KR101481447B1 - 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 고분자 하이드로겔은 생분해성 고분자에 방사성 핵종을 직접 표지하고 하이드로겔 형성시 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를 담지함으로써, 고분자 하이드로겔이 집적된 병소 부위에서 머물면서 서서히 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를 방출시킬 수 있어서 다량의 혈관신생촉진-단백질의 낭비를 막을 수 있으며, 감마 카메라를 이용하여 생체 내 분포를 확인할 수 있어서 허혈성 질병 부위에 머물고 있는 입자의 양을 정량화할 수 있고 치료효과를 예측할 수 있다. 또한, 병소 부위에서 방사선을 방출하여 허혈성 질환 등의 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 고분자 하이드로겔은 방사성 핵종 및 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드에 의한 치료효과를 동시에 기대할 수 있으며, 치료제의 축적을 정량적으로 평가할 수 있는 바 병소의 치료효과를 높일 수 있다.

Description

방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Radioisotope-labeled and angiogenesis-promoting protein or peptide-loaded polymeric hydrogel and method for preparing the same, and pharmaceutical composition comprising the same for preventing or treating ischemic disease}
본 발명은 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
허혈이란 출혈, 색전 및 경색 등에 의해 조직으로의 혈류공급이 중단되어 세포손상이 일어나 국부적으로 조직의 괴사가 일어난 상태를 말한다. 허혈의 대표적인 질병으로는 허혈성뇌졸중과 허혈성 심장질환이 있으며, 이 질병들은 심각한 후유증을 유발하거나 사망을 초래할 수 있다. 특히, 급성 심근경색 또는 중증 협심증 등과 같은 허혈성 심혈관질환은 급속하게 증가하고 있고 이 질환으로 인한 사망자는 전 세계적으로 높은 수치를 보인다. 이러한 허혈성 질환의 치료방법으로는 혈관신생-촉진 단백질요법, 스텐트를 이용하여 좁은 혈관을 확장시켜 주는 관상동맥 성형술이 있으며, 심장의 경우 동맥 우회술 (bypass surgery)을 시행하기도 한다. 그러나, 혈관신생-촉진 단백질 치료 또는 수술 치료 등에 반응하지 않거나 실패한 경우, 더 이상의 치료법이 없어 환자는 질병 부위를 절단하거나 사망에 이르게 되어 새로운 치료전략이 필요하다. 최근에는 혈관신생의 기전이 밝혀짐에 따라 허혈 부위에 혈관신생에 관련한 인자 (factor)의 유전자 또는 단백질을 투여하여 혈관생성을 유도함으로써 측부혈류를 증가시켜 허혈성 질환을 치료하고자 하는 시도들이 이루어지고 있다. VEGF(Vascular endothelial growth factor)는 혈관내피세포를 특이적으로 성장 분화시키는 단백질로 일반적인 혈관형성에 관여한다고 알려져 있다.
VEGF와 같은 혈관신생 재조합 단백질(peptide)을 투여하는 방법은 다음과 같은 문제점이 있다. 1) 주사한 혈관신생 단백질은 다른 조직으로 이동하거나 활성을 잃어버리기 때문에 혈관신생의 효과를 보기 위해 고순도의 단백을 다량 사용하여야 하므로 막대한 비용이 든다. 2) 측부혈관의 형성을 위하여 단백질을 적은 용량으로 지속적으로 투여하는 것이 바람직하지만, 자주 주사하여야 하는 문제점이 있다. 위와 같은 문제점은 혈관신생 단백질을 주사부위에 머물면서 서서히 방출시킬 수 있는 전달시스템으로 해결될 수 있다. 그리고, 이러한 주사 전달시스템의 생체 내 분포를 정확하게 모니터링함으로써 치료효과를 효율적으로 예측할 수 있는 추적 전략이 필요하다.
