KR102019364B1

KR102019364B1 - 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물

Info

Publication number: KR102019364B1
Application number: KR1020180023782A
Authority: KR
Inventors: 김재화
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2019-09-06
Also published as: WO2018155995A1; KR20180099543A

Abstract

본 발명은 시아릴락토오스 (sialyllactose)를 유효성분으로 포함하는, 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균용 조성물 등에 관한 것이다.

Description

시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물 {An antimicrobial composition comprising sialyllactose as an active ingredient}

본 발명은 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는, 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 α2,3-시아릴락토오스 또는 α2,6-시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는, 크렙시엘라 뉴모니애에 대한 항균용 조성물, 크렙시엘라 뉴모니애에 대한 대식세포의 식균작용 촉진용 조성물 등에 관한 것이다.

병원성 미생물에 의한 직접 혹은 간접적인 피해는 경제, 환경, 의학적으로 많은 문제를 야기시키고 있으며, 이에 최근 위생에 대한 관심이 증가하면서 식품, 의료기기, 의약품, 섬유 등에서 항균소재에 대한 관심이 증대되고 있다. 그러나, 화학적으로 합성된 항생제 사용이 점점 빈번해짐에 따라 내성 발생율 또한 증가하게 되어, 천연물 유래의 신규한 항생물질에 대한 연구가 중요한 문제로 대두되고 있다.

예를 들어, 인체 감염의 가장 흔한 원인균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 마지막 치료제로 불리던 반코마이신에도 고도의 내성을 보이는 황색포도상구균(vancomycin-resistant S. aureus, VRSA)이 2002년 미국 질병통제국 (Centers for Disease Control)에서 세계 최초로 보고됨으로써 소위 슈퍼 박테리아의 확산 가능성이 매우 높아지고 있다. 반코마이신에 의해서만 치료가 되는 메치실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant S. aureus, MRSA)이 1970년대부터 문제시된 이후 1988년 반코마이신에 내성을 보이는 장구균(vancomycin resistant Enterococcus, VRE)이 유럽에서 처음으로 발견되었고, 1990년 후반에는 일본, 미국, 프랑스, 한국에서 보고된 반코마이신에 내성을 보이는 황색포도상구균 (vancomycin intermediate-resistant S. aureus, VISA)이 발생하면서, 범세계적인 위기로 떠오른 항생제 내성문제가 매우 심각한 실정이며, 그에 따라 천연물 유래로서 유용한 항생제 개발이 시급히 요구되고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 새로운 항생물질을 찾고자 예의 노력한 결과, α2,3-시아릴락토오스 또는 α2,6-시아릴락토오스를 포함하는 조성물이 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) 균에 대한 높은 항균 활성을 보임을 확인함으로써, 상기 α2,3-시아릴락토오스 또는 α2,6-시아릴락토오스을 포함하는 조성물이 항균용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허공보 제10-1725175호 한국등록특허공보 제10-1773066호

본 발명의 하나의 목적은, 시아릴락토오스 (sialyllactose)를 유효성분으로 포함하는, 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는, 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 대식세포의 식균작용 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 시아릴락토오스 (sialyllactose)를 유효성분으로 포함하는, 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "시아릴락토오스"는 시알산 (sialic acid)의 올리고당 형태로, 화학식 C₂₃H₃₉NO_19, 분자량 633.5511g/mol을 가지는 물질로 알려져 있다.

상기 시아릴락토오스는 구체적으로 2,3-시아릴락토오스, 3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스, 6-시아릴락토오스, α2,3-시아릴락토오스 또는 α 2,6-시아릴락토오스로 혼용하여 사용될 수 있다.

상기 2,3-시아릴락토오스 또는 2,6-시아릴락토오스는 각각 하기 화학식 1 또는 2로 구성되는 화합물이다.

본 발명은 시아릴락토오스의 획득 방법에 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법으로 화학적으로 합성하거나, 시판되는 물질을 사용할 수 있다.

