KR102008041B1 - Peg 치환된 알파-히드록시 포스포네이트 셸을 가지는 초상자성 나노입자 - Google Patents

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브라이언 크리스토퍼 베일스
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Abstract

본 출원은 철분 치료법 및 진단 영상화, 예컨대 자기 공명 (MR)에 효용이 있는 나노입자, 특히 초상자성 산화 철의 나노입자에 대해 개시한다. 개시되는 나노입자는 나노입자가 진단 영상화에 효용이 있기에 충분하게 친수성이 되도록 하는 친수성 잔기로서 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 α-히드록시포스폰산 접합체로 처리되어 있다. 개시되는 개질 친수성 나노입자들 중에는, 개질 접합체의 친수성 잔기가 폴리에틸렌 옥시드-기재 중합체이며, 5,000 달톤 초과 내지 약 30,000 달톤 이하의 분자량을 가지는 것들이 있다. 놀랍게도, 이러한 나노입자들은 PEG-기재 친수성 잔기가 5,000 미만의 분자량을 가지는 유사한 나노입자와 비교하였을 때, 잔류 나노입자의 간에서의 더 빠르고 완전한 처리성을 가진다.

Description

PEG 치환된 알파-히드록시 포스포네이트 셸을 가지는 초상자성 나노입자{SUPERPARAMAGNETIC NANOPARTICLES WITH PEG SUBSTITUTED ALPHA-HYDROXY PHOSPONATE SHELLS}
본 발명은 일반적으로 안정한 수성 현탁액을 형성하기에 충분하게 친수성이 되도록 α-히드록시포스폰산 유도체를 사용하여 처리된 나노입자, 특히 전이 금속 산화물을 기재로 하는 것들에 관한 것이다. 개질된 나노입자는 치료제로서, 그리고 예를 들면 자기 공명 영상화 (MRI)에 의한 진단 영상화의 조영제로서 사용하기 위한 것과 같이 친수성을 필요로 하는 적용분야에 유용하다.
일부 적용분야에서, 예를 들면 조영제 또는 치료제로 사용되는 경우, 나노입자는 명확하게 정해진 재현가능 구조를 가지며 또한 안전성 시험에 부합하는 것이 바람직하다. 따라서, 정제의 결과로 친수성 저하가 발생하지 않으며 전해질을 함유하는 수성 매질 중에서 현탁 안정성을 나타내는 친수성 나노입자에 대한 필요성이 있어 왔다. 예를 들어, 인간 대상체에서의 생체내 사용을 위한 조영제의 제조시, 후보 나노입자는 통상적으로 정제에 적용되며, 등장성 수성 매질, 즉 약 150 mM의 NaCl을 함유하는 매질에서 현탁 안정성을 나타낼 것이 요구된다. 약 5,000 달톤 이하의 분자량을 가지는 α-히드록시포스폰산-PEG 접합체를 사용하여 전이 금속 산화물 입자를 코팅하는 것에 의해 나노입자의 친수성 및 식염수에서의 안정성을 향상시키기 위한 노력이 어느 정도 성공을 거두었었다.
오늘날까지, 이러한 개질 입자의 생체내 거동과 관련하여서는, 있다 하더라도 적은 정보가 가용하였었다. 특히, 신체에서의 체류 시간과 관련된 파라미터들은 나노입자가 진단 영상화에서의 사용을 위하여 개발되는 경우, 또는 치료제로서의 사용이 기획되는 경우를 고려할 때 중요하다. 처리되지 않은 산화 철 나노입자로부터의 잔류 MR 신호는 강한 MR 신호를 유지하는데, 임상 워크플로우에서 작용제의 반복적인 투여가 필요한 경우, 이는 바람직하지 않다. 이와 관련하여, 본원에서 개시되는 개질 나노입자는 향상된 안정성에도 불구하고, 예컨대 간에서 향상된 처리성(processing)을 나타낸다.
국제특허공개공보 WO 2011/051422
[발명의 개요]
α-히드록시포스폰산-기재 코팅 물질의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자량 증가가 최종 초상자성 산화 철 (SPIO) 나노입자를 더 안정한 프로필 및 더 긴 혈중 반감기 쪽으로 이동시킨다는 것이 앞서 관찰된 바 있다. 예상치 못하였던 것은 혈액 및 혈청에서의 증가된 안정성에도 불구하고, α-히드록시포스폰산-PEG 접합체를 가지며 상기 PEG의 분자량이 5000을 초과하는 SPIO가 더 빠른 잔류 투여량 간 처리성을 나타낸다는 이후의 관찰이었다. 따라서, 본 개시는 약 5,000 달톤 초과 내지 약 30,000 달톤 이하의 분자량을 가지는 PEG를 포함하는 α-히드록시포스폰산 접합체를 사용하여 코팅된 SPIO에 관한 것이다. 예를 들어 일 실시양태에서, 5,000 달톤을 초과하는 분자량의 PEG를 가지는 접합체는 놀랍게도 분자량이 5,000 달톤 미만인 PEG를 가지는 동일한 코팅 물질에 비해 더 빠르고 완전한 간 처리성을 가진다.
따라서 일 측면에서, 본 발명은, 하기 화학식 I의 구조를 가지는 α-히드록시포스포네이트 잔기가 부착된 산화 철 코어를 갖는 나노입자를 포함하는, 나노입자 조성물에 관한 것이다:
<화학식 I>
Figure 112014082248744-pct00001
(식 중, S는 스페이서이며, L은 S와 R 사이의 연결부이고, R은 폴리(에틸렌 글리콜)이며, Z는 PEG 사슬 ω 말단의 알콕시 또는 히드록시 말단캡이고, 여기서 상기 PEG는 약 5,000 달톤 초과 내지 약 30,000 달톤 이하의 분자량을 가지며, o = 0 또는 1임).
일부 실시양태에서, S는 직접 결합, 비치환 또는 치환 지방족 또는 고리지방족 기, 헤테로지방족 기, 일부 경우에서는 길이 1 내지 10개 탄소 원자의 직쇄 알킬 기이며, L은 직접 결합, 카르보닐 기, 에테르 기, 에스테르 기, 2차 또는 3차 아민, 4차 아민 기, 아미드 기, 카르바메이트 기 또는 우레아 기이다.
접합체는 인간 조직과 바람직하지 않은 반응을 가질 수 있는 기 또는 잔기를 포함하지 않는 것이 특히 중요하다. 따라서, 접합체는 나노입자에 부착되었을 때 약 -40 mV 내지 40 mV 사이, 바람직하게는 약 -15 mV 내지 15 mV 사이의 제타 전위를 나타내는 것이 적절하며, 부착되었을 때 본질적으로 중성인 제타 전위를 나타낸다면 특히 유리하다.
또한, 인간 대상체에서 생체 내로 사용될 나노입자를 처리하는 데에 사용되는 접합체는 α-히드록시포스폰산과 PEG 사이의 연결부가 탄화수소인 것, 즉 구조 I에서 S가 단일 결합인 것이 적절하다.
본 개시는 또한 PEG-치환 알파-히드록시 포스포네이트 코팅 나노입자를 사용한 진단 영상화 방법에 관한 것으로써, 하기를 포함한다:
나노입자 조성물이 투여된 개체를 영상화에 적용하는 것으로써, 상기 나노입자 조성물은 하기 화학식 I의 구조를 가지는 α-히드록시포스포네이트 잔기가 부착된 산화 철 나노입자를 포함하는 것:
<화학식 I>
Figure 112014082248744-pct00002
(식 중, S는 스페이서이며, L은 S와 R 사이의 연결부이고, R은 폴리(에틸렌 글리콜)이며, Z는 PEG 사슬 ω 말단의 알콕시 또는 히드록시 캡이고, o = 0 또는 1이며, 여기서 상기 PEG는 약 5,000 달톤 초과 내지 약 30,000 달톤 이하의 분자량을 가짐).
