KR102051757B1 - 황화수소 검출용 신규 화합물 및 이를 이용한 황화수소 검출용 센서 키트 - Google Patents

황화수소 검출용 신규 화합물 및 이를 이용한 황화수소 검출용 센서 키트 Download PDF

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숙명여자대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 황화수소 검출용 신규 화합물, 이를 이용한 황화수소 검출용 센서 키트 및 황화수소 검출 방법에 관한 것으로, 황화수소의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공을 제공하여 수용액 또는 기상의 황화수소(H2S)를 선택적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

황화수소 검출용 신규 화합물 및 이를 이용한 황화수소 검출용 센서 키트{Novel compounds for the detection of hydrogen sulfide and sensor kit for the detection of hydrogen sulfide using the same}
본 발명은 황화수소 검출용 신규 화합물, 이를 이용한 황화수소 검출용 센서 키트 및 황화수소 검출 방법에 관한 것이다.
황화수소(H2S)는 악취가스로서 주로 수용액 상태에서 음이온(HS-) 형태로 존재하고 있다. 포유류에서 H2S는 내생의 가소트랜스미터(gasotransmitter)로, 황 산화 환원 밸런스, 항산화, 세포사멸(apoptosis) 및 항염증과 같은 중요한 생물학적 과정에 관여한다. H2S의 생리적인 농도는 세포 수준에서 0.01-3μM의 범위이고, 세럼에서는 30-100μM로 보고되고 있다. 그러나, H2S의 비정상적인 수치는 알츠하이머, 파킨스 질병과 같은 몇 가지 질병을 일으킬 수 있다. 게다가, 석유 산업에서, H2S 가스는 정제과정에서 생산될 수 있으며, 호흡기관, 심혈관 및 신장 시스템에 유독할 수 있다.
현재, 수많은 형광 프로브들이 생물학적 시스템에서 H2S 검출에 이용되고 있다. H2S의 상대적으로 강한 친핵성 때문에, 구리-황화물 석출, 아지드화물 및 니트로 화합물의 환원, 다이니트로 페닐 에테르의 티올리시스(thiolysis) 및 이황화물 결합의 끊어짐을 포함하여 몇 가지 센싱 메카니즘에서 H2S를 검출하기 위한 형광 프로브를 개발하여 이용하는 연구가 진행되고 있다. 그러나, 대다수의 프로브들은 H2S, 글루타치온(glutathion, GSH), 시스테인(cysteine, Cys) 및 호모시스테인(homocysteine, Hcy)을 포함하는 티올(thiol)기를 가진 화합물에 비-선택성 반응을 보여주었다.
따라서 선택적으로 H2S를 검출할 수 있는 프로브 역할을 하는 신규 화합물 및 이를 이용한 센싱 메카니즘에 대한 연구가 필요한 실정이다.
1. 대한민국 공개특허 제10-2018-0031273호
본 발명의 목적은 황화수소의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 황화수소의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 조성물, 황화수소 검출용 형광 프로브 및 황화수소 검출용 센서 키트를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 황화수소의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이용하여 황화수소를 검출하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018080970647-pat00001
(상기 화학식 1에서,
R1은 하이드록시, 아민, (C1~C4)알킬아민, (C1~C4)알킬, (C1~C4)알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택되며,
R2, R3 및 R4은 각각 동일하거나 다를 수 있고, 수소, 아민, (C1~C4)알킬아민, (C1~C4)알킬, (C1~C4)알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택됨.)
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 형광 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 센서 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 황화수소가 포함된 시료와, 2개의 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 접촉하여 반응 시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물의 형광 신호, 흡광 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 황화수소 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 황화수소의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물은 황화수소(H2S)의 존재에 이합체(화합물 2)를 형성함으로써 강한 형광 반응을 보여 황화수소(H2S)를 검출할 수 있는 효과가 있다.
또한, 생물학적으로 풍부한 티올기를 가진 화합물(GSH, Hcy, Cys), 산화 환원 종(ROS), 금속이온 및 음이온과 같은 간섭물과 함께 반응하여도 선택적으로 황화수소(H2S)를 검출할 수 있는 효과가 있다.