본 발명의 시아릴락토오스는 용매화된 형태뿐만 아니라 비-용매화된(unsolvated)형태로 존재할 수도 있다. 또한, 본 발명의 시아릴락토오스는 결정형 또는 무정형 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 물리적 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서 용어 "항균"은 미생물을 포함하는 균의 생육 또는 증식을 억제하여 균의 감염을 예방 또는 치료하는 활성을 의미한다.

상기 시아릴락토오스, 또는 이를 포함하는 조성물은 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균능을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)는 그람 음성 단간균으로 사람의 장관 내, 구강 등에 상재하고 있는 병원균에 해당한다. 크렙시엘라 뉴모니애 감염으로 인한 질병의 치료에는 세파로스모린계 항생제가 유효한 것으로 알려져 있으나, 크렙시엘라 뉴모니애에 대한 2,3-시아릴락토오스 또는 2,6-시아릴락토오스의 항균 활성은 알려진 바가 없으며 이는 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 시아릴락토오스의 항균 활성을 실험한 결과 시아릴락토오스가 크렙시엘라 뉴모니애 균에 대한 식균작용을 촉진함을 확인하였으며 (도 4 및 도 5), 반면 다른 세균에 대해서는 항균 활성을 갖지 않음을 확인하였다. 따라서, 시아릴락토오스가 크렙시엘라 뉴모니애 균주에 대한 특이적인 항균 활성을 가짐을 확인하였다.

본 발명에서 상기 시아릴락토오스는 대식세포 내 키모카인 CXCL8의 발현량을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "키모카인 (chemokine)"이란 백혈구 유주 작용, 활성화 작용을 하는 염기성 헤파린 결합성 저분자 단백질로서, CXC(CXCL), CC(CCL), CX₃C(CX₃CL), C(XCL)의 4개의 아과로 분류하여 현재 40종 이상 동정되어 있다. "키모카인 CXCL8"이란 인터류킨 8 (IL8)로도 불리며, 마크로파지 또는 상피세포 등에서 생산되는 키모카인으로, CXC 키모카인으로 분류된다.

본 발명의 일 실시예에서는, LPS가 처리된 대식세포 군에 시아릴락토오스를 처리한 결과, 시아릴락토오스를 처리하지 않은 군에 비해 CXCL8의 발현량이 약 3배 정도 증가하였음을 확인하였다 (도 2).

본 발명에서 상기 시아릴락토오스는 대식세포 내 활성 산소 함량 또는 라이소좀 활성을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스와 함께 LPS가 처리된 대식세포 군에서, 활성산소(ROS)를 생성하는 Rac 단백질이 대식세포의 세포 표면으로 모이는 현상이 뚜렷하게 나타남을 확인하였으며, 대식세포 내 리소좀의 활성이 증가함을 확인하였다 (도 8).

본 발명에서 상기 시아릴락토오스는 대식세포의 식균작용 (phagocytosis)을 촉진하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 시아릴락토오스 (sialyllactose)를 유효성분으로 포함하는, 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 대식세포의 식균작용 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 식균작용(phagocytosis)이란, 대식세포가 외부로부터 침입한 병원체나 이물을 받아들여 처리하는 현상을 의미한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 크렙시엘라 뉴모니애가 처리된 대식세포 군에 시아릴락토오스를 처리한 결과, 시아릴락토오스가 크렙시엘라 뉴모니애에 대한 대식세포의 식균작용을 활성화하는 것을 확인하였다 (도 5).

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태는, 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공한다. 상기 항균용 약학 조성물은 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.

상기 시아릴락토오스, 크렙시엘라 뉴모니애, 항균에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명의 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 크렙시엘라 뉴모니애의 증식을 억제하는 항균용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 항균 효과를 가진다고 알려진 약학적 조성물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가하여, 약제학적 단위 투여형으로 제형화할 수 있다.

본 발명에서 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물에서 시아릴락토오스는 약학적으로 유효한 양으로 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 상기 시아릴락토오스는 약학 조성물에 0.001 내지 200 ㎍/㎖로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎍/㎖으로 포함될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태는, 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 의약외품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 공지의 항균 성분을 포함할 수 있을 것이다. 추가적인 항균 성분을 포함하게 되면 본 발명의 조성물의 항균 효과는 더욱 증가될 수 있을 것이다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 당업계에 공지된 항균 성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태는, 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 천연물 유래 물질을 함유하고 있어, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 크렙시엘라 뉴모니애에 대한 높은 항균 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.

