KR102033221B1 - 리나룰 나노입자와 항암제가 동시에 탑재된 암 치료용 리포좀 - Google Patents

리나룰 나노입자와 항암제가 동시에 탑재된 암 치료용 리포좀 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 리나룰 나노입자와 항암제가 봉입된 리포좀 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 리포좀은 리나룰 나노입자 및 항암제 두 가지 친수성 물질을 봉입한 것으로, 수동적 표적지향 방법인 EPR(enhanced permeability and retention) 효과를 통해 in vivo에서 암 조직에 선택적으로 축적되어 항암 효과가 뛰어나고 부작용이 적을 뿐만 아니라, 기존 항암제의 효과를 증진시키는 에쥬번트로서 리나룰 나노입자를 동시에 전달함으로써 암 치료에 대해 상승 효과를 나타내므로 암의 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

리나룰 나노입자와 항암제가 동시에 탑재된 암 치료용 리포좀{Liposome for treating cancer containing both linalool nanoparticles and anticancer drug}
본 발명은 리나룰 나노입자 및 항암제가 동시에 봉입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 불용성의 리나룰을 나노입자화하고 이를 항암제와 함께 리포좀에 봉입함으로써 in vivo 상에서 항암 활성을 향상시키고 부작용을 감소시킨 약물 전달 시스템에 대한 것이다.
리나룰(linalool) 나노입자는 자연계에 존재하는 테르펜 알코올 (terpene alcohol)인 200종 이상의 꽃 (특히 민트향기가 나는 Lamiaceae 속 허브종), 향료 식물에 포함되어 있는 부드러운 방향성의 천연화합물인 리나룰 나노에멀젼 형태로서 기존의 비수용성인 물질을 양친매성 고분자와의 합성을 통해 형성된 나노미터 크기의 구조물을 의미한다. 항암 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, 기존 항암제의 효과를 증진시키는 에쥬번트로서의 효과가 뛰어나 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
약물전달시스템(DDS, drug delivery system) 이라는 용어는 약물의 방출, 흡수를 제어하거나, 체내의 특정 부위에 약물을 전달하기 위한 것으로 약물의 부작용을 줄이고 표적부위에 약물을 선택적으로 전달하여 치료효능 및 효과를 극대화하는 시스템을 의미한다. 약물전달체로서 리포좀을 이용한 종양 특이적 약물 전달이 최근 암 치료 분야에서 많이 이용되고 있다. 리포좀은 생체세포막의 구성성분인 인지질을 주성분으로 사용하여 형성된 지질 이중막 구조의 소포체로서 내부에 수용성 약물을 봉입하거나 지질 이중막에 소수성 약물을 봉입시킬 수 있는 구조로 많은 약물의 전달에 사용되어 왔다. 또한, 인지질의 말단에 PEG(polyethylene glycol)을 결합시킨 인지질을 사용하여 세망내피계(reticuloendothelial system)에 의한 소실을 감소시키고 약물의 혈중순환시간을 연장시켜 표적부위로의 약물전달률을 높이는 효과를 증진시켰다.
인간의 몸을 구성하고 있는 가장 작은 단위를 세포(cell)이라 부르는데 정상적인 세포는 세포 내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하며 세포수의 균형을 유지한다. 어떤 원인으로 세포가 손상을 받은 경우, 치료를 받아 정상 세포로 역할을 하거나 회복이 안 된 경우 스스로 사멸하게 된다. 그러나 여러 가지 이유로 인해 세포의 유전자에 변화가 일어나면 비정상적으로 세포가 변하여 불완전하게 성숙하고, 세포주기가 조절되지 않아 세포분열을 계속하는데 이를 암(cancer)이라 정의한다. 또한 암은 주의 조직 및 장기에 침입하고 이들을 파괴할 뿐만 아니라 다른 장기로 펴져 갈 수 있는 특징이 있다. 암에 의한 사망률은 국내에서 사망원인 1위로, 매년 그 수가 증가하고 있다. 그 중 간암은 산업화 사회가 진행될수록 현대인들의 식습관이 고단백, 고지방식으로 변화함에 따라 발병률이 증가하고 있다. 암을 정복하기 위해 DNA 손상/복구의 기본적인 메커니즘, 아폽토시스, 종양형성, 및 분자 측면에서의 치료의 더 깊은 이해에 초점을 맞춘 혁신적인 암 연구가 강력하게 요구되며 (Varmus, 2006; Alberts, 2008, 2011), 이는 결국 암 요법에서의 돌파구가 될 수 있을 것이다.
