KR102028108B1 - 석영 모세관을 이용한 형광표지 없는 생물입자 검출 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다파장 고휘도 초집적 반도체 광원부를 활용한 광학셀의 설계변수 도출을 기반으로 하는 생물입자의 검출 시스템에 관한 것으로서, 특히, 석영 모세관의 개질화를 이용한 항원-항체 반응을 통해 특정 생물입자와 선택적으로 결합이 가능한 생물입자 검출장치에 관한 것이다. 구체적으로, 광원부로부터 발생된 광에 의해 광학셀에 초점이 형성되고, 광학셀 내부에 위치한 모세관의 하이드록시기와 유입되는 실란화합물의 반응을 통해 모세관 벽에 실란화합물이 부착되며, 모세관 내부로 유입되는 링커가 반응을 통해 실란화합물에 연결된 후, 항체를 상기 링커에 고정함으로써 생물입자를 포집하는 것을 포함하는, 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치에 관한 것이다.
Description
본 발명은 다파장 고휘도 초집적 반도체 광원부를 활용한 광학셀의 설계변수 도출을 기반으로 하는 생물입자의 검출에 관한 것으로서, 특히 석영 모세관의 표면 개질을 이용한 항원-항체 반응을 통해 특정 생물입자와 선택적으로 결합이 가능한 생물입자 검출 시스템에 관한 것이다.
단백질의 방향족 아미노산류(즉, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 등), NADH 및 플라빈(flavin)류는 대표적으로 분광학적 발색단을 갖는 생물입자이다. 이들 중 많은 조성으로 존재하며 가장 강한 형광을 나타내는 아미노산을 여기시키기 위해서는 원자외선(deep UV) 광원이 필요한데, 약 270nm 내지 약 280nm의 여기파장에서 가장 강한 형광을 나타내므로, 상기 아미노산류와 같은 생물입자 여기를 위해서는 상기 범위의 여기광원이 필요하다.
예를 들어, 원자외선 파장을 흡수하는 대표적인 아미노산인 트립토판은 알콜 용액에서 약 278nm를 정점으로 하는 흡수 스펙트럼을 보이고, 약 5,300 cm-1/M의 흡광도를 나타낸다. 또한, 생물입자 중 포자(胞子)는 무성 생식 식물(예를 들어, 균류(버섯, 곰팡이))에서 생식을 위해서 분리되는 단세포로서 두꺼운 세포벽을 가지는 경우가 많으며, 내생포자(endospore)로서 성숙된 포자는 약 750가지의 단백질을 발현하는데, 약 270nm 내지 약 280nm의 광원으로 방향족 아미노산의 형광 탐지가 가능하다.
반면, 식물 또는 동물로부터 배출되는 독소(toxin)는 크게 균체 내 독소(endotoxin)와 균체외 독소(exotoxin)로 나뉘는데, 균체 내 독소는 직접적인 형광 탐지가 가능하지만, 균체외 독소의 경우는 생물학적 대사과정이 거의 없기 때문에 세균(및 포자)에 비해 NADH와 플라빈의 양이 세균에 비해서 현저히 적어 상기 광원으로 검출이 어려울 수 있다. 따라서 NADH 또는 플라빈을 검출 대상으로 할 경우, 다른 여기 광원(예를 들어, 340nm 광원)을 도입하여 세균/포자와의 형광 차이로 확인이 가능한데, 이를 위해, 약 270nm 내지 약 280nm의 광원을 비롯하여 다양한 파장의 여기광원을 가지는 다파장 분광기가 요구된다.
이러한 다파장 분광기에 사용되는 다이오드를 이용한 고체상 광원(LED)은 소형화/경량화된 검출 시스템에서 적용 구조가 간단하기 때문에 대량생산이 가능하고 저렴하며 소형이고 수명이 길다. 또한 입력 전압에 대한 응답이 빨라서 통신에도 사용되며, 전기가 연결되는 즉시 최대 발광치를 발현한다. 이러한 고휘도 자외선 LED를 이용하면 저비용의 안정적 광원으로 생물입자를 포함한 거의 모든 염료를 여기시킬 수 있다.
한편, 에어로졸 상태의 생물입자의 형광 탐지는 에어로졸의 유량의 속도 및 입자의 크기에 민감하며, 검출이 어렵다. 그러나 생물입자를 포함한 에어로졸을 모세관을 통해 이동하도록 유도한 후 우리가 확인하고자 하는 생물입자를 선택적으로 모세관 외벽에 고정시킬 수 있다면 적은 양의 생물입자도 포집시간 축적에 따라 일정수준 이상의 형광 신호를 발현할 수 있다. 생물입자의 비가역적인 고정에 있어 가장 확실하고, 효과적이면서 보편화된 방법은 실란화 반응(silanization method)이며, 상기 개질 방법을 통해 해로운 생물입자 또는 존재 유무를 확인하고자 하는 생물입자에서 발현하는 신뢰성 높은 신호 획득이 가능해진다.
이러한 생물입자의 고감도 자발 형광 신호 획득을 위해서는 입자를 여기시킬 수 있는 광원의 파장과 세기가 중요하다. 대체적으로 획득신호대비 잡음비가 작아 검출이 어려운 에어로졸상 또는 액상 생물입자 시료의 형광을 검출하기 위해서는 상기 이점을 갖는 LED(Light Emitting Diode) 광원의 집속이 필수적인데, 자외선에 높은 투과도를 가지는 광학재료의 제한성과 광학재료의 낮은 굴절률로 인해 광원의 집속에 어려움이 있다. 이를 극복하기 위해서는, 광학렌즈를 이용한 렌즈모듈의 개발이 필수적이다.