또한, 생리학적 환경에서도 황화수소(H2S)를 검출할 수 있으며, 본 발명에 따른 황화수소의 선택적 검출이 가능한 신규 화합물을 포함하는 센서 키트로 공기중의 황화수소(H2S)도 검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 응집반응으로 유도되는 형광(AIE)을 기초로한 화합물 1의 H2S 센싱 메카니즘을 나타낸 도면이다.
도 2는 화합물 1의 (a)1H NMR 스펙트럼, (b)13C NMR 스펙트럼, (c)HR-ESI-MS 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 화합물 2의 (a)1H NMR 스펙트럼, (b)13C NMR 스펙트럼, (C)HR-ESI-MS 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 4는 H2S 존재하에 화합물 1의 반응 메카니즘을 나타낸 도면이다.
도 5는 fw에 따른 화합물 1의 (a)흡광도, (b)형광 스펙트라, (c)471nm에서의 형광세기(FI) 플롯(plot)을 나타낸 도면이다.
도 6은 fw에 따른 화합물 3의 (a)흡광도, (b)형광 스펙트라, (c)500nm에서의 형광세기(FI) 플롯(plot)을 나타낸 도면이다.
도 7은 fw에 따른 화합물 2의 (a)흡광도, (b)형광 스펙트라, (c)480nm에서의 형광세기(FI) 플롯(plot)을 나타낸 도면이다.
도 8은 NaHS의 20등가물(equiv.)이 존재 할때와 없을 때의 화합물 1, 2 및 3의 (a)UV/Vis 흡광도, (b)형광 스펙트라를 나타내며, NaHS의 존재에 화합물 1의 (c)FE-SEM 이미지, (d)DLS 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 9는 (a, b)화합물 1, (c, d)화합물 2, (e, f)화합물 3 각각의 FE-SEM이미지와 DLS 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 10은 (a)다양한 산환 환원종(20 등가물)에 대한 화합물 1의 형광 반응, (b)다른 농도의 NaHS에서의 형광 변화, (c)NaHS 농도에 따른 480nm에서의 형광 세기(FI), (d)NaHS의 20등가물(equiv.)이 존재 할때(빨간줄)와 없을 때(검은줄) 화합물 1의 시간에 따른 형광 변화를 나타낸 도면이다.
도 11은 (a)다양한 금속이온, 음이온, 산화 환원 종 및 티올기를 가진 화합물에 대한 화합물 1의 형광 스펙트라, (b)다양한 금속이온과 음이온의 존재에 화합물 1의 480nm에서의 형광세기(FI) 변화를 나타낸 도면이다.
도 12는 다른 농도의 NaHS(0-34 등가물)에서 화합물 1의 UV/Vis 흡광도를 나타낸 도면이다.
도 13은 초과량의 다양한 티올기를 가진 화합물에 대한 (a)화합물 1, (b)화합물 2의 형광변화를 나나낸 도면이다.
도 14는 (a)NaHS의 0.8등가물, (b)NaHS의 50등가물에 대한 화합물 1의 TLC 분석을 나타낸 도면이다.
도 15는 480nm에서 NaHS 농도에 대한 화합물 1의 형광세기(FI) 플롯(plot)을 나타낸 도면이다.
도 16은 NaHS 20등가물의 존재에 시간에 따른 화합물 1의 형광 스펙트라를 나타낸 도면이다.
도 17은 pH 1 - 11에서의 NaHS 20등가물에 대한 화합물 1의 형광 변화를 나타낸 도면이다.
도 18은 (a)화합물 1의 DCM 용액에 담궈진 TLC 플레이트, (b)휘발성 용액을 포함하는 증기에 노출된 화합물 1이 코팅된 TLC 플레이트, (c)다양한 증기에 노출된 후, 화합물 1이 코팅된 TLC 플레이트의 형광반응, (d)NaHS의 증가되는 농도에 노출 되었을 때, 화합물 1이 코팅된 TLC 플레이트의 형광변화를 나타낸 도면이다.