또 다른 측면에서, 본 발명은 PEG-치환 알파-히드록시 포스포네이트 코팅 나노입자를 사용한 철분 결핍의 치료 방법에 관한 것으로써, 하기를 포함한다:
α-히드록시포스포네이트 잔기가 부착된 산화 철 코어를 가지는 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물을 개체에게 투여하는 것으로써, 상기 α-히드록시포스포네이트 잔기는 하기 화학식 I의 구조를 가지는 것:
<화학식 I>
Figure 112014082248744-pct00003
(식 중, S는 스페이서이며, L은 S와 R 사이의 연결부이고, R은 폴리(에틸렌 글리콜)이며, Z는 PEG 사슬 ω 말단의 알콕시 또는 히드록시 캡이고, 여기서 상기 PEG는 약 5,000 달톤 초과 내지 약 30,000 달톤 이하의 분자량을 가지며, o = 0 또는 1임).
상기 α-히드록시포스폰산-PEG 접합체는 바람직하게는, Fe 원자 당 약 0.04 내지 약 2.0 접합체의 비로 나노입자를 처리하는 데 사용될 경우, DLS에 의해 측정하였을 때 약 15 내지 100 nm, 일부 실시양태에서는 약 15 내지 50 nm 사이, 또 다른 실시양태에서는 약 20 내지 약 30 nm 사이의 DH를 갖는 나노입자가 수성 매질 중에서 안정한 콜로이드 현탁액을 형성할 수 있도록 하기에 충분히 친수성이다. 동일 부피의 n-옥탄올과 pH 7.0의 0.1 M 3-(N-모르폴리노) 프로판술폰산 (MOPS) 완충제 사이 분배 계수 로그(log)에 있어 1 미만의 값을 나타내기에 충분한 정도로 상기 처리된 나노입자가 친수성이 되도록 한다면 특히 적절하다.
α-히드록시포스폰산-PEG 접합체의 첨가에 의해 개질되는 나노입자 코어는 바람직하게는 전이 금속 및 전이 금속 화합물, 예컨대 산화물, 탄화물, 황화물, 질화물, 인화물, 붕소화물, 할로겐화물, 셀렌화물, 텔루르화물 및 이들의 조합을 기재로 하는 것들이다. 산화물이 특히 유리하다. 전이 금속 화합물은 자기 공명 (MR) 영상화용 조영제를 제조하는 데에 유용하다. 원소 주기율표 3 주기의 전이 금속들이 상자성 및 적절하게는 초상자성을 나타내며 그에 따라 MRI 조영제로서 유용한 화합물을 형성하는 데에 유용하다. 특히 적절한 것은 산화 철을 기재로 하는 초상자성 나노입자이다. 이들은 보통 초상자성 산화 철 (SPIO) 입자로 지칭되는데, SPIO 나노입자의 제조 방법에 대해서는 업계 숙련자에게 알려져 있다 (예를 들면, 문헌 [Lodhia et al. Development and use of iron oxide nanoparticles ( Part I): Synthesis of iron oxide nanoparticles for MRI . Biomedical Imaging and Intervention Journal, 6(2):e12, 2010] 참조).
친수성으로 개질된 나노입자는 통상적으로 DLS에 의해 측정하였을 때 약 15 nm 내지 100 nm, 일부 실시양태에서는 15 내지 50 nm 사이, 또 다른 실시양태에서는 약 20 nm 내지 약 30 nm 사이의 DH를 가진다. 친수성으로 개질된 나노입자가 예를 들어 MRI 조영제로서 인간 대상체에서의 생체내 사용을 예정으로 하는 경우, 특히 적절한 DH는 약 30 nm 이하이다.
일 실시양태에서, 친수성으로 개질된 나노입자는 나노입자를 접합체와 반응시키는 것에 의해 제조된다. 한 가지 접근법은 벤질 알콜 (BnOH)과 같은 유기 용매 중 나노입자의 콜로이드 현탁액을 형성시킨 다음, 그것을 동일하거나 상이한 유기 용액 중 접합체의 유기 용액과 혼합하는 것이다. 이후, 반응이 본질적으로 완료될 때까지, 혼합물이 승온으로 장기간 동안 유지될 수 있다. 통상적으로, 50℃ 이상의 온도에서 16시간 이상 동안이 적절하다.
친수성으로 개질된 나노입자의 안정한 단분산 수성 콜로이드 현탁액이 용이하게 수득된다. 그와 같은 현탁액은 바람직하게는 30 kDa 컷오프 (cut off)의 접선 유동 여과(tangential flow filtration)와 같은 여과, 및 수성 매질을 등장성, 즉 약 150 mM의 NaCl이 되게 하는 NaCl의 첨가와 같은 전해질의 첨가에 대하여 안정해야 한다. 바람직하게는 현탁액은 1주 이상의 저장 기간 동안 안정하며, 보다 바람직하게는 현탁된 나노입자의 침강에 대해서 뿐만 아니라, DLS에 의해 측정하였을 때의 DH의 증가에 대해서도 안정하다. 현탁액이 인간 대상체에서의 생체내 사용을 예정으로 하는 경우, NaCl, 덱스트로스, 또는 업계에 알려져 있는 다른 장성 개질제, 또는 이들의 조합의 첨가에 의해 그것을 등장성이 되게 하는 것이 적절하다.
친수성으로 개질된 나노입자는 치료제로서, 또는 진단 영상화의 조영제로서 적절하게 사용될 수 있다. 진단 영상화의 통상적인 유형에는 자기 공명 (MR) 영상화가 포함된다. 철분 보충제로서의 친수성으로 개질된 나노입자의 치료적 투여 역시 예를 들면 철분 결핍 치료용으로 고려된다.
치료법 또는 영상화 모두에서, 약 -15 mV 내지 15 mV 사이의 제타 전위를 가지는 친수성으로 개질된 나노입자를 사용하는 것이 적절하다. 인간 대상체에 대한 친수성으로 개질된 나노입자 투여의 적절한 접근법은 바람직하게는 안정한 등장성 수성 현탁액으로서 정맥내로 나노입자를 투여하는 것이다. 용도가 MR 영상화인 경우, 나노입자는 상자성, 바람직하게는 초상자성인 종을 포함해야 하며, 가장 바람직하게는 그것이 마그네타이트 또는 마그헤마이트와 같은 산화 철 기재의 것이어야 한다.
첨부된 도면을 참조하여 하기의 상세한 설명을 해독하면, 본 발명의 이들 및 기타 특징, 측면 및 장점들이 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 350, 440, 750, 2,000 및 5,000 달톤을 포함한 다양한 평균 분자량의 PEG를 가지는 친수성으로 개질된 나노입자들을 비교하는 간 청소 연구의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 평균 분자량 2,000, 5,000, 10,000 및 30,000 달톤의 PEG를 가지는 친수성으로 개질된 나노입자들을 비교하는 간 청소 연구의 결과를 나타내는 그래프이다.
이어지는 상세한 설명에서, 다르게 언급되지 않는 한, 사용되는 용어의 해석은 해당 용어(들)의 일반적인 의미와 일치하는 것으로 한다.
본 발명의 접합체는 매우 다양한 연결부를 가질 수 있다. 핵심 특징은 접합체가 화학적 및 입체적으로 접근가능한 3개의 α-히드록시포스폰산 히드록실 기를 가진다는 것이다. 구조상 키랄 중심을 가지고 있기는 하지만, 모든 개별 거울상이성질체 및 있을 수 있는 라세미 혼합물들이 수불용성인 나노입자에 친수성을 부여하는 데에 적합할 것으로 예상된다.
이들 접합체는 α-히드록시포스폰산 구조와 PEG 사이에 탄소, 질소, 산소 및 황을 기재로 하는 것들을 포함한 어떠한 통상적으로 알려져 있는 화학적 연결부도 가질 수 있다. 특히 유리한 기는 탄화수소, 카르보닐, 에스테르, 에테르, 2차 또는 3차 아민, 4차 아민, 우레아, 카르바메이트 및 아미드이다. 접합체를 사용하여 처리될 나노입자의 예정된 최종 용도가 연결 기의 선택에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 나노입자가 생체내, 특히 인간 대상체에서 사용되어야 하는 경우, 불활성의 관점에서 가장 유리한 연결 기는 탄화수소이다.
