KR102059513B1

KR102059513B1 - 애엽 및 동충하초 추출물을 포함하는 항산화용 또는 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102059513B1
Application number: KR1020170111958A
Authority: KR
Inventors: 오한선; 정영수; 김진식; 김용채; 조재열; 정덕; 정성구; 한상윤; 김성규
Original assignee: (주)뷰티화장품
Priority date: 2017-09-01
Filing date: 2017-09-01
Publication date: 2019-12-26
Also published as: KR20190025376A

Abstract

본 발명은 애엽 및 동충하초 추출물을 포함하는 주름 개선용 또는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 안전하면서도, 애엽과 동충하초 추출물의 시너지 작용에 의해 더욱 개선된 주름 개선 및 항산화 효능을 가지며, 그 외에도 항염증, 보습 및 미백 효능이 우수하여 화장품 소재로 널리 사용될 수 있을 것으로 보인다.

Description

애엽 및 동충하초 추출물을 포함하는 항산화용 또는 주름 개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR SKIN ANTIOXIDANT OR IMPROVING SKIN WRINKLE COMPRISING EXTRACTS OF ARTEMISIAE ARGYI FOLIUM AND CORDYCEPS MILITARIS}

본 발명은 애엽 및 동충하초 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 애엽 및 동충하초 추출물을 포함하는 항산화용 또는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

애엽(Artemisiae Argyi Folium)은 국화과의 황해쑥(Artemisia argyi), 쑥(Artemisia vulgaris), 사자발쑥(Artemisia princeps) 또는 약쑥(Artemisia asiatica)의 잎 및 어린줄기를 말린 약재를 말한다. 애엽은 기혈(氣血)과 경맥(經脈)을 따뜻하게 하므로 한의학적으로 생리불순, 부인병 치료 등에 사용되고 있으며, 약리작용으로 지혈작용, 억균작용, 기관지 평활근 이완작용, 진해거담작용, 수면작용, 자궁흥분유도작용, 과민성 쇼크 보호작용 등이 보고되었다.

애엽의 주요성분으로는 치네올 50%, 아테닌, 콜린, 타닌(tannin), 클로로필 등이 함유되어 있다. 특히, 치네올 성분은 해열작용 및 혈액순환 촉진작용이 있는 것으로 알려져있다.

동충하초는 겨울철에는 곤충의 몸에 들어가 월동을 하면서 양분을 흡수하여 곤충을 죽게 하고 여름철이 되면 죽은 그 곤충의 몸에서 풀(버섯)을 만든다는 모습에서 명명된 일종의 버섯이다. 동충하초속 버섯 균주는 분류학적으로 볼 때 자낭균문(Ascomycota), 핵균강(Pyrenomycetes), 육자균목(Clavicipitaceae), 동충하초속 (Codyceps)에 속하며, 한국을 비롯한 중국, 일본 등 전 세계적으로 100 속 300여 종이 알려졌다.

동충하초에 대한 약리 물질로는 생리활성 물질인 코디세핀(Cordycepin)이 알려져 있는데, 이는 3-데옥시아데노신(deoxyadenosine) 계통의 천연 화합물로서, 항세균, 항종양 및 항암 효과가 있음이 임상 실험에서 밝혀졌다. 또한, 동충하초에는 코디세핀 이외에도 D-만니톨(D-mannitol), 퀸산(quinic acid) 등과 함께 다량의 다당체를 포함하고 있으며, 각종 아미노산 함량 또한 높은 것으로 알려졌다.

기존에 생약 추출물을 이용한 항산화 및 주름 개선용 화장품 연구가 진행 중이나, 아직까지 만족스러운 효과는 얻지 못하고 있다. 또한 사철쑥의 동충하초 발효 추출물을 주요 성분으로 포함하는 주름 개선용 조성물(대한민국 특허출원 10-2014-0055345) 또는 동충하초, 쑥 및 솔잎 추출물의 항균 효능에 관한 보고[한국식품저장유통학회 Vol 9, No. 1(2002)]는 있었으나, 애엽 및 동충하초 추출물의 시너지 작용을 이용한 항산화능 및 주름개선에 관한 특허는 없었다.

본 발명은 상기 문제를 해결하고자, 동충하초 및 애엽 추출물을 포함하여 개선된 주름 개선 또는 항산화 작용을 갖는 화장료 조성물을 제공하고자 하였다.