도 19는 화합물 1, 2 및 3이 코팅된 TLC 플레이트의 형광색을 나타낸 도면이다.
이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 황화수소(H2S) 검출이 가능한 응집반응으로 유도되는 형광 발광(Aggregation-induced emmission luminogen; AIEgen) 신규 화합물을 합성하였으며, 이러한 신규 화합물은 GSH, Cys 및 Hcy와 같은 티올(thiol)기를 가진 화합물, 산화 환원종(ROS), 금속이온 및 음이온과 같은 간섭물과 함께 반응하여도 선택적으로 H2S를 검출할 수 있으며, H2S 가스를 검출 할 수 있는 센서로도 이용할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018080970647-pat00002
(상기 화학식 1에서,
R1은 하이드록시, 아민, (C1~C4)알킬아민, (C1~C4)알킬, (C1~C4)알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택되며,
R2, R3 및 R4은 각각 동일하거나 다를 수 있고, 수소, 아민, (C1~C4)알킬아민, (C1~C4)알킬, (C1~C4)알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택됨.)
이때, 상기 R1은 하이드록시, 아민, (C1~C4)알킬아민, (C1~C4)알킬, (C1~C4)알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택되며, R2, R3 및 R4은 수소일 수 있다.
또한, 상기 R1은 하이드록시, 아민 및 (C1~C4)알킬아민으로 이루어진 군에서 선택되며, R2, R3 및 R4은 수소일 수 있다. 바람직하게, R1은 하이드록시이며, R2, R3 및 R4은 수소일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 형광 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 센서 키트를 제공한다.
이때, 상기 센서 키트는 황화수소 존재 시 2개의 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 이황화 결합을 통해 형광을 나타내는 이합체를 형성하여 황화수소를 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 황화수소는 수용액 또는 기상에 존재하는 황화수소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 황화수소가 포함된 시료와, 2개의 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 접촉하여 반응 시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물의 형광 신호, 흡광 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 황화수소 검출 방법을 제공한다.
이때, 상기 형광 신호는 황화수소 존재 시 2개의 상기 화학식 1에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 이황화 결합을 통해 얻어진 이합체 형태에 의해 발생되는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출 방법을 제공하며, 상기 황화수소는 수용액 또는 기상에 존재하는 황화수소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 이황화 결합을 포함하는 AIEgen 신규 화합물(화합물 1)은 수용액과 가스상에서 H2S의 선택적인 검출을 위해 분자 사이의 티올-이황화 교환을 매개로 특별한 AIEgen 이합체화 반응을 형성할 수 있다. 도 1에서와 같이 화합물 1은 AIEgen으로서 테트라페닐에텐(tetraphenylethene; TPE)과 H2S를 위한 이합체화 반응의 위치(site)로서 이황화결합으로 구성되었다. 초기에, 화합물 1은 약한 형광을 보여주었다. 그러나, H2S가 존재할 때, 화합물 1은 TPE 이합체인 화합물 2를 보여주며 강한 파란색 형광을 나타냈는데, 이것은 증가된 AIE(Aggregation-induced emmission) 효과 때문이다. 그 후, H2S가 초과 반응되었을 때, 화합물 2는 비-형광 TPE-NH2로 변형되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 재료 및 기기장치
모든 형광 및 UV/Vis 흡광 데이터는 각각 RF-6000(Shimadzu Corporation, Kyoto, Kyoto Prefecture, Japan)과 UV-2600(Shimadzu Corporation, Kyoto, Kyoto Prefecture, Japan) 분광광도계를 이용하여 얻었다. 1H 와 13C NMR 스펙트라는 CDCl3 (Cambridge Isotope Laboratories, Cambridge, MA)에 Brucker 500 MHz 분광기를 이용하여 얻었다. HR-ESI-MS 데이터는 한국기초과학연구원(서울)에서 액체 크로마토그래피 질량 분광기(liquid chromatography mass spectrometer; LC/MS)를 이용하여 얻었다. FE-SEM(Field emission scanning electron microscopy) 이미지는 가속전압 10kV에서 JEOL JSM-7600F기기를 이용하여 얻었다. SEM 이미지 샘플은 접착된 카본 테이프에 응집된 용액 몇방울을 올리고 Operon 동결건조기를 이용하여 3일동안 동결건조하였다. 