따라서, 체내에 투여 후 허혈성 질병 부위에 머물면서 혈관신생 단백질을 서서히 방출할 수 있는 방사성 핵종을 이용한 치료제에 대한 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 체내에 투여 후 허혈성 질병 부위에 머물면서 혈관신생 단백질을 서서히 방출할 수 있는 방사성 핵종을 이용한 치료제에 대하여 연구하던 중, 생분해성 고분자에 방사성 핵종을 직접 표지하고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를, 담지한 고분자 하이드로겔을 제조하였으며, 이렇게 제조된 고분자 하이드로겔은 방사성 핵종의 표지 효율 및 표지 안정성이 우수하여 고분자 하이드로겔을 허혈성 질환 부위에 국소적으로 직접 주사한 경우 고분자 하이드로겔이 허혈성 질환 조직 부위에 그대로 머물면서 외부로 거의 유출되지 않으며, 주사된 하이드로겔이 질병 부위에서 머무르는 기간을 파악할 수 있어 치료제의 치료효과를 예측할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 조영 염료 및 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔 및 이의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔을 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 조영 염료 및 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 고분자 하이드로겔은 생분해성 고분자에 방사성 핵종을 직접 표지하고 하이드로겔 형성시 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를, 담지함으로써 고분자 하이드로겔이 집적된 병소 부위에서 머물면서 서서히 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를, 방출시킬 수 있어서 다량의 혈관신생촉진-단백질 또는 펩티드의 낭비를 막을 수 있으며, 감마 카메라를 이용하여 생체 내 분포를 확인할 수 있어서 허혈성 질병 부위에 머물고 있는 입자의 양을 정량화할 수 있고 치료효과를 예측할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 고분자 하이드로겔은 방사성 핵종 및 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드에 의한 치료효과를 동시에 기대할 수 있으며, 치료제의 축적을 정량적으로 평가할 수 있는 바 병소의 치료효과를 높일 수 있다.
도 1은 테크니슘 (99mTc)이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔의 방사성 표지 효율 및 안정성을 나타낸 도이다.
도 2는 테크니슘 (99mTc)이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔을 하지허혈 랫트(Rat)의 동맥에 주사한 후, 감마영상을 통해 병소에 축적된 랫트의 감마영상을 나타낸 도이다.
도 3은 테크니슘 (99mTc)이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 VEGF가 담지된 키토산-DTPA 하이드로겔의 주사 후, 하지허혈 동물모델의 치료효과를 나타낸 도이다.
본 발명은 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 생분해성 고분자와 방사성 핵종을 표지할 수 있는 작용기를 가진 킬레이터를 반응시켜 고분자-킬레이터를 제조하는 단계;
2) 상기 1)단계에서 제조된 고분자-킬레이터를 방사성 핵종 및 방사성 핵종을 표지하기 위한 활성제와 반응시켜 방사성 핵종이 표지된 고분자-킬레이터를 제조하는 단계; 및
3) 상기 2)단계에서 제조된 방사성 핵종이 표지된 고분자-킬레이터에 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드, 및 음이온성 가교물질을 첨가하고 교반시켜 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔을 제조하는 단계;
를 포함하는, 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔의 제조방법으로서,
상기 방사성 핵종은 감마영상 및 PET 영상이 가능한 방사성 핵종으로 99mTc, 111In, 18F, 64Cu, 68Ga, 131I, 125I, 124I, 186Re, 188Re, 90Y 및 166Ho로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 고분자 하이드로겔은, 생분해성 고분자에 방사성 핵종을 직접 표지하고 하이드로겔 형성시 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를, 담지시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 고분자 하이드로겔의 제조방법에 대해 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 1)단계는 고분자-킬레이터를 제조하는 단계로, 생분해성 고분자를 아세트산 수용액에 용해하고 유기용매를 가한 뒤, 킬레이터를 가하여 교반한 후 고분자-킬레이터를 얻는다. 상기 얻어진 고분자-킬레이터를 증류수로 투석하여 정제하고 동결 건조한다.
상기 생분해성 고분자는 키토산 및 그 유도체, 폴리글루탐산, 헤파린, 히알루론산, 알긴산, 펙틴, 카복시메틸 셀룰로오스, 단백질 등이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 킬레이터는 방사성 핵종을 표지할 수 있는 작용기를 가진 화합물로, SHPP(N-succinimidyl-3-[4-hydroxyphenyl]propionate), DTPA(diethylenetriamine pentaacetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), TETA (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid), 히스티딘, 티로신, 티로신을 포함하는 단백질 등이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 킬레이터는 방사성 핵종에 따라 달라질 수 있다.
상기 킬레이터를 용해시키는 유기용매는 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭시드(DMSO), 1,4-디옥산, 테트라히드로퓨란(THF), 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 생분해성 고분자와 킬레이터는 1 : 0.01~1의 중량비, 바람직하게는 1 : 0.~0.5의 중량비로 혼합되는 것이 좋다. 만일 킬레이터를 너무 과량으로 생분해성 고분자에 결합시키면 상기 혼합물이 수용액으로 제조되기가 어려워 하이드로겔을 형성시키기 어려운 문제점이 발생한다.