현재 항암 화학치료에 있어 많은 환자들은 항암제의 부작용에 의하여 고통을 받고 있으며, 특히 항암제의 독성으로 인하여 제한적인 투여가 이루어지고 있다. 임상에서 사용되고 있는 항암물질은 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 영향을 미치며 투여회수가 반복되면서 치료에 실패하는 등 부작용 및 항암제 내성과 같은 문제점을 가지고 있다. 암 자체의 다양성 및 발병기전의 다양화로 인해 야기되는 기존항암제의 부작용을 극복할 수 있는 새로운 형태의 항암제 치료물질 연구가 진행되고 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 요구를 충족시키기 위하여 연구를 거듭한 결과 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀을 제조하고, 이의 암 예방 또는 치료에 대한 현저한 상승효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
1. 한국등록특허 제10-0726720호 2. 한국등록특허 제10-1189763호
본 발명에서는 리나룰 나노입자와 항암제를 함께 리포좀에 봉입하였을 때의 in vivo 상에서의 상승 효과, 암세포 선택적인 항암 효과 및 부작용 감소 효과를 확인하고, 이를 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 리나룰 나노입자 및 항암제를 함께 봉입한 리포좀을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 리나룰 나노입자 또는 항암제 단독으로 사용할 때보다, 리포좀에 함께 봉입한 경우 항암 활성이 시너지적으로 증가하였으며, 특히, 두 물질을 함께 리포좀에 봉입함으로써 in vivo에서 암세포 특이적으로 전달되어 소분자 항암제의 항암 활성은 최대화하고 부작용은 최소화시키는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 제조된 리나룰 나노입자, 리나룰 나노입자가 봉입된 리포좀, 및 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀의 입자크기 (A), 제타 전위 (B) 및 리나룰 나노입자 (C)와 독소루비신 적재효율 (D)을 측정한 결과를 나타낸 도이다:
Linalool-NP: 리나룰 나노입자;
Linalool/NTSL: 리나룰 나노입자가 봉입된 리포좀; 및
Linalool/DOX/NTSL: 리나룰 나노입자 및 독소루비신이 봉입된 리포좀.
도 2는 리나룰 나노입자의 농도에 따른 인간 난소암 세포주의 세포 생존률을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에서 제조된 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀의 농도에 따른 인간 난소암 세포주의 세포 생존률을 나타낸 도이다:
Doxorubicin: 독소루비신 단독 투여;
DOX/NTSL: 독소루비신이 봉입된 리포좀; 및
Linalool-NP(2mM)/DOX/NTSL: 리나룰 나노입자 2mM 및 독소루비신이 봉입된 리포좀.
도 4는 항암제 내성 난소암 모델세포주인 HeyA8-MDR를 주입한 마우스에서의 in vivo 항암 활성을 확인한 도이다:
A: HeyA8-MDR 주입, 약물 주입 및 희생까지의 모식도;
B: 종양 조직 및 마우스 무게;
Linalool-NP: 리나룰이 봉입된 리포좀;
DOX liposome: 독소루비신이 봉입된 리포좀; 및
Linalool-NP-DOX liposome: 리나룰 및 독소루비신이 함께 봉입된 리포좀.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
일 측면에서, 본 발명은 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 리나룰(linalool)은 비수용성이며, 하기의 화학식 1로 나타낼 수 있다:
Figure 112017105387758-pat00001
일 구현예에서, 상기 리나룰 나노입자는 계면활성제와 같은 양친매성 고분자를 이용하여 자가-나노-유화 약물 전달 시스템(self-nanoemulsifying drug delivery system, SNEDDS)의 방법으로 제조할 수 있다. 상기 자가-나노-유화 약물 전달 시스템이란 리나룰의 자기조합(self-assembly)으로 소수성과 친수성을 함께 갖는 양친매성 고분자와의 합성을 통해 나노미터 크기의 구조물을 제조하는 것을 의미한다. 상기 과정을 통해 제조된 본 발명에 따른 리나룰 나노입자는 나노에멀젼 형태이다.