그 후, 108 auto(Cressington Sputter Coater)로 40초간 Pt 코팅하여 준비하였다. 입자 크기와 분포는 입자 크기 분석기(Microtrac, UAP-150) DLS(dynamic light scattering)를 이용하여 측정되었다. 실리카 겔 60(Merck, 0.063 - 0.2 mm)이 컬럼 크로마토그래피를 위해 사용되었다. 분석적인 얇은 층 크로마토그래피는 Merck60 F254 실리카 겔(미리 코팅된 시트, 0.25 mm 두께)을 이용하여 수행되었다. 모든 반응은 질소 대기하에서 수행되었다. 피페라진(piperazine), 아세토니트릴(acetonitrile), 염화염의 Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Pb2+, Hg2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ 이온과 같은 금속, 테트라부틸암모니움(tetrabutylammonium;TBA) 염의 H2PO4 -, HSO4 -, ClO4 -, AcO-, CN-, OH-, F-, Cl-, I-이온과 같은 음이온, 시스테인(cysteine; Cys), 호모시스테인(homocysteine; Hcy), 글루타치온(glutathione; GSH), H2S 발생을 위한 소듐 하이드로설파이드(sodium hydrosulfide; NaHS)와 같은 티올기를 가진 화합물 및 합성을 위한 다른 화학물질 및 버퍼 용액을 포함하는 모든 시약들은 Aldrich, Alfa, TCI로부터 구매하여 받아진채로 사용되었다. 모든 용매는 분석용 시약을 사용하였다. 분광기 분석 실험을 위한 DMSO는 형광 불순물이 없는 HPLC 시약이며, 물은 탈이온화된 물을 사용하였다.
<실시예 2> UV/Vis 흡광 및 형광 분광분석 방법
합성 화합물의 원액은 DMSO에 준비하였다. TBA염의 음이온과 염화염의 금속 이온 원액은 각각 DMSO와 물에 준비하였다. H2O2, 3차-부틸하이드로퍼옥사이드(tert-butylhydroperoxide; HOOtBu) 및 소듐 하이퍼클로라이드(NaOCl)는 각각 35%, 70% 및 11-14% 수용액을 이용하였다. 히드록시 라디칼(Hydroxyl radical;·OH) 및 3차-부톡시 라디칼(tert-butoxy radical; tBuO˙)은 각각 10 mM Fe(ClO4)2에 10 mM H2O2과 HOOtBu의 반응에 의해 발생되었다. 티올기를 가진 화합물의 원액은 20 mM pH 7.4 HEPES 버퍼 용액에서 준비되었다. 흡광 및 발광(emission) 측정을 위한 샘플은 쿼츠 큐벳(4mL volume)에 넣어져 측정되었다. 여기(excitation)와 발광(emission) 슬릿(slit) 너비 5, 10nm로 여기(excitation)는 320nm에서 측정되었다.
<실시예 3> 화합물 1의 합성
화합물 3(50mg, 0.1mmol)과 10mL 다이클로로메탄(dichloromethane; DCM)에 4-니트로페닐 클로로포르메이트(4-nitrophenyl chloroformate)(58mg, 0.3mmol)의 혼합을 위해 피리딘(pyridine)(0.1mL, 1.2mmol)을 드롭방식으로 첨가하였다. 상기 용액은 질소가스 하에서 1시간동안 섞어주었다. 반응 완성은 TLC로 확인하였다. DCM/THF(v/v=1:1)의 2,2’-다이티올다이에탄올(2,2’-dithiodiethanol)(0.1mL, 0.8mmol)과 다이이소프로필에틸아민(diidopropylethylamine; DIPEA)(0.02mL, 0.1mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 그 후, 실온에서 하룻밤동안 섞어주었다. 용매를 제거한 후에, 조생성물은 DCM에 용해시키고, 물에 철저하게 헹궈낸 후, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 증발시킨 후에, 조생성물은 용리제로서 에틸아세테이트(ethylacetate)와 헥산(hexane)(v/v=1:3)을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 55% 수율(25mg)로 노란색 고상의 화합물 1을 얻었다. HR-ESI-MS m/z [M+Na]+ calcd 550.14790, found 550.14917. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 2.90 (t, 2H, J = 7.5 Hz); 2.97 (t, 2H, J = 7.5 Hz); 3.89 (s, 2H); 4.40 (t, 2H, J = 7.5 Hz); 6.73 (s, 1H); 6.95-7.10 (m, 19H) ppm. 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 29.7, 37.5, 41.6, 60.3, 126.4, 127.6, 127.7, 131.3, 131.4, 132.1, 135.8, 139.1, 140.2, 140.7, 143.6, 143.7, 143.7 ppm.(도 2a, b, c).
