KR102060722B1 - 스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델 및 이의 제조방법 - Google Patents

스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델 및 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 동물 모델은 스타틴에 의한 약물유해반응에 관한 자세한 연구를 가능하게 할 수 있는 신규 동물 모델일 뿐만 아니라, 다양한 약물유해반응의 예방 또는 치료제의 스크리닝(선별)에 사용될 수 있기 때문에 이로 인한 다양한 치료제의 개발 및 연구에 사용 가능할 것으로 기대된다.

Description

스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델 및 이의 제조방법{Animal model of adverse drug reaction by statin and a method for producing the same}
본 발명은 스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
스타틴(statin)이란 콜레스테롤 합성 저해제(cholesterol synthesis inhibitor)로서, 콜레스테롤 합성 경로의 율속효소인 히드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소(HMG-CoA 환원효소)의 총칭이며, 각종 스타틴은 기본구조로서 같은 구조를 가지고 있다. 이 화합물은 분자내에 HMG-CoA환원효소의 기질인 HMG-CoA와 유사한 구조를 하며, 경합저해에 의해 메발론산으로의 변환을 억제하고, 이를 통하여 총 콜레스테롤 수치와 저밀도 지방단백질(low density lipoprotein; LDL)의 수치를 낮출 수 있기 때문에, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 협심증 등의 치료제로서 널리 사용되고 있으며, 이외에도 협심증, 심근경색증과 같은 관상동맥경화증으로 인한 심장병의 예방 및 치료에 있어서 일차 선택 약으로 사용되고 있다. 현재는 세계에서 하루 3천만명 이상 복용하고 있는 일반화된 약물이다.
이러한 스타틴과 관련하여 최근 다양한 약물유해반응(부작용)이 보고되고 있는데, 대표적으로 발기부전, 간질성 폐 질환, 근세포 손상, 불면증, 기억력 감소, 위장관 장애, 근육통, 횡문근 융해 등이 있다(국내공개특허 10-2011-0136687). 2010년 1월 “미국 심장학 저널”에 발표된 실험에 따르면, 심부전 진단을 받은 300여명의 성인들을 평균 3.7년 동안 추적한 결과 스타틴 약물을 복용하고 저밀도 지방단백질(low density lipoprotein; LDL)의 수치가 낮은 사람들의 사망률이 가장 높은 것이 보고되었다. 또한, 국내에서 시험한 임상시험 중 피타로틴정을 사용한 886례 중 197례(22.2%)에서 이상반응이 관찰된 바 있다(“Druginfo” 참조).
이와 같이, 콜레스테롤 및/또는 심혈관계 질환 치료에 효과적인 스타틴 약물의 부작용을 낮추기 위한 방법, 또는 부작용을 예방 또는 치료할 수 있는 약물의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 따라서, 본 발명자들은 스타틴에 의한 약물유해반응의 원인에 대해 연구하고, 스타틴에 의한 약물유해반응에 대해 연구할 수 있는 동물 모델에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에 있어서, "약물유해반응(adverse drug reaction)"이란 특정 약물에 의한 의도하지 않은 반응을 의미하는 광의의 개념을 말하며, 바람직하게는 약물에 의한 부작용을 말한다. 본 명세서에 있어서, 상기 약물 부작용이란 콜레스테롤 합성 저해제(inhibitor)인 스타틴(statin)에 의해 유도될 수 있는 모든 부작용을 의미하며, 바람직하게는 체내 옥시스테롤의 농도에 의해 유도되는 스타틴의 부작용을 의미하며, 더욱 바람직하게는 스타틴과 옥시스테롤의 동시 존재 하에서 신장 세관 세포, 췌장 세포, 신경 세포 등의 세포 손상으로 인한 부작용이나, 스타틴에 의해 유도될 수 있는 부작용이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “정상 동물(normal animal)”이란 스타틴에 의해 부작용이 발생하지 않은 동물을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 동물 모델과 같은 종일 수 있으며, 또는 동일 또는 유사한 환경에서 사육된 약물유해반응이 발생하지 않은 동물일 수 있다.