본 발명은 애엽 및 동충하초 추출물을 포함하는 주름 개선용 또는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.

일 실시예에서, 상기 애엽은 황해쑥(Artemisia argyi), 쑥(Artemisia vulgaris), 사자발쑥(Artemisia princeps) 및 약쑥(Artemisia asiatica)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 동충하초는 번데기동충하초(Cordyceps militaris) 또는 천연 박쥐나방 애벌레 동충하초(Cordyceps sinensis)일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 화장료 조성물에 포함되는 애엽 및 동충하초 추출물의 배합비는 건조 중량을 기준으로 1:10~10:1일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 화장료 조성물에 포함되는 애엽 및 동충하초 추출물의 합산량은 전체 화장료 조성물의 0.001 내지 20 중량%인 것을 특징으로 할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 애엽 및 동충하초 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매에 의해 추출되는 것일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 애엽 및 동충하초 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이 크림, 세럼, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 파우더, 바디 로션, 바디 크림, 바디 오일, 바디 에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 및 바디 세정제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 안전하면서도, 주름 개선 또는 항산화 기능이 우수할 뿐만 아니라, 보습, 미백 및 항염증 작용도 우수하다.

본 발명의 화장료 조성물은 UV 광노화(photoaging)에 의해 감소된 1형 프로콜라겐의 형성을 촉진시키고, 주름 관련 MMP(metrix metalloproteinase) 유전자의 발현을 억제하여 주름 개선 효능을 가지며, 애엽 및 동충하초 추출물의 시너지 효과에 의해 더욱 개선된 주름 개선 효능을 갖는다. 뿐만 아니라, 상기 화장료 조성물은 자유 라디칼 소거능을 가져 항산화 효능을 가지며, 애엽 및 동충하초 추출물의 시너지 효과에 의해 더욱 개선된 항산화 효능을 갖는다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습 관련 HAS(hyaluronan synthase)-1 내지 HAS-3, TGM(transglutaminase)-1 및 FLG(filaggrin) 유전자의 발현을 촉진시켜 피부 보습 효능을 가지며, 티로시나제(tyrosinase) 활성을 감소시켜 피부 미백 효과를 갖는다. 또한 염증 인자인 산화질소(NO)의 형성 억제 및 COX (cyclooxygenase)-2 유전자의 발현을 억제하여 항염증 효능을 갖는다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 기능성 화장료 소재로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 대식세포주인 RAW 264.7 세포(도 1A), 섬유아세포주인 NIH-3t3 세포(도 1B) 및 상피세포주인 HaCa T 세포(도 1C)에서의 애엽 추출물의 세포 독성 평가 결과를 나타낸 그래프로서, 애엽 추출물은 100㎍/㎖의 농도까지는 각 세포에 대해 세포 독성이 거의 없음을 알 수 있었다.
도 2는 대식세포주인 RAW 264.7 세포(도 2A), 섬유아세포주인 NIH-3t3 세포(도 2B) 및 상피세포주인 HaCa T 세포(도 2C)에서의 동충하초 추출물의 세포 독성 평가 결과를 나타낸 그래프로서, 동충하초 추출물은 50㎍/㎖의 농도까지는각 세포에 대해 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.
도 3은 애엽 추출물(도 3A)과 애엽 및 동충하초 추출물(도 3B)의 라디칼 소거능 평가 결과를 나타낸 것으로, 애엽 추출물은 자체로 라디칼 소거능이 있으나, 동충하초 추출물과 함께 처리한 경우 서로 시너지 효과가 있음을 알 수 있었다.
도 4는 애엽 추출물(도 4A) 및 동충하초 추출물(도 4B)에 의한 1형 프로콜라겐 유전자 발현 변화를 나타낸 것으로, UV에 의해 감소된 1형 프로콜라겐의 발현이 애엽 추출물 및 동충하초 추출물에 의해 각각 농도 의존적으로 회복되는 것을 알 수 있었다. 또한, 애엽 및 동충하초 추출물(도 4C)은 1형 프로콜라겐 유전자 발현에 대해 뚜렷한 시너지 효과를 갖는 것으로 나타났다.
도 5는 애엽 추출물(도 5A) 및 동충하초 추출물(도 5B)에 의한 주름 관련 유전자 발현의 억제 효과를 나타낸 것으로, 두 경우 모두 MMP-2 유전자의 발현이 가장 많이 억제되는 것을 알 수 있었다.
도 6은 애엽 추출물(도 6A) 및 동충하초 추출물(도 6B)에 의한 염증인자 NO 생성 억제 효과를 나타낸 것으로, 각각 50㎍/㎖의 농도 및 100㎍/㎖의 농도 이상부터 급격한 NO 억제 효과가 나타났다.
도 7은 애엽 추출물의 티로시나제 활성 저해 효과를 나타낸 것으로, 농도 의존적으로 활성 저해하는 것으로 나타났다.
도 8은 애엽 추출물(도 8A) 및 동충하초 추출물(도 8B)에 의한 보습 관련 유전자의 발현 증가 효과를 나타낸 것으로, 특히 애엽 추출물은 및 동충하초 추출물은 각각 HAS-3 유전자와 HAS-1 유전자의 발현을 가장 많이 증가시키는 것으로 나타났다.