<실시예 4> 화합물 2의 합성
화합물 1(0.8mg, 0.2mmol)은 4mL의 아세토니트릴(acetonitrile; ACN)에 용해되었고, 여기에 NaHS(7mg, 0.1mmol)를 포함하는 20mM HEPES 버퍼(pH 7.4) 6mL를 첨가하였다. 상기 용액을 30분 동안 섞어주었고, 반응과정은 TLC로 확인하였다. 조생성물은 DCM으로 희석시키고, 물에 철저하게 헹궈낸 후, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 증발시킨 후에, 조생성물은 용리제로서 에틸아세테이트와 헥산(v/v=1:3)을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 30% 수율(41mg)로 흰색 고상의 화합물 2를 얻었다. HR-ESI-MS m/z [M+Na]+ calcd 923.29707, found 923.29579. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 2.95 (t, 4H, J = 7.5 Hz); 4.40 (t, 4H, J = 7.5 Hz); 6.95-7.02 (m, 15H); 7.03-7.11 (m, 26H) ppm. 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 37.3, 62.6, 117.9, 126.4, 126.5, 127.6, 127.7, 131.3, 131.4, 132.1, 140.2, 140.7, 143.6, 143.7 ppm.(도 3a, b, c).
<실험예 1> H 2 S의 존재하에 화합물 1의 반응 기전
도 4와 같이, 화합물 1은 H2S가 존재할 때, 화합물 1의 이황화 결합이 끊어져 TPE-SH를 생성하고, 이후에 화합물 1은 또 다른 티올-이황화 결합 교환이 일어나서, 분자내의 고리화 반응 대신에 AIEgen 이합체화 반응을 이끌었다. 이것은 상당한 형광 발광을 하는 TPE 이합체인 화합물 2 형성을 초래하였다. 이러한 AIEgen 이합체는 수용액에서 TPE 일부분의 소수성 결합에 의한 화합물 1의 응집반응으로 생겨났다. 다시 말해서, 응집반응 상태에서, 티올-이황화 교환으로부터 이합체화 반응 결과는 분자내 고리화 반응 보다 더 호의적이다. 게다가, AIEgen의 이합체화 반응은 증가된 AIE 효과 때문에 강한 형광을 나타냈다. 그러나, H2S가 초과 반응되었을 때, TPE 이합체인 화합물 2는 분자내의 고리화 반응에 의해서 이황화 결합이 끊어져 매우 약한 형광을 보이는 TPE-NH2가 생성되었다.
<실험예 2> 화합물 1, 2 및 3의 형광분석
화합물 1, 2 및 3에서 다른 비율의 물(fw)과 함께 물-DMSO 혼합물에서의 AIE 현상을 분석하였다(도 5 - 7). fw가 50%에서 90%로 증가함으로써, 이황화 결합된 AIEgen 화합물 1은 471nm에서 증가된 형광을 보였다. TPE-NH2인 화합물 3에서, 형광 세기의 증가는 fw가 60%에서 90%로 증가했을 때 500nm에서 관찰되었다. 그러나, TPE 이합체인 화합물 2는 fw> 30%, fw가 60%에 도달했을 때 안정화 되면서 증가된 형광이 관찰되었다. 또한, 증가된 형광 세기는 화합물 1과 화합물 3의 형광 세기보다 16배 이상 더 높아짐이 관찰되었다. 이것으로 화합물 2의 두 TPE 때문에 화합물 1 및 화합물 3보다 더 큰 AIE 효과를 보여주었음을 알아냈다. 게다가, H2S가 존재할 때, 화합물 1의 이합체화 반응(화합물 2의 형성)으로 강한 AIE-에 기초한 형광 증가가 있음을 밝혀냈다.