본원 개시 접합체는 에틸렌 옥시드를 기재로 하며, 약 5,000 달톤 초과 내지 약 30,000 달톤 이하의 평균 분자량을 가지는 폴리(에틸렌 옥시드/글리콜)을 갖는다.
본원에서 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)의 분자량을 언급하는 경우, 개시되는 값은 화합물의 평균 분자량을 나타내는데; 해당 화합물의 조제물은 분자량이 평균으로부터 10-28% 가량 가변적인 종들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제조자에 의해 표시되어 있는 바와 같이, PEG 3350의 조제물은 3350 달톤의 평균 분자량을 가지며, 조제물 중 분자 종들이 3000 내지 3750 사이의 분자량을 가진다. 사용된 PEG 5000 물질의 스펙트럼 분석은 평균이 5,000 달톤 가량인 약 4,000 내지 6,400 달톤의 크기 범위를 나타내었다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 하기 화학식 II의 구조를 가지는 PEG-α-히드록시포스폰산 접합체를 사용하여 처리된다:
<화학식 II>
Figure 112014082248744-pct00004
(식 중, n = 1 또는 2이며, p는 ~114-681임).
일부 실시양태에서, 접합체는 하기의 합성 반응식 (식 중, R은 PEG임)에 따라 먼저 α-히드록시포스폰산을 제조하는 것에 의해 제조된다:
<반응식 1>
Figure 112014082248744-pct00005
다른 실시양태에서, 접합체는 하기의 합성 반응식에 따라 제조된다:
Figure 112014082248744-pct00006
접합체는 바람직하게는 충분히 친수성이어서, 나노입자의 금속 기제(metal basis) 당 접합체 약 0.04-2.0 당량의 비로 접합체가 나노입자와 반응되었을 때, 나노입자가 안정한 수성 현탁액을 형성할 수 있도록 만들 수 있다. 나노입자는 통상적으로 산화물과 같은 전이 금속 화합물 또는 전이 금속 자체를 기재로 하게 된다. 반응 비는 원소 금속의 몰수를 사용하여 명기하는 것이 적절한데, 그것이 유기 용매 중 개시 나노입자 현탁액의 원소 분석으로부터 용이하게 수득될 수 있기 때문이다. 나노입자의 화학적 구성 및 처리 전의 그의 평균 크기에 대한 지식으로부터, 나노입자 당 접합체의 양의 개략적인 계산이 이루어질 수 있다. 접합체는, 15 nm 내지 100 nm 사이, 일부 실시양태에서는 15 nm 내지 50 nm 사이, 또 다른 실시양태에서는 약 20 내지 약 30 nm 사이의 코팅된 산화 철 나노입자를 제공함으로써, 동일 부피의 n-옥탄올과 0.1 M pH 7.0 MOPS 완충제 사이 분배 계수 log에 있어 1 미만의 값을 나타내기에 충분한 친수성을 가지는 입자를 산출하기에 충분하도록 친수성인 것이 특히 적절하다.
부착된 알파-히드록시포스폰산 접합체를 가지는 개질 친수성 나노입자는 안정한 수성 콜로이드 현탁액을 형성하기에 충분하게 친수성이어서, 접선 유동 여과 후 150 mM NaCl 수 중에서 동적 광 산란 (DLS)에 의해 측정하였을 때 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter) (DH)의 실질적인 변화를 나타내지 않는 것이 특히 중요하다. 접합체를 사용하여 처리될 수 있는 나노입자는 접합체의 α-히드록시포스폰산 부분이 부착하게 되는 100 nm 이하의 입자로 형성될 수 있는 모든 수불용성 물질의 것일 수 있다. 자기 공명 영상화에서 조영제로서 효용을 가지는 나노입자를 사용하는 것이 유리하다. 추가적으로, 치료 방식으로의 본 개시 나노입자의 사용도 고려된다. 그러나, 유전자의 형질감염을 위한 세포 배양물의 주입과 같은 다른 최종 용도를 위한 나노입자 역시 중요하다.
MRI 조영제로서의 사용을 위해서는, 나노입자의 기제가 상자성인 금속 또는 그의 화합물이어야 하는데, 초상자성인 것들이 특히 유리하다. 이러한 금속은 망간으로 시작하여 아연으로 끝나는 원소 주기율표 III 주기의 전이 금속에서 적절하게 선발된다. 치료법은 물론 영상화에서 사용함에 있어서 특히 중요한 물질 군은 산화 철을 기재로 하는 것들이다. 특히 적절한 물질은 SPIO로 알려져 있는 것들이다. 이 물질은 [Fe2 +O3]x[Fe2 +O3(M2 +O)]1-x (식 중, 1 ≥ x ≥ 0임)의 화학식을 가진다. M2 +는 철, 망간, 니켈, 코발트, 마그네슘, 구리, 아연 또는 이들의 조합과 같은 2가의 금속 이온일 수 있다. 금속 이온 (M2 +)이 철 이온 (Fe2 +)이고 x = 0인 경우, 물질은 마그네타이트 (Fe3O4)이고, x = 1인 경우, 물질은 마그헤마이트 (γ-Fe2O3)이다.
일반적으로, 초상자성은, 결정-함유 홀 스핀(unpaired spin) 영역이 충분히 커서, 그것이 자기 도메인(magnetic domain)으로 지칭되는 열역학적으로 독립적인 단일 도메인 입자로 간주될 수 있는 경우에 발생한다. 이러한 자기 도메인은 그의 개별 홀 전자의 합계보다 더 큰 순 자기 쌍극자를 나타낸다. 인가 자기장의 부재하에서는, 모든 자기 도메인들이 순 자화 없이 무작위로 배향된다. 외부 자기장의 인가는 모든 자기 도메인의 쌍극자 모멘트가 재배향되도록 함으로써 순 자기 모멘트를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이러한 물질은 투과 전자 현미경 (TEM) 분석으로 나타내었을 때 스피넬 결정질 구조를 나타낸다.
α-히드록시포스폰산이 부착된 개질 친수성 나노입자는 치료제 또는 진단 영상화의 조영제로서 사용될 수 있다. 영상화 적용분야에서는, 개질된 나노입자가 대상체, 일부 실시양태에서는 포유동물 대상체에게 투여된 다음, 대상체가 영상화에 적용된다. 치료 적용분야에서는, 예를 들면 철분 결핍을 해소하기 위하여, 개질된 나노입자가 대상체에게 투여된다.
구체적으로 포유동물 대상체, 더 구체적으로는 인간 대상체의 진단 영상화에 사용되는 경우, α-히드록시포스폰산이 부착된 개질 친수성 나노입자는 통상적으로 1종 이상의 부형제를 포함할 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 약제학적으로 허용가능한 담체에 포함된다. 투여가 주사, 특히 비경구 주사에 의해야 하는 경우, 담체는 통상적으로 약 150 mM의 NaCl, 5% 덱스트로스 또는 이들의 조합의 첨가에 의해 등장성이 된 수성 매질이다. 통상적으로, 그것은 또한 약 7.3 내지 7.4 사이의 생리학적 pH를 가진다. 투여는 근육내 (IM), 피하 (SQ) 또는 가장 일반적으로는 정맥내 (IV)의 것일 수 있다. 그러나, 투여는 나중에 천천히 대상체의 혈액 또는 조직에 나노입자를 방출하는 데포(depot)의 이식을 통한 것일 수도 있다.
다르게는, 투여는 GI 관로의 영상화를 위한 또는 치료용 철분 투여량의 경구 전달을 위한 섭취에 의한 것이거나, 또는 폐 및 기도의 영상화를 위한 흡입에 의한 것일 수 있다.