본 발명은 다파장 자외선 집속 광원부의 최적 설계 및 석영 모세관의 개질화를 통한 생물입자의 검출방법 및 이를 포함하는 검출 시스템에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 다파장의 고휘도 초집적 반도체 자외선 광원부 및 개질화된 석영 모세관을 이용하여 특별한 형광 표지 없이도 가능한 생물입자의 실시간 검출방법 및 검출장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면은, 생물입자의 광학적 검출장치에 있어서, 광원부; 상기 광원부로부터 발생된 광에 의해 초점이 형성되는 광학셀; 상기 광학셀의 내부에 위치하며 상기 생물입자가 포집되는 모세관; 및 상기 생물입자에 투과된 상기 광에 의해 발생되는 산란광을 검출하는 검출부;를 포함하여 이루어지며, 상기 생물입자가 상기 모세관을 지날 때 선택적인 항원-항체반응을 통해 상기 생물입자를 상기 모세관의 중심부에 고정시킴으로써 집광이 되는 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치를 제공한다.
이를 위해, 본 발명에서는 라이트 툴즈(Light tools) 프로그램을 이용하여 광원부를 설계하였으며, 광원부 최적 설계 변수 도출을 바탕으로 제작된 광원부를 도입한 후 광학셀의 설계 변수를 도출하였다. 또한 석영 모세관의 표면 개질 조건을 도출한 후 현미경 및 PMT(광증배관, photo multiplier tube)를 이용하여 개질화 여부 및 생물입자의 신호를 측정하였다.
구체적으로, 광원부, 렌즈 및 광학셀로 구성되는 생물입자의 형광 검출 시스템에 있어서, 광학셀 중심부에 직경 3mm의 석영 모세관을 위치시키고, 광원부에서 생성된 빛이 모세관 중심부를 지나면서 형광이 발현되도록 설계하였다. 생물입자를 포함하는 에어로졸상(또는 액상)을 모세관에 투입하여 선택적인 항원-항체 반응으로 생물입자를 고정한 후, 모세관의 중심부에 집광함으로써 입자에 의한 산란이 일어나도록 하였다. 발생하는 빛의 이동 방향에 수직한 곳에 위치한 감지부(receiver)가 병원체 등의 생물입자에 의한 산란 및 형광 신호의 감지가 가능하게 된다.
또한, 상기 광학셀의 내부에 형성된 상단부 미러 및 하단부 미러는 각각 타원형 미러 및 구형 미러에 의해 형성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 광학셀의 내부의 상단부 미러에 의해 둘러싸인 지점에 제1초점이 형성되고, 상기 광학셀의 내부이면서 상기 하단부 미러의 외부에 제2초점이 형성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 하단부 미러와 PMT 위치 사이의 길이/상기 상단부 미러의 높이의 비율은 0.6인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 모세관은 중심부의 직경이 상기 모세관 양단의 직경보다 작은 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 모세관 표면의 하이드록시기와 유입되는 실란화합물의 반응을 통해 모세관 벽에 상기 실란화합물이 부착되고, 상기 모세관의 내부로 유입되는 링커가 반응을 통해 상기 실란화합물에 연결된 후, 상기 항체를 상기 링커에 고정함으로써 상기 생물입자를 포집하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 실란화합물은 아민기를 포함하는 아미노실란화합물으로서, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, (3-아미노프로필)트리메톡시실란, (3-아미노프로필)트리에톡시실란, 3-트리에톡시실릴-N-(1,3-디메틸부틸리덴)프로필아민, N-페닐-3-아미노프로필트리메톡시실란 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 한편으로, 본 발명의 다른 일실시예는, 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치에서 상기 생물입자를 포집하는 방법으로서, 모세관 표면의 하이드록시기를 활성화하는 단계; 상기 모세관을 실란화합물 함유 용액에 담궈 상기 하이드록시기와 반응시킨 후 초음파 처리하는 단계; 상기 모세관을 링커 함유 용액에 담궈 상기 실란화합물에 상기 링커를 연결하는 단계; 상기 모세관을 항체 함유 용액에 담궈 상기 링커에 상기 항체를 고정하는 단계; 및 상기 모세관 내부로 생물입자의 유입을 통해 상기 항체가 상기 생물입자를 포집하는 단계;를 포함하는 모세관을 이용한 생물입자의 포집방법을 제공한다.