<실험예 3> 황화수소(H 2 S)에 대한 반응의 특성 분석
화합물 1의 흡광 및 형광의 변화는 40% DMSO(v/v)를 포함한 HEPES 버퍼(pH 7.4)에서 H2S가 존재할 때와 없을 때 관찰되었다(도 8a, b). 화합물 1의 용액은 314nm에서 흡광밴드와 464nm에서 발광 반응을 보였으나, 이 용액에 NaHS(H2S 도너)의 20등가물(equiv.)을 첨가했을 때, 흡광 및 발광 밴드는 강한 형광 증가를 보이며, 각각 342, 480nm로 변했다(도 8b 삽입). 이러한 결과의 스펙트라(spectra)는 비슷한 조건 하에서 TPE-NH2 화합물 3보다 독립된 TPE 이합체인 화합물 2의 스펙트라에 더 가깝게 일치했다(도 5 - 7).
게다가, NaHS가 존재할 때와 없을 때의 화합물 1의 응집반응은 FE-SEM과 DLS를 이용하여 알아냈다(도 8c, d), NaHS가 없을 때, 화합물 1은 응집되어 1,533nm의 평균 지름(Dave)을 보여줬다(도 9a, b). 그러나 NaHS가 존재할 때 응집체의 Dave은 1,070nm로 감소하였다. 게다가, 독립된 TPE 이합체인 화합물 2 응집체의 Dave은 826nm를 나타냈다(도 9c, d). 이와 대조적으로, TPE-NH2 화합물 3은 Dave=1,791nm로 상대적으로 큰 응집체를 보여줬다(도 9e, f). 이러한 결과로 응집체 크기는 수용액에서 AIEgen의 AIE 효과가 증가함에 따라 감소함을 알아냈다. 이로써 화합물 1은 H2S의 존재에 높은 발광체인 TPE 이합체 화합물 2의 형성을 이끌어냄을 증명하였다. 그러므로, 화합물 1은 수용액에서 H2S를 검출하기 위한 AIE 에 기초한 형광 프로브로서 사용될 수 있다.
<실험예 4> 간섭물 존재시, 황화수소(H 2 S)에 대한 화합물 1의 선택적 반응 분석
40% DMSO(v/v)를 포함하는 HEPES 버퍼(pH7.4, 20mM)에서 다양한 금속이온, 음이온, 활성 산소 종(reactive oxygen species; ROS), 티올기를 가진 화합물을 37℃, 1시간동안 인큐베이션한 후에 형광 반응을 조사하였다. 도 10a에서 볼 수 있듯이, NaHS(H2S 도너)의 20등가물(equiv.)을 첨가했을 때, 화합물 1은 480nm에서 상당한 형광 세기의 증가를 보였다. 이와 대조적으로, GSH, Cys, Hcy, ClO-, ˙O2-, ˙OH, 및 tBuOOH를 포함하는 다른 산화 환원 종이 존재할 때 무시할 수 있는 형광 변화가 관찰되었다. 게다가, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Pb2+, Hg2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+ 및 Fe3+를 포함하는 다른 금속이온과 H2PO4 -, HSO4 -, ClO4 -, AcO-, CN-, OH-, F-, Cl- 및 I-를 포함하는 음이온이 존재할 때 형광 변화가 관찰되지 않았다(도 11).
이러한 결과로 화합물 1은 다른 잠재적인 간섭물에 대해 H2S는 매우 선택적인 형광 증가 반응을 보임을 알아냈다.