본 명세서에서 "Aa-EE"라는 것은 애엽 에탄올 추출물을 의미하며, "Cm-EE"라는 것은 동충하초의 에탄올 추출물을 의미한다.

일 실시예에서, 상기 애엽은 황해쑥, 쑥, 사자발쑥 및 약쑥으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

애엽은 기혈(氣血)과 경맥(經脈)을 따뜻하게 하므로 한의학적으로 생리불순, 부인병 치료 등에 사용되고 있으며, 약리작용으로 지혈작용, 항균작용, 기관지 평활근 이완작용, 진해거담작용, 수면작용, 자궁흥분유도작용, 과민성 쇼크 보호작용 등이 보고되었다.

애엽의 주요성분으로는 치네올이 50%를 차지하며, 아테닌, 콜린, 타닌(Tannin), 클로로필 등이 함유되어 있다. 특히, 치네올 성분은 해열작용 및 혈액순환 촉진작용이 있는 것으로 알려져있다.

일 실시예에서, 상기 동충하초는 번데기동충하초 또는 천연 박쥐나방 애벌레 동충하초 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 동충하초는 대부분 곤충에 기생하다가 곤충이 죽은 후 자실체를 형성하는 형태로 되어있는 것으로서 겨울에는 벌레이던 것이 여름에는 버섯으로 변한다는 뜻에서 붙여진 이름이다. 또한, 동충하초의 성분을 분석해보면 인체에 필요한 11종의 아미노산과 약효가 있는 10종의 아미노산이 각각 총 함량의 60% 이상을 차지하고 있으며, 코디세핀을 약 7% 함유하고 있다. 또한, 세포 활성화에 필요한 항산화 지질인 리놀렌산(linolenic acid)과 헥산인 3'-데옥시아데노신이 상당량 포함되어 있다. 이 밖에 면역 증강 등의 다양한 약리 작용이 알려져 있다.

일 실시예에서, 상기 화장료 조성물에 포함되는 애엽 및 동충하초 추출물의 배합비는 건조 중량을 기준으로 1:10~10:1일 수 있고, 바람직하게는 1:3~3:1이다.

애엽 및 동충하초 추출물의 합산량이 0.001 중량% 미만이면 화장료 조성물의 효능이 나타나지 않을 수 있고, 20 중량% 이상이면 제형의 안정성이 떨어질 수 있다.

본 발명의 애엽 및 동충하초 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법, 즉, 통상 적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 애엽 및 동충하초 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매에 의해 추출될 수 있고, 바람직하게는 에탄올에 의해 추출되나, 이에 제한되지 않는다.

상기 추출 용매의 적합한 양은 애엽 및 동충하초의 합산 건조 중량을 기준으로 1 내지 10배 정도이며, 더욱 바람직하게는 5 내지 8배이며, 가장 바람직하게는 5배이다. 또한, 추출 방법으로는 열 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등을 사용할 수 있으며, 1회 또는 다수회 반복하여 추출시켜 사용할 수 있다. 또한, 추출온도는 애엽 및 동충하초의 유용 성분의 유효활성이 제거되지 않을 정도의 온도이면, 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상온에서 침적시켜 추출한다.

상기 에탄올의 농도는 40~70%일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 애엽 및 동충하초의 중량, 온도, 원하는 성분 등에 따라 적절히 조정할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등의 통상 화장료에 배합되는 보조제를 포함할 수 있다.