또한, 상기 광학셀의 내부에 형성된 상단부 미러 및 하단부 미러는 각각 타원형 미러 및 구형 미러에 의해 형성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 광학셀의 내부의 상단부 미러에 의해 둘러싸인 지점에 제1초점이 형성되고, 상기 광학셀의 내부이면서 상기 하단부 미러의 외부에 제2초점이 형성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 하단부 미러와 PMT 위치 사이의 길이/상기 상단부 미러의 높이의 비율은 0.6인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 모세관은 중심부의 직경이 상기 모세관 양단의 직경보다 작은 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 모세관 표면의 하이드록시기와 유입되는 실란화합물의 반응을 통해 모세관 벽에 상기 실란화합물이 부착되고, 상기 모세관의 내부로 유입되는 링커가 반응을 통해 상기 실란화합물에 연결된 후, 상기 항체를 상기 링커에 고정함으로써 상기 생물입자를 포집하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 실란화합물은 아민기를 포함하는 아미노실란화합물으로서, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, (3-아미노프로필)트리메톡시실란, (3-아미노프로필)트리에톡시실란, 3-트리에톡시실릴-N-(1,3-디메틸부틸리덴)프로필아민, N-페닐-3-아미노프로필트리메톡시실란 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 한편으로, 본 발명의 다른 일실시예는, 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치에서 상기 생물입자를 포집하는 방법으로서, 모세관 표면의 하이드록시기를 활성화하는 단계; 상기 모세관을 실란화합물 함유 용액에 담궈 상기 하이드록시기와 반응시킨 후 초음파 처리하는 단계; 상기 모세관을 링커 함유 용액에 담궈 상기 실란화합물에 상기 링커를 연결하는 단계; 상기 모세관을 항체 함유 용액에 담궈 상기 링커에 상기 항체를 고정하는 단계; 및 상기 모세관 내부로 생물입자의 유입을 통해 상기 항체가 상기 생물입자를 포집하는 단계;를 포함하는 모세관을 이용한 생물입자의 포집방법을 제공한다.
본 발명에 의하여, 광학렌즈를 이용한 광원부 최적 설계를 기반으로 다파장 광원을 탑재한 다파장 렌즈모듈의 설계가 가능하고, 석영 모세관이 장착되는 광학셀의 시뮬레이션 및 설계를 통해 실시간 생물입자 형광 탐지를 위한 광학 시스템 구현이 가능하다.
특히, 광학셀에 위치한 석영 모세관의 개질화를 통해 특정 생물입자를 검출할 수 있고, UV LED 광원을 활용하여 실시간으로 생물입자의 형광을 탐지할 수 있다.
또한, 본 발명의 다파장 광원부에 탑재되는 LED 광원 파장대의 다양화를 통해 생물입자의 검출뿐만 아니라, 목표로 하는 자발 형광 물질에 따른 다양한 분자 및 재료들의 특성 연구에 사용이 가능하다.
도 1은 광원부 구성을 나타낸 모식도이다.
도 2는 광원부의 구성을 3D도면으로 구현한 그림이다.
도 3은 광학셀 구성을 표현한 그림이다.
도 4는 광원부 및 광학셀을 연동한 모식도이다.
도 5는 연동한 광원부, 광학셀의 상면부 모식도이다.
도 6은 항체로 표면 개질된 모세관에 항원이 반응한 모습을 나타낸 모식도이다.
도 7은 석영 모세관의 표면을 개질하는 실란화 반응을 순차적으로 나타낸 모식도이다.
도 8은 광학셀에서 여기광 및 유체의 이동경로를 나타낸 모식도이다.
도 9는 광학셀 크기 변화에 따른 모식도이다.
도 10은 광학셀 크기에 따른 산란광의 조도값 및 분포도 변화를 나타낸 그림이다.
도 11은 광학셀 크기에 따른 형광의 조도값 및 분포도의 변화를 나타낸 그림이다.
도 12는 항체의 개질화 여부를 현미경을 통해 확인한 그림이다.
도 13은 표면 개질되지 않은 모세관의 현미경 그림이다.
도 14는 형광체(FITC)가 달린 항체 개질화된 모세관과 개질화되지 않은 모세관의 형광신호를 PMT(광증배관, photo multiplier tube)를 이용하여 확인한 결과이다.
도 15는 형광체(FITC)의 파장에 따른 여기 및 방사 정도를 나타낸 그래프이다.
도 16은 형광체(FITC)가 없는 BA(바실러스 아트로페어스, Bacillus atrophaeus)항체로 개질화된 샘플을 BA와 항원-항체 반응시켜 신호를 확인한 결과이다.
도 2는 광원부의 구성을 3D도면으로 구현한 그림이다.
도 3은 광학셀 구성을 표현한 그림이다.
도 4는 광원부 및 광학셀을 연동한 모식도이다.
도 5는 연동한 광원부, 광학셀의 상면부 모식도이다.
도 6은 항체로 표면 개질된 모세관에 항원이 반응한 모습을 나타낸 모식도이다.
도 7은 석영 모세관의 표면을 개질하는 실란화 반응을 순차적으로 나타낸 모식도이다.
도 8은 광학셀에서 여기광 및 유체의 이동경로를 나타낸 모식도이다.
도 9는 광학셀 크기 변화에 따른 모식도이다.
도 10은 광학셀 크기에 따른 산란광의 조도값 및 분포도 변화를 나타낸 그림이다.
도 11은 광학셀 크기에 따른 형광의 조도값 및 분포도의 변화를 나타낸 그림이다.
도 12는 항체의 개질화 여부를 현미경을 통해 확인한 그림이다.
도 13은 표면 개질되지 않은 모세관의 현미경 그림이다.
도 14는 형광체(FITC)가 달린 항체 개질화된 모세관과 개질화되지 않은 모세관의 형광신호를 PMT(광증배관, photo multiplier tube)를 이용하여 확인한 결과이다.
도 15는 형광체(FITC)의 파장에 따른 여기 및 방사 정도를 나타낸 그래프이다.
도 16은 형광체(FITC)가 없는 BA(바실러스 아트로페어스, Bacillus atrophaeus)항체로 개질화된 샘플을 BA와 항원-항체 반응시켜 신호를 확인한 결과이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용한다.
제 1, 제 2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소도 제 1 구성요소로 명명될 수 있다. "및/또는"이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다.