본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 스타틴에 의해 유도되는 부작용의 발생을 차단하는 광의의 개념을 말하며, 바람직하게는 발생 이전에 미리 방지하는 1차 예방과, 부작용의 발생을 조기에 발견하고 적시에 치료하는 2차 예방을 모두 포함하나, 스타틴에 의한 부작용 발생 이전에 대처하는 과정 및/또는 활동이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “치료(treating)”란 스타틴에 의해 유도된 부작용에 대처하는 광의의 개념을 말하며, 스타틴에 의해 유도된 부작용을 치료, 치유, 완화, 감소 등을 시키기 위한 과정 및/또는 활동이라면 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, “투여”란 약물, 화합물 등을 동물에게 투여하는 모든 방법(경로)을 의미하며, 바람직하게는 구강으로 복용시키거나, 주사하거나, 호흡 또는 피부를 통해 흡수시킬 수 있으나, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 사용될 수 있는 모든 투여 방법을 통하여 투여될 수 있다. 상기 투여 방법에는 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 있어서, “후보 물질”이란 스타틴에 의한 약물유해반응을 예방, 완화, 개선, 치료 등을 할 수 있는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 물질을 의미한다. 상기 물질은 이미 알려져 있는 화합물일 수도 있고, 미지의 물질일 수도 있다. 상기 후보 물질 또는 화합물은 바람직하게는 DNA, 올리고뉴클레오티드, 펩타이드, 단백질, 항체, 천연 추출물, 합성 화합물 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또는 단일 화합물 또는 화합물의 혼합일 수 있으며, 이러한 혼합은 세포 배양액, 세포 배양물, 천연 추출물 등일 수 있다.
본 명세서에 있어서, "생물학적 시료"란 환자 체내의 옥시스테롤 농도를 확인할 수 있는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청 등일 수 있으나, 옥시스테롤 농도를 확인할 수 있는 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "키트"란 체내 옥시스테롤의 농도를 측정하여 스타틴에 의한 약물유해반응을 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 옥시스테롤 농도를 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다.
본 발명은 a) 인간을 제외한 동물에 스타틴을 투여하는 단계; 및 b) 상기 스타틴이 투여된 동물에 옥시스테롤을 유도 또는 투여하는 단계를 포함하는, 스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 스타틴은 바람직하게는 아토르바스타틴(atorvastatin), 로슈바스타틴(rosuvastatin), 심바스타틴(simvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 메바스타틴(mevastatin) 등일 수 있으나, 콜레스테롤 합성 저해제라면 이에 제한되지 않는다. 상기 스타틴은 바람직하게는 1kg의 동물 사료에 80 내지 120mg의 스타틴을 혼합하여 제공될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1kg의 동물 사료에 90 내지 110mg의 스타틴을 혼합하여 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또는, 일반적인 스타틴 투여 방법에 의해 투여될 수 있으며, 상기 투여는 일반적으로 치료에 사용되는 하루 허가용량 농도일 수 있으며, 이는 0.5 내지 1500mg일 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 1000mg이거나, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 100mg일 수 있으며, 또는 0.5mg 내지 80mg이나, 또는 0.5mg 내지 50mg일 수 있으나, 승인되어 있는 하루 허가용량 농도라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 스타틴은 ezetimibe 제제, niacin extended relase 제제, amlodipine 제제 등과 함께 투여될 수 있으며, 일반적으로 스타틴과 함께 투여되는 제제라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 옥시스테롤은 25-히드록시콜레스테롤, 7-케토콜레스테롤, 콜레스테롤 5,6-에폭시드, 24-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 4β-히드록시콜레스테롤, 19-히드록시콜레스테롤, 7 β-히드록시콜레스테롤. 7α-히드록시콜레스테롤, 26-히드록시콜레스테롤, 7-산화스테롤, 콜레스탄-3 β,5 α,6 β -트리올, 5,6-클로로히드린즈, 24,25-에폭시스테롤즈, 32-산화스테롤, 4-히드록시스테롤, 19-히드록시스테롤, 15-산화스테롤, 22-히드록시스테롤, 20-히드록시스테롤, 5 α,6 α -에폭시콜레스테롤, 5 β,6 β -에폭시콜레스테롤, 및 5 α,6 β -디히드록시콜레스테롤 등이며, 또는 리포다당류에 의해 체내에 생성되는 옥시스테롤일 수 있으나, 체내에 생성 또는 투여될 수 있는 옥시스테롤의 종류라면 제한이 없다. 