유지 성분으로서는, 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

보습제로서는, 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는, 장쇄 아실글루탐산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는, 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

살균제로서는, 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 클로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리실산, 징크 피리티온(zinc pyrithione), 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨(sodium mononitroguaiacol), 운데실렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는, 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 에리소르빈산 (erythorbic acid) 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는, 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는, 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 상기 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또한 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 0.01~5 중량%, 바람직하게는 0.01~3 중량%로 배합된다.

일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 조성물 애엽 및 동충하초를 각각 2:1의 배합비로 혼합한 후, 상기 혼합물의 5배 중량의 60% 에탄올로 20~25℃에서 5일 동안 추출한 추출물을 1:3~3:1의 배합비로 혼합한 복합 추출물을, 화장료 조성물의 5~7 중량% 만큼 포함하는 것일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이 크림, 세럼, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 분무제, 바디 로션, 바디 크림, 바디 오일, 바디 에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 및 바디 세정제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 제조될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 세포 독성이 없으며, 주름 개선 및 항산화 효능 외에도, 미백, 보습 및 항염증 효능으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효능을 추가로 가질 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 자외선 광노화에 의해 감소된 1형 프로콜라겐의 형성을 촉진시키고 주름 관련 MMP 유전자의 발현을 억제하여 주름 개선 효능을 가지며, 애엽 및 동충하초 추출물의 시너지 효과에 의해 더욱 개선된 주름 개선 효능을 갖는다. 상기 자외선은 UVA 및 UVB를 모두 포함한다. 뿐만 아니라, 상기 화장료 조성물은 자유 라디칼 소거능을 가져 항산화 효능을 가지며, 애엽 및 동충하초 추출물의 시너지 효과에 의해 더욱 개선된 항산화 효능을 갖는다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습 관련 HAS-1 내지 HAS-3, TGM-1 및 FLG 유전자의 발현을 촉진시켜 피부 보습 효능을 가지며, 티로시나제 활성을 감소시켜 피부 미백 효과를 갖는다. 또한 염증 인자인 산화질소(NO)의 형성을 억제하고, COX-2 유전자의 발현을 억제하여 항염증 효능을 갖는다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 기능성 화장료 소재로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

이하에서 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 예시할 뿐이며 본 발명의 권리범위를 한정하지 않는다.

<실시예>

실시예 1: 애엽 및 동충하초 추출물의 제조

애엽 및 동충하초의 건조 분말(머쉬텍 사)을 2:1의 건조중량비로 각각 혼합한 후, 상기 혼합물의 건조 중량의 7~8배 가량의 에탄올을 첨가하여, 50℃에서 1500psi의 압력으로 3일간 추출하였다. 상기 추출액을 모듈 스핀(Modul spin) 건조 및 농축 시스템(Biotron Corporation)으로 40℃에서 24시간 동안 농축하였다. 농축된 추출액을 교반시키면서, 농축된 추출액 중량의 약 10배의 정제수를 적가하고, 5℃에서 30분간 방치 후, 진공 여과를 진행하여 석출되는 분말을 얻었다. 상기 분말은 100% 디메틸 설폭시드(DMSO)에 용해시키고, 0-300㎍/㎖의 농도로 희석하여, 본 발명의 실시에 사용하였다.

실시예 2: 세포 배양 및 세포 독성 평가

세포 배양

대식세포주인 RAW264.7는 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지를 이용하고, 상피세포주인 HaCaT 및 섬유아세포주인 NIH-3T3는 10% FBS를 포함하는 DMEM 1640 배지를 이용하여, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 70~80%의 밀도로 배양하였다. 상기 배지들에는 항생제로서 페니실린(100 IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100㎍/㎖)를 첨가하였다.

세포 생존률 (cell viability) 실험

상기 각각의 세포주에서 상기 애엽 및 동충하초 추출물이 세포 생존에 미치는 효과를 알아보기 위해, MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 시험법을 이용하여 분석하였다. 96-웰 플레이트에 1×10⁶의 세포를 플레이팅(plating)하고, 37℃에서 각 면역실험 조건에 상응하는 배양시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한다. 이후 10㎕ MTT 용액 (스톡 농도: 5 mg/㎖)을 첨가하고 3시간 동안 추가 반응을 유도하였다. 반응 종료 및 포르마잔 결정(formazan crystal)의 용해를 위해, 각 웰에 100㎕ MTT 정지 용액(stopping solution, 0.01M HCl 중의 10% 소듐 도데실 설페이트)을 추가로 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT가 포르마잔으로 환원된 양을 570nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 OD₅₇₀ 값을 통해 산출하였다.