일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않아야 한다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 고휘도 초집적 반도체 자외선 광원을 이용한 실시간 생물입자 검출장치를 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은, 생물입자의 광학적 검출장치에 있어서, 광원부; 상기 광원부로부터 발생된 광에 의해 초점이 형성되는 광학셀; 상기 광학셀 내부에 위치하며 상기 생물입자가 포집되는 모세관; 상기 생물입자에 투과된 상기 광에 의해 발생되는 산란광을 검출하는 검출부; 상기 생물입자가 상기 모세관을 지날 때 선택적인 항원-항체반응을 통해 상기 생물입자를 상기 모세관의 중심부에 고정시킴으로써 집광이 되는 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치를 제공한다.
상기 광학셀의 내부에 형성된 상단부 미러 및 하단부 미러는 각각 타원형 미러(10) 및 구형 미러(11)에 의해 형성될 수 있으며, 상기 광학셀 내부의 상단부 미러에 의해 둘러싸인 지점에 제 1 초점이 형성되고, 상기 광학셀 내부이면서 상기 하단부 미러의 외부에 제 2 초점이 형성될 수 있다. 여기서, 상기 상단부 미러의 높이와 상기 하단부 미러와 PMT 위치 사이의 길이의 비율로 상기 하단부 미러와 PMT 위치 사이의 길이/상기 상단부 미러의 높이의 비율은 0.6일 수 있다.
상기 모세관에 있어서, 중심부의 직경은 상기 모세관 양단의 직경보다 작을 수 있다.
또한, 상기 모세관의 항체 개질화를 통해 생물입자를 포집이 가능하다. 구체적으로, 상기 모세관 표면의 하이드록시기와 유입되는 실란화합물의 반응을 통해 상기 모세관 벽에 상기 실란화합물이 부착되고, 상기 모세관 내부로 유입되는 링커가 반응을 통해 상기 실란화합물에 연결된 후, 상기 항체를 상기 링커에 고정함으로써 상기 생물입자를 포집할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로, 상기 실란화합물은 아민기를 포함하는 아미노실란화합물으로서, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, (3-아미노프로필)트리메톡시실란, (3-아미노프로필)트리에톡시실란, 3-트리에톡시실릴-N-(1,3-디메틸부틸리덴)프로필아민, N-페닐-3-아미노프로필트리메톡시실란 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은, 모세관 표면의 하이드록시기를 활성화하는 단계; 상기 모세관을 실란화합물 함유 용액에 담궈 상기 하이드록시기와 반응시킨 후 초음파 처리하는 단계; 상기 모세관을 링커 함유 용액에 담궈 상기 실란화합물에 상기 링커를 연결하는 단계; 상기 모세관을 항체 함유 용액에 담궈 상기 링커에 상기 항체를 고정하는 단계; 및 상기 모세관 내부로 생물입자의 유입을 통해 상기 항체가 상기 생출입자를 포집하는 단계를 포함하는 광학적 검출장치 내 모세관을 이용한 생물입자의 포집방법을 제공한다.
이를 위해, 특별한 염료를 주입하지 않고 박테리아 등의 생물입자에서 발현되는 형광을 탐지하기 위하여 소형화/경량화에 유리한 제 1광원(1) 및 제 2 광원(2)을 갖는 다파장 고휘도 및 고출력 자외선 광원을 도입한 광원부를 구성하고, 이를 바탕으로 하는 반도체 광원부를 휴대용 형광 탐지를 위한 검출장치에 적용한다. 특히, 석영 모세관의 개질화를 통해 특정 생물입자을 고정하고 형광을 측정한다. 상기 반도체 광원부는 라이트 툴즈(Light tools) 프로그램 등을 활용하여 설계할 수 있다.
본 발명에 따른 광원부 최적 설계변수 도출을 바탕으로 광원부를 도입하고 광학셀의 설계 변수를 도출할 수 있다. 생물입자 검출장치는 광원부, 렌즈모듈(12) 및 광학셀로 구성되며, 광학셀의 중심부에 석영 모세관이 위치한다. 광원부에서 생성된 빛이 석영 모세관의 중심부를 지나면서 생물입자에 의해 형광이 발현된다. 에어로졸 상(또는 액상)의 생물입자가 모세관의 중심부를 지날 때 입자에 의한 산란이 일어나게 되며, 발생하는 빛의 이동 방향에 수직한 곳에 위치한 감지부(receiver)에서 병원체의 형광 신호를 감지하게 된다. 광원부를 구성하는 LED 칩(chip)의 발광 면적은 약 1mm×1mm으로 설정할 수 있으며, 렌즈모듈(12)을 통해 집광되는 빛의 초점은 도 1의 제 3 비구면 렌즈(aspheric lens)(5)에서부터 5mm에 위치한다.
[실시예]
본 발명의 실시예는 광원부 설계, 광학셀 설계 및 석영 모세관의 개질화에 관한 것이다.
광원부 설계에 있어서는, 생물입자를 여기시킬 제 1 광원(1) 및 제 2 광원(2)이 각각 365nm 및 275nm의 LED 광원으로서, 용융 실리카(fused silica) 재질의 렌즈를 통하여 각각 시준되었다. LED부터 렌즈까지의 거리와 렌즈의 전방 초점거리가 같을 때 광이 시준되므로, 두 개의 값은 같다. 상기 렌즈 값(z)은 아래의 [수식 1]으로 환산될 수 있다.