상기 옥시스테롤의 농도는 0.5ng/mL 내지 10ug/mL일 수 있으며. 바람직하게는 0.5ng/mLL 내지 5ug/mL의 농도이며, 더욱 바람직하게는 1ng/mL 내지 2.5ug/mL의 농도이나, 평소 동물 모델에서 일반적으로 체내에 생성되는 농도보다 높은 농도라면 제한이 없다. 상기 리포다당류는 바람직하게는 동물의 체중 1kg당 10 내지 15mg의 농도로 투여될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 11 내지 13mg의 농도로 투여될 수 있으나, 체내에서 옥시스테롤을 생성시킬 수 있는 농도라면 제한이 없다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 상기 약물유해반응(부작용)은 옥시스테롤과 스타틴의 동시 존재 상태로 인하여 발생되는 부작용이며, 바람직하게는 신장 세관 세포, 신경 세포, 췌장 세포 등의 세포 손상으로 인한 부작용이며, 더욱 바람직하게는 인지기능 장애(Cognitive dysfunction), 치매(dementia), 급성신부전증, 급성 세뇨관 괴사손상, 허혈 재관료 손상, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴증후군, 뇌졸증, 척추신경손상, 당뇨병 등이나 스타틴에 의한 약물유해반응이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델을 제공한다
또한, 본 발명은 (a) 상기 동물 모델에 스타틴에 의한 약물유해반응 예방 또는 치료용 후보 물질을 투여하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질에 의해 세포 손상이 감소하였을 경우에 상기 후보 물질을 약물유해반응 예방제 또는 치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 스타틴에 의한 약물유해반응 예방제 또는 치료제 선택을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 후보 물질은 바람직하게는 DNA, 올리고뉴클레오티드, 펩타이드, 단백질, 항체, 천연 추출물, 및 합성 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이나, 약물로 사용될 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 스타틴을 투여한 또는 투여 예정인 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 옥시스테롤의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 스타틴에 의한 약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 체내의 옥시스테롤 농도를 측정할 수 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 체내 옥시스테롤 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 스타틴에 의한 약물유해반응 예측용 키트를 제공한다. 상기 키트는 체내 옥시스테롤 농도를 측정할 수 있는 형태라면 제한이 없다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 옥시스테롤의 농도는 바람직하게는 1ng/mL 내지 5ug/mL이며, 더욱 바람직하게는 10ng/mL 내지 2.5ug/mL이나, 체내에서 영향을 미치지 않는 농도이나, 스타틴과 병용 투여시 신장 독성을 일으킬 수 있는 농도라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 동물 모델은 스타틴에 의한 약물유해반응에 관한 자세한 연구를 가능하게 할 수 있는 신규 동물 모델일 뿐만 아니라, 다양한 약물유해반응의 예방 또는 치료제의 스크리닝(선별)에 사용될 수 있기 때문에 이로 인한 다양한 치료제의 개발 및 연구에 사용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 종류의 스타틴과 옥시스테롤의 연관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 종류의 옥시스테롤과 스타틴의 연관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 스타틴 및 옥시스테롤의 병용투여로 인한 스타틴의 부작용에 있어서 이소프레노이드 계열 화합물의 예방 및 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직에 따른 스타틴 부작용의 차이를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 췌장에서의 스타틴 부작용의 차이를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 스타틴과 옥시스테롤의 병용투여에 의한 부작용 기작을 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 스타틴과 옥시스테롤의 병용투여에 의한 부작용 기작을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내에서 