본 발명의 항균용 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로 상기 시아릴락토오스, 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

본 발명의 용어, “생리학적으로 허용가능한 염”이란, 생리학적으로 허용되고 생물체에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않으면서, 투여되는 화합물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있는 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.

또한, 상기 언급한 바와 같이 식품보조첨가제를 추가로 첨가할 수도 있는바 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품보조첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 건강보조식품은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함한다. 상기 건강 기능(성) 식품 (functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태는, 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 처리하는 단계를 포함하는 항균 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "개체"란, 크렙시엘라 뉴모니애에 의해 감염되었거나 감염될 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 상기 항균 방법은 구체적으로, 크렙시엘라 뉴모니애에 의해 감염되었거나 감염될 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여 또는 도포하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 시아릴락토오스를 포함하는 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 시아릴락토오스를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물로서, 크렙시엘라 뉴모니애 균주에 대한 우수한 항균 활성을 갖는 항균용 조성물, 대식세포의 식균작용 촉진용 조성물을 제공한다.

도 1은, THP-1 세포와 Raw 264.7 세포에서 2,3-시아릴락토오스와 2,6-시아릴락토오스의 세포 독성 유무를 확인한 그래프이다.
도 2는, THP-1 세포에 2,3-시아릴락토오스와 LPS를 단독 또는 복합 처리한 경우, CXCL8과 TNF-α의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은, STAT, AP-1, NF-κB의 결합 서열을 포함한 CXCL8 promoter 부위와 루시퍼라제 발현 유전자를 이용하여 제작한 CXCL8 reporter 벡터 (A)와, A549 세포에 2,3-시아릴락토오스와 LPS를 단독 또는 복합 처리에 따른 루시퍼라제 활성 정도를 나타낸 것이다.
도 4는, 3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스의 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) 균에 대한 식균작용 촉진능을 확인하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는, 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스의 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) 균에 대한 식균작용 촉진능을 나타낸 그래프이다. (세로축 단위: CFU; 가로축 단위: 시간)
도 6은, 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스의 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus),스트렙토코커스 슈도뉴모니아 (Streptococcus pseudopneumonia)에 대한 식균작용 촉진 여부를 확인한 것이다.
도 7은, 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스의 식균 작용 활성을 TLR4 수용체의 엔도시토시스 검증을 통해 확인한 것이다.
도 8은, ROS를 생성하는 Rac 단백질이 대식세포의 표면으로 모이는 현상 및 대식세포 내 리소좀 활성에 대한 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스의 영향을 확인한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험 재료 및 실험 방법

1-1. 세포 배양 (animal cell culture)

THP-1 (인간 단핵 세포), HL-60 (호중구 세포주), A549 (인간 폐 상피 세포)는 열에 의해 불활성화된 10%의 FBS와 항생제, β-mercaptoethanol을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였고, Raw 264.7 쥐 대식 세포는 열에 의해 불활성화된 10%의 FBS와 항생제를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였으며, 상기 세포들을 37℃에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하였다.

1-2. 시험 물질(reagents)

2,3-시아릴락토오스와 2,6-시아릴락토오스는 ㈜진켐에서 얻었으며, 증류수에 용해시킨 후 세포 배양 배지에 첨가하였다.

1-3. WST 분석 (WST assay)

WST 분석으로서, THP-1 세포와 Raw 264.7 세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 5 x 10³의 수만큼 시딩(seeding) 하여 하루 배양시킨 후, 2,3-시아릴락토오스와 2,6-시아릴락토오스를 24시간 동안 각각 0.1uM, 1uM,10uM, 100uM, 300uM씩 처리하였다. 세포의 생존율(Viability)은 Ez-Cytox 시약을 각 well에 넣어준 후 리더기를 이용해 O.D 값을 측정하여 확인하였다.

