JP2015508796A - ＰＥＧ置換α−ヒドロキシホスホネート外殻を有する超常磁性ナノ粒子 - Google Patents

ＰＥＧ置換α−ヒドロキシホスホネート外殻を有する超常磁性ナノ粒子 Download PDF

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Abstract

本発明は、鉄治療、磁気共鳴（ＭＲ）などの画像診断で有用性を見出すナノ粒子、特に超常磁性酸化鉄のナノ粒子を開示する。本発明のナノ粒子は、親水性の部分としてポリエチレングリコールを含むα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートで処理してナノ粒子を画像診断で有用性を見出すのに十分に親水性にする。修飾親水性ナノ粒子の中で、修飾するコンジュゲートの親水性の部分が、ポリエチレンオキサイド系ポリマーであり、５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下の分子量をもつものを開示する。驚くべきことに、これらのナノ粒子は、ＰＦＧベースの親水性の部分が５０００Ｄａ未満の分子量をもつ類似ナノ粒子に比べた場合、残留ナノ粒子の肝臓中での処理がより迅速で完全である。【選択図】図１

Description

本発明は一般に、安定な水性懸濁液を形成するのにα−ヒドロキシホスホン酸誘導体で処理して十分に親水性にしたナノ粒子、特に遷移金属酸化物を基材としたナノ粒子に関する。修飾ナノ粒子は、親水性を必要とする用途、具体的には、治療薬、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などによる画像診断での造影剤としての使用に有効である。
ある用途、例えば、造影剤又は治療薬として用いる場合、ナノ粒子は、明確に定義された再現可能な構造を有し、安全性試験に適していることも望ましい。したがって、精製により親水性を低減せずに、電解質を含有する水媒体中で懸濁安定性を示す親水性ナノ粒子が必要とされている。例えば、ヒト被験体で生体内使用するための造影剤の製造において、候補ナノ粒子は、典型的に精製を施し、等張性水媒体、即ち約１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する媒体中で懸濁安定性を示すことが期待される。ナノ粒子の親水性及び生理食塩水中での安定性を向上する研究は、分子量が約５０００Ｄａ以下のα−ヒドロキシホスホン酸−ＰＥＧコンジュゲートで遷移金属酸化物粒子を被覆することによってある程度成功している。
現在までに、これらの修飾粒子の生体内挙動に関して得られている情報はほとんどない。特に、画像診断で用いるためにナノ粒子が開発される場合、或いは治療薬としての使用が想定される場合、体内での残留時間に関するパラメーターを考慮することが重要である。未処理酸化鉄ナノ粒子からの残留ＭＲシグナルは強いＭＲシグナルを保ち、これは、臨床ワークフローでこの薬剤の繰り返し投与が必要な場合は望ましくない。その点で、本発明の修飾ナノ粒子は、安定性が向上するにもかかわらず、肝臓などでの処理に優れている。
国際公開第２０１１／０５１４２２号
α−ヒドロキシホスホン酸系の被覆材料のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量の増大によって、得られる超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子が一段と安定なプロファイル及び長い血液半減期へとシフトすることは従前認められている。しかるに、予想外な知見として、血液及び血清中の安定性が増すにもかかわらず、ＰＥＧの分子量が５０００超であるα−ヒドロキシホスホン酸−ＰＥＧコンジュゲートを含むＳＰＩＯは、滞留用量の肝臓処理がより迅速であるという知見が得られたことである。したがって、本発明は、約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下の分子量のＰＥＧを含むα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートで被覆したＳＰＩＯに関する。一実施形態では、例えば、５０００Ｄａ超の分子量のＰＥＧを含むコンジュゲートは、驚くべきことに、５０００Ｄａ未満の分子量のＰＦＧを含む同様の被覆材料に比べて肝臓処理がより迅速で完全である。
したがって、ある態様では、本発明は、α−ヒドロキシホスホネート部分が付着した酸化鉄コアを有するナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、α−ヒドロキシホスホネート部分が式Ｉの構造を有する組成物に関する。
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲの間の連結部であり、Ｒはポリ（エチレングリコール）であり、ＺはＰＥＧ鎖のω末端のアルコキシ又はヒドロキシ末端封鎖基であり、ＰＥＧの分子量は約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下であり、ｏ＝０又は１である。
ある実施形態では、Ｓは、直接結合、置換又は非置換の脂肪族又は脂環式基、ヘテロ脂肪族基、場合によっては、炭素原子数１〜１０の鎖長の直鎖アルキル基であり、Ｌは、直接結合、カルボニル基、エーテル基、エステル基、第２級又は第３級アミン、第４級アミン基、アミド基、カルバメート基又は尿素基である。
コンジュゲートが、ヒト組織と望ましくない反応をするであろう基又は部分を含まないことが特に重要である。したがって、コンジュゲートが、ナノ粒子に付着したときに約−４０ｍＶ〜４０ｍＶ、好ましくは約−１５ｍＶ〜１５ｍＶのゼータ電位を示すことが好都合であり、付着したときに本質的に中性のゼータ電位を示すことが特に興味深い。
また、ヒト被験体で生体内使用するためにナノ粒子を処理するのに用いるコンジュゲートでは、α−ヒドロキシホスホン酸とＰＥＧ間の結合が、炭化水素、即ち構造Ｉで、Ｓは単結合であることが好都合である。