인간 대상체에의 투여, 특히 IV 투여는, α-히드록시포스폰산이 부착된 개질 친수성 나노입자가 사용된 양에서 비-독성이고 세균 및 바이러스와 같은 어떠한 감염 요인도 없으며 또한 어떠한 발열원도 없을 것을 필요로 한다. 따라서, 이러한 나노입자는 필요한 정제 절차에 대하여 안정하고, 그의 친수성의 저하가 발생하지 않아야 한다.
이러한 나노입자는 적정한 오스몰랄농도 및 pH를 가지는 안정한 수성 콜로이드 현탁액으로서, 희석 및 조정에 적합한 농축 수성 콜로이드 현탁액으로서, 또는 재구성에 적합한 동결건조에 의해 수득되는 것과 같은 분말로서 투여 부위까지 전달될 수 있다.
따라서, 본 개시는 추가적으로 본원에서 개시되는 나노입자를 사용한 대상체의 영상화 방법에 관한 것이다. 그와 같은 방법은, 나노입자 조성물이 투여된 대상체를 예를 들면 자기 공명에 의한 영상화에 적용하는 단계로써, 여기서 대상체에게 투여되는 상기 조성물은 α-히드록시포스포네이트-PEG 접합체가 부착되어 있는 나노입자를 포함하며, 상기 PEG는 약 5,000 달톤 초과 내지 약 30,000 달톤 이하의 분자량을 가지는 단계를 포함한다.
PEG-α-히드록시포스폰산 개질된 초상자성 산화 철 입자 (SPIO)를 생성시키기 위한 이전의 노력들은 향상된 친수성 및 안정성을 가지는 SPIO로 이어졌다. 그러나, 영상화 실험에서, 간에서의 나노입자의 지속성에 기인하는 MR 신호의 "이중 단계(dual phase)" 이중지수 붕괴가 관찰되었다.
나노입자를 코팅하는 데에 사용되는 친수성 접합체의 PEG 분자량의 더 정밀한 평가는 간 처리성 특성이 PEG 중합체 크기에 따르는 것으로 보임을 나타내었다. 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, PEG의 분자량이 약 5,000 달톤을 초과하는 (PEG5000) PEG-α-히드록시포스폰산을 사용하여 개질된 나노입자가 분자량이 약 2000 달톤인 PEG (PEG2000)에 의해 개질된 것에 비해 현저하게 더 빠르고 완전한 간 처리성 프로필을 가졌다.
동위원소 강화 산화 철 나노입자를 사용한 유도 커플링 플라스마 질량 분광법(inductively coupled plasma mass spectroscopy)을 통하여 측정하였을 때, 주사 24시간 후, PEG2000-과 PEG5000-기재 SPIO 나노입자 사이의 철의 간 흡수에는 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다 (데이터 미기재). 마찬가지로, 유도 커플링 플라스마 질량 분광법에 의해 측정하였을 때, 주사 후 적어도 84일까지 간에서의 외인성 또는 내인성 철분의 양에는 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다 (데이터 미기재). 그러나, PEG2000- 및 PEG5000-기재 SPIO 나노입자에 있어서의 이러한 유사한 조직 철분 농도에도 불구하고, MR 영상화에서는 간에서의 산화 철 코어의 처리성 프로필의 차이가 분명하였다. PEG5000-기재 SPIO 나노입자는, 분자량이 2000 달톤 이하인 PEG를 가지는 접합체를 포함하는 SPIO 나노입자에서 관찰되었던 MR 영상화에 의해 평가하였을 때의 보다 느린 이중지수 분해 프로필을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는다.
본 기재 명세서는 최적 양태를 포함한 개시내용을 설명하고, 또한 임의의 업계 숙련자가 개시내용을 실시할 수 있도록 하는 데에 하기의 실시예를 사용하는 바이다. 개시내용 중 특허가능한 영역은 청구범위에 의해 정의되어 있는 바, 업계 숙련자에게 떠오르는 다른 예들을 포함할 수 있다.
[ 실시예 ]
실시예 1: PEG -350 접합체의 합성
Figure 112014082248744-pct00007
PEG -350 모노( 메틸 에테르) 아세트알데히드의 합성. CH2Cl2 (98 mL) 중에 용해된 PEG-350 모노(메틸 에테르) (3.438 g, 9.82 mmol)를 함유하는 용액에 데쓰-마르틴 페리오디난(Dess-Martin Periodinane) (5.00 g, 11.79 mmol)을 첨가하고, 생성 용액을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 동안, 미세한 백색의 침전물이 형성되었는데, 반응 종료시에 셀라이트(celite) 패드를 통한 여과를 통하여 제거하였다. 진공에서 여과액으로부터 용매를 제거함으로써, 황색의 오일에 현탁된 백색 고체를 산출하였다. 디에틸 에테르를 사용하여 고체를 연화처리하고(triturated), 셀라이트 패드를 통한 여과에 의해 고체를 제거하였다. 진공에서의 여과액으로부터의 용매의 제거로써, 생성물인 PEG-350 모노(메틸 에테르) 아세트알데히드 (3.42 g, 100%)를 황색의 오일로 산출하였다.
Figure 112014082248744-pct00008
Figure 112014082248744-pct00009
디에틸 α-히드록시 PEG -350 모노( 메틸 에테르) 포스포네이트의 합성. 테트라히드로퓨란 (53 mL) 중에 용해된 PEG-350 모노(메틸 에테르) 아세트알데히드 (3.71 g, 10.7 mmol)를 함유하는 용액에 디에틸 포스파이트 (1.77 g, 12.8 mmol)를 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각하고, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔 (1.94 g, 12.8 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 10분 동안 교반한 후, 반응액을 실온으로 가온하고, 추가 24시간 동안 교반하였다. 진공에서 용매를 제거하여 짙은 황색의 오일을 산출한 후, 컬럼 크로마토그래피 (100% CH2Cl2 내지 15% MeOH/85% CH2Cl2)를 통해 그것을 정제함으로써, 3.30 g (64%)의 원하는 디에틸 α-히드록시 PEG-350 모노(메틸 에테르) 포스포네이트 생성물을 황색의 오일로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00010
Figure 112014082248744-pct00011
Figure 112014082248744-pct00012
α-히드록시 PEG -350 모노( 메틸 에테르) 포스폰산의 합성. 메틸렌 클로라이드 (74 mL) 중에 용해된 디에틸 α-히드록시 PEG-350 모노(메틸 에테르) 포스포네이트 (3.61 g, 7.43 mmol)를 함유하는 용액에 트리메틸실릴 브로마이드 (3.41 g, 22.3 mmol)를 첨가하고, 생성 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 진공에서 용매를 제거하여 갈색의 오일을 산출하였다. 생성 오일을 아세톤 (74 mL) 및 물 (0.5 mL) 중에 용해시키고, 생성 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 다음에, 진공에서 용매를 제거함으로써, 원하는 α-히드록시 PEG-350 모노(메틸 에테르) 포스폰산 생성물 (2.66 g, 84%)을 금색의 오일로서 산출하였다.