옥시스테롤 존재 하에서의 스타틴 부작용을 H&E 염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내에서 옥시스테롤 존재 하에서의 스타틴 부작용을 PAS 염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내에서 옥시스테롤 존재 하에서의 스타틴 부작용을 NGAL 면역조직화학염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내에서 옥시스테롤 존재 하에서의 스타틴 부작용을 NGAL 면역조직화학염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내에서 옥시스테롤 존재 하에서의 스타틴 부작용을 NGAL 면역조직화학염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL 면역조직화학염색법 결과를 정량화한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내에서 이소프레노이드 계열 화합물의 스타틴에 의한 부작용 예방 및 치료 효과를 H&E 염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내에서 이소프레노이드 계열 화합물의 스타틴에 의한 부작용 예방 및 치료 효과를 PAS 염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내에서 이소프레노이드 계열 화합물의 스타틴에 의한 부작용 예방 및 치료 효과를 NGAL 면역조직화학염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL 면역조직화학염색법 결과를 정량화한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 스타틴과 옥시스테롤과의 연관관계 확인
1.1. 다양한 종류의 스타틴(statin)과 옥시스테롤(oxycholesterol)과의 연관관계 확인
스타틴과 옥시스테롤과의 연관관계를 확인하기 위하여, 인간 신장의 세관(tubule) 세포주인 HK-2(human kidney-2 cell line; ATCCⓡ CRL-2190TM)를 24 웰플레이트에 웰당 1X105개씩의 세포를 접종하였다. 그리고 각 웰에 5uM의 아토르바스타틴(atorvastatin) 또는 1uM의 플루바스타틴(fluvastatin)을 처리하고, 옥시스테롤의 한 종류인 25-히드록시콜레스테롤(25-hydroxycholesterol; 25-HC)을 0, 0.1, 0.5 및 1ug/mL을 각각의 웰에 첨가하였다. 그리고 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양한 후에 LDH 분석 키트(Takara, Cat#. MK401)를 사용하여 각 웰의 세포 사멸 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 스타틴 또는 옥시스테롤을 단독으로 처리한 경우에는 세포 사멸이 유도되지 않았지만, 스타틴과 옥시스테롤을 병용투여한 경우에는 급격한 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 종류와 관계 없이 스타틴의 독성이 나타나지 않는 저농도에서도 옥시스테롤의 존재 시 신장 세관 세포주에서 현저한 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 체내에 옥시스테롤의 존재 시 스타틴에 의한 부작용이 발생될 수 있다는 것을 확인하였다.
1.2. 다양한 종류의 옥시스테롤과 스타틴의 연관관계 확인
다양한 종류의 옥시스테롤에서도 동일한 결과를 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 1.1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 스타틴으로는 5uM의 아토르바스타틴을 사용하였고, 옥시스테롤로는 0.1ug/mL의 25-히드록시콜레스테롤, 7-케토콜레스테롤(7-ketocholesterol), 콜레스테롤 5,6-에폭시드(cholesterol 5,6-epoxide), 24-히드록시콜레스테롤(24-hydroxycholesterol), 및 27-히드록시콜레스테롤(27-hydroxycholesterol)을 사용하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 옥시스테롤을 단독으로 투여한 세포주에서는 세포 사멸이 나타나지 않았지만, 스타틴과 병용투여한 실험군에서는 모두 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 종류와 관계 없이 옥시스테롤의 독성이 나타나지 않는 저농도에서도 스타틴의 존재 시 신장 세관 세포주에서 현저한 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 체내에 옥시스테롤의 존재 시 스타틴에 의한 부작용이 발생될 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 옥시스테롤과 스타틴의 병용 투여로 인하여 신장 세관 세포에 강한 세포 독성이 유도되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여, 저농도의 옥시스테롤 또는 저농도의 스타틴에서는 세포 독성이 유도되지 않지만, 병용 투여의 경우에는 저농도에서도 신장 세관 세포에 강한 독성을 유도할 수 있다는 것을 확인하였으며, 체내 옥시스테롤의 농도가 높은 상태에서는 치료를 위한 스타틴의 투여가 급성신부전증(acute renal failure; acute kidney injury) 등과 같은 부작용을 야기시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 이소프레노이드 계열 화합물의 부작용 감소 효과 확인