<실험예 5> 황화수소(H 2 S) 농도에 따른 반응의 특성 분석
화합물 1을 사용하여 H2S 검출의 양적 분석을 위해, 다른 농도의 NaHS에서 화합물 1의 흡광 및 형광 변화를 관찰하였다. NaHS의 농도가 증가할 때, 341nm에서의 흡광 밴드는 342nm로 레드-이동(res-shift)되었는데, 이것은 TPE 이합체인 화합물 2의 형성 때문이다(도 12). 이와 대조적으로, 첨가된 NaHS의 농도가 증가할 때, 480nm에서 형광 세기가 점차적으로 증가(53배)되었다가 20등가물(equiv.)에서 포화상태가 되었다(도 10b, c). 점차적인 형광 증가는 또한 소형 UV 램프 하에서도 보여졌다(도 10c 삽입). 그러나, NaHS가 초과(1000등가물)된 경우에, 이황화 결합의 끊어짐을 매개로 TPE-NH2 화합물 3의 약한 발광 형성 때문에 화합물 1은 감소된 형광 세기를 보여줬다(도 13a). 화합물 3의 형성은 실리카 겔 TLC 분석을 이용해 확인하였다(도 14). 게다가, TPE 이합체인 화합물 2에서 NaHS가 초과 존재할 때 비슷한 형광 감소가 관찰되었으나, GSH, Cys 및 Hcy를 포함하여 다른 티올기를 가진 화합물이 초과 존재할 때에 화합물 2에서 무시할 수 있는 형광 변화가 관찰되었다(도 13b). 이것으로, 화합물 1은 H2S 존재 하에 선택적으로 TPE 이합체인 화합물 2의 형성을 통해 TPE-NH2 화합물 3을 생성할 수 있음을 알아냈다. H2S-선택적 형광 프로브 달성을 위해, 화합물 1의 형광 증가가 관찰된 범위인 NaHS의 0-34 등가물(0-170μM)에 집중하였다. 게다가, 480nm에서 형광세기가 0과 100 μM NaHS 사이에서 비례적으로 증가했는데, 이러한 범위는 H2S의 일반 생리학적 수치의 범위이다(도 15). 또한, NaHS에 대한 화합물 1의 검출한계(LOD, 3σ/s)는 84nM이었으며, 이것으로 화합물 1은 세포내의 H2S 수치인 0.01-3μM도 검출하는데 사용될 수 있다.
<실험예 6> 시간에 따른 황화수소(H 2 S)에 대한 화합물 1의 특성 분석
H2S와의 반응에 화합물 1의 시간에 따른 형광 변화는 37℃에서 40% DMSO(v/v)를 포함하는 HEPES 버퍼(pH 7.4, 20mM)에서 관찰되었다. NaHS(H2S 도너)의 20등가물(equiv.)의 존재에, 480nm에서 형광 세기가 증가되었으며, 1시간내에 안정상태에 도달되었다(도 10d의 빨간줄, 도 16). 이와는 대조적으로, NaHS이 없을 때, 화합물 1은 2시간 후에도 형광이 보이지 않았다(도 10d의 검은줄). 이러한 결과로 화합물 1은 H2S가 없을 때 안정화되나, H2S에 매우 민감하게 반응하여 생리학적 조건에서도 형광 신호를 제공함을 알아냈다.
<실험예 7> 화합물 1의 황화수소(H 2 S) 검출에 pH의 효과 분석
NaHS가 존재하거나 없을 때, 화합물 1의 H2S 검출에 pH 효과를 조사하였다(도 17). NaHS(H2S 도너)의 20등가물(equiv.)의 존재에, 생리학적 조건에서 널리 관찰되는 pH 수치 5와 8 사이에서 화합물 1은 480nm에서 명확한 형광 증가를 보여줬다. 이와는 대조적으로, 화합물 1은 pH 수치 1과 7 사이에서 무시할 수 있는 형광 변화를 보여줬다. 그러나, pH 수치 8과 11에서 화합물 1은 약간의 형광 증가를 보여줬는데, 이것은 TPE 일부분에 결합된 이황화 결합의 민감함 때문이다. 이러한 결과로 화합물 1은 대부분의 생리학적 pH 값에서 H2S를 검출할 수 있는 형광 증가를 제공할 수 있음을 알아냈다.