Figure 112014082248744-pct00013
실시예 2: PEG -1900 접합체의 합성
Figure 112014082248744-pct00014
mPEG2k - 에폭시드의 합성. 2 L 자켓구비 반응 용기를 질소로 퍼징하고, 에피클로로히드린 (222.9 mL, 2.843 mol), 이어서 H2O (11.37 mL, 0.631 mol)를 충전하였다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, NaOH (113.7 g, 2.843 mol)를 첨가하고, 생성된 반응 슬러리를 72℃로 가열하였다. PEG1900 모노(메틸 에테르)를 반응액에 첨가하고, 생성 용융물을 72℃에서 3시간 동안 교반하였다. 다음에, 반응액을 35℃로 냉각하고, H2O (750 mL)를 첨가하였다. 반응 용액이 실온에 도달하고 나면, 반응 수용액을 CH2Cl2 (2×750 mL)로 추출하였다. 다음에, 진공에서 합쳐진 유기 추출물로부터 용매를 제거하여 황갈색/갈색 고체를 수득하였다. 고체를 CH2Cl2 (750 mL) 중에 용해시키고, 생성된 혼탁 용액을 셀라이트 패드로 통과시켰다. 진공에서 생성된 투명한 오렌지색 여과액으로부터 용매를 제거함으로써, 왁스질의 황갈색 고체를 산출하였다. 회수된 고체를 2:1 THF/헥산 (1.3 mL THF/g 조물질)으로부터 2× 재결정화함으로써, 439.7 g (85%)의 원하는 생성물을 회백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00015
Figure 112014082248744-pct00016
mPEG2k - 디올의 합성. mPEG2k-에폭시드 (125.0 g, 63.9 mmol)를 0.5 M H2SO4 (500 mL) 중에 용해시키고, 생성 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 다음에, 반응 용액을 CH2Cl2 (2×500 mL)로 추출하였다. 진공에서 합쳐진 유기 층으로부터 용매를 제거하여 왁스질의 황갈색 고체를 수득하였다. 회수된 고체를 2:1 THF/헥산 (0.83 mL THF/g 조물질)으로부터 재결정화함으로써, 115.8 g (93%)의 원하는 생성물을 회백색 분말로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00017
Figure 112014082248744-pct00018
mPEG2k -알데히드의 합성. mPEG2k-디올 (5.0 g, 2.53 mmol)을 H2O (14.7 mL)중에 용해시키고, 반응 용액을 6℃로 냉각하였다. H2O (4.42 mL) 중에 용해된 NaIO4 (0.650 g, 3.04 mmol)를 함유하는 용액을 10분의 기간에 걸쳐 3개의 동일 분취량으로 첨가하였다. 생성 용액을 6℃에서 1시간 동안 교반하였다. 1,2-프로판디올 (0.100 mL, 0.136 mmol)을 첨가하고, 반응액을 6℃에서 추가 15분 동안 교반하였다. 다음에, 반응액을 실온으로 가온하고, 수성 반응 혼합물을 CH2Cl2 (3×20 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기 층을 염수 (15 mL)로 세척하고, 진공에서 용매를 제거함으로써, 4.59 g (93%)의 원하는 생성물을 회백색의 왁스질 고체로서 산출하였다.
Figure 112014082248744-pct00019
Figure 112014082248744-pct00020
디벤질 -α HmPP5k 의 합성. mPEG2k-알데히드 (79.00 g, 40.7 mmol)를 CH2Cl2 (136.5 mL) 중에 용해시켰다. 디벤질 포스파이트 (8.99 mL, 40.7 mmol)를 첨가하고, 이어서 트리에틸아민 (5.65 mL, 40.68 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 20시간 동안 교반한 후, 진공에서 반응 혼합물로부터 용매를 제거하여 왁스질의 황색 고체를 산출하였다. 회수된 고체를 2:1 THF/헥산 (2 mL THF/g 조물질)으로부터 재결정화함으로써, 81.0 g (90%)의 원하는 생성물을 회백색 분말로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00021
Figure 112014082248744-pct00022
α HmPP2k 의 합성. 디벤질-αHmPP5k (80.0 g, 36.3 mmol)을 95% 에탄올 (471.4 mL) 중에 용해시키고, 10% 탄소상 Pd (2.87 g, 2.7 mmol Pd)를 교반하면서 천천히 첨가하였다. 반응액을 H2 분위기하에 위치시키고, H2 흡수가 완료될 때까지 교반하였다 (93시간). 셀라이트 패드를 통한 여과를 통하여 탄소상 Pd를 제거하고, 진공에서 여과액으로부터 용매를 제거하여 백색의 왁스질 고체를 산출하였다. 회수된 고체를 2:1 THF/헥산 (1.3 mL THF/g 조물질)으로부터 재결정화함으로써, 79.2 g (~100%)의 원하는 생성물을 백색의 분말로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00023
실시예 3: PEG -5000 접합체의 합성
Figure 112014082248744-pct00024
mPEG5k - 에폭시드의 합성. 물 (4.32 mL)을 에피클로로히드린 (84.68 mL, 1.080 mol)에 현탁시키고, NaOH (43.20 g, 1.080 mmol)를 첨가한 후, 이어서 트리에틸암모늄 히드로클로라이드 (1.18 g, 0.009 mol)를 첨가하였다. 용액을 교반하고 70℃로 가열하면서, 그 시간 동안 온도가 상승함에 따라 조금씩 PEG5000 모노(메틸 에테르) (500 g, 0.100 mol)를 첨가하였다. 생성 현탁액을 그 온도에서 4시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각하였다. 물 (500 mL)을 첨가하고, 생성물을 CH2Cl2 (2×1000 mL)로 추출하였다. 진공에서 CH2Cl2를 제거하고 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 생성 오일을 THF (400 mL)/헥산 (200 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 499.93 g (이론적 질량의 99%)의 원하는 생성물을 회백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00025
Figure 112014082248744-pct00026
mPEG5k - 디올의 합성. mPEG5k-에폭시드 (499.93 g, 98.88 mmol)를 0.5 M H2SO4 (2000 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 1.5시간 동안 (~30분 물질을 완전히 용해시키고, 추가 1시간 반응) 교반하였다. 다음에, 반응액을 CH2Cl2 (2×1000 mL)로 추출하였다. 진공에서 CH2Cl2를 제거하고 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 생성 오일을 THF/헥산 (400 mL:200 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 411.88 g (이론적 질량의 82%)의 원하는 생성물을 회백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00027
Figure 112014082248744-pct00028
mPEG5k -알데히드의 합성. mPEG5k-디올 (208 g, 40.99 mmol)을 물 (320 mL)중에 용해시키고, 실온에서 ~45분 동안 교반하였다. 이 혼탁 용액에, 물 (90 mL)중에 사전-용해된 NaIO4 (10.7 g, 50 mmol)의 용액을 ~30분에 걸쳐 동일한 양으로 첨가하였다. 최종 산화제 첨가 ~1.5 - 2시간 후, 혼탁도가 투명해졌다. 다음에, 반응액을 16시간 동안 교반하고, 프로필렌 글리콜 (1.20 mL)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 다음에, 수성 반응 혼합물을 CH2Cl2 (1×1000 mL, 1×500 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합치고, 진공에서 CH2Cl2를 제거하였다 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만). 생성된 금색 오일을 THF/헥산 (400 mL:200 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 183.77 g (이론적 질량의 89%)의 원하는 생성물을 백색의 고체로서 산출하였다.
Figure 112014082248744-pct00029
Figure 112014082248744-pct00030
디벤질 -α HmPP5k 의 합성. mPEG5k-알데히드 (181.453 g, 35.97 mmol)를 CH2Cl2 (850 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸아민 (5.01 mL, 35.97 mmol)을 첨가한 후, ~30분 동안 교반시켰다. 이후, 디벤질 포스파이트 (9.43 g, 35.97 mmol)를 천천히 첨가하였다. 실온에서 48시간 동안 교반한 후, 진공에서 용매를 제거하고 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 생성 오일을 THF/헥산 (350 mL:175 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 175.59 g (이론적 질량의 92%)의 원하는 생성물을 백색의 고체로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00031
Figure 112014082248744-pct00032
α HmPP5k 의 합성. 무수 디벤질-αHmPP5k (122.80 g, 23.15 mmol)를 무수 에탄올 (500 mL) 및 물 (25 mL)에 현탁시키고, 10% 탄소상 Pd (4.0 g)를 천천히 첨가하였다. 다음에, 반응액을 H2 분위기하에서 (풍선 압력) 흡수가 완료될 때까지 교반하였다. 셀라이트 패드를 통한 여과를 통하여 탄소상 Pd를 제거하고, 진공에서 여과액으로부터 용매를 제거하였다 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만). 생성 오일을 THF/헥산 (300 mL:150 mL)으로부터 재결정화함으로써, 109.7 g (이론적 질량의 94%)의 원하는 생성물을 백색의 분말로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00033
실시예 4: PEG -10,000 접합체의 합성
Figure 112014082248744-pct00034
mPEG10k - 디올의 합성. PEG10000 모노(메틸 에테르) (20 g, 2 mmol)를 80℃로 가열하면서, 그 시간 동안 물 (0.090 mL), 에피클로로히드린 (1.78 mL, 22.7 mmol) 및 NaOH (0.908 g, 22.7 mmol), 그리고 이어서 트리에틸암모늄 히드로클로라이드 (0.025 g, 0.182 mmol)를 첨가하였다. 생성 용융물/현탁액을 그 온도에서 18시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각하였다. 0.5 M H2SO4 (100 mL)를 첨가하고, 반응액을 실온에서 추가 18시간 동안 교반하였다. 생성물을 CH2Cl2 (1×200 mL, 1×100 mL)로 추출하였다. 진공에서 CH2Cl2를 제거하고 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 생성 오일을 THF (150 mL)/헥산 (75 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 18.378 g (이론적 질량의 91%)의 원하는 생성물을 백색의 고체로서 산출하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 다음 단계로 전달하였다.