[수식 1]
c: 면의 곡률(Curvature(1/Radius))
r: 곡률반경
k: 코닉상수(Conic Constant)
A, B, C, D, E, F, G, H, J: 비구면 계수(Aspheric Coefficients)
시준된 제 1 광원(1) 및 제 2 광원(2)의 광을 산란 및 형광 측정에 필요한 파장만을 통과시키는 제 1 광원용 필터(6)(365nm 광원용 필터) 및 제 2 광원용 필터(7)(275nm 광원용 필터)에 각각 입사하였다. LED의 경우, 방출하는 광이 해당 파장을 출력의 최고점으로 하여 가우시안 분포를 보이기 때문에 원하는 여기 광원만을 활용하기 위해 각각의 LED 광원 전면부에 필터를 위치시켜 선택적인 광투과를 유도하였다. 필터를 통한 각각의 광이 만나게 되는 다이크로익 미러(dichroic mirror)(8)에서 제 2 광원(2)의 파장은 반사되고 제 1 광원(1)의 파장은 투과되었다. 따라서 두 개의 파장에 대한 광축은 동축이 되었다. 상기 동축이 된 두 개의 파장은 광학셀 방향으로 이동하는데, 광원의 켜짐/꺼짐에 따라 선택될 수도 있고 동시에 이동될 수도 있다. 이동된 광은 다시 제 3 비구면 렌즈(5)에 의해 집광되는데, 상기 제 3 비구면 렌즈(5)가 갖는 초점은 타원으로 설계된 광학셀이 갖는 상단의 초점 위치와 같은 곳에 위치되었다.
이와 관련한 광원부의 구성을 도 1 및 도 2에 도시하였다. 제작된 광원부의 하단에는 x, y축 거리 조정이 가능한 스테이지(13)를 설계함으로써, +/- 6.5mm 거리 조정을 통해 위치에 의한 광신호 획득 변수를 최소화하고 획득한 신호의 신뢰성을 향상시키고자 하였다.
광학셀은 광원부에서 병원체의 발색단을 거쳐 나오는 형광 및 산란 신호를 극대화도록 설계하였다. 상단부 타원형 미러(ellipsoid mirror)(10)와 하단부 구형 미러(spherical mirror)(11)를 구성하고, 도 3과 같이, 모세관을 빛의 진행 방향에 위치시키고, 모세관 중심부에 광원의 초점을 위치시켜, 모세관을 통과하는 생물입자의 형광신호를 향상시키고자 하였다. 광원부를 통해 진행된 빛은 광학셀의 중심부를 지나 타원형 미러(10)에 반사되어 검출부인 PMT(광증배관, photomultiplier tube)로 향하며, PMT로 가지 못하고 구형 미러(11)에 도달하는 반사광은 다시 광학셀의 중심부 초점으로 이동하여, 타원형 미러(10)에 반사됨으로써 검출부로 진행하도록 설계하였다.
광학셀 크기에 따른 산란광 및 형광의 집광 형상, 최대 조도 및 효율을 시뮬레이션하였으며, 이를 통해 광학셀의 최적 설계변수를 도출하였다(도 8 내지 도 11). 광원부에서 방출된 빛이 초점에서 1mm2(=1mm×1mm)의 면적 내에 집속되도록 설정하였고, 광원부 렌즈의 하단부(도 1의 제 3 비구면 렌즈(5))에서 5mm 이하의 초점 거리를 갖도록 설정하였다. 형광의 시뮬레이션은 산란광 시뮬레이션에서 설정한 광원의 전체 세기에서 3% 정도로 가정하여 진행하였다.
석영 모세관(quartz capillary)의 개질화에 있어서, 생물입자의 실시간 검출를 위하여 상기 석영 모세관에 생물입자(포자 또는 독소)와 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 도입하였다. 석영의 표면에 존재하는 하이드록시기(hydroxyl group)를 이용하여 항체 도입이 가능하다. 항체를 석영 표면에 도입하기 위해서 실란화 반응(silanization method)을 사용하였다. 즉, 석영 표면을 반응성이 좋은 아민기(NH2 group)로 치환한 후, 항체에 존재하는 아민기와의 연결시킴으로써 항체를 석영 표면에 도입하였다(도 6).
구체적으로, 석영 모세관을 아세톤, 에탄올 및 증류수에 담궈 초음파세척기로 각각 5분간 초음파 세척한 후 질소 블로잉을 수행하였다. 이후, 2분간 플라즈마 처리하여 잔여 유기물들을 제거하였다. 상기 석영 모세관을 1 wt% 하이드록실아민(NH2OH) 용액에 넣고 80℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 증류수로 상기 석영 모세관을 헹군 후, 질소 블로잉으로 세척 및 건조하였다. 10 %(v/v) (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES, (3-aminopropyl)triethoxysilane)용액을 에탄올(99.5 %)에 용해한 후, 상온에서 24시간 동안 반응시켰다. 에탄올로 상기 석영 모세관을 헹군 후, 에탄올에 담궈 초음파세척기로 5분간 물리적으로 흡착된 실란을 떼어냈다. 이후, 질소 블로잉으로 세척 및 건조하고, 100℃에서 10분간 오븐에 두었다. 상기 반응된 실란화합물에 링커(linker) 연결을 위해, 1-10wt%의 글루타르알데하이드(GA, glutaraldehyde) 용액을 증류수에 용해한 후 상기 석영 모세관을 투입하여 상온에서 8시간 동안 반응시켰다. 증류수로 상기 석영 모세관을 헹군 후, 질소 블로잉으로 세척 및 건조하였다.