<실시예 3: 항산화능 평가>

DPPH 이용한 자유 라디칼 소거 활성 측정

에탄올에 용해시킨 DPPH 용액을 495㎕씩 시험관에 분주하고, 여기에 상기 애엽 및 동충하초 추출물을 5㎕씩 첨가하여, 최종 반응용액이 500㎕가 되도록 하였다. 이를 일정시간 동안 반응시킨 후, 96-웰 플레이트에 200㎕씩 2개의 웰에 분주한 뒤 517nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다.

<실시예 4: 주름 개선 평가>

1형 프로콜라겐 유전자 발현 조사

섬유아세포주 NIH-3t3 세포를 6-웰 플레이트에 5×10⁵세포/웰이 되도록 분주한 다음, 배지를 제거하고 PBS로 씻어내었다. 이에 PBS를 1 ㎖/웰이 되도록 분주한 다음, 자외선 조사 장치(Vilbert Lourmat)로 UVB를 30 mJ/㎠로 조사하였다. 자외선을 조사 후에, PBS를 제거하고 새로운 배지로 교환한 후, 상기 애엽 및 동충하초 추출물을 처리하여 24시간 방치하였다. 이에 트리졸(trizol) 시약을 처리하여 총 RNA를 추출하였고, 추출한 RNA로부터 cDNA를 합성하였으며, 1형 프로콜라겐 유전자의 발현을 비교 측정하기 위하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 진행한 후 95℃에서 30초간 변성, 55~60℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장을 30 사이클 진행한 후, 72℃에서 5분간 더 반응시켰다. 각 PCR 산물들을 EDTA(ethidium bromide)를 포함하는 1.5% 아가로스 겔에 전기영동을 하여, 1형 프로콜라겐 유전자 발현을 확인하였다. 사용한 PCR 프라이머로는, 센스(sense) 프라이머 5'-AGCCAGCAGATCGAGAACAT-3' 및 안티센스(antisense) 프라이머 5'-TCTTGTCCTTGGGGTTCTTG-3'를 사용하였다.

주름 관련 유전자 발현 조사

상피세포주인 HaCaT 세포를 10% 소태아 혈청(FBS), 100 유닛/㎖ 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 공기 혼합 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 6-웰 플레이트에 HaCaT 세포를 1×10⁶세포/웰이 되도록 분주하였다. 다음날 애엽 추출물(25, 50, 100 ㎍/㎖) 및 동충하초 추출물 (12.5, 25, 50 ㎍/㎖)로 예비 처리한 지 1시간 후, 각 웰의 배양액을 PBS 1㎖로 바꾼 뒤 UVB 30mJ/㎠을 조사하였다. UV 조사 후 애엽 추출물(25, 50, 100 ㎍/㎖)과 동충하초 추출물(12.5, 25, 50 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 RNA을 추출하여, 광노화 관련 유전자인 MMP(메트릭스 메탈로프로테아나제)-1,2,9 및 COX-2, 그리고 하우스키핑 유전자인 GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 RT-PCR을 통해 확인하였다. PCR 증폭은 i-Master PCR 키트(iNtRON)을 사용하여, 각 실험군 cDNA와 표적 단백질들의 센스 및 안티센스 프라이머, 대조군 GAPDH 프라이머 및 dNTP 250uM, Tris-HCl(pH 8.3) 10mM, KCl 50mM, NgCl₂ 1.5mM를 포함한 HiPi 용액 20㎕으로 실시하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 진행한 후, 95℃에서 30초간 변성, 55~60℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장을 30 사이클 진행한 다음, 72℃에서 5분간 더 반응시켰다. 사용한 프라이머는 이하의 표 1과 같았다.