1-4. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

THP-1 세포를 24 well plate에 2 x 10⁵의 수만큼 seeding 하여 하루 배양시키고, 2,3-시아릴락토오스를 3시간 전처리 한 다음 LPS를 24시간 동안 처리하였다. 세포의 배양 상층액을 회수하여 CXCL8의 capture 항체로 코팅해놓은 96 well plate에 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 CXCL8의 detection 항체와 HRP를 넣고 상온에서 1시간 동안 추가 반응시킨 후, TMB 용액과 Stop solution을 넣어주어 고정시키고 발광 정도를 리더기를 이용하여 측정하였다.

1-5. 플라스미드 벡터 제작

세포의 게놈(genomic) DNA로부터 STAT, AP-1, NF-κB 결합 서열을 포함한 CXCL8 프로모터 영역을 PCR을 통해 증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물은 pGL4-Lucifearase 벡터와 동일한 제한 효소 부위를 포함하는 TA 벡터에 클로닝 하였다. TA 벡터에서 얻어낸 insert는 pGL4 벡터의 Kpn Ⅰ- XhoⅠ제한효소 부위에 연결하였으며, 제작된 플라스미드 벡터는 서열 분석을 통해 최종 확인하였다.

1-6. 형질주입(Transfection) 및 루시퍼라제 분석(Luciferase Reporter Assay)

A549 세포를 24 well plate에 각 well 당 8 x 10⁴의 수만큼 seeding하고, 제조사의 프로토콜에 따라 Attractene 시약을 사용하여 플라스미드 발현 벡터를 세포 주에 형질주입 시켰다. 이후 3시간 동안 2,3-시아릴락토오스를 전처리 한 다음, LPS를 24시간 동안 처리하였다. Lysis 버퍼를 사용하여 세포를 용해시키고 루시퍼라제 시약 (Luciferase reagent)을 첨가해 준 후 루미노미터(Luminometer)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

1-7. 시아릴락토오스의 크렙시엘라 뉴모니애 ( Klebsiella pneumoniae) 균에 대한 식균작용 촉진능 확인

먼저, THP-1 세포를 계대 배양하여 2X10⁶/ml의 수를 12 웰-배양 플레이트(well cultureplate)에 1ml/well씩 분주하여, 대식 세포주를 준비하였다.

다음으로, K. pneumoniae 를 감염시키기 하루 전에 LB broth에 접종시킨 후, 37℃, shaking incubator에서 16 내지 20시간 동안 배양시켰다. 배양한 K. pneumoniae는 PBS 20μl에 2 x 10⁵CFU가 되도록 희석하여 감염을 위한 준비를 하였다. 준비된 균은 배양중인 THP-1 세포에 10, 50 MOI (multiplicityof infection)가 되도록 균수를 조정하여 배양액에 혼합하여 대식세포에 의하여 세포 내로 포식되는(internalization) 균주의 수를 확인하였다.

상기 배양 중인 THP-1세포에 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스의 농도를 100nM로 조정하여 첨가하여 세포의 식균작용(phagocytosis) 활성을 분석하였다.

또한, CFU(colony forming unit)를 측정하여 대식세포의 식균능력을 구체적으로 확인하고자 하였다. 배양된 대식세포주인 THP-1세포에 K. pneumoniae 를 감염시키고 0.5, 1, 2, 3시간 후, 대식세포에 의하여 포식되지 않은 K. pneumoniae 를 항생제인 겐타마이신(Gentamicin)을 투여하여 제거하였다. 이때 시아릴락토오스를 동시에 투여한 그룹에서 K. pneumoniae 의 식균능력 효능을 검증하였다. 식균작용에 의하여 세포 내에 존재하는 미생물 수를 확인하기 위하여 대식 세포를 회수하고 네크로시스(necrosis)시킨 후, 아가 배지(agar plates)를 활용한 CFU를 통하여 생성된 콜로니를 측정하였다.