상기 2)단계는 방사성 핵종이 표지된 고분자-킬레이터를 제조하는 단계로, 고분자-킬레이터를 아세트산 수용액에 용해한 후, 이를 방사성 핵종 및 방사성 핵종을 표지하기 위한 활성제와 반응시켜 방사성 핵종이 표지된 고분자-킬레이터를 얻는다. 상기 방사성 핵종이 표지된 고분자-킬레이터에서 방사성 핵종의 표지 효율은 99% 이다.
상기 방사성 핵종은 99mTc, 111In, 18F, 64Cu, 68Ga, 131I, 125I, 124I, 186Re, 188Re, 90Y 또는 166Ho 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 3)단계는 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔을 제조하는 단계로, 방사성 핵종이 표지된 고분자-킬레이터를 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드, 및 음이온성 가교물질과 반응시켜 고분자 하이드로겔을 제조한다.
상기 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), IGF(Insulin-like growth factor), FGF(Fibroblast growth factor), PDGF(Platelet-derived growth factor) 및 PGF(placental growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 음이온성 가교물질은 하이드로겔을 형성하기 위해 사용되며, 이를 사용하여 고분자 하이드로겔을 제조할 시 방사성 핵종의 표지 안정성을 증가시켜 병소 부위 외의 정상 조직으로의 방사성 핵종의 유출을 막을 수 있다. 또한, 상기 가교물질의 음이온의 농도에 따라 고분자 하이드로겔 입자의 크기를 조절할 수 있어서 병소 적용 범위를 넓힐 수 있다. 음이온성 가교물질로는 TPP(tripolyphosphate), 알긴산, 펙틴, 카복시메틸 셀룰로오스, 폴리글루탐산, 단백질, DNA, RNA 등이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 고분자 하이드로겔을 제조하는 방법은 방사성 핵종이 표지된 고분자 용액에 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를, 첨가하고 음이온성 가교물질을 첨가하여 교반하는 방법 이외에, 전기방사법, 전기분무방사법 또는 에멀젼 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
전기분무방사법을 이용할 경우, 방사성 핵종이 표지된 고분자-킬레이터에 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를 첨가하고, 이 혼합 용액을 실리지 펌프를 통해 음이온성 가교제 용액에 고전압하에 공기를 주입하여 전기분무방사법으로 분무하여 고분자 하이드로겔을 제조할 수 있다.
전기방사법을 이용할 경우, 방사성 핵종이 표지된 고분자-킬레이터에 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를 첨가하고, 이 혼합 용액에 실린지 펌프를 통해 음이온성 가교물질을 1~20 kV의 전압 하에 전기방사하여 고분자 하이드로겔을 제조할 수 있다.
상기 방법으로 제조된 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔은, 방사성 핵종의 표지 효율이 99% 이상이고, 표지 안정성이 40시간 이상으로 우수하다. 또한, 고분자 하이드로겔에서 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드의 함량과 담지 효율은 고분자-킬레이터의 양과 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드의 양에 따라 조절이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔은 하지허혈 동물 모델의 하지허혈 병소 부위에 국소적으로 직접 주사된 경우, 고분자 하이드로겔이 당해 조직 부위에 그대로 머물면서 외부로 거의 유출되지 않고 축적되며, 하지허혈 혈류의 호전이 관찰되어 정상 하지혈류의 80% 이상으로 회복시킨다. 또한, 감마 카메라를 이용하여 생체 내 분포를 확인할 수 있어서 허혈성 질병 부위에 머물고 있는 입자의 양을 정량화할 수 있고 치료효과를 예측할 수 있으며, 병소 부위에서 방사선을 방출하여 허혈성 질환 등의 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔은 허혈성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 허혈성 질환으로는 하지허혈, 심근허혈 및 뇌경색를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔과 함께 허혈성 질환 치료효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 고분자 하이드로겔은 허혈성 질환 치료를 위하여 주사제 제형으로 투여될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 고분자 하이드로겔을 직접 병소에 주사하거나, 또는 병소에 근접한 동맥 또는 정맥에 주사하여 병소에 전달할 수 있다. 비경구 투여를 위한 본 발명의 조성물로는 멸균 수성 또는 비수성 액제, 분산제, 현탁제, 또는 유제 뿐만 아니라 멸균 액제 또는 현탁제로 사용하기 직전에 재조제하는 멸균 산제가 있다. 적합한 멸균 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 생리식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 혼합물, 식물성 오일(예를 들어, 올리브 오일), 주사가능한 유기 에스터(예를 들어, 에틸올레이트)가 있다. 예를 들어, 분산제 및 현탁제의 경우에는 레시틴과 같은 피복재를 사용하여 적절한 특정 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