상기 링커에 항체를 연결하기 위해, 10 mM 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS) (pH 7.4) 용액에 1/100의 항체를 용해한 후 상기 석영 모세관을 투입하여 상온에서 12시간 이상(overnight) 반응시켰다. 10 mM의 PBS 용액과 증류수로 상기 석영 모세관을 헹군 후, 질소 블로잉으로 세척 및 건조하였다.
상기 실시예에 의해 다파장 광원부 제작이 가능하고, 이를 통해 특정 파장의 광원을 선택할 수 있으며, 집속직경이 약 1 mm에 불과한 고집적 광원을 만들 수 있다. 광학시스템의 설계는 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같고, 도 8 내지 도 11의 시뮬레이션을 통해 광학셀(적분구) 설계 및 제작하여 높은 방사조도(irradiance) 값과 면적대비 집광효율이 높은 검출 시스템을 구현할 수 있다.
구체적으로, 광원부(도 1 및 도 2) 설계에 있어서, 각각의 광원에서 초점까지의 거리가 제 1 광원(1)일 때는 137.11 mm, 제 2 광원(2) (약 270 내지 약 280nm)일 때는 135.64 mm가 되도록, 광경로를 15cm 미만으로 설계하였다.
광학셀은 타원형 미러(10) 및 구형 미러(11)로 구성하였다(도 3). 모세관 중심부(제 1 초점)에서 발산된 입자의 형광은 도 11에 나타낸 바와 같이, 타원형 미러(10)와 구형 미러(11)에 반사되어 진행된다. 타원형 미러(10)에 반사되는 빛은 제 2 초점으로 향하게 되며, 구형 미러(11)와 만난 빛은 제 1 초점으로 반사되어 제 2 초점으로 향하게 된다.
도 4 및 도 5는 상기 광원부 및 광학셀을 연동한 모식도로서, 스테이지(13) 이동을 통해 x, y축을 정렬하고 광학셀 중심부에 모세관을 위치시켜 여기광이 모세관 중심에 집광이 되도록 하였다.
도 6은 항체로 개질화된 모세관 내 항원이 반응한 모습을 나타낸 모식도이며, 도 7은 항체를 도입하여 상기 모세관을 개질화하는 실란화 반응을 순차적으로 나타낸 모식도이다. 실란화 반응은 다른 물질들과의 반응성이 낮은 기재의 표면에 반응성이 높은 작용기를 도입하여 개질하기 위한 보편적 방법으로, 유리, 석영, ITO(인듐 주석 산화물, indium tin oxide) 전극 등의 표면을 개질을 위해 사용된다. 실란화 반응을 통해 표면 개질된 석영 모세관에 항체를 도입하기 위하여 항체에 존재하는 아민기를 이용할 수 있으며, 항체가 석영 모세관 표면에서 화학적 결합을 통해 안정적으로 고정될 수 있도록 링커(linker)를 도입하였다. 도 7과 같이 항체가 고정된 석영 모세관에 항체와 특이적인 결합을 할 수 있는 생물입자를 흘려 보내주면, 도 6과 같이 석영 모세관 표면에 존재하는 항체에에 의해 생물입자들이 포집될 수 있다. 이때, 고휘도 고출력 자외선 광원을 이용해 UV 광을 조사하면, UV 광에 의해 여기되는 생물입자의 형광파장이 포집된 생물입자의 종류 및 그 양에 따라서 변화를 보이게 된다. 이와 같이, 발생되는 형광파장의 변화를 분석하여 관찰하고자 하는 생물입자의 정량 및 정성 분석이 가능하다.
도 8에서 볼 수 있듯이, 광원부에서 발산된 여기광이 이동하는 방향과 광학셀을 지나는 유체의 경로는 서로 수직한다. 광학셀을 통한 여기광원의 집광은 도 8에 표기된 C'/B의 길이 비에 영향을 받으므로, C'/B의 비율을 변화시켜 최적의 조도 분포 및 조도값을 갖는 광학셀을 제작하였다(B: 광학셀의 상단부 미러의 높이, C: 광학셀의 초점 및 입자 위치, C': 광학셀의 하단부 미러와 PMT 위치 사이의 길이).
도 9는 광학셀을 하기 표 1의 조건에 따라 크기를 변화시킨 모식도로서, 이를 각각 시뮬레이션하여 산란광과 형광의 효율을 도 10 및 도 11과 같이 도출하였다. 도 10은 광학셀 크기에 따른 산란광의 조도값 및 분포도의 변화이며, 도 11은 광학셀 크기에 따른 형광의 조도값 및 분포도의 변화이다. 제조예 1 내지 제조예 5의 상세 비율(C'/B)은 하기 표 1과 같다.
| (단위:mm) | 제조예 1 | 제조예 2 | 제조예 3 | 제조예 4 | 제조예 5 |
| A | 40 | ||||
| B | 62 | 59 | 56 | 53 | 50 |
| C(=C’) | 47 | 43 | 39 | 34 | 30 |
| 비율 (C’/B) |
0.76 | 0.73 | 0.7 | 0.64 | 0.6 |
비율(C'/B)이 0.6인 제조예 5에서, 광원이 365nm일 때 최대 조도값 0.0288 (W/mm2), 275nm일 때 최대 조도값 0.0796(W/mm2)로 최대 조도값 및 분포도가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다. 사각형인 LED 칩 모양으로 빛을 발산하기 때문에 렌즈부를 거쳐 발산되고 집광되는 빛 또한 사각에 가까울수록 우수한 집광 성능을 나타낸다고 볼 수 있다. 또한 광원부 설계에 있어 높은 조도값과 더불어, 광 분포 영역 대비 높은 조도값을 갖는 영역(붉은색 영역)이 얼마나 넓은지의 여부가 광 집적도의 좋고 나쁨을 평가하는 기준으로 작용했다. 엔서클드 에너지(encircled energy)를 이용하여 효율을 계산한 결과는 하기 표 2와 같다(효율= (수신 전력/LED의 입력전력)×100).