Figure 112014082248744-pct00035
Figure 112014082248744-pct00036
mPEG10k -알데히드의 합성. mPEG10k-디올 (17.805 g, 1.824 mmol)을 물 (75 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 ~30분 동안 교반하였다. 이 혼탁 용액에, 물 (4.5 mL) 중에 사전-용해된 NaIO4 (0.456 g, 2.22 mmol)의 용액을 ~30분에 걸쳐 동일한 양으로 첨가하였다. 최종 산화제 첨가 ~1.5시간 후, 혼탁도가 투명해졌다. 다음에, 반응액을 18시간 동안 교반하고, 프로필렌 글리콜 (0.054 mL)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 이 반응 혼합물을 추가 1시간 동안 교반하였다. 다음에, 수성 반응 혼합물을 CH2Cl2 (1×150 mL, 1×100 mL)로 추출하였다. 유기물질을 합쳐, 진공에서 CH2Cl2를 제거하고 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 생성된 황색 오일을 THF/헥산 (200 mL:100 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 13.182 g (이론적 질량의 72%)의 원하는 생성물을 백색의 고체로서 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 다음 단계로 전달하였다.
Figure 112014082248744-pct00037
Figure 112014082248744-pct00038
디벤질 - aHmPP10k 의 합성. mPEG10k-알데히드 (18.475 g, 1.242 mmol)를 CH2Cl2 (50 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸 아민 (0.26 mL, 1.86 mmol)을 첨가한 후, ~30분 동안 교반시켰다. 이후, 디벤질 포스파이트 (0.488 g, 1.86 mmol)를 천천히 첨가하였다. 실온에서 96시간 동안 교반한 후, 진공에서 용매를 제거하고 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 생성 오일을 THF/헥산 (150 mL:75 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 12.53 g (이론적 질량의 98%)의 원하는 생성물을 백색의 고체로서 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 다음 단계로 전달하였다.
Figure 112014082248744-pct00039
Figure 112014082248744-pct00040
aHmPP10k 의 합성. 디벤질-aHmPP10k (11.81 g, 1.15 mmol)를 무수 에탄올 (100 mL)에 현탁시키고, 완전히 용해될 때까지 40℃에서 가열하였다. 10% 탄소상 Pd (2.0 g)를 천천히 첨가하였다. 다음에, 반응액을 H2 분위기하에 (풍선 압력) 40℃에서 흡수가 완료될 때까지 교반하였다. 셀라이트 패드를 통한 여과를 통하여 탄소상 Pd를 제거하고, 진공에서 여과액으로부터 용매를 제거하였다 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만). 생성 오일을 THF/헥산 (150 mL:75 mL)으로부터 재결정화함으로써, 11.27 g (이론적 질량의 98%)의 원하는 생성물을 백색의 분말로서 수득하였다.
Figure 112014082248744-pct00041
실시예 5: PEG -30,000 접합체의 합성
Figure 112014082248744-pct00042
mPEG30k - 디올의 합성. PEG30000 모노(메틸 에테르) (30 g, 1 mmol)를 85℃로 가열하면서, 그 시간 동안 물 (0.040 mL), 에피클로로히드린 (0.89 mL, 11.35 mmol) 및 NaOH (0.454 g, 11.35 mmol), 그리고 이어서 트리에틸암모늄 히드로클로라이드 (0.013 g, 0.091 mmol)를 첨가하였다. 생성 용융물/현탁액을 그 온도에서 10분 동안, 95℃에서 30분 동안, 105℃에서 2.5시간 동안, 그리고 이후에 95℃에서 추가 1시간 동안 교반하였다. 다음에, 반응액을 실온으로 냉각하였다. 0.5 M H2SO4 (100 mL)를 첨가하고, 반응액을 실온에서 추가 18시간 동안 교반하였다. 생성물을 CH2Cl2 (2×150 mL)로 추출하였다. 진공에서 CH2Cl2를 제거하고 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 생성 오일을 THF (150 mL)/헥산 (75 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 17.91 g (이론적 질량의 60%)의 원하는 생성물을 백색의 고체로서 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 다음 단계로 전달하였다.
Figure 112014082248744-pct00043
mPEG30k -알데히드의 합성. mPEG30k-디올 (17.0 g, 0.565 mmol)을 물 (50 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 ~30분 동안 교반하였다. 이 혼탁 용액에, 물 (10 mL) 중에 사전-용해된 NaIO4 (0.147 g, 0.69 mmol)의 용액을 한번에 첨가하였다. 산화제 첨가 ~45분 후, 혼탁도가 투명해졌다. 다음에, 반응액을 18시간 동안 교반하고, 프로필렌 글리콜 (0.0165 mL)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 이 반응 혼합물을 추가 1시간 동안 교반하였다. 다음에, 수성 반응 혼합물을 CH2Cl2 (2×100 mL)로 추출하였다. 유기물질을 합쳐, 진공에서 CH2Cl2를 제거하고 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 생성된 황색 오일을 THF/헥산 (150 mL:75 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 15.08 g (이론적 질량의 89%)의 원하는 생성물을 백색의 고체로서 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 다음 단계로 전달하였다.
Figure 112014082248744-pct00044
디벤질 -α HmPP30k 의 합성. mPEG30k-알데히드 (14.27 g, 0.475 mmol)를 CH2Cl2 (50 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸 아민 (0.132 mL, 0.95 mmol)을 첨가한 후, ~30분 동안 교반시켰다. 이후, 디벤질 포스파이트 (0.249 g, 0.95 mmol)를 천천히 첨가하였다. 실온에서 72시간 동안 교반한 후, 진공에서 용매를 제거하고 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 생성 오일을 THF/헥산 (200 mL:100 mL)으로부터 재결정화함으로써 (THF를 첨가하고, 가열한 다음, 헥산을 첨가하고, 혼탁도가 투명해질 때까지 ~30초 교반), 14.03 g (이론적 질량의 97%)의 원하는 생성물을 백색의 고체로서 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 다음 단계로 전달하였다.
Figure 112014082248744-pct00045
α HmPP30k 의 합성. 디벤질-αHmPP30k (10.6 g, 0.35 mmol)를 무수 에탄올 (100 mL)에 현탁시키고, 완전히 용해될 때까지 40℃에서 가열하였다. 10% 탄소상 Pd (0.4 g)를 천천히 첨가하였다. 다음에, 반응액을 H2 분위기하에 (풍선 압력) 40℃에서 흡수가 완료될 때까지 교반하였다. 셀라이트 패드를 통한 여과를 통하여 탄소상 Pd를 제거하고, 진공에서 여과액으로부터 용매를 제거함으로써 (무수까지는 아님 - 농후한 오일까지만), 9.22 g (이론적 질량의 88%)의 원하는 생성물을 백색의 고체로서 수득하였다.