표적 유전자	염기 서열 (5’ → 3’)
MMP-1	센스 TCT GAC GTT GAT CCC AGA GAG CAG 안티센스 CAG GGT GAC ACC AGT GAC TGC AC
MMP-2	센스 CAA GTG GAG AGC AGT TGA GGA CAT C 안티센스 TGA GGA CAT CTC CCA CGT CAA
MMP-9	센스 TCC CTG GAG ACC TGA GAA CC 안티센스 GGC AAG TCT TCC GAG TAG TTT
COX-2	센스 CAA AAG CTG GGA AGC CTT CT 안티센스 CCA TCC TTC AAA AGG CGC AG
GAPDH	센스 CAA TGA ATA CGG CTA CAG CA 안티센스 AGG GAG ATG CTC AGT GTT GG

<실시예 5: 항염증 효과 평가>

염증 인자인 산화질소(NO) 생성능 조사

대식세포주인 RAW 264.7를 페니실린(100 IU/㎖), 스트렙토마이신 및 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 1×10⁶ 세포/㎖의 농도로 조절한 후, 96-웰 플레이트에 접종하고, 5% CO₂ 및 37℃에서 18시간 동안 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고, 4배 농도로 조제된 50㎕의 애엽 및 동충하초 추출물과 50㎕의 LPS(최종농도 1 ㎍/㎖) 함유 배지를 동시에 처리하여 배양하였다. 24시간 후 상층액을 100㎕씩 또 다른 96-웰 플레이트에 옮기고, 그리스(Griess) 용액 [0.5% 나프틸에틸렌디아민 디히드로클로라이드(naphthylethylenediamine dihydrochloride), 5% 설파닐아미드(sulfanilamide), 25% H₃PO₄]을 이용하여 NO 정량을 실시하였다. 표준 물질로 소듐 니트라이트(sodium nitrite)(0~100 μM)를 사용하여 검량선을 작성하였다.

<실시예 6: 미백 효과 평가>

티로시나제 활성 저해 시험

애엽 및 동충하초 추출물을 에탄올에 녹여 티로시나제 활성을 억제하기 위한 적당한 농도 범위로 희석한 것을 시료액으로 하여, 시험관에 0.1M 인산염 완충액(pH 6.5) 220㎕, 시료액 20㎕ 및 버섯 티로시나제액(1500~2000 U/㎖) 20㎕를 순서대로 넣는다. 이 용액에 1.5 mM 티로신액 40㎕를 넣고, 37℃에서 10~15분 동안 반응시킨다. 그리고 이것을 ELISA 판독기를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군으로 시료액 대신, 0.1M 인산염 완충액(pH 6.5)을 넣는다.

<실시예 7: 보습 효능 평가>

보습 관련 유전자 발현 조사

애엽 및 동충하초 추출물에 의한 보습 관련 HAS-1 내지 HAS-3, TGM-1 및 FLG 유전자의 발현 정도를 전사수준에서 조사하기 위해, 상피세포주(HaCaT)에 애엽 및 동충하초 추출물(최종농도 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)과 레티놀(최종 농도 10 ㎍/㎖)을 24시간 동안 처리하였다. 이에 트리졸 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA에 대해 1차 가닥(First strand) cDNA 합성 키트(Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 상기 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머의 염기서열은 표 2에 나타내었고, 대조군 유전자로는 GAPDH을 사용하였다. PCR 증폭은 2×PCRBIOHS Taq 프리믹스 키트(premix kit)(PCRBIO)를 사용하여, 각 실험군 cDNA와 표적 단백질들의 센스 및 안티센스 프라이머, 대조군 GAPDH 프라이머와, dNTP 2mM, MgCl₂ 6 mM, HS Taq DNA 중합효소 등을 포함한 PCR 프리믹스 키트 10㎕로 실시하였다. PCR 조건은 95℃에서 10초간 변성, 58℃에서 15초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 신장하는 조건으로, 총 30 사이클을 수행하였다.

표적 유전자	염기서열 (5‘ → 3’)
FLG	센스 AGG GAA GAT CCA AGA GCC CA 안티센스 ACT CTG GAT CCC CTA CGC TT
TGM	센스 GAA ATG CGG CAG ATG ACG AC 안티센스 AAC TCC CCA GCG TCT GAT TG
HAS-1	센스 CCA CCC AGT ACA GCG TCA AC 안티센스 CAT GGT GCT TCT GTC GCT CT
HAS-2	센스 TTC TTT ATG TGA CTC ATC TGT CTC ACC GG 안티센스 ATT GTT GGC TAC CAG TTT ATC CAA ACG
HAS-3	센스 TAT ACC GCG CGC TCC AA 안티센스 GCC ACT CCC GGA AGT AAG ACT
GAPDH	센스 CAA TGA ATA CGG CTA CAG CA 안티센스 AGG GAG ATG CTC AGT GTT GG

<결과 및 논의>

도 1 및 도 2에 나타나는 바와 같이, 대식세포주(RAW 264.7 세포), 섬유아세포주(NIH-3t3 세포), 상피세포주(HaCaT 세포)에 대해 애엽은 100㎍/㎖의 농도까지, 동충하초는 50㎍/㎖의 농도까지 세포독성이 없는 것으로 나타나, 화장료 조성물에 사용가능한 것으로 확인되었다.