| Case 1 | Case 2 | Case 3 | Case 4 | Case 5 | ||||||
| 산란광 | 275nm | 365nm | 275nm | 365nm | 275nm | 365nm | 275nm | 365nm | 275nm | 365nm |
| 11.7% | 6.4% | 13.46% | 7.63% | 15.06% | 8.68% | 17.02% | 9.63% | 18.24% | 10.93% | |
| 형광 | 275nm | 365nm | 275nm | 365nm | 275nm | 365nm | 275nm | 365nm | 275nm | 365nm |
| 69.92% | 69.92% | 70% | 70% | 70% | 70% | 66.47% | 66.5% | 72.64% | 72.64% | |
상기 제조예 1 내지 제조예 5의 시뮬레이션 결과를 기반으로, 최대 조도값 및 광효율을 나타내는 제조예 5를 이용하여 광학셀을 제작하였다.
도 12는 항체의 개질화 여부를 현미경을 통해 확인한 그림으로서, 항체에 형광체(fluorescein)를 결합하는 FITC(형광항체법, fluorescent antibody technique)를 이용하여 450nm 내지 490nm의 범위의 빛에 대해 형광을 내도록 하였으며, 이를 통해 모세관 표면 내벽이 항체로 개질화 되었음을 확인할 수 있다. 왼쪽은 개질화된 모세관의 광학 이미지이며, 오른쪽은 450nm 내지 490nm 여기광에 의한 형광 이미지이다. 반면, 도 13의 개질화되지 않은 모세관은 여기광에 의한 형광이 확인되지 않는다. 도 14는 형광체(fluorescein)가 달린 항체 개질화된 모세관과 개질화되지 않은 모세관으로 제작한 광원부를 이용하여 형광신호를 PMT(광증배관, Photo multiplier tube)를 통해 확인한 결과이다. 형광체(FITC)가 달려있는 모세관(a)의 경우, 270nm 내지 280nm의 여기광에 민감하게 반응을 하며, 높은 카운트(count) 수를 나타낸다. 반면, 형광체(FITC)가 없는 모세관의 경우(b) 낮은 카운트 수를 보이는 것을 확인할 수 있다.
형광체(FITC)의 파장에 따른 여기 및 방사 정도는 도 15와 같으며 270nm 내지 280nm 여기광에 의해 여기가 잘 이루어졌음을 알 수 있다.
도 16은 형광체(FITC)가 없는 BA(Bacillus atrophaeus)항체로 개질화된 모세관을 다시 BA와 항원-항체 반응시켜 신호를 확인한 결과이다. BA 농도 2.4×
개/ml 내지 2.4×
개/ml에 따른 신호검출을 실시하였으며, 2.4×
개/ml의 농도까지 검출 가능하다는 것을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 다파장의 광원을 이용하여 생물입자 내의 다양한 형광원을 선택적으로 여기시킬 수 있고, 생물체의 종류에 따라 다른 분포와 다른 값을 나타내는 형광 스펙트럼을 분석하여 세균(및 포자)과 생물독소를 용이하게 식별할 수 있다. 예를 들어, NADH나 플라빈(flanvin)의 여기파장은 약 360nm 내지 약 380nm이며, 상기 파장과 근접한 파장대에서 가장 많은 형광을 발현한다. 따라서, NADH나 플라빈의 함량이 적거나 없는 경우, 상기 여기 광원(약 360nm 내지 약 380nm)에 의한 형광 신호가 나타나지 않으며, 이를 이용하여 생물입자가 포자 인지 생물독소인지 여부를 판단할 수 있게 된다.
광학셀의 경우, 통상의 크롬 도금(반사율: 40~50%) 대신 뷸균일도 P-V 값 (peak to value: 표면 거칠기(roughness)의 최대-최소 차이) 1μm 이하, 90% 이상의 반사율을 가지는 보호 미러 코팅(protected mirror coating)이 적용된 알루미늄 도금 광학용 셀을 적용하였다. 이를 통해 광수집 효율 및 신호 대비 잡음비 증대 효과를 향상시킬 수 있다.
유동하는 유체상의 에어로졸의 경우, 입자의 양이 적을수록 신호를 획득하는 것이 쉽지 않으며, 확인하고자 하는 특정 생물입자의 신호탐지의 신뢰도가 유체의 동시다발적 유입에 따른 타 입자들로 인해 떨어질 수 있다 자연 상태에서 포집되는 기상의 에어로졸 안에는 먼지 및 비 형광입자 등의 산란입자(scatter)뿐만 아니라 꽃가루 및 기타 무해한 생물입자들도 포함될 수 있어, 단백질로 이루어진 상기 생물입자들에서 발현된 형광에 의해 검출하고자 하는 유해한 생물입자 신호의 신뢰성이 떨어지는 것이다. 또한, 기상의 에어로졸 유체에 포함된 생물입자의 개수가 적을 경우, 원하는 정도의 신호세기 획득이 어려울 수 있으므로 특정 생물입자만을 일정 시간동안 선택적으로 반응시킴으로써 상기 특정 생물입자를 고정하는 것이 안정적인 신호 획득을 위해 유리할 수 있다.