본 발명의 조성물은 허혈성 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 생분해성 고분자와 킬레이터를 반응시켜 고분자-킬레이터를 제조하는 단계;
2) 상기 1)단계에서 제조된 고분자-킬레이터를 조영 염료(dye)와 반응시켜 조영 염료가 담지된 고분자-킬레이터를 제조하는 단계; 및
3) 상기 2)단계에서 제조된 조영 염료가 담지되거나 화학적으로 결합된 고분자-킬레이터에, 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩타이드 및 음이온성 가교물질을 첨가하고 교반시켜, 조영 염료 및 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩타이드가 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔을 제조하는 단계;
를 포함하는, 조영 염료 및 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔의 제조방법으로서,
상기 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), IGF(Insulin-like growth factor), FGF(Fibroblast growth factor), PDGF(Platelet-derived growth factor) 및 PGF(placental growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조영 염료 및 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
상기 조영 염료 및 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자-킬레이터 하이드로겔의 제조방법으로 제조된 고분자 하이드로겔은, 상기 방사성 핵종이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드가, 담지된 고분자 하이드로겔과 같은 방법으로 허혈성 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 고분자 하이드로겔은 생분해성 고분자에 방사성 핵종을 직접 표지하고 하이드로겔 형성시 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를 담지함으로써, 고분자 하이드로겔이 집적된 병소 부위에서 머물면서 서서히 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드를 방출시킬 수 있어서 다량의 혈관신생촉진-단백질의 낭비를 막을 수 있으며, 감마 카메라를 이용하여 생체 내 분포를 확인할 수 있어서 허혈성 질병 부위에 머물고 있는 입자의 양을 정량화할 수 있고 치료효과를 예측할 수 있다. 또한, 병소 부위에서 방사선을 방출하여 허혈성 질환 등의 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 고분자 하이드로겔은 방사성 핵종 및 혈관신생-촉진 단백질 또는 펩티드에 의한 치료효과를 동시에 기대할 수 있으며, 치료제의 축적을 정량적으로 평가할 수 있는 바 병소의 치료효과를 높일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 테크니슘 ( 99m Tc)이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질 VEGF가 담지된 키토산-DTPA 하이드로겔의 제조
1-1. 키토산-DTPA의 제조
Figure 112012097402425-pat00001
상기 반응식에서, n은 100~800의 정수이다.
키토산 100 mg을 10% (v/v) 아세트산 수용액 90 ml에 용해한 후 메탄올 10 ml를 가하고, DTPA(diethylenetriamine pentaacetic acid) 무수물 10 mg을 가하였다. 이후, 상온에서 24시간 동안 교반하고 증류수를 이용하여 투석 및 정제한 뒤, 동결 건조하여 키토산-DTPA를 얻었다.
2. 키토산-DTPA에 테크니슘 ( 99m Tc)의 표지
상기 실시예 1-1에서 제조된 키토산-DTPA 2.5 mg을 0.5%(v/v) 아세트산 수용액 5 ml에 용해한 후, SnCl2 용액 (2.5 mg/ml 0.04 N HCl) 0.1 ml와 테크니슘 (99mTc)을 가하고 10분 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 테크니슘 (99mTc)이 표지된 키토산-DTPA를 얻었다.
1-3. 테크니슘 ( 99m Tc)이 표지되고 혈관신생-촉진 단백질이 담지된 키토산-DTPA 하이드로겔의 제조
Figure 112012097402425-pat00002
상기 실시예 1-2에서 얻어진 2.5 mg/ml의 테크니슘 (99mTc)이 표지된 키토산-DTPA 1 ml에, 혈관신생-촉진 단백질 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 0.01 mg을 가하고 교반하면서 2 mg/ml의 TPP(tripolyphosphate) 1 ml을 가하고 교반하여 하이드로겔을 제조하였다. 이때, 키토산-DTPA에 대한 혈관신생-촉진 단백질의 비율은 1:0.001~2의 중량비, 바람직하게는 1:0.001~1의 중량비가 적당하다. TPP의 첨가 농도에 따라 하이드로겔의 크기와 강도가 달라질 수 있다.