1-8. 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 슈도뉴모니아 (Streptococcus pseudopneumonia)에 대한 식균작용 촉진능력 확인

황색포도상구균, 스트렙토코커스 슈도뉴모니아에 대한 시아릴락토오스의 식균작용 촉진능력을 추가적으로 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-7과 동일하게 배양된 대식세포주인 THP-1 세포에 황색포도상구균, 스트렙토코커스 슈도뉴모니아를 THP-1: bacteria=1:50 (MOI 50)수가 되도록 감염시키고, 3시간 후 항생제인 겐타마이신을 투여하여 대식세포에 의하여 포식되지 않은 박테리아를 제거하였다. 이때 시아릴락토오스를 동시에 투여한 그룹에서 박테리아의 식균능력에 대한 효능을 검증하고자 하였다. 식균작용에 의하여 세포 내에 존재하는 박테리아의 수를 확인하기 위하여 대식세포를 회수하고 괴사 (necrosis)시킨 후, 세포 안에 존재하는 세균 수를 agar plates를 활용한 CFU를 통하여 생성된 콜로니를 통하여 식균작용이 일어난 박테리아 수를 확인하였다.

1-9. K. pneumoniae 의 수용체인 Toll like receptor4의 엔도시토시스(endocytosis) 검증을 통한 식균작용 활성 확인

2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스와 K. pneumoniae 가 처리된 THP-1 세포를 시간 별로 (0.5, 1, 2, 4h) 회수하여 PBS로 세척한 후 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 슬라이드 위에 고정하였다. 세포 표면에 존재하는 TLR4를 염색하기 위하여 TLR4항체 (sc-13593, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 반응시킨 후, FITC-conjugated 2ndary 항체를 반응시키고, 이를 공초점 현미경 (a Zeiss LSM800 confocal microscope, Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 세포 표면 단백질을 관찰하였다.

1-10. ROS 생성효소인 RAC의 세포 표면으로의 어셈블리 현상 및 리소좀 활성 현상 확인

THP-1 세포를 24 well plate에 2 x 10 의 수만큼 seeding 하여 하루 배양시키고, 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스를 각각 3시간 전처리 한 다음, LPS를 30분, 60분, 120분, 240분 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 세척 후, 세포 표면에 존재하는 Rac1 단백질만을 확인하기 위하여 별도로 투과화(permeabilization) 하지 않고 파라포름알데히드를 이용하여 세포를 고정시켰다. 1% BSA로 블로킹(blocking)한 후, Rac1의 항체를 넣어 상온에서 1시간 반응시켰다. Alexa fluor 594가 결합된 2차 항체와 DAPI를 넣고 추가 반응시킨 후, 염색된 세포를 광학 현미경으로 관찰하였다 (Rac1 localization).

또한, 리소좀 활성 측정은 LYSO-ID Red Detection Kit를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, THP-1 세포를 24 well plate에 2 x 10의 수만큼 seeding 하여 하루 배양시키고, 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스를 각각 3시간 전처리 한 다음, LPS를 30분, 60분, 120분 동안 처리하였다. 세포를 assay buffer로 세척한 후, Lyso-tracker 염료를 넣고 37도에서 30분 동안 반응시켰다. Assay buffer로 세포를 한번 더 세척한 후, 염색된 세포를 광학 현미경으로 관찰하였다

실시예 2: 시아릴락토오스의 세포 내 안전성 확인

2,3-시아릴락토오스와 2,6-시아릴락토오스의 세포 독성이 있는지 확인하기 위하여 THP-1 세포와 Raw 264.7 세포를 96 well plate에 5 x 10³의 수만큼 seeding 하여 2,3-시아릴락토오스와 2,6-시아릴락토오스를 24시간 동안 각각 0.1uM, 1uM,10uM, 100uM, 300uM씩 처리 후 상기 실시예 1-3과 같이 WST Assay를 진행하였다.

실험 결과, 다양한 농도에서도 2,3-시아릴락토오스와 2,6-시아릴락토오스는 별다른 세포 독성을 보이지 않음을 알 수 있었다(도 1).

실시예 3: 시아릴락토오스에 의한 키모카인 CXCL8 증가 여부 확인 (단백질 분석)

THP-1 세포에서 키모카인의 발현을 상기 실시예 1-4와 같이 효소면역정량법(ELISA) 을 이용하여 확인하였다. THP-1 세포에 2,3-시아릴락토오스를 3시간 동안 전처리 하고 LPS를 24시간 동안 처리한 후 CXCL8과 TNF-α의 발현 정도를 확인하였다.