본 발명에 따르는 개질화된 석영 모세관을 특정 지역에 위치시켜 항원-항체 반응으로 항체를 특정 세균(및 포자)군 또는 유해 생물입자들과 반응하게 할 수 있다. 석영 모세관의 항체 개질화를 통해 항원-항체 반응으로 특정 생물입자만을 모세관에 고정할 수 있으며, 안정적인 신호 획득이 가능하다. 상기 석영 모세관을 수거한 후 분석기를 이용하여 신호를 탐지할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명에 따른 특정 생물입자의 포집 및 신호 검출을 통해 발현되는 형광을 탐지할 수 있으며, 유체가 유입되는 모세관의 개질화를 통해 특정 생물입자에 대해 보다 신뢰성이 높은 탐지 시스템을 구축할 수 있다. 저렴하고 대량생산에 용이하며 긴 수명까지 갖추고 있는 LED 광원을 이용하여 탄저균과 같은 포자형태의 생물입자에서부터 식물 또는 동물로부터 나오는 균체 내/외 독소까지 탐지할 수 있다는 장점이 있다.
앞서 살펴본 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하는 바람직한 실시예일 뿐, 전술한 실시 예 및 첨부한 도면에 한정되는 것은 아니므로 이로 인해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다. 따라서 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것이 당업자에게 있어 명백할 것이며, 당업자에 의해 용이하게 변경 가능한 부분도 본 발명의 권리범위에 포함됨은 자명하다.
1: 제 1 광원
2: 제 2 광원
3: 제 1 비구면 렌즈
4: 제 2 비구면 렌즈
5: 제 3 비구면 렌즈
6: 제 1 광원용 필터
7: 제 2 광원용 필터
8: 다이크로익 미러
9: 스팟(spot)
10: 타원형 미러
11: 구형 미러
12: 렌즈모듈
13: 스테이지
2: 제 2 광원
3: 제 1 비구면 렌즈
4: 제 2 비구면 렌즈
5: 제 3 비구면 렌즈
6: 제 1 광원용 필터
7: 제 2 광원용 필터
8: 다이크로익 미러
9: 스팟(spot)
10: 타원형 미러
11: 구형 미러
12: 렌즈모듈
13: 스테이지
Claims (8)
- 생물입자의 광학적 검출장치에 있어서,
광원부;
상기 광원부로부터 발생된 광에 의해 초점이 형성되는 광학셀;
상기 광학셀의 내부에 위치하며 상기 생물입자가 포집되는 모세관; 및
상기 생물입자에 투과된 상기 광에 의해 발생되는 산란광을 검출하는 검출부;를 포함하되,
상기 광학셀의 내부에 형성된 상단부 미러 및 하단부 미러는 각각 타원형 미러 및 구형 미러에 의해 형성되고,
상기 광학셀의 내부의 상단부 미러에 의해 둘러싸인 지점에 제1초점이 형성되고, 상기 광학셀의 내부이면서 상기 하단부 미러의 외부에 제2초점이 형성되고,
상기 하단부 미러와 PMT 위치 사이의 길이/상기 상단부 미러의 높이의 비율은 0.6 이며,
상기 생물입자가 상기 모세관을 지날 때 선택적인 항원-항체반응을 통해 상기 생물입자를 상기 모세관의 중심부에 고정시킴으로써 집광이 되는 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 모세관은 중심부의 직경이 양단의 직경보다 작은 것을 특징으로 하는 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치. - 제5항에 있어서,
모세관 표면의 하이드록시기와 유입되는 실란화합물의 반응을 통해 모세관 벽에 상기 실란화합물이 부착되고, 상기 모세관의 내부로 유입되는 링커가 반응을 통해 상기 실란화합물에 연결된 후, 상기 항체를 상기 링커에 고정함으로써 상기 생물입자를 포집하는 것을 특징으로 하는 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치. - 제6항에 있어서,
상기 실란화합물은 아민기를 포함하는 아미노실란화합물으로서, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-2-(아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, (3-아미노프로필)트리메톡시실란, (3-아미노프로필)트리에톡시실란, 3-트리에톡시실릴-N-(1,3-디메틸부틸리덴)프로필아민, N-페닐-3-아미노프로필트리메톡시실란 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치. - 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 모세관을 이용한 생물입자의 광학적 검출장치에서 상기 생물입자를 포집하는 방법에 있어서,
모세관 표면의 하이드록시기를 활성화하는 단계;
상기 모세관을 실란화합물 함유 용액에 담궈 상기 하이드록시기와 반응시킨 후 초음파 처리하는 단계;
상기 모세관을 링커 함유 용액에 담궈 상기 실란화합물에 상기 링커를 연결하는 단계;
상기 모세관을 항체 함유 용액에 담궈 상기 링커에 상기 항체를 고정하는 단계; 및
상기 모세관의 내부로 생물입자의 유입을 통해 상기 항체가 상기 생물입자를 포집하는 단계;
를 포함하는 모세관을 이용한 생물입자의 포집방법.
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| KR1020170153775A KR102028108B1 (ko) | 2017-11-17 | 2017-11-17 | 석영 모세관을 이용한 형광표지 없는 생물입자 검출 시스템 |
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