이소프레노이드(isoprenoid) 계열 화합물이 옥시스테롤과 스타틴의 병용 투여 시에 유도되는 부작용을 감소시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1.1과 동일한 방법으로 세포주에 옥시스테롤(0.1ug/mL의 25-히드록시콜레스테롤) 및 스타틴(5uM의 아토르바스타틴)을 처리하고, 이소프레노이드 계열 화합물인 10uM의 파르네실피로인산(farnesyl pyrophosphate), 200uM의 메발론산염(mevalonate), 또는 10uM의 제라닐제라닐피로인산(geranylgeranyl pyrophosphate)을 처리하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 옥시스테롤과 스타틴의 병용 투여 시에 유도되는 세포 사멸은 이소프레노이드 계열 화합물에 의하여 억제되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 스타틴 투여 시 유도되는 부작용을 이소프레노이드 계열 화학물의 병용 투여로 예방 및 감소시킬 수 있으며, 부작용의 발생 시 치료에도 이소프레노이드 계열 화합물을 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 스타틴과 옥시스테롤의 병용투여에 의한 부작용과 조직 간의 연관관계 확인
스타틴과 옥시스테롤의 병용투여에 의한 부작용이 체내 조직에 따라 서로 다른 결과를 나타내는지 확인하기 위하여, 신장 세관 세포주인 HK-2 세포주 외에 원발성 신장 세관 세포(primary renal tubule cell; ATCCⓡ PCS-400-010TM), 신장 혈관간막세포(renal mesangial cell; ScienCell Cat.# #4200), 원발성 간세포(primary hepatocyte; C57BL6/J 마우스로부터 채취해서 배양함), 및 췌장 세포(Pancreas cell)인 Ins-1e 세포(ThermoFisher Scientific)에 실시예 1.1과 동일한 방법으로 옥시스테롤(0.1ug/mL의 25-히드록시콜레스테롤) 및 스타틴을 처리하고, 세포 사멸 정도를 확인하였다. 원발성 신경세포(primary neuron)는 어미쥐를 안락사시킨 후 자궁에 있는 태아의 머리의 뇌 조직을 채취하여 획득하였다. 획득된 뇌 조직의 지주막과 피아 마타(pia matar)를 제거한 후에 해마를 분리하여 DM 배지(dissection media; 490mL의 HBSS, 5mL의 HEPES, 및 5mL의 페니실린/스트렙토마이신)로 옮겨준 후에, 이로부터 대뇌피질(cerebral cortex)을 분리하였다. 일반적으로 대뇌피질은 태아 두 마리로부터 분리되고, 해마는 하나의 어미쥐로부터 분리된 모든 태아로부터 분리된 양을 사용하였다. 각각의 분리된 해마 또는 대뇌피질은 15mL 튜브에 담고, 트립신과 DM 배지로 세척하고 분쇄하여 세포를 획득하였다. 그리고 획득된 세포는 이미지 획득 용도로는 1X105 내지 5X105세포/mL이 되도록 PM 배지(plating media; 485mL의 Neurobasal media, 10mL의 B-27 supplement, 및 5mL의 100X glutamax)에 접종하였고, 이외 실험 용도로는 5X105 내지 1X106세포/mL이 되도록 PM 배지에 접종하였다. 그리고 2주간 배양하여 실험에 사용하였다. 그 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4 및 5에 나타난 바와 같이, 신장 혈관간막세포와 원발성 간세포에서는 스타틴과 옥시스테롤에 의한 병용투여가 세포 독성을 나타내지 않는 반면, 원발성 신장 세관 세포와 췌장 세포에서 스타틴과 옥시스테롤의 병용투여에 의하여 현저한 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 또한, 원발성 신경세포에서도 스타틴 또는 옥시스테롤 각각의 단독 투여시에는 세포 사멸이 관찰되지 않았지만, 병용 투여시에는 현저히 세포 사멸이 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 옥시스테롤과 스타틴의 병용 투여에 의한 세포 독성은 세포 특이적으로 나타나는 것을 확인하였으며, 이를 통하여, 체내 옥시스테롤의 농도가 높은 상태에서 스타틴의 투여로 인한 부작용은 조직 특이적으로 발생한다는 것을 확인할 수 있었으며, 특별히 신장 세관 세포, 췌장 세포와 신경 세포에 손상을 유도한다는 것을 확인할 수 있었다
실시예 4: 스타틴과 옥시스테롤의 병용투여에 의한 부작용 기작 확인