일 구현예에서, 상기 암은 상기 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 난소암이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 소분자 물질인 독소루비신인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서 항암제로서 사용한 독소루비신(doxorubicin)은 안트라사이클린계 항종양제 계열에 속하는 항암제로서 세포 주기 선택적으로 작용하여 세포 분열을 저해하므로 유방암, 난소암, 폐암, 기관지 암 등 다양한 암치료에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 리포좀은 인지질들 간의 자기 조립(self-assembly) 과정으로 제조할 수 있으며 상기 인지질은 L-α-phosphatidylcholine(soyhydrogenated) (HSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphochline(DPPC), 1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(MSPC), 1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(MPPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000](DSPE-mPEG2000) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질로 이루어질 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 L-α-phosphatidylcholine(soyhydrogenated)(HSPC) 및 1-α-phosphatidyl-choline-1,2-distearoy1-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethylene -glycol-2000] (DSPE-mPEG2000)를 이용하여 리포좀을 제조하였다.
본 발명에서 "인지질들 간의 자기 조립(self-assembly) 과정"은 인지질의 극성분자단은 물쪽으로 향하고 비극성분자단은 자기들끼리 소수성 상호작용에 의해 결합되어 2분자막이 자발적으로 형성되며, 이는 소수성 부분이 물과 접촉하지 않기 위하여 구형의 소포체가 합성을 통해 나노미터 크기의 구조물을 제조하는 것을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 리나룰 나노입자는 70 내지 90nm의 입자크기를 가지며, 리나룰 나노입자를 봉입한 리포좀은 80 내지 100nm의 입자크기를 가지고, 리나룰 나노입자와 독소루비신이 봉입된 리포좀은 100 내지 200nm의 입자크기를 가지는 나노에멀젼 형태인 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 리포좀에 봉입된 리나룰 나노입자의 농도는 1 내지 8mM일 수 있다. 일 실시예에서, 리나룰 나노입자의 농도가 2mM 이상인 경우 항암 활성이 가장 현저한 것을 확인하였다.
본 발명의 리포좀에 봉입된 독소루비신의 경우 소분자(small molecule) 물질로, 단독으로 사용할 경우 원하는 종양 조직으로만 전달되는 것이 아니라 전신, 특히, 심장에 상당량 분포되기 때문에 비가역적인 심근증이나 울혈성 심부전 같은 심장 부작용이 나타난다. 암은 빠른 세포분열 등으로 인하여 산소 등의 혈액공급이 다량 요구되므로 암 조직 주위에 형성되는 신생혈관은 정상혈관에 비해서 혈관상피세포간의 간극이 느슨하고 림프조직이 덜 형성되므로 나노 크기의 리포좀이 쉽게 통과할 수 있고 이러한 EPR 효과에 의해서 정상조직이 아닌 암 부위에만 선택적으로 전달될 수 있는 효과가 있다. 이에 본 발명에서는 리나룰 나노입자와 독소루비신을 암 조직 등의 체내의 특정 부위에만 분포시키기 위하여 리포좀 (운반체)을 사용하여 in vivo에서의 약효를 최대화하고 항암제의 부작용을 최소화하였다. 일 실시예에서, 독소루비신이 봉입된 리포좀의 경우 in vitro 상에서의 효과는 독소루비신 단독으로 사용한 것에 비해 효과가 떨어지게 나타난 바와 같이, 독소루비신은 소분자 물질이므로 in vitro 상에서 쉽게 세포 내로 들어가게 되고, 반면에 리포좀의 경우 나노 크기의 사이즈 때문에 독소루비신보다 세포 내로 들어가는 확률의 차이가 발생하므로, in vitro 상에서 리포좀에 봉입된 독소루비신의 항암 효과가 상대적으로 저조하게 나타날 수 있다. 하지만 in vivo 상에서는 전신으로 퍼지는 독소루비신에 비해 리포좀의 경우 EPR 효과에 의해 종양 조직 특이적으로 축적이 되므로 항암 효과가 훨씬 뛰어나며 부작용 발생 확률이 줄어들고, 리나룰 나노입자의 에쥬번트(adjuvant) 효과도 향상시켜 각각을 병용 투여한 것에 비해 현저한 항암 활성 상승 효과를 나타내게 된다.