さらに、本発明はＰＥＧ置換α−ヒドロキシホスホネート被覆ナノ粒子を用いた画像診断の方法に関しており、本方法は、ナノ粒子組成物が予め投与されている個体をイメージングに付す工程を含み、ナノ粒子組成物がα−ヒドロキシホスホネート部分が付着した酸化鉄ナノ粒子を含有し、α−ヒドロキシホスホネート部分が式Ｉの構造を有する。
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲの間の連結部であり、Ｒはポリ（エチレングリコール）であり、ＺはＰＥＧ鎖のω末端のアルコキシ又はヒドロキシ末端封鎖基であり、ｏ＝０又は１であり、ＰＥＧの分子量は約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下である。
また別の観点では、本発明は、ＰＥＧ置換α−ヒドロキシホスホネート被覆ナノ粒子を用いて鉄欠乏症を処置する方法に関しており、本方法は、α−ヒドロキシホスホネート部分が付着した酸化鉄コアを有するナノ粒子を含むナノ粒子組成物を個体に投与する工程を含み、α−ヒドロキシホスホネート部分が式Ｉの構造を有する。
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲの間の連結部であり、Ｒはポリ（エチレングリコール）であり、ＺはＰＥＧ鎖のω末端のアルコキシ又はヒドロキシ末端封鎖基であり、ＰＥＧの分子量は約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下であり、ｏ＝０又は１である。
α−ヒドロキシホスホン酸−ＰＥＧコンジュゲートは十分に親水性であり、これを用いてＦｅ１原子当たり約０．０４〜約２．０のコンジュゲートの比でナノ粒子を処理した場合、該コンジュゲートが、ナノ粒子を水媒体中でＤＬＳによって求めたＤHが、約１５〜１００ｎｍ、ある実施形態では、約１５〜５０ｎｍ、また別の実施形態では、約２０〜約３０ｎｍである安定なコロイド懸濁液を形成できるようにさせることが好ましい。等体積のｎ−オクタノールと０．１Ｍの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）バッファー（ｐＨ７．０）の間の分配係数の対数が１未満の値を示すように、コンジュゲートが、このように処理したナノ粒子を十分に親水性にすることが特に好都合である。
α−ヒドロキシホスホン酸−ＰＥＧコンジュゲートの適用によって修飾されるナノ粒子コアは、遷移金属及び遷移金属化合物、例えば酸化物、炭化物、硫化物、窒化物、リン化物、ホウ化物、ハロゲン化物、セレン化物、テルル化物及びこれらの化合物を基材とするものであることが好ましい。酸化物は、特に有利である。遷移金属化合物は、磁気共鳴（ＭＲ）イメージング用の造影剤を形成するのに有用である。元素周期表の第３周期の遷移金属は、常磁性、好都合なことには超常磁性を示し、したがってＭＲＩ造影剤として有効である化合物を形成するのに有用である。特に、酸化鉄を基材とする超常磁性ナノ粒子が好都合である。これらは、普通、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）粒子と呼ばれ、ＳＰＩＯナノ粒子の製造の方法は当業者に既知である（例えば、Ｌｏｄｈｉａ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ＭＲＩ． Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ，６（２）：ｅ１２，２０１０参照）。
親水性修飾ナノ粒子は典型的に、ＤＬＳによって求めたＤHが、約１５ｎｍ〜１００ｎｍであり、ある実施形態では、１５〜５０ｎｍであり、また別の実施形態では、約２０ｎｍ〜約３０ｎｍである。親水性修飾ナノ粒子がヒト被験体で、例えば、ＭＲＩ造影剤として生体内で使用する場合、ＤHが約３０ｎｍ未満であることが特に好都合である。
一実施形態では、親水性修飾ナノ粒子は、ナノ粒子とコンジュゲートを反応させることによって製造される。１つの方法は、ベンジルアルコール（ＢｎＯＨ）などの有機溶剤中におけるナノ粒子のコロイド懸濁液を形成し、その後、これをコンジュゲートの有機溶剤と同じ又は異なる有機溶液中で混合する方法である。その後、反応が本質的に完了するまで、混合物を長時間高温に保つことができる。典型的に、温度５０℃以上で１６時間以上が好都合である。
親水性修飾ナノ粒子の安定な単分散水性コロイド懸濁液は容易に得られる。このような懸濁液は、濾過、例えば３０ｋＤａ分画に対するタンジェンシャルフロー濾過及び電解質の添加、例えば水媒体を等張性にするＮａＣｌ、即ち約１５０ｍＭのＮａＣｌの添加に対して安定であることが好ましい。懸濁液は、１週間以上の期間の保存に安定であり、より好ましくは沈降だけでなく、ＤＬＳによって求める懸濁したナノ粒子のＤHの増大に対しても安定であることが好ましい。懸濁液がヒト被験体での生体内使用のためのものである場合、ＮａＣｌ、デキストロース又は当業界で既知の他の等張化調整剤又はこれらの組合せの添加によってそれらを等張性にすることが好都合である。
親水性修飾ナノ粒子は、治療薬又は画像診断での造影剤として好都合に使用できる。一般の種類の画像診断には磁気共鳴（ＭＲ）イメージングがある。鉄サプリメントとしての親水性修飾ナノ粒子の治療上の投与、例えば鉄欠乏症の処置のための投与も想定する。
治療又はイメージングのどちらでも、ゼータ電位が約−１５ｍＶ〜１５ｍＶの親水性修飾ナノ粒子を用いることが好都合である。親水性修飾ナノ粒子のヒト被験体への投与の簡便な方法は、ナノ粒子を静脈内に好ましくは安定な等張性の水性懸濁液として投与することである。ＭＲイメージングのために使用する場合、ナノ粒子は常磁性、好ましくは超常磁性種を含有し、最も好ましくはそれらが、磁鉄鉱、磁赤鉄鉱などの酸化鉄を基材とするものである。
本発明の上記その他の特徴、観点及び効果を一層良く理解できるように、以下に添付の図面を参照しながら本発明を詳細に説明する。