실험예 1 : 테크니슘 ( 99m Tc)이 표지된 키토산-DTPA 하이드로겔에서 테크니슘 ( 99m Tc)의 표지 효율 측정
상기 실시예 1-2에서 제조한 테크니슘 (99mTc)이 표지된 키토산-DTPA에서 테크니슘 (99mTc)의 표지효율을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로는, 고정상으로 Gelman 사의 ITLC-SG를 이용하고, 이동상으로 식염수(saline)를 사용하여 상기 실시예 1-2에서 제조한 테크니슘 (99mTc)이 표지된 키토산-DTPA 하이드로겔의 크로마토그래피를 수행하여, 테크니슘 (99mTc)의 표지효율을 확인하고, 40시간 동안 표지 안정성을 평가하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 테크니슘 (99mTc)이 표지된 키토산-DTPA에서 테크니슘 (99mTc)의 표지 효율은 99% 이상이었고 40시간 이상 안정하였다.
실험예 2 : 테크니슘 ( 99m Tc)이 표지되고 VEGF가 담지된 키토산-DTPA 하이드로겔을 이용한 하지허혈 동물 모델 치료 효과 평가
랫트(Rat)의 하지 동맥을 실크(silk)로 막음으로써 급성 하지허혈 동물 모델을 만들고, 24시간 후에 관류(perfusion) 감마영상을 통해 허혈 질병을 확인하고 하지 동맥에 상기 실시예 1에서 제조한 테크니슘 (99mTc)이 표지되고 VEGF가 담지된 키토산-DTPA 하이드로겔을 주사하였다. 감마영상을 통해 질병 부위로의 하이드로겔 축적을 확인하고, 관심영역 분석법을 이용하여 질병 부위에 축적된 VEGF가 담지된 하이드로겔의 양을 정량적으로 평가함. 일주일 후 관류 감마영상을 통해 혈류(blood flow)를 확인하고 반대쪽 정상 하지와 비교분석하였다. 같은 방법으로 허혈동물 모델을 만들고 키토산 하이드로겔만을 주사한 그룹과 수술외에 아무것도 처리하지 않은 그룹으로 나누어서 평가 분석하였다.
구체적으로는, 테크니슘 (99mTc)이 표지되고 VEGF가 담지된 키토산-DTPA 하이드로겔을 질병의 하지 동맥으로 주사하고 축적 여부를 감마 영상으로 확인하였다. 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 테크니슘 (99mTc)이 표지되고 VEGF가 담지된 키토산-DTPA 하이드로겔은 하지허혈 질병 부위에 축적되고, 외부로 유출되는 정도가 거의 관찰되지 않았다.
도 3에 나타난 바와 같이, 테크니슘 (99mTc)이 표지되고 VEGF가 담지된 키토산-DTPA 하이드로겔을 랫트에 주사 후, 하지허혈의 혈류(blood flow)의 호전이 관찰되어 정상 하지의 혈류(flow)의 80%이상으로 회복됨을 확인하였다.

Claims (11)

1) 생분해성 고분자인 키토산과 방사성 핵종을 표지할 수 있는 작용기를 가진 킬레이터인 DTPA (diethylenetriamine pentaacetic acid)를 반응시켜 고분자-킬레이터인 키토산-DTPA를 제조하는 단계;
2) 상기 1)단계에서 제조된 고분자-킬레이터인 키토산-DTPA를 방사성 핵종 및 방사성 핵종을 표지하기 위한 활성제인 SnCl2와 반응시켜 방사성 핵종이 표지된 키토산-DTPA를 제조하는 단계; 및
3) 상기 2)단계에서 제조된 방사성 핵종이 표지된 키토산-DTPA에 혈관신생-촉진 단백질인 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 음이온성 가교물질인 TPP(tripolyphosphate)을 첨가하고 교반시켜 방사성 핵종이 표지되고 VEGF가 담지된 키토산-DTPA 하이드로겔을 제조하는 단계;를 포함하는, 고분자 하이드로겔의 제조방법으로서, 상기 방사성 핵종은 감마영상 및 PET(Positron Emission Tomography) 영상이 가능한 방사성 핵종으로 99mTc, 111In, 18F, 64Cu, 68Ga, 131I, 125I, 124I, 186Re, 188Re, 90Y 및 166Ho로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 방사성 핵종이 표지되고 VEGF가 담지된 고분자 하이드로겔의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 1)단계에서 키토산과 DTPA (diethylenetriamine pentaacetic acid)는 1 : 0.01~1의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 방사성 핵종이 표지되고 VEGF가 담지된 고분자 하이드로겔의 제조방법.
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제1항에 의해 제조된, 방사성 핵종이 표지되고 VEGF가 담지된 고분자 하이드로겔.
제7항의 방사성 핵종이 표지되고 VEGF가 담지된 고분자 하이드로겔을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 하지허혈, 심근허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물은 주사제 제형인 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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