스타틴과 옥시스테롤의 병용투여에 의한 부작용이 유도되는 원인을 확인하기 위하여, HK-2 세포주를 24 웰플레이트에 웰당 1X105개씩의 세포를 접종하였다. 그리고 각 웰에 5uM의 아토르바스타틴 또는 1uM의 플루바스타틴을 처리하고, 25-히드록시콜레스테롤 0.1ug/mL을 각각의 웰에 첨가하였다. 그리고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후에 RNA isolation kit(Qiagen)를 이용하여 세포로부터 mRNA를 추출하였다. 또한, ReadyPrep Protein Extraction kit(Bio-rad)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 그리고 추출된 mRNA를 주형으로 하여 Prime Script RT-PCR kit(Takara)를 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 이용하여 HMGCR(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase; HMG-CoA reductase) 유전자의 발현 정도를 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 통해 정량하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응을 위해 사용한 서열은 하기 표 1과 같고, 그 결과는 도 6에 나타내었다. 또한, 추출된 단백질은 anti-cleaved SREBP2(sterol regulatory element binding protein 2) 항체(abcam)를 이용하여 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 실시하였고, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
Gene Primer sequence
HMG-CoA reductase Forward: 5'-CAGGATGCAGCACAGAATGT-3'
Reverse: 5'-CTTTGCATGCTCCTTGAACA-3'
GAPDH Forward: 5'-GCACAGTCAAGGCCGAGAAT-3'
Reverse: 5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3'
도 6에 나타난 바와 같이, 저농도의 스타틴 처리 시에는 HMGCR의 발현량이 증가되나, 옥시스테롤을 병용투여한 경우에는 HMGCR의 발현량이 감소되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 저농도의 스타틴 투여 시에는 양성 피드백(positive feedback)에 의하여 HMGCR의 발현량이 증가되나, 옥시스테롤의 존재 하에서는 양성 피드백이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 저농도의 스타틴 처리 시에는 활성화된 SREBP2가 증가되나, 역시 옥시스테롤의 존재 하에서는 SREBP2의 증가가 억제되는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 저농도의 스타틴 처리 시에는 양성 피드백을 통하여 스타틴에 의한 부작용이 감소되나, 옥시스테롤의 존재 하에서는 양성 피드백이 억제되어 이로 인한 세포 손상이 유도되며, 최종적으로는 다양한 조직에 부작용이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 생체 내에서의 스타틴과 옥시스테롤 병용 투여로 인한 부작용 확인
스타틴과 옥시스테롤의 병용 투여가 생체 내(in vivo)에서도 부작용을 유도시키는지, 또한, 옥시스테롤의 존재 하에서 스타틴의 부작용으로 인한 동물실험을 제조할 수 있는지 확인하기 위하여, 마우스 체중 1kg당 20mg 내지 30mg 정도의 스타틴이 복용될 수 있도록 1kg의 사료에 100mg의 스타틴(아토르바스타틴 또는 플루바스타틴)을 혼합하여 8주령의 C57BL6/J 마우스에게 14일 동안 공급하였다. 그리고 14일 후에 체내 옥시스테롤의 농도가 5ng/mL 내지 5ug/mL의 농도가 되도록 리포다당류(lipopolysaccharide; LPS, SIGMA)를 1kg의 마우스 체중당 12mg의 리포다당류가 주입되도록 복강내 투여하여 마우스의 체내에서 옥시스테롤의 생성을 유도하였다(“J Lipid Res (2009) 50:2258-2264; PNAS (2009) 106: 16764-16769” 참조). 리포다당류를 투여하고 72시간 후에 마우스를 안락사시킨 후 4% 농도가 되도록 파라폼알데하이드(paraformaldehyde)를 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)에 혼합한 후에 심장 관류(cardiac perfusion)을 실시하여 신장 조직을 추출하였다. 그리고 추출된 신장 조직은 H&E(hematoxylin&eosin) 염색법, PAS(Periodic acid-Schiff) 염색법 및 급성신부전 초기 진단 마커인 NGAL의 면역조직화학염색(immunohistochemistry of neutrophil gelatinase-associated lipocalin)을 통해 급성 신장 손상 및 급성신부전증 여부를 확인하였다. 그 결과는 도 8 내지 도 13에 나타내었다.
도 8은 H&E 염색을 시행한 결과로서 청색 화살표는 원주(cast)가 형성된 부위를 나타내며, 청색 화살촉은 세관 세포의 액포화(vacuolization)가 유도된 부위를 나타낸다. 도 8에 나타난 바와 같이, 스타틴을 투여한 실험군에서 옥시스테롤의 발생을 유도하였을 때, 급성 신부전증이 유도되는 것을 확인하였다.
도 9는 PAS 염색을 시행한 결과로서 적색 화살표가 원주가 형성된 부위를 나타내며, 도 9에서 나타난 바와 같이, 스타틴을 투여한 실험군에서 옥시스테롤의 발생을 유도하였을 때, 급성 신부전증이 유도되는 것을 확인하였다.