様々な平均分子量、例えば３５０、４４０、７５０、２０００及び５０００ＤａのＰＥＧを含む親水性修飾ナノ粒子を比較する肝クリアランス実験の結果を示すグラフである。 平均分子量２０００、５０００、１００００及び３００００ＤａのＰＥＧを含む親水性修飾ナノ粒子を比較する肝クリアランス実験の結果を示すグラフである。
下記の説明において、特記しない限り、用いる用語の解釈は、これらの用語の通常の意味と矛盾しないものとする。
本発明のコンジュゲートは多種多様の結合をもつことができる。重要な特徴は、コンジュゲートが化学的、立体的にアクセス可能である３つのヒドロキシル基をα−ヒドロキシホスホン酸に有することである。構造はキラル中心を有するが、個々のエナンチオマー及び可能性のあるラセミ混合物のすべてが、水に溶けないナノ粒子に親水性を付与するのに適当であることが期待される。
これらのコンジュゲートは、α−ヒドロキシホスホン酸構造とＰＥＧ間に一般に知られている化学結合、例えば炭素、窒素、酸素及び硫黄をベースとするものをもつことができる。特に有利な基は、炭化水素、カルボニル、エステル、エーテル、第２級又は第３級アミン、第４級アミン、尿素、カルバメート及びアミドである。コンジュゲートと処理されるナノ粒子の意図した最終用途が結合基の選択に影響を与えることがある。例えば、ナノ粒子を生体内、特にヒト被験体で用いる場合、不活性の観点から最も興味深い結合基は炭化水素である。
本発明のコンジュゲートは、約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下の平均分子量をもつポリ（エチレンオキサイド／グリコール）を含むエチレンオキサイドをベースとするものである。
ここでポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の分子量について言及する場合、開示した値は化合物の平均分子量を示し、その化合物の標品は、分子量において平均およそ１０〜２８％異なる化学種を含有してもよい。例えば、製造業者によって示されるように、ＰＥＧ３３５０の標品は３３５０Ｄａの平均分子量をもち、標品中の分子種は３０００〜３７５０の分子量をもつ。用いたＰＥＧ５０００材料のスペクトル分析は、約４０００〜６４００Ｄａのサイズ範囲を示し、平均がおよそ５０００Ｄａであった。
ある実施形態では、ナノ粒子は、式ＩＩの構造をもつＰＥＧ−α−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートで処理される。
式中、ｎ＝１又は２及びｐは１１４〜６８１である。
ある実施形態では、コンジュゲートは、まず、以下の合成スキームにしたがってα−ヒドロキシホスホン酸を製造することにより形成される。
別の実施形態では、コンジュゲートは、以下の合成スキームにしたがって形成される。
コンジュゲートは十分に親水性であり、ナノ粒子の金属主成分あたり約０．０４〜２．０等量のコンジュゲートの比でコンジュゲートをナノ粒子と反応させたとき、コンジュゲートがナノ粒子を安定な水性懸濁液を形成できるようにさせることが好ましい。ナノ粒子は典型的に遷移金属化合物、例えば酸化物又は遷移金属自体を基材とする。元素金属のモルを用いて反応比を特定することが好都合である。これは、有機溶剤中におけるナノ粒子の出発懸濁液の元素分析から容易に得ることができるからである。ナノ粒子の化学組成及び処理前の平均サイズの知見から、ナノ粒子あたりのコンジュゲートの量の概算を行うことができる。コンジュゲートが、１５ｎｍ〜１００ｎｍ、ある実施形態では、１５ｎｍ〜５０ｎｍ、また別の実施形態では、約２０〜約３０ｎｍの被覆された酸化鉄のナノ粒子を提供するのに十分に親水性であり、等体積のｎ−オクタノールと０．１ＭのＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．０）間の分配係数の対数が１未満の値を示すのに十分に親水性である粒子を与えることが特に好都合である。
α−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートを付着した修飾親水性ナノ粒子が、タンジェンシャルフロー濾過後に、動的光散乱法（ＤＬＳ）により１５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液中で求めた流体力学的半径（ＤH）に実質的変化のない安定な水性コロイド懸濁液を形成するのに十分に親水性であることが特に有利である。コンジュゲートで処理されるナノ粒子は、１００ｎｍ以下の粒子に成形することができ、コンジュゲートのα−ヒドロキシホスホン酸部位が付着する、水に溶けない任意の材料とすることができる。磁気共鳴画像法での造影剤として有用性のあるナノ粒子を使用することが有利である。さらに、治療的方法での本発明のナノ粒子の使用も想定される。しかし、遺伝子のトランスフェクションのための細胞培養の注入などの他の最終用途のためのナノ粒子も重要である。
ＭＲＩ造影剤として使用する場合、ナノ粒子の基材は、常磁性である金属又は金属化合物でなければならなく、超常磁性のものが特に有利である。これらの金属は、元素周期表の第３周期のマンガンから亜鉛までの遷移金属から選ぶことが好都合である。治療並びにイメージングで用いる場合、特に興味深い材料の群は、酸化鉄を基材とするものである。特に、好都合な材料はＳＰＩＯとして知られるものである。これらの材料は一般式［Ｆｅ2 +Ｏ3］x［Ｆｅ2 +Ｏ3（Ｍ2+Ｏ）］1-xで表される（式中１・ｘ・０）。Ｍ2+は２価金属イオン、例えば鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、マグネシウム、銅、亜鉛又はこれらの組合せとすることができる。金属イオン（Ｍ2+）が第一鉄イオン（Ｆｅ2+）及びｘ＝０の場合、材料は、磁鉄鉱（Ｆｅ3Ｏ4）であり、ｘ＝１である場合、材料は磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ2Ｏ3）である。