실험 결과, TNF-α는 LPS만 단독 처리한 군과 비교했을 때 큰 차이를 보이지 않은 반면에, CXCL8은 2,3-시아릴락토오스 처리 시 LPS만 단독 처리한 군보다 발현이 3배 정도 증가함(synergistic effects)을 알 수 있었다 (도 2).

따라서, 시아릴락토오스는 LPS가 없는 경우에 비해 LPS가 존재하는 경우 키모카인 CXCL8의 발현량을 더욱 증가시킴을 확인하였다.

실시예 4: 시아릴락토오스에 의한 키모카인 CXCL8 증가 여부 확인 (프로모터 분석)

CXCL8의 발현을 ELISA로 확인한 상기 실시예 3과 달리, 프로모터 활성을 이용해 2,3-시아릴락토오스에 의한 키모카인 CXCL8 증가 여부를 확인하고자 하였다.

상기 실시예 1-5와 같이, CXCL8 reporter 벡터는 STAT, AP-1, NF-κB의 결합 서열을 포함한 CXCL8 promoter 부위와 루시퍼라제 발현 유전자를 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작하였다 (도 3의 A). 제작된 발현 벡터를 A549 세포에 주입하여 2,3-시아릴락토오스를 3시간 동안 전처리 하고 LPS를 24시간 동안 처리하여 발현을 유도한 후, 루시퍼라제의 활성을 측정하여 발현양을 비교 분석함으로써 CXCL8 프로모터의 활성화 여부를 측정하였다.

실험 결과, 시아릴락토오스의 처리에 따른 루시퍼라제 활성을 확인할 수 있었으며 (도 3의 B), LPS만 단독 처리한 군보다 시아릴락토오스가 함께 처리된 군에서 CXCL8 활성 효과가 더욱 높음을 알 수 있었다.

실시예 5: 시아릴락토오스의 크렙시엘라 뉴모니애 ( Klebsiella pneumoniae) 균에 대한 식균작용 촉진능 확인

상기 실시예 1-7에 서술한 방법으로 시아릴락토오스의 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) 균에 대한 식균작용 촉진능을 확인하였다.

그 결과, 대식세포 대비 K. pneumoniae 박테리아의 숫자 1:10 인 경우 (MOI 10) 대식세포의 포식능력은 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스의 첨가에 의하여 1시간째 뚜렷하게 증가되는 실험 결과를 확인하였으며, Colony Formation Unit (CFU)를 통하여 세포의 포식능력이 초기(1시간 이내)에 4 내지 5배정도 증가함을 확인하였다 (도 5).

즉, 포식된 균은 시간이 지남에 따라 세포 내에 존재하는 균이 제거되어 4시간 정도가 지난 후에는 대식세포의 활성을 통하여 세포 내에 존재하는 균의 숫자가 뚜렷하게 감소하였음을 알 수 있다.

상기 결과를 통해, 시아릴락토오스가 크렙시엘라 뉴모니애 균주에 대한 우수한 항균 활성이 있음을 알 수 있다.

실시예 6: 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus),스트렙토코커스 슈도뉴모니아 (Streptococcus pseudopneumonia)에 대한 식균작용 촉진능력 확인

상기 실시예 1-8에 서술한 방법으로 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) 이외의 다른 균에서도 동일하게 항균 활성이 있는지 여부를 확인하였다.

이에, 황색포도상구균, 스트렙토코커스 슈도뉴모니아에 대한 시아릴락토오스의 식균작용 촉진능력을 확인하였다. 대식세포 대비 황색포도상구균, 또는 대식세포 대비 스트렙토코커스 슈도뉴모니아의 숫자 1:50 인 경우 (MOI 50) 대식세포의 포식능력은 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스의 첨가 후 3시간 경과 시점에 측정한 결과, 황색포도상구균, 스트렙토코커스 슈도뉴모니아에 대한 식균 작용에는 별다른 영향을 미치지 않음 확인하였다 (도 6).

즉, 세균의 종류에 따라 시아릴락토오스의 항균 활성이 상이하게 나타남을 알 수 있다.