도 10 내지 12는 NGAL 면역조직화학염색을 시행한 결과로서 적색은 팔로이딘(phalloidin)으로 세관의 구조를 나타내고, 녹색은 NGAL을 나타내며, 청색은 다피(DAPI)로서 세포핵을 나타낸다. 또한, 도 13은 NGAL 염색을 정량화한 그래프이다. 도 10 내지 도 13에서 나타난 바와 같이, 스타틴을 투여한 실험군에서 옥시스테롤의 발생을 유도하였을 때에만 급성 신부전증의 초기 진단 마커인 NGAL의 발현량이 현저히 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 생체 내에서도 저농도의 스타틴 투여 또는 옥시스테롤 단독으로는 스타틴에 의한 부작용이 유도되지 않지만, 옥시스테롤의 존재 하에서 저농도의 스타틴의 투여는 급격한 세포 손상을 유도하여 급성 신부전증과 같은 부작용이 유도될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 스타틴으로 인한 부작용 동물 모델을 제조할 수 있다는 것과, 이를 통하여 환자의 체내 옥시스테롤 농도를 확인하여 스타틴에 의한 약물유해반응을 미리 예측할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 생체 내에서 이소프레노이드 계열 화합물의 부작용 감소 효과 확인
실시예 5의 방법으로 제조한 동물 모델을 실질적으로 치료제 선별 등의 동물 모델로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 이소프레노이드 계열 화합물을 이용하여 실험을 진행하였다. 1kg의 사료에 100mg의 스타틴(플루바스타틴)을 혼합하여 8주령의 C57BL6/J 마우스에게 14일 동안 공급하였다. 이 후에 1kg의 마우스 체중당 30mg의 메발론산염을 4일간 연속으로 복강 내 투여한 후에, 리포다당류(SIGMA)를 1kg의 마우스 체중당 12mg의 리포다당류가 주입되도록 복강내 투여하여 마우스의 체내에서 옥시스테롤을 생성시켰다. 리포다당류를 투여하고 72시간 후에 마우스를 안락사시킨 후 4% 농도가 되도록 파라폼알데하이드(paraformaldehyde)를 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)에 혼합한 후에 심장 관류(cardiac perfusion)을 실시하여 신장 조직을 추출하였다. 그리고 추출된 신장 조직은 H&E(hematoxylin&eosin) 염색법, PAS(Periodic acid-Schiff) 염색법 및 급성신부전 초기 진단 마커인 NGAL의 면역조직화학염색(immunohistochemistry of neutrophil gelatinase-associated lipocalin)을 통해 급성 신장 손상 및 급성신부전증 여부를 확인하였다. 그 결과는 도 14 내지 도 17에 나타내었다.
도 14는 H&E 염색을 시행한 결과이고, 도 15는 PAS 염색을 시행한 결과로서, 하늘색 화살표는 원주(cast)가 형성된 부위를 나타내며, 청색 화살촉은 세관 세포의 액포화(vacuolization)가 유도된 부위를 나타낸다. 도 14 및 15에 나타난 바와 같이, 스타틴을 투여하지 않고 리포다당류 만을 투여하여 옥시스테롤을 형성시킨 마우스 실험군에서는 원주의 형성 및 세관 세포의 액포화가 유도된 것을 확인하였고, 스타틴을 투여한 후에 옥시스테롤을 형성시킨 마우스 실험 군에서는 원주의 형성 및 세관 세포의 액포화가 더 유도된 것을 확인하였다. 그리고 메발론산염을 투여한 결과를 보면, 옥시스테롤 형성에 의한 신장 손상에는 메발론산염의 치료 효과가 보이지 않지만, 스타틴 및 옥시스테롤 투여 실험군에서는 특이적으로 메발론산염에 의한 현저한 치료 효과를 확인하였다.