一般に、不対スピンの結晶含有領域が十分に大きく、それらが磁区と呼ばれる熱力学的に独立な単磁区粒子とみなすことができる場合、超常磁性は起こる。これらの磁区は、その独立した不対電子の和より大きい正味の磁気双極子を示す。磁場をかけていない場合、すべての磁区は、不規則に配向し、正味の磁化がない。外部磁場をかけることにより、すべての磁区で双極子モーメントを再配向させ、結果として正味の磁気モーメントを生じる。ある実施形態では、これらの材料は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析によって示されるスピネル結晶構造を示す。
α−ヒドロキシホスホン酸が付着した修飾親水性ナノ粒子は治療薬又は画像診断での造影剤として使うことができる。イメージング用途において、修飾ナノ粒子を被験体、ある実施形態では、哺乳類被験体に投与し、その後、被験体にイメージングを施す。治療上の用途では、修飾ナノ粒子を被験体に投与して、例えば、鉄欠乏症に対処する。
特に哺乳類被験体、さらに特定するとヒト被験体の画像診断に用いる場合、α−ヒドロキシホスホン酸が付着した修飾親水性ナノ粒子は典型的に、１つ又は２つ以上の賦形剤を含有してもしなくてもよい薬学的に許容されるキャリアに取り込まれる。投与が注射、特に非経口注射による場合、キャリアは典型的に、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のデキストロース又はこれらの組合せを添加することによって等張性にした水媒体である。それは典型的に約７．３〜７．４の生理的ｐＨも有する。投与は、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＱ）又は最も一般的には静脈（ＩＶ）にすることができる。しかし、投与は、ナノ粒子を被験体の血液又は組織にゆっくり放出するデポの埋め込みによるものにすることもある。
または、投与は、胃腸管のイメージングのため又は治療上鉄用量の経口デリバリーのための経口摂取又は肺及び気道のイメージングのための吸入によるものにできる。
ヒト被験体への投与、特にＩＶ投与では、α−ヒドロキシホスホン酸が付着した修飾親水性ナノ粒子は、使用する量で無毒であり、バクテリア、ウィルスなどの感染体が存在せず、発熱物質も存在しないことが要求される。したがって、これらのナノ粒子は、必要な精製手順に対して安定であり、それらの親水性を低下しないことが必要である。
これらのナノ粒子は、適切な浸透圧及びｐＨをもつ安定な水性コロイド懸濁液として、希釈及び調節に適当な濃縮水性コロイド懸濁液として又は例えば凍結乾燥によって得られ、水を加えてもとに戻すのに適当な粉末として、投与のサイトに運ぶことができる。
したがって、本発明はさらに、ここで開示したナノ粒子を用いて被験体をイメージングする方法に関する。このような方法は、ナノ粒子組成物を投与した被験体に磁気共鳴などによってイメージングを施す工程を含み、被験体に投与した上記組成物はα−ヒドロキシホスホネート−ＰＥＧコンジュゲートを付着したナノ粒子を含有し、上記ＰＥＧの分子量は約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下である。
ＰＥＧ−α−ヒドロキシホスホン酸修飾超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＯ）を生成するためのこれまでの研究は、優れた親水性及び安定性をもつＳＰＩＯをもたらした。しかし、イメージングの実験では、肝臓中の残留ナノ粒子に起因するＭＲシグナルの「デュアルフェーズ」二重指数関数的（biexponential）減衰が観察された。
ナノ粒子を被覆するのに用いた親水性のコンジュゲートのＰＥＧ分子量の詳細な評価により肝臓処理特性がＰＥＧポリマーサイズに追従するようであるとわかった。図１及び図２に示すように、ＰＥＧの分子量が約５０００Ｄａ（ＰＥＧ５０００）超のＰＥＧ−α−ヒドロキシホスホン酸で修飾したこれらのナノ粒子は、ＰＥＧの分子量が約２０００Ｄａ（ＰＥＧ２０００）のそれらに比べて明らかにより迅速及び完全な肝臓処理プロファイルを有した。
同位体標識酸化鉄ナノ粒子を用いてＩＣＰ質量分析法により測定したとき（データは示さず）、ＰＥＧ２０００とＰＥＧ５０００ベースのＳＰＩＯナノ粒子間での鉄の肝臓取り込みにおいて注射後２４時間で有意な差は認められなかった。同様に、ＩＣＰ質量分析法により測定したとき（データは示さず）、少なくとも注射後８４日間まで肝臓中の外因性又は内因性鉄の量で有意な差は認められなかった。しかし、ＰＥＧ２０００及びＰＥＧ５０００ベースのＳＰＩＯナノ粒子に対してこれらの類似した組織鉄レベルであったのにもかかわらず、酸化鉄コアの肝臓中の処理のプロファイルでの差がＭＲイメージングによって明らかであった。ＰＥＧ５０００ベースＳＰＩＯナノ粒子は、分子量２０００Ｄａ以下のＰＥＧを有するコンジュゲートを含むＳＰＩＯナノ粒子で観察されたＭＲイメージングによって評価される遅いｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ型の低減をほとんど又は全く示さない。
本明細書では、具体例を挙げて、最良の形態を含む本発明を開示するとともに当業者が本発明を実施できるようにしている。本発明の要旨は、特許請求の範囲に規定された通りで、当業者が想起できる他の例を含むことができる。
実施例１：ＰＥＧ３５０コンジュゲートの合成
ＰＥＧ３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒドの合成
ＣＨ2Ｃｌ2（９８ｍＬ）にＰＥＧ３５０モノ（メチルエーテル）（３．４３８ｇ、９．８２ｍｍｏｌ）を溶解した溶液にデス・マーチン・ペルヨージナン（５．００ｇ、１１．７９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２０時間攪拌した。反応中、微細な白色沈殿物が形成し、これを反応終了時にセライトパッドで濾過することにより除去した。白色固体を黄色油状物に懸濁させたまま真空で濾液から溶剤を除去した。固体をジエチルエーテルで研和し、セライトパッドで濾過することにより固体を除去した。濾液から溶剤を真空で除去すると、生成物ＰＥＧ３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（３．４２ｇ、１００％）が黄色油状物として残った。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ９．７３（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），３．６５（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ
ＩＲ（原液）２８７３，１７３２，１４５５，１３５０，１１０９，１０４０，９４８，８５１，７４９ｃｍ-1。
ジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネートの合成
テトラヒドロフラン（５３ｍＬ）にＰＥＧ３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（３．７１ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に亜リン酸ジエチル（１．７７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を０℃に冷却し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１．９４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で１０分間攪拌後、反応を室温まで温め、さらに２４時間攪拌した。溶剤を真空で除去すると、暗黄色油状物が残り、これをカラムクロマトグラフィ（１００％ＣＨ2Ｃｌ2〜１５％ＭｅＯＨ／８５％ＣＨ2Ｃｌ2）により精製し、３．３０ｇ（６４％）の所望のジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネート生成物を黄色油状物として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ４．１９（ｍ，６Ｈ），３．６５（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），１．３４（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２３．１ ｐｐｍ
ＩＲ（原液）３３４３，２８７２，１７２５，１４５３，１２４８，１１０５，９６５，８５０，７９１ｃｍ-1。
α−ヒドロキシＰＥＧ３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸の合成
塩化メチレン（７４ｍＬ）にジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネート（３．６１ｇ、７．４３ｍｍｏｌ）を溶解した溶液にトリメチルシリルブロミド（３．４１ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２時間攪拌した。溶剤を真空で除去すると、茶色油状物が残った。得られた油状物をアセトン（７４ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で１．５時間攪拌した。その後、溶剤を真空で除去すると、所望のα−ヒドロキシＰＥＧ３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸生成物（２．６６ｇ、８４％）が金色油状物として残った。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．６５（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２４．０ ｐｐｍ
ＩＲ（原液）３４６０，２８７０，１７２７，１４５６，１３５１，９４５，８４９ｃｍ-1。
実施例２：ＰＥＧ１９００コンジュゲートの合成
ｍＰＥＧ２ｋ−エポキシドの合成
２Ｌのジャケット反応容器を窒素で浄化し、エピクロロヒドリン（２２２．９ｍＬ、２．８４３ｍｏｌ）、続いてＨ2Ｏ（１１．３７ｍＬ、０．６３１ｍｏｌ）を入れた。室温で１０分間攪拌後、ＮａＯＨ（１１３．７ｇ、２．８４３ｍｏｌ）を添加し、得られた反応スラリーを７２℃に加熱した。ＰＥＧ1900モノ（メチルエーテル）を反応に添加して、得られた融解物を７２℃で３時間攪拌した。その後、反応を３５℃に冷却し、Ｈ2Ｏ（７５０ｍＬ）を添加した。反応溶液が室温に達したら、水性反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（７５０ｍＬで２回）で抽出した。その後、合わせた有機層から真空で溶剤を除去して黄褐色／茶色固体を得た。この固体をＣＨ2Ｃｌ2（７５０ｍＬ）に溶解し、得られた濁った溶液をセライトパッドに通した。得られた透明なオレンジ色濾液から溶剤を真空で除去すると、ワックス状黄褐色の固体が残った。回収した固体を２：１（ＴＨＦ：ヘキサン）（粗生成物１ｇあたり１．３ｍＬのＴＨＦ）から２回再結晶して４３９．７ｇ（８５％）の所望の生成物をオフホワイト固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．７６（ｍ，２Ｈ），３．６０（ｍ，１８６Ｈ），３．３９（ｍ，２Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），２．７５（ｍ，１Ｈ），２．５７（ｍ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７２．１２，７２．０６，７０．８７，７０．７０，５９．１８，５０．９５，４４．３９。
ｍＰＥＧ２ｋ−ジオールの合成