<실험예 8> 황화수소(H 2 S) 가스 검출 키트 제조 및 이를 이용한 황화수소(H 2 S) 가스 검출
H2S 가스를 검출하기 위해 화합물 1이 코팅된 실리카 겔 TLC 플레이트를 제작했다. 도 18a와 같이, 뒤쪽이 유리로 된 실리카 겔 TLC 플레이트는 2cm x 2cm 조각으로 자르고, 화합물 1의 DCM 용액에 담근(0.5mM)후에, 건조하였다. 각 화합물 1이 코팅된 플레이트는 초과적인 양의 휘발성 용액을 포함하는 바이알(vial) 위에 30초간 놓았다(도 18b). 유리 플레이트는 H2S, H2O2, 아세트알데하이드(acetaldehyde), 에틸 아세테이트(ethyl acetate; EA), 아세톤(acetone), 다이에틸 에테르(diethyl ether), 클로로폼(chloroform; CH2Cl2), 염산(hydrochloric acid; HCl), 트리플루오로아세트 산(trifluoroacetic acid; TFA), 황산(sulfuric acid; H2SO4), 아세트산(acetic acid; AcOH), 하이드라진(hydrazine; N2H4), 메틸아민(methylamine; CH3NH2), 암모니아(ammonia; NH3) 및 포름알데하이드(formaldehyde)를 포함하는 다양한 증기에 노출되었다. 소형 UV램프를 사용하여 365nm의 여기(excitation) 조건 하에서 형광색의 변화를 관찰하였다. H2S에 노출됐을 때, 상당히 밝은 파란 형광이 나타났으나, 다른 증기들에 노출됐을 때는 이러한 반응이 나타나지 않았다(도 18c). 게다가, 도 18d와 같이, NaHS 용액의 농도가 증가했을 때, 화합물 1이 코팅된 플레이트의 약한 파란 형광이 점차적으로 증가하였다.
화합물 1은 쉽게 H2S-선택성 이합체의 AIEgen이 발생되어 뒤쪽이 유리로 된 실리카 겔 TLC 플레이트에 TPE 이합체인 화합물 2의 형성을 초래한다. 화합물 1, 2 및 3이 코팅된 실리카 겔 TLC 플레이트를 준비하였다(도 19). H2S증기에 노출된 후에 화합물 1이 코팅된 플레이트에 밝은 파란 형광이 관찰되었으며, 화합물 2가 코팅된 플레이트에서도 형광이 관찰되었으나, 화합물 3이 코팅된 플레이트에서는 관찰되지 않았다. 결과적으로, 유리로 된 실리카 겔 TLC 플레이트에 코팅된 화합물 1은 H2S 가스를 선택적으로 검출할 수 있으며, 작업환경에서 독성의 H2S 가스 검출을 위한 센서 키트로서 사용될 수 있음을 보여주었다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure 112019086938705-pat00003

    (상기 화학식 1에서, R1은 하이드록시이며, R2, R3 및 R4는 수소임.)
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 조성물.
  5. 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 형광 프로브.
  6. 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 황화수소 검출용 센서 키트.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 센서 키트는 황화수소 존재 시 2개의 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 이황화 결합을 통해 형광을 나타내는 이합체를 형성하여 황화수소를 검출하는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 센서 키트.
  8. 제 6항 또는 7항에 있어서, 상기 황화수소는 수용액 또는 기상에 존재하는 황화수소인 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 센서 키트.
  9. 황화수소가 포함된 시료와, 2개의 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 접촉하여 반응 시키는 단계; 및
    상기 반응시킨 반응물의 형광 신호, 흡광 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 황화수소 검출 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 형광 신호는 황화수소 존재 시 2개의 제 1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 이황화 결합을 통해 얻어진 이합체 형태에 의해 발생되는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출 방법.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 황화수소는 수용액 또는 기상에 존재하는 황화수소인 것을 특징으로 하는 황화수소 검출 방법.
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