도 16은 NGAL 면역조직화학염색을 시행한 결과로서 적색은 팔로이딘(phalloidin)으로 세관의 구조를 나타내고, 녹색은 NGAL을 나타내며, 청색은 다피(DAPI)로서 세포핵을 나타낸다. 또한, 도 17은 NGAL 염색을 정량화한 그래프이다. 도 16 및 17에서 나타난 바와 같이, 스타틴 투여 없이 옥시스테롤의 발생을 유도하였을 때에도 급성 신부전증의 초기 진단 마커인 NGAL의 발현량이 증가하지만, 스타틴 투여 후 옥시스테롤의 발생을 유도하였을 때는 NGAL의 발현량이 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 스타틴 투여 없이 옥시스테롤의 발생을 유도한 실험군에 메발론산염을 투여하였을 때는 메발론산염으로 인한 치료 효과가 유의성있게 나타나지 않지만, 스타틴 투여 후 옥시스테롤의 발생을 유도한 실험군에 메발론산염을 투여하였을 때는 NGAL의 발현량이 현저하게 감소된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 저농도의 스타틴으로 인한 부작용, 즉, 신장, 췌장, 신경 등의 세포 손상은 체내 옥시스테롤의 존재 하에서 유의성 있게 증가되며, 이소프레노이드 계열 화합물은 이로 인한 부작용을 예방 및 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 옥시스테롤 단독으로 인한 세포 손상에서는 이소프로노이드 계열 화합물의 예방 또는 치료 효과가 나타나지 않지만, 옥시스테롤의 존재 하에서의 스타틴 부작용에서는 현저히 세포 손상이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본원 발명의 스타틴으로 인한 부작용 동물 모델은 스타틴으로 인한 부작용의 치료제 선별, 스타틴으로 인한 부작용에 대한 연구에 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. a) 인간을 제외한 동물에 스타틴을 투여하는 단계; 및
    b) 상기 스타틴이 투여된 동물에 옥시스테롤을 투여 또는 유도하는 단계를 포함하고,
    상기 옥시스테롤은 25-히드록시콜레스테롤, 7-케토콜레스테롤, 콜레스테롤 5,6-에폭시드, 24-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 4β-히드록시콜레스테롤, 19-히드록시콜레스테롤, 7 β-히드록시콜레스테롤. 7α-히드록시콜레스테롤, 26-히드록시콜레스테롤, 7-산화스테롤, 콜레스탄-3 β,5 α,6 β -트리올, 5,6-클로로히드린즈, 24,25-에폭시스테롤즈, 32-산화스테롤, 4-히드록시스테롤, 19-히드록시스테롤, 15-산화스테롤, 22-히드록시스테롤, 20-히드록시스테롤, 5 α,6 α -에폭시콜레스테롤, 5 β,6 β -에폭시콜레스테롤, 및 5 α,6 β -디히드록시콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며,
    상기 옥시스테롤은 1ng/mL 내지 5ug/mL의 농도로 투여되거나, 또는 리포다당류 투여에 의해 체내에서 생성되는 것인, 스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 스타틴은 아토르바스타틴(atorvastatin), 로슈바스타틴(rosuvastatin), 심바스타틴(simvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 및 메바스타틴(mevastatin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 스타틴은 1kg의 동물 사료에 80 내지 120mg의 스타틴을 혼합하여 제공되는 것인, 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 리포다당류는 동물의 몸무게 1kg당 10 내지 15mg의 농도로 투여되는 것인, 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 약물유해반응은 신장 세관 세포, 신경 세포, 및 췌장 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 세포 손상으로 인한 것인, 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 신장 세관 세포 손상으로 인한 질환은 급성신부전, 급성 세뇨관 괴사손상, 및 허혈 재관류 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 제조방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 신경 세포 손상으로 인한 질환은 인지기능 장애(Cognitive dysfunction), 치매(dementia), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴증후군, 뇌졸증, 및 척추신경손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 제조방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 췌장 세포 손상으로 인한 질환은 당뇨병인, 제조방법.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 스타틴에 의한 약물유해반응용 동물 모델.
  13. (a) 제 12 항의 동물 모델에 스타틴에 의한 약물유해반응 예방 또는 치료용 후보 물질을 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 후보 물질에 의해 세포 손상이 감소하였을 경우에 상기 물질을 약물유해반응 예방제 또는 치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 스타틴에 의한 약물유해반응 예방제 또는 치료제 선택을 위한 정보제공방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 후보 물질은 DNA, 올리고뉴클레오티드, 펩타이드, 단백질, 항체, 천연 추출물, 및 합성 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 정보제공방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포 손상은 신장 세관 세포, 신경 세포, 및 췌장 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 세포 손상인, 정보제공방법.
  16. 스타틴을 투여한 또는 투여 예정인 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 옥시스테롤의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 스타틴에 의한 약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
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