ｍＰＥＧ２ｋ−エポキシド（１２５．０ｇ、６３．９ｍｍｏｌ）を０．５ＭのＨ2ＳＯ4（５００ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で１時間攪拌した。その後、反応溶液をＣＨ2Ｃｌ2（５００ｍＬで２回）で抽出した。その後、合わせた有機層から真空で溶剤を除去してワックス状黄褐色固体を得た。回収した固体を２：１（ＴＨＦ：ヘキサン）（粗生成物１ｇあたり０．８３ｍＬのＴＨＦ）から再結晶して１１５．８ｇ（９３％）の所望の生成物をオフホワイト粉末として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．７１（ｍ，２Ｈ），３．５３（ｍ，１８２Ｈ），３．３５（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７３．００，７２．０５，７０．８５，６４．０３，５９．１６。
ｍＰＥＧ２ｋ−アルデヒドの合成
ｍＰＥＧ２ｋ−ジオール（５．０ｇ、２．５３ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ（１４．７ｍＬ）に溶解し、反応溶液を６℃に冷却した。Ｈ2Ｏ（４．４２ｍＬ）にＮａＩＯ4（０．６５０ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）を溶解した溶液を３等分割して１０分間かけて添加した。得られた溶液を６℃で１時間攪拌した。１，２−プロパンジオール（０．１００ｍＬ、０．１３６ｍｍｏｌ）を添加し、反応を６℃でさらに１５分間攪拌した。その後、反応を室温まで温め、水性反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬで３回）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１５ｍＬ）で洗浄し、溶剤を真空で除去すると、４．５９ｇ（９３％）の所望の生成物がオフホワイトのワックス状固体として残った。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ９．６７（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｍ，２Ｈ），３．７６（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｍ，１７０Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ）。
ジベンジル−αＨｍＰＰ５ｋの合成
ｍＰＥＧ２ｋ−アルデヒド（７９．００ｇ、４０．７ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１３６．５ｍＬ）に溶解した。亜リン酸ジベンジル（８．９９ｍＬ、４０．７ｍｍｏｌ）、続いてトリエチルアミン（５．６５ｍＬ、４０．６８ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２０時間攪拌した後、反応混合物から溶剤を真空で除去すると、ワックス状黄色固体が残った。回収した固体を２：１（ＴＨＦ：ヘキサン）（粗生成物１ｇあたり２ｍＬのＴＨＦ）から再結晶して８１．０ｇ（９０％）の所望の生成物をオフホワイト粉末として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．３０（ｍ，１０Ｈ），５．０６（ｍ，４Ｈ），４．１６（ｍ，１Ｈ），３．７８（ｍ，２Ｈ），３．５９（ｍ，１６３Ｈ），３．４２（ｍ，１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１２８．７８，１２８．６３，１２８．４７，１２８．１０，１２８．０３，７２．０１，７１．３２，７０．８４，７０．６５，６８．１７，６８．１０，６７．８６，６７．３４
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２３．９７。
αＨｍＰＰ２ｋの合成
ジベンジル−αＨｍＰＰ５ｋ（８０．０ｇ、３６．３ｍｍｏｌ）を９５％のエタノール（４７１．４ｍＬ）に溶解し、１０％のＰｄ／炭素（２．８７ｇ、２．７ｍｍｏｌ Ｐｄ）を攪拌しながらゆっくり添加した。反応をＨ2の雰囲気に置き、Ｈ2の取り込みが完了するまで（９３時間）攪拌した。Ｐｄ／炭素をセライトパッドでの濾過により除去し、濾液から溶媒を真空で除去すると、白色のワックス状固体が残った。回収した固体を２：１（ＴＨＦ：ヘキサン）（粗生成物１ｇあたり１．３ｍＬのＴＨＦ）から再結晶して７９．２ｇ（約１００％）の所望の生成物をホワイト粉末として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．６５（ｍ，２Ｈ），３．４７（ｍ，１６５Ｈ），３．２９（ｍ，２Ｈ），３．２０（ｓ，３Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７２．３７，７１．５９，７０．６２，７０．２２，６１．１８，５８．６８
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２２．８５。
実施例３：ＰＥＧ５０００コンジュゲートの合成
ｍＰＥＧ５ｋ−エポキシドの合成
水（４．３２ｍＬ）をエピクロロヒドリン（８４．６８ｍＬ、１．０８０ｍｏｌ）に懸濁させ、ＮａＯＨ（４３．２０ｇ、１．０８０ｍｍｏｌ）、続いてトリエチルアンモニウムハイドロクロライド（１．１８ｇ、０．００９ｍｏｌ）を添加した。溶液を攪拌し、７０℃に加熱し、加熱中に温度が上昇するにつれてＰＥＧ５０００モノ（メチルエーテル）（５００ｇ、０．１００ｍｏｌ）を複数回に分けて添加した。得られた懸濁液をその温度で４時間攪拌し、その後室温に冷却した。水（５００ｍＬ）を添加し、生成物をＣＨ2Ｃｌ2（１０００ｍＬで２回）で抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去し、得られた油状物をＴＨＦ（４００ｍＬ）／ヘキサン（２００ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶して４９９．９３ｇ（理論的質量の９９％）の所望の生成物をホワイト固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．８１（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｍ，４２２Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６１（ｍ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７１．９７，７１．８９，７０．５３，５９．００，５０．７６，４４．２２。