실시예 6: 나노입자 조성물의 합성 (α HmPP5k SPIO )
9.177 g의 αHmPP5k 리간드를 자석 교반 막대가 들어 있는 1 L 에를렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크에 칭량 투입하였다. 8.955 ml의 NaOH 용액 (0.2 M)을 104 ml의 탈이온수 및 무수 EtOH (200 mL)와 함께 첨가하였다. 플라스크를 시계 접시로 덮고, 자석 교반에 의해 교반하면서, 투명한 무색의 용액이 수득될 때까지 약하게 가열하였다. 상기 용액을 기계식 교반기, 테플론 앵커 아지테이터(agitator), 열전쌍, 질소 유입구 및 버블러, 그리고 환류 응축기가 구비된 2 L 자켓구비 반응기에 첨가하였다. 상기 플라스크를 무수 EtOH (2×25 mL)로 세정하고, 세정액을 반응기에 첨가하였다. 투명한 무색 용액을 100 rpm으로 교반하였다. 330.6 ml의 벤질 알콜 중 산화 철 나노입자 코어 용액 (6.05 g Fe/ml)을 분말 깔때기를 통해 염기 세척되고 DI수 세정되었으며 오븐 건조된 눈금 실린더를 통하여 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 눈금 실린더를 무수 EtOH (2×25 mL)로 세정하고, 세정액을 반응기에 첨가하였다. 단일 상의 짙은 적갈색 용액이 관찰되었다. 교반 속도를 200 rpm으로 증가시키고, 반응기를 마개로 막은 후, 질소하에 교반하면서 50℃ (내부 온도)에서 18시간 동안 가열하였다. 18시간 동안 가열한 후, 반응기를 25℃로 냉각하였다. EtOAc (660 mL) 및 탈이온수 (320 mL)를 반응기에 첨가하고, 혼합을 강화하기 위하여 배플(baffle)을 삽입하였다. 반응 혼합물을 500 rpm으로 10분 동안 교반하였다. 교반을 중지하고, 상을 분리시켰다. 혼탁 혼합물은 < 10분 이내에 상분리되기 시작하였고, 투명 상 분리는 ~30분 후에 관찰되었다. 247 그램의 짙은 적갈색 용액으로 구성되는 저부 수성 상 (SPIO 입자 함유)을 반응기로부터 2 L 24/40 둥근 바닥 플라스크로 배수하였다. 용액을 물을 사용하여 800 mL로 희석하고 (이론상 ~2.5 mg Fe/mL), 잠시 회전 증발시켜 모든 잔류 휘발성 유기물질을 제거하였다. 다음에, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛), 50K PES 밀리포어(Millipore) 0.1 m2 막을 사용한 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 정제하였다. 보유물 저장소 내 부피를 2.5 L로 유지하면서, ~10 psi로 ~3시간에 걸쳐 24 L의 탈이온수를 사용하여 생성물을 세척하였다. 투과물이 1 리터 수집될 때마다, 투과물 및 보유물 샘플 (각각 ~5 mL)을 제거하였다. 세척이 완료되고 나면, 보유물을 ~120 그램 (~16 mg Fe/mL)으로 농축하였다. 동적 광 산란에 의해 150 mM 염화나트륨 용액 중에서 측정하였을 때, 최종 입자는 19.2 nm의 유체역학적 직경을 가졌다. 40℃로 인큐베이팅되는 150 mM 염화나트륨 용액 중에서 2일 후, 입자의 크기는 변화되지 않았다.
실시예 7: SPIO 나노입자 콜로이드 현탁액의 특성화
접선 유동 여과의 결과로 수득된 콜로이드 현탁액을 안정성 및 제타 전위에 대하여 평가하였다.
현탁 매질로서의 150 mM 수 중 NaCl을 사용한 동적 광 산란 (DLS)을 통하여 유체역학적 직경 (DH)을 측정하였다. 접선 유동 여과로부터의 정제된 SPIO 현탁액을 150 mM 수 중 NaCl에 희석하고, 브루크하벤 제타팔스(Brookhaven ZetaPALS)를 사용한 DLS 분석 전에 200 nm 필터로 통과시켜 먼지를 제거하였다. 희석은 DLS 측정 동안 초 당 최소 20,000 카운트를 산출하도록 수행되었다. 측정은 개질 나노입자가 제조된 후 바로 이루어졌다. 저장 후 DH의 유의성 있는 증가는 나노입자가 응집되었다는 것, 및 그에 따라 해당 콜로이드 현탁액이 안정하지 않다는 표시가 되었다. 결과를 하기 표 1에 제시하였다.
Figure 112014082248744-pct00046
실시예 8
MRI 에 의한 생체 내에서의 간 신호 강도의 영상화. 동물과 관계된 모든 절차는 GE 글로벌 연구 협회 동물 관리 및 사용 위원회(GE Global Research Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜하에 완료되었다. 산화 철 나노입자 시험용 작용제의 주사 전, 및 이어서 주사 후 다양한 시점 (예컨대 1, 2, 5, 7, 21, 28일차...)에 화상 데이터를 수집하였다. 시험용 작용제는 ~150 g 암컷 루이스(Lewis) 래트 (찰스 리버 래보래토리즈(Charles River Laboratories) 사, 매사추세츠 윌밍턴 소재)의 외측 꼬리 정맥에 위치된 카테터를 통하여 주사되었는데, 재료상 한계로 인하여 3 mg Fe/kg으로 투여된 PEG-30,000 α-히드록시 포스포네이트 코팅 작용제를 제외하고는, 5 mg Fe/kg 체중으로 투여되었다. 카테터는 주사 후 식염수로 플러싱하였다.
영상화는 맞춤형 제조 ~6 cm 솔레노이드 리시브 RF 코일을 사용하는 임상용 1.5 T GE 시그나(Signa) 스캐너에서 수행하였다. 영상화를 준비하기 위하여, 래트를 산소 중 3% 이소플루란이 충전된 유도 챔버 내에 위치시킴으로써 마취시켰다. 다음에, 준비된 동물을 RF 코일 내에 넣고, 스캐너의 보어 내에 위치시킨 후, 노즈 콘(nose cone)을 통하여 2-3% 이소플루란으로 유지하였다.
12개 에코 시간(echo time)에서의 영상 수집을 가능케 하는 3D 속성 구배 에코 펄스 시퀀스(fast gradient echo pulse sequence)를 사용하였다. 간이 횡축 슬랩(slab) 내의 중심에 오고 슬랩 당 12개 영상이 수집되도록, 그래픽 명령 인터페이스(graphical prescription interface)를 통하여 영상화 슬랩을 위치시켰다. 펄스 시퀀스 파라미터들은 하기와 같았다: 펄스 시퀀스: 3D ME fGRE; TE: 2.7 내지 55.2 ms 범위, 4.7 ms 간격; TR: 146.8 ms; 플립 각도: 25 도; 밴드폭: 12.5 MHz; 매트릭스: 192×160; NEX: 1; 슬라이스 두께: 1.1 mm; 슬라이스간 간격: 1.1 mm; 시야: 9 cm, 0.35×0.35×1.1의 복셀 크기 산출. 시퀀스 획득 시간은 ~2분이었다.
영상화 데이터 세트는 IDL 플랫폼 (IDL v. 6.3, ITT Corp. 사, 콜로라도 불더 소재)에서 구축된 맞춤 소프트웨어 도구 (시네툴(CineTool) v8.0.2, GE 헬스케어(Healthcare) 사)를 사용하여 분석하였다. 간단하게 말하자면, 영상 분석 도구는 각 시리즈의 간-함유 슬라이스에서의 관심 3D 영역 (ROI)의 수동 도시와 그에 따른 도시된 ROI 내 각 복셀에 대한 지수 회귀에 의한 T2* 시간 상수의 계산을 가능케 하였다. 가변적인 PEG 분자량을 가지는 α-히드록시 포스포네이트-PEG 코팅 산화 철 나노입자들에 대하여, 그와 같이 측정된 T2*의 역으로 계산되는 간 R2* 값을 도 1 및 2에 플로팅하였다.