애엽 추출물은 또한, 도 3에 나타나는 바와 같이 DPPH에 의해 유도된 라디칼 생성을 농도 의존적으로 억제하여 항산화 기능을 갖는다. 특히, 애엽 추출물만을 처리한 경우(도 3A) 약 30%의 항산화 효과를 나타내나, 애엽 및 동충하초 추출물을 동시에 처리한 경우(도 3B) 38%의 항산화 효능을 나타내어, 8% 정도의 시너지 효과를 나타내었다.

애엽 및 동충하초 추출물은 또한, 도 4에 나타나는 바와 같이, 1형 프로콜라겐 유전자 발현을 농도 의존적으로 촉진시킨다. 특히, 각각을 처리한 경우 약 30%의 1형 프로콜라겐 발현 증가 효능을 나타내었으나, 둘을 동시에 처리한 경우 80%가 넘는 발현 효능을 보여 뚜렷한 주름 개선 시너지 작용을 나타내었다(도 4C).

따라서, 애엽과 동충하초 추출물을 동시에 포함하는 화장료 조성물의 경우, 상기 추출물의 양을 줄이면서도 항산화 및 주름개선 효능을 높일 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 애엽 및 동충하초 추출물은 도 5에 나타나는 바와 같이, MMP 유전자의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 상기 MMP 유전자는 콜라겐의 분해를 촉진시키는 작용을 하며, 자외선에 의한 광노화시 발현이 촉진된다. 애엽 및 동충하초 추출물은 광노화시 이 유전자의 발현을 감소시키므로, 콜라겐 분해를 막아 주름 및 탄력 개선 효능을 갖는 것으로 기대된다. 특히 애엽 추출물은 MMP-1,2,9 모두에서, 동충하초 추출물은 MMP-2,9 유전자의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다.

애엽 및 동충하초 추출물은 또한, 도 5에 나타나는 바와 같이 각각 100㎍/㎖ 및 12.5㎍/㎖ 농도에서 염증 관련 COX-2 유전자의 발현을 감소시키며, 도 6에 나타나는 바와 같이 각각 100㎍/㎖ 및 200㎍/㎖ 농도에서 염증 인자 NO의 형성을 억제시켜 항염증 효능을 갖는 것으로 나타났다.

애엽 추출물은 도 7에 나타나는 바와 같이, 멜라닌 색소를 형성하는 티로시나제 효소의 활성을 감소시켜, 미백 효과를 갖는 것으로 나타났다.

애엽 및 동충하초 추출물은 도 8에 나타나는 바와 같이, 보습 관련 HAS, TGM-1, FLG 유전자의 발현을 증가시키는데, 그 중 애엽 추출물은 HAS-3 유전자의 발현을 농도 의존적으로 증가시키고, 동충하초 추출물은 50㎍/㎖ 농도에서 HAS-1 유전자의 발현을 증가시켰다. HAS 유전자는 보습인자로 알려진 히알루론산의 생성을 유도할 수 있어, 본 발명의 화장료 조성물이 우수한 보습 효능을 갖는 것으로 기대된다.

Claims

1:3 ~ 3:1 중량비의 애엽 및 동충하초의 에탄올 추출물을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.

제1항에 있어서, 상기 애엽은 황해쑥(Artemisia argyi), 쑥(Artemisia vulgaris), 사자발쑥(Artemisia princeps), 및 약쑥(Artemisia asiatica)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

제1항에 있어서, 상기 동충하초는 번데기 동충하초(Cordyceps militaris) 또는 천연 박쥐나방 애벌레 동충하초(Cordyceps sinensis)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

삭제

제1항에 있어서, 애엽 및 동충하초 추출물의 합산량이 전체 화장료 조성물의 0.001 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

삭제

제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이 크림, 세럼, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디 로션, 바디 크림, 바디 오일, 바디 에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 및 바디 세정제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.