ｍＰＥＧ５ｋ−ジオールの合成
ｍＰＥＧ５ｋ−エポキシド（４９９．９３ｇ、９８．８８ｍｍｏｌ）を０．５ＭのＨ2ＳＯ4（２０００ｍＬ）に溶解し、室温で１．５時間攪拌した（完全に材料が溶解するまで約３０分間、さらに１時間反応させた）。その後、反応をＣＨ2Ｃｌ2（１０００ｍＬで２回）で抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去し、得られた油状物をＴＨＦ／ヘキサン（４００ｍＬ：２００ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶して４１１．８８ｇ（理論的質量の８２％）の所望の生成物をホワイト固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．７５（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｍ，４２２Ｈ），３．３９（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７２．８８，７１．９１，７０．５５，６３．９３，５９．０２。
ｍＰＥＧ５ｋ−アルデヒドの合成
ｍＰＥＧ５ｋ−ジオール（２０８ｇ、４０．９９ｍｍｏｌ）を水（３２０ｍＬ）に溶解し、室温で約４５分間攪拌した。この濁った溶液に、ＮａＩＯ4（１０．７ｇ、５０ｍｍｏｌ）を水（９０ｍＬ）に予め溶解した溶液を約３０分間かけて複数回に分けて等量ずつ添加した。最終の酸化剤添加の約１．５〜２時間後に、濁りが澄んだ。その後、反応を１６時間攪拌し、プロピレングリコール（１．２０ｍＬ）の添加によりクエンチした。次に、水性反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１０００ｍＬで１回、５００ｍＬで１回）で抽出した。有機層を合わせ、ＣＨ2Ｃｌ2を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去した。得られた金色油状物をＴＨＦ／ヘキサン（４００ｍＬ：２００ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶して１８３．７７ｇ（理論的質量の８９％）の所望の生成物を白色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ９．６６（ｍ，１Ｈ），４．１０（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｍ，４２２Ｈ），３．３９（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２００．９４，７１．９０，７１．１８，７０．５４，５９．０１，５３．５６。
ジベンジル−αＨｍＰＰ５ｋの合成
ｍＰＥＧ５ｋ−アルデヒド（１８１．４５３ｇ、３５．９７ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（８５０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（５．０１ｍＬ、３５．９７ｍｍｏｌ）を添加し、約３０分間攪拌させた。その後、亜リン酸ジベンジル（９．４３ｇ、３５．９７ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。室温で４８時間攪拌した後、溶剤を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去し、得られた油状物をＴＨＦ／ヘキサン（３５０ｍＬ：１７５ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶して１７５．５９ｇ（理論的質量の９２％）の所望の生成物を白色固体として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．３４（ｍ，１０Ｈ），５．１０（ｍ，４Ｈ），３．７９（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｍ，４６０Ｈ），３．５３（ｍ，４Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１３６．４０，１３６．２７，１２８．７４，１２８．６０，１２８．４３，１２７．９９，７１．９８，７１．１７，７０．６１，６８．６７，６８．１３，６４．８５，６７．５９，５９．０８
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２３．９２。
αＨｍＰＰ５ｋの合成
乾燥ジベンジル−αＨｍＰＰ５ｋ（１２２．８０ｇ、２３．１５ｍｍｏｌ）を無水エタノール（５００ｍＬ）及び水（２５ｍＬ）に懸濁させ、１０％のＰｄ／炭素（４．０ｇ）をゆっくり添加した。その後、反応をＨ2の雰囲気（バルーン圧）下で取り込みが完了するまで攪拌した。Ｐｄ／炭素をセライトパッドでの濾過により除去し、濾液から溶剤を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去した。得られた油状物をＴＨＦ／ヘキサン（３００ｍＬ：１５０ｍＬ）から再結晶させて１０９．７ｇ（理論的質量の９４％）の所望の生成物を白色粉末として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．８１（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｍ，３６６Ｈ），３．４７（ｍ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７２．００，７１．０４，７０．５４，５９．１１
