색질환 모델 쥐의 apical puncture를 통하여 각각 200 ㎕씩 주입한 다음, 실시예 2와 동일한 방법으로 심장 관류 이미지를 관찰하고, 상대적 관류(relative perfusion)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
또한, 실시예 2와 동일한 방법으로 전체 혈관 수(total vessel count)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도가 감소하여도 심장 관류 결과에서 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않아, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 적은 농도의 VEGF 유래 펩타이드에서도 허혈병변의 치료효과를 보이는 것을 확인하였다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 전체 혈관의 수를 비교한 결과 리포좀에 담지된 VEGF 유래 펩타이드의 농도 차이에 의한 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
도 9는 상기 면역염색을 통해 조직을 관찰한 이미지로, VEGF 유래 펩타이드 농도에 상관없이 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 처리에 의해 전체 혈관이 생성된 것을 확인하였다.
즉, 상기 결과로부터 2.5 × 10-10 M 농도 이상의 VEGF 유래 펩타이드가 리포좀에 담지되어 있고, 평균입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀은 허혈병변에서 효과적인 치료효과를 보이는 것을 확인하였다.
VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 중뇌동맥협착 질환에 대한 치료 효능 평가
본 발명에서는 심근경색질환 이외의 다른 허혈성 질환에 대해 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀의 치료효과가 있는지 확인하고자 하였다.
먼저, 실시예 1과 동일한 방법으로 5.0 × 10-10 M 농도의 VEGF 유래 펩타이드를 리포좀에 담지시킨 다음, 최종적으로 평균입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀을 제조하였다.
그 다음, 8주령 쥐(Sprague-Dawley)를 ㈜오리엔트 바이오로부터 구입하여 중뇌동맥협착 질환(transient middle cerebral artery occlusion; MCAO) 모델을 유발하고(Nagasawa H et al, Stroke; a journal of cerebral circulation, 20:1037. 1989; Bunevicius A et al., BioMed research international, 2013:634598, 2013), 총경동맥(common carotid artery)을 통하여 대조군(PBS), 상기 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-(LPVEGF)}을 200 ㎕로 각각 주입한 뒤, 실시예 2와 동일한 방법으로 허혈병변이 있는 뇌의 관류 이미지를 관찰한 다음, 상대적 관류(relative perfusion)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
또한, 실시예 2와 동일한 방법으로 전체 혈관 수(total vessel count)를 측정하여, VEGF 유래 펩타이드에 의한 치료 효과를 평가하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)} 처리군은 PBS 용액을 주입한 대조군에 비하여 통계적으로 유의한(P=0.003) 관류개선 효과를 보이는 것을 확인하였다.
또한, 도 11에 나타난 바와 같이, VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀{PEG-LP(VEGF)} 처리군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게(P=0.01) 전체 혈관의 수가 증가한 것을 확인하였다. 도 12는 상기 면역염색을 통해 조직을 관찰한 이미지로, 중뇌동맥협착 질환에서 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀 처리에 의해 신생 혈관이 생성되어 전체 혈관 수가 증가된 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 VEGF 유래 펩타이드가 리포좀에 담지되어 있고, 평균입자 크기가 100 nm이며, 50 ~ 200 nm 입자분포를 가지고 PEG2000으로 표면이 개질된 리포좀은 심근경색 질환뿐만 아니라 중뇌동맥협착 질환에서도 높은 치료효과를 보였으며, 이는 VEGF 유래 펩타이드가 담지된 리포좀은 다양한 허혈병변 질환에 치료효과를 가진다는 것을 의미한다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Compositions for Prevention or Treatment of Ischemic Disease Comprising Liposome Encapsulated Vascular Endothelial Growth Factor Peptide <130> 1041789 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> VEGF peptide <400> 1 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile 1 5 10

Claims (6)

  1. a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 VEGF 유래 펩타이드가 2.5 × 10-10M 내지 5.4 × 10-9M 농도로 담지되고, 99mTc-HMPAO로 표지된 리포좀; 또는
    b) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 VEGF 유래 펩타이드가 2.5 × 10-10M 내지 5.4 × 10-9M 농도로 담지되고, DTPA-PE(diethylene tetramine pentaacetic acid-phosphatidylethanolamine)를 포함하며, 상기 DTPA는 99mTc로 표지된 리포좀; 을 포함하며,
    상기 a) 및 b)의 리포좀은 표면이 폴리에틸렌 글리콜로 개질되어 있고,
    평균 입자크기가 90 내지 110 nm로, 50 내지 200 nm의 입자분포를 가지는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 1800g/mol 내지 2200g/mol인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 심근경색, 중뇌동맥협착 질환, 하지허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 주사제형인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
KR1020180063004A 2018-05-31 2018-05-31 Vegf 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 KR102083082B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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FASEB Journal. Vol. 23, no. 10, pp. 3361-3367 (2009)*
Radiology. Vol. 273, No. 1, pp. 160-167 (2014)*

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