도 1은 α-히드록시포스포네이트-PEG 코팅 산화 철 나노입자 5 mg Fe/kg의 정맥내 주사 후 장기간 생존하는 래트를 MR 영상화하는 것을 통하여 측정된 간에서의 R2* 이완율을 나타낸다. R2* 신호의 시간 경과에 따른 손실로 반영되는 간에서의 입자 처리 속도는 코팅 리간드의 PEG 사슬 길이에 대한 의존성을 나타낸다. 5000 달톤 MW PEG 코팅의 경우, 간 신호 붕괴가 단일-지수적이며 빨라서, 대략 1주 이내에 기준선으로 복귀된다. 반면, 더 낮은 MW의 PEG (2000 달톤 이하)로 코팅된 입자는 간 신호가 여러 달 동안 가변적인 농도로 상승된 채 유지됨으로써 (평균 ± SD, n ≥ 3), 2단계 붕괴를 나타낸다.
더 높은 MW의 PEG (5000 달톤 이상)로 코팅된 입자의 간에서의 간 R2* 이완율 프로필을 도 2에 나타내었다. x-축은 도 1의 것에서 확대된 것으로써, 각각 MW 5000, 10,000 및 30,000 달톤의 PEG로 코팅된 3종의 상이한 입자가 기준선을 향해 빠르고 단일-지수적인 경사를 나타내는 유사한 프로필을 나타낸다는 것을 보여준다. 참조를 위하여, 2000 달톤 PEG-코팅된 입자도 나타내었다.
개시된 α-히드록시포스폰산-PEG-개질 나노입자의 향상된 간 처리성 특성으로 인하여, 개질된 나노입자는 철분 결핍의 치료를 위한 보충 철분 공급원으로서도 유용하다.
본원에서는 본 발명의 소정 특징들만이 예시 및 기술되었지만, 업계 숙련자라면 많은 변형 및 변화들이 떠오를 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위로써 그와 같은 모든 변형 및 변화들을 본 발명의 진정한 기술사상에 속하는 것으로 포괄하고자 한다는 것이 이해되어야 한다.

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  15. 알파-히드록시 포스포네이트 잔기가 부착되어 있으며 상기 알파-히드록시 포스포네이트 잔기가 하기 화학식 I의 구조를 가지는 나노입자; 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 포유동물 대상체에의 투여에 적합한, 진단 영상화용 조성물:
    <화학식 I>
    Figure 112019071892618-pct00059

    (식 중, S는 스페이서이며, L은 S와 R 사이의 연결부이고, R은 폴리(에틸렌 글리콜)이며, Z는 PEG 사슬 ω 말단의 알콕시 또는 히드록시 캡이고, o = 0 또는 1이며, 상기 PEG는 5,000 달톤 초과 내지 30,000 달톤 이하의 분자량을 가짐).
  16. 제15항에 있어서, 알파-히드록시 포스포네이트 잔기가 하기 화학식 II의 구조를 가지는 조성물:
    <화학식 II>
    Figure 112019048303798-pct00060

    (식 중, n = 1 또는 2이며, p는 114-681임).
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, S가 직접 결합, 비치환 또는 치환 지방족 또는 고리지방족 기, 헤테로지방족 기 또는 이들의 조합인 조성물.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, L이 직접 결합, 카르보닐 기, 에테르 기, 아미드 기, 에스테르 기, 카르바메이트 기, 우레아 기 또는 이들의 조합인 조성물.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 나노입자가 MRI 조영제로서 사용하기에 적합한 조성물.
  20. 제15항 또는 제16항에 있어서, 나노입자가 초상자성 산화 철을 포함하는 조성물.
  21. 제15항 또는 제16항에 있어서, 나노입자가 동적 광 산란에 의해 측정하였을 때 150 mM NaCl 수 중에서 15 nm 내지 100 nm 사이의 평균 유체역학적 입자 크기 (DH)를 가지는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 나노입자가 동적 광 산란에 의해 측정하였을 때 150 mM NaCl 수 중에서 15 nm 내지 50 nm 사이의 평균 유체역학적 입자 크기 (DH)를 가지는 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 나노입자가 20 nm 내지 30 nm 사이의 평균 DH를 가지는 조성물.
  24. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 나노입자가 접선 유동 여과 및 실온에서의 1주일 동안의 저장 후 150 mM NaCl 수 중에서 동적 광 산란에 의해 측정하였을 때 유체역학적 직경 (DH)의 변화를 나타내지 않는 안정한 수성 콜로이드 현탁액을 형성하기에 충분하게 친수성인 조성물.
  25. 제15항 또는 제16항에 있어서, 담체가 등장성 수성 매질인 조성물.
  26. 제15항 또는 제16항에 있어서, 담체가 생리학적 pH인 조성물.
  27. 하기 화학식 I의 구조를 가지는 α-히드록시포스포네이트 잔기가 부착된 산화 철 나노입자를 포함하는, 진단 영상화용 PEG-치환 알파-히드록시 포스포네이트 코팅 나노입자 조성물:
    <화학식 I>
    Figure 112019048303798-pct00061

    (식 중, S는 스페이서이며, L은 S와 R 사이의 연결부이고, R은 폴리(에틸렌 글리콜)이며, Z는 PEG 사슬 ω 말단의 알콕시 또는 히드록시 캡이고, o = 0 또는 1이며, 여기서 상기 PEG는 5,000 달톤 초과 내지 30,000 달톤 이하의 분자량을 가짐).
  28. 제27항에 있어서, α-히드록시 포스포네이트 잔기가 하기 화학식 II의 구조를 가지는 조성물:
    <화학식 II>
    Figure 112019048303798-pct00062

    (식 중, n = 1 또는 2이며, p는 114-681임).
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 대상체에게 투여 시 나노입자 조성물이 조영제로서 작용하는 것인 조성물.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 나노입자가 흡입 또는 섭취에 의해 투여되는 것인 조성물.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 나노입자가 비경구로 투여되는 것인 조성물.
  32. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 나노입자가 주사 또는 주입에 의해 투여되는 것인 조성물.
  33. 제27항 또는 제28항에 있어서, 나노입자가 대상체에 이식되는 것인 조성물.
  34. 제27항 또는 제28항에 있어서, 영상화가 자기 공명 (MR)에 의한 것인 조성물.
  35. α-히드록시포스포네이트 잔기가 부착된 산화 철 코어를 가지는 나노입자를 포함하고, 상기 α-히드록시 포스포네이트 잔기는 하기 화학식 I의 구조를 가지는, 철분 결핍 치료용 PEG-치환 알파-히드록시 포스포네이트 코팅 나노입자 조성물:
    <화학식 I>
    Figure 112019048303798-pct00063

    (식 중, S는 스페이서이며, L은 S와 R 사이의 연결부이고, R은 폴리(에틸렌 글리콜)이며, Z는 PEG 사슬 ω 말단의 알콕시 또는 히드록시 캡이고, o = 0 또는 1이며, 여기서 상기 PEG는 5,000 달톤 초과 내지 30,000 달톤 이하의 분자량을 가짐).
  36. 제35항에 있어서, α-히드록시포스포네이트 잔기가 하기 화학식 II의 구조를 가지는 조성물:
    <화학식 II>
    Figure 112019048303798-pct00064

    (식 중, n = 1 또는 2이며, p는 114-681임).
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 대상체에게 투여 시 나노입자 조성물이 생체이용가능 철분의 공급원으로 작용하는 것인 조성물.
  38. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 나노입자가 비경구로 투여되는 것인 조성물.
  39. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 나노입자가 주사에 의해 투여되는 것인 조성물.
  40. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 나노입자가 주입에 의해 투여되는 것인 조성물.
  41. 제35항 또는 제36항에 있어서, 나노입자가 대상체에 이식되는 것인 조성물.
  42. 제35항 또는 제36항에 있어서, 나노입자가 섭취에 의해 투여되는 것인 조성물.
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