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２２．８５。
実施例４：ＰＥＧ１００００コンジュゲートの合成
ｍＰＥＧ１０ｋ−ジオールの合成
ＰＥＧ10000モノ（メチルエーテル）（２０ｇ、２ｍｍｏｌ）を８０℃に加熱し、加熱中、水（０．０９０ｍＬ）、エピクロロヒドリン（１．７８ｍＬ、２２．７ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（０．９０８ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）、続いて、トリエチルアンモニウムハイドロクロライド（０．０２５ｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた融解物／懸濁物をその温度で１８時間攪拌し、その後室温まで冷却した。０．５ＭのＨ2ＳＯ4（１００ｍＬ）を添加し、反応を室温でさらに１８時間攪拌した。生成物をＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬで１回、１００ｍＬで１回）で抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去し、得られた油状物をＴＨＦ（１５０ｍＬ）／ヘキサン（７５ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶させて１８．３７８ｇ（理論的質量の９１％）の所望の生成物を白色固体として得た。この材料をこれ以上精製せずに次の工程に進めた。
1Ｈ−ＮＭＲ ｄ（ＣＤＣｌ3）：３．８（８Ｈ，ｍ），３．５−３．７５（８５６Ｈ，ｂｓ），３．４４−３．４８（５Ｈ，ｍ），３．３８（３Ｈ，ｓ）。
ｍＰＥＧ１０ｋ−アルデヒドの合成
ｍＰＥＧ１０ｋ−ジオール（１７．８０５ｇ、１．８２４ｍｍｏｌ）を水（７５ｍＬ）に溶解し、室温で約３０分間攪拌した。この濁った溶液に、ＮａＩＯ4（０．４５６ｇ、２．２２ｍｍｏｌ）を水（４．５ｍＬ）に予め溶解した溶液を約３０分間かけて複数回に分けて等量ずつ添加した。最終の酸化剤添加の約１．５時間後に、濁りが澄んだ。その後、反応を１８時間攪拌し、プロピレングリコール（０．０５４ｍＬ）の添加によりクエンチした。この反応混合物をさらに１時間攪拌した。次に、水性反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬで１回、１００ｍＬで１回）で抽出した。有機層を合わせ、ＣＨ2Ｃｌ2を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去し、得られた黄色油状物をＴＨＦ／ヘキサン（２００ｍＬ：１００ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶して１３．１８２ｇ（理論的質量の７２％）の所望の生成物を白色固体として得た。この材料をこれ以上精製せずに次の工程に進めた。
1Ｈ−ＮＭＲ ｄ（ＣＤＣｌ3）：９．７４（１Ｈ，ｓ），４．１７（２Ｈ，ｄ），３．８２（６Ｈ，ｍ），３．５２−３．７６（８８０Ｈ，ｂｓ），３．４６−３．４８（５Ｈ，ｍ），３．３８（３Ｈ，ｓ）。
ジベンジル−αＨｍＰＰ１０ｋの合成
ｍＰＥＧ１０ｋ−アルデヒド（１８．４７５ｇ、１．２４２ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．２６ｍＬ、１．８６ｍｍｏｌ）を添加し、約３０分間攪拌させた。その後、亜リン酸ジベンジル（０．４８８ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。室温で９６時間攪拌した後、溶剤を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去し、得られた油状物をＴＨＦ／ヘキサン（１５０ｍＬ：７５ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶して１２．５３ｇ（理論的質量の９８％）の所望の生成物を白色固体として得た。この材料をこれ以上精製せずに次の工程に進めた。
1Ｈ−ＮＭＲ ｄ（ＣＤＣｌ3）：７．３６（１０Ｈ，ｍ），５．１０（４Ｈ，ｍ），４．２（１Ｈ，Ｍ），３．８３（９Ｈ，ｍ），３．５４−３．７４（８７２Ｈ，ｂｓ），３．４６−３．４８（５Ｈ，ｍ），３．３８（３Ｈ，ｓ）。
αＨｍＰＰ１０ｋの合成
ジベンジル−αＨｍＰＰ１０ｋ（１１．８１ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を無水エタノール（１００ｍＬ）に懸濁させ、完全に溶解するまで４０℃で加熱した。１０％のＰｄ／炭素（２．０ｇ）をゆっくり添加した。その後、Ｈ2の雰囲気（バルーン圧）下４０℃で取り込みが完了するまで反応を攪拌した。Ｐｄ／炭素をセライトパッドでの濾過により除去し、濾液から溶剤を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去した。得られた油状物をＴＨＦ／ヘキサン（１５０ｍＬ：７５ｍＬ）から再結晶させて１１．２７ｇ（理論的質量の９８％）の所望の生成物を白色粉末として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ ｄ（ＣＤＣｌ3）：３．９５（１Ｈ，ｍ），３．４２−３．９（９００Ｈ，ｂｓ），３．３９（３Ｈ，ｓ）
実施例５：ＰＥＧ３００００コンジュゲートの合成
ｍＰＥＧ３０ｋ−ジオールの合成
ＰＥＧ30000モノ（メチルエーテル）（３０ｇ、１ｍｍｏｌ）を８５℃に加熱し、加熱中、水（０．０４０ｍＬ）、エピクロロヒドリン（０．８９ｍＬ、１１．３５ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（０．４５４ｇ、１１．３５ｍｍｏｌ）、続いてトリエチルアンモニウムハイドロクロライド（