따라서, 본 발명의 리포좀은 리나룰 나노입자 및 항암제를 함께 봉입함으로써 약물을 선택적으로 암 조직으로 전달하여 축적시킬 수 있으며, 암 조직으로 항암제와 리나룰 나노입자를 동시에 전달하여 리나룰 나노입자와 항암제 각각을 병용 처리할 때에 비해 항암 활성이 현저하게 증진되기 때문에 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명의 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 암세포의 사멸 또는 암의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
일 구현예에서, 상기 약학조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있으며, 주사 제형이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 리나룰 나노입자를 제조하는 단계; 지질 필름을 제조하는 단계; 상기 지질 필름을 암모늄 설페이트 및 상기 리나룰 나노입자로 수화시키는 단계; 초음파 처리하여 유니라멜라(unilamellar) 형태의 리포좀을 제조하는 단계; 및 항암제를 리포좀 내부로 봉입하는 단계를 포함하는 리나룰 나노입자 및 항암제를 함께 봉입한 리포좀을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 리포좀 제조 방법은 (a) 인지질들을 유기용매에 용해하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 용액을 evaporator로 감압 증발 단계; (c) 상기 (b) 단계에 생성된 인지질 얇은 막에 암모니움 설페이트 및 리나룰 나노입자 용액으로 수화시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 용액을 sonicator를 이용하여 유니라멜라(unilamellar) 소포 형태의 리포좀으로 제조하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 용액을 sepadex G-50 칼럼을 통해 봉입되지 않은 암모니움 설페이트 및 리나룰 나노입자를 제거하는 단계; (f) 상기 (e) 단계의 용액에 독소루비신 용액을 넣어 항온 수조에서 독소루비신을 리포좀 내부 공간에 봉입시키는 단계; (g) 상기 (f) 단계의 용액을 sepadex G-50 칼럼을 통해 봉입되지 않은 독소루비신을 제거하는 단계로 제조될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 (c) 단계는 리포좀 친수성 내부 공간에 암모니움 설페이트 및 리나룰 나노입자를 봉입시키는 단계로서, 얇은 막 수화 과정을 통해 리포좀이 형성되며, 상기 (f) 단계의 봉입 단계는 50℃에서 24시간 동인 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (2)의 지질 필름은 L-α-phosphatidylcholine(soyhydrogenated) (HSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphochline(DPPC), 1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycer o-3-phosphocholine(MSPC), 1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(MPPC) 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoetha nolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000](DSPE-mPEG2000) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질을 클로로포름/메탄올 혼합 용매에 용해시키고 감압 증발시켜 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법으로 리포좀에 봉입된 리나룰 나노입자의 적재효율은 50 내지 70%일 수 있으며, 독소루비신의 적재효율은 20 내지 40%일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 리나룰 나노입자의 제조
불용성인 리나룰을 가용화하기 위하여 자가-나노-유화 약물 전달 시스템(self-nanoemulsifying drug delivery system, SNEDDS)의 방법을 이용해 리나룰 나노입자를 제조하였다. 구체적으로, 900mg의 리나룰을 1.064g의 Tween 80(polyoxyethylene(20) sorbitan monooleate) 또는 Tween 20(Polypxyethylene(20) sorbitan monolaurate) 용액 (4% v/v)에 첨가한 후 실온에서 일정하게 교반하여 자발적 형성을 유도함으로써 나노에멀젼 형태로 제조하였다. 교반 후 형성된 리나룰 나노입자를 4℃에서 40분 동안 안정화한 뒤 투석막을 이용하여 반응하지 않은 Tween 80 또는 Tween 20을 4℃에서 24시간 동안 제거하여 최종적으로 생성된 리나룰 나노입자 (linalool-NP)를 분리하였다.