실시예 7: K. pneumoniae 의 수용체인 Toll like receptor4의 엔도시토시스(endocytosis) 검증을 통한 식균작용 활성 확인

LPS가 처리된 THP-1 세포는 TLR4 수용체를 통하여 LPS를 인지하고 세포 안으로 엔도시토시스가 일어난다. LPS 처리 후 1시간이 지나면 대부분의 수용체인 TLR4가 세포 안으로 들어가고 4시간이 지나면 다시 세포 표면으로 돌아오게 된다(endocytosis-exocytosis cycle).

이를 토대로, 실시예 1-9에서 Toll like receptor4의 엔도시토시스 검증을 통한 식균작용 활성을 확인하였다.

그 결과, 시아릴락토오스가 첨가된 세포에서는 LPS가 처리된 THP-1 세포 군에 비하여 TLR4 수용체의 엔도시토시스가 촉진되었음을 확인하였다. 또한, 시아릴락토오스가 처리된 군에서는 TLR4 수용체의 엔도시토시스가 LPS 처리 후 30분 이내에 일어나며, 표면으로 돌아오는 시간 역시 빨라짐을 확인하였다 (도 7).

이러한 결과를 통해, 크렙시엘라 뉴모니애 균주에 대한 대식세포의 포식작용을 시아릴락토오스가 활성화하는 역할을 함을 알 수 있다.

실시예 8: 활성산소(ROS) 생성효소인 RAC의 세포 표면으로의 어셈블리 현상 및 리소좀 활성 현상 확인

크렙시엘라 뉴모니애 균주에 대한 시아릴락토오스의 항균 활성에 대하여 상기 실시예 1-10의 방법으로 구체적인 작용 기전을 확인하였다.

그 결과, 도 8에 따르면, K. pneumoniae의 표면인자인 LPS가 처리된 THP-1에서는 60분이 지난 후에 Rac 단백질이 세포 표면으로 모이는 현상(assembly)이 뚜렷하게 확인되었다. 반면, 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스와 함께 LPS가 처리된 THP-1 세포 군에서는 Rac 단백질의 세포 표면으로 모이는 현상이 30분부터 나타나고 있음을 확인하였다. 세포 표면에 존재하는 Rac 단백질은 ROS 생성에 필요한 효소인 NADPH (nicotinamide adenine dineucleotide phosphate) oxidase의 구성성분으로, ROS를 세포 표면에 빠르게 발생시켜 외부에서 침입된 균이나 독소를 제거하는 활성을 갖는다. 외부에서 침입한 균이나 독소는 식균작용으로 인하여 세포 내 엔도솜으로 이동하고, 이곳에서 생성된 ROS에 의하여 살균, 제거되며 리소좀 내 다양한 효소에 의한 분해된다.

세포 리소좀 활성을 측정한 결과, LPS가 처리된 THP-1에서는 120분이 지난 후에 리소좀의 활성이 뚜렷하게 보인 반면, 2,3-시아릴락토오스, 2,6-시아릴락토오스와 함께 LPS가 처리된 군에서는 리소좀 활성이 더욱 짧은 시간인 60분 경과 시점에 뚜렷하게 나타남을 확인하였다 (도 8).

상기 결과를 통해, 시아릴락토오스는 크렙시엘라 뉴모니애 균주에 대한 대식세포의 식균작용을 촉진하며, 대식세포 내 활성산소의 함량, 라이소좀 활성을 빠르게 증가시킴으로써 우수한 항균 활성을 나타내는 물질임을 확인하였다

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

시아릴락토오스 (sialyllactose)를 유효성분으로 포함하는, 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 시아릴락토오스는 α2,3-시아릴락토오스 또는 α2,6-시아릴락토오스인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 시아릴락토오스는 대식세포 내 키모카인 CXCL8의 발현량을 증가시키는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 시아릴락토오스는 대식세포 내 활성 산소 함량 또는 라이소좀 활성을 증가시키는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 시아릴락토오스는 대식세포의 식균작용 (phagocytosis)을 촉진하는 것인, 조성물.
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