실시예 2. 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀의 제조
소분자(small molecule) 항암제의 부작용을 최소화하고 암 조직 부위에만 선택적으로 전달하기 위하여, 인지질들 간의 자기 조립(self-assembly) 및 얇은 필름 수화(thin film hydration)의 방법을 이용하여 리나룰 나노입자 및 항암제를 리포좀에 봉입하였다. 구체적으로, L-α-phosphatidylcholine(soyhydrogenated)(HSPC), Cholesterol 및 1,2-distearoy1-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethylene-glycol-2000](DSPE-mPEG2000)을 22.9:7.6:7.6의 무게비 (mg)로 혼합한 뒤 이들을 클로로포름/메탄올 혼합 용매에 용해시켰다. 상기 혼합 용매를 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 유기 용매를 감압 증발시킴으로써 지질로 이루어진 얇은 지질필름을 제조하였다. 제조된 지질필름을 1:1 (v/v)의 암모늄 설페이트 및 상기 실시예 1에서 제조한 리나룰 나노입자 용액 (30mg/ml)으로 수화시킨 후, 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 유니라멜라(unilamellar) 소포 형태의 리포좀을 제조하였다. 리포좀 내부에 봉입되지 않은 암모늄 설페이트 및 리나룰 나노입자를 sepadex G-50 칼럼을 이용하여 4℃에서 제거하였다. 그 후, 암모늄 설페이트 및 리나룰 나노입자가 봉입된 리포좀 용액과 항암제인 독소루비신 (2mg/ml) 용액을 항온수조 50℃에서 20시간 내지 24시간 동안 반응시켜, 암모늄 설페이트의 편차에 의해 독소루비신이 리포좀 내부로 봉입되게 하였다. 독소루비신을 리포좀 내부로 봉입시킨 후 봉입되지 않은 독소루비신을 sephadex G-50 칼럼을 이용하여 4℃에서 제거함으로써 최종적으로 리나룰 나노입자 및 독소루비신이 함께 봉입된 리포좀을 제조하였다.
실험예 1. 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀의 특성
1-1. 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀의 물리적 특성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 리나룰 나노입자, 리나룰 나노입자가 봉입된 리포좀, 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀의 크기, 입자 표면의 전위 및 리나룰 나노입자 및 항암제의 적재효율(loading efficiency)을 확인하였다. 구체적으로, 광산란장치를 이용하여 나노입자와 리포좀의 크기를 측정한 결과, 리나룰 나노입자의 크기는 80nm이었으며, 리나룰 나노입자가 봉입된 리포좀의 크기는 90nm, 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀의 크기는 150nm임을 확인하였다 (도 1A). 또한, 제타 전위 측정기를 이용하여 입자 표면의 전위를 측정한 결과, 리나룰 나노입자의 전위 값은 -14mV이었으며, 리나룰 나노입자가 봉입된 리포좀의 전위 값은 -16mV, 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀의 전위 값은 -20mV임을 확인하였다 (도 1B). 아울러, 리나룰 나노입자와 리나룰 나노입자 및 항암제의 리포좀 적재효율(loading efficiency)을 UV 분광 광도계를 이용하여 각각 295nm 및 498nm의 흡광 파장에서 측정한 결과, 리나룰과 독소루비신을 함께 리포좀에 적재했을 때, 리나룰 나노입자의 리포좀 적재효율은 60%로 나타났고, 독소루비신의 리포좀 적재효율은 25%로 나타났다 (도 1C 및 1D).
1-2. 리나룰 및 항암제의 리포좀 적재 효율 조절
리포좀에 봉입되는 리나룰 나노입자의 적재 효율은 리나룰 나노입자의 농도를 조절함으로써 조절되는 것을 확인하였다. 구체적으로, 100 mM의 리나룰 나노입자를 봉입했을 경우 약 60%의 봉입(적재) 효율을 나타내는 것을 확인하였으며, 30mM의 리나룰 나노입자를 봉입했을 경우에는 약 70%의 봉입 효율을 나타냄을 확인하였다. 또한, 항암제인 독소루비신을 봉입할 때 온도를 올리면 독소루비신의 적재 효율이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, 리나룰 나노입자는 기화점이 낮아, 독소루비신의 봉입시 온도를 높이면 리나룰 나노입자의 적재 효율이 감소하였다.
이를 통해, 리나룰 나노입자의 농도와 항암제 봉입시 온도 조건을 조절함으로써 리나룰 나노입자 및 항암제의 적재 효율, 즉, 이들의 적재 비율을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2. 리나룰 나노입자 및 항암제가 함께 봉입된 리포좀의 in vitro 암세포 사멸 효과
2-1. 리나룰 나노입자의 in vitro 암세포 사멸 확인
본 발명의 리나룰 나노입자가 암세포의 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 리나룰 나노입자를 인간 난소암 세포주인 HeyA8 및 HeyA8 MDR에 각각 0.5mg, 1mg, 2mg, 4mg 및 8mg씩 처리하고, 24시간 마다 MTT 분석으로 암세포에 대한 리나룰 나노입자의 독성을 측정하였다.
그 결과, 리나룰 나노입자의 농도가 증가할수록 암세포에 대한 독성이 증가했으며, 특히, 농도 2mM까지 현저하게 항암 효과가 증가하는 경향을 나타냈다 (도 2).
2-2. 리나룰 나노입자 및 항암제가 봉입된 리포좀의 in vitro 암세포 사멸 확인
상기 실시예 2에서 제조된 리나룰 나노입자 및 항암제가 함께 봉입된 리포좀이 암세포의 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 독소루비신, 독소루비신이 봉입된 리포좀, 리나룰 나노입자 (2 mM 봉입) 및 독소루비신이 함께 봉입된 리포좀을 독소루비신 농도 0.312 μM, 0.625 μM, 1.25 μM, 2.5 μM 및 5 μM에 따라 각각 인간 난소암 세포주인 HeyA8 및 HeyA8 MDR에 처리하였다. 약물 처리 후 24시간마다 MTT 분석을 통하여 세포 독성을 측정하였다.
그 결과, 리나룰 나노입자와 독소루비신을 함께 봉입한 리포좀의 경우 독소루비신 또는 독소루비신이 봉입된 리포좀보다 현저하게 암세포의 생존을 감소시켜, 리나룰 나노입자가 독소루비신의 항암 효과를 향상시키는 에쥬번트로서의 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 또한, 독소루비신보다 독소루비신을 봉입한 리포좀의 항암 활성이 오히려 감소되는 것으로 나타났으나, 이는 소분자 물질인 독소루비신이 in vitro 상에서 쉽게 세포 내로 들어가게 되는 반면, 독소루비신이 봉입된 리포좀의 경우 나노 크기의 사이즈 때문에 독소루비신보다 세포 내로 들어가는 확률의 차이가 발생하고 이로 인해 in vitro 상에서 효과가 떨어진 것으로 유추된다.
실험예 3. 리나룰 나노입자 및 항암제가 함께 봉입된 리포좀의 in vivo 암세포 사멸 효과
본원발명의 리나룰 나노입자 및 항암제 (독소루비신)이 함께 봉입된 리포좀의 항암 활성을 in vivo로 확인하였다. 구체적으로, 리나룰-NP 투여군, 리포좀 봉입된 리나룰-NP 투여군, 독소루비신 투여군, 리포좀에 봉입된 독소루비신 투여군, 리나룰-NP 및 독소루비신의 병용 투여군, 리포좀에 봉입된 리나룰-NP 및 리포좀에 봉입된 독소루비신의 병용 투여군, 및 리나룰-NP 및 독소루비신이 함께 봉입된 본원발명의 리포좀 투여군으로 군을 나누어 항암활성을 비교하였다.
실험예 4. 항암제 내성 암에 대한 사멸 효과
인간화 항암제 내성 난소암 모델세포주인 HeyA8-MDR(multi drug resistance)을 주입한 마우스를 이용하여, 리나룰이 봉입된 리포좀, 항암제가 봉입된 리포좀, 및 리나룰 나노입자 및 항암제가 함께 봉입된 본 발명의 리포좀 (linalool-NP-DOX liposome)의 항암제 내성 암종에 대한 항암 효능을 비교하였다. 구체적으로, HeyA8-MDR 세포주를 마우스에 주입한 뒤, 리나룰 50 mg/kg, 독소루비신 (DOX): 3 mg/kg 및 동량의 리나룰과 독소루비신을 봉입한 리포좀을 도 4A에 나타낸 바와 같이 투여하였다. 그 후, 마우스들을 희생시킨 뒤, 암종의 무게와 마우스의 무게를 측정하였다.
그 결과, 리나룰 50 mg/kg 및 독소루비신 3 mg/kg은 종양조직의 성장을 억제하지 못해 항암 효과를 나타내지 않았으나, 본 발명의 리포좀(linalool-NP-DOX liposome)은 항암제 내성 암종의 성장을 억제하여 유의적인 항암 효과를 나타냈다 (도 4B).
따라서, 리나룰과 항암화학제를 동시에 탑재한 본 발명의 리포좀은 항암제 내성 암에 대한 항암제의 약물민감성을 증가시켜 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.

Claims (8)

  1. 리나룰 나노입자 및 독소루비신이 봉입된 리포좀을 유효성분으로 포함하며, 상기 리포좀은 L-α-phosphatidylcholine(soyhydrogenated) (HSPC) 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoetha nolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000](DSPE-mPEG2000)로 이루어진, 암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 리포좀에 봉입된 리나룰 나노입자의 농도는 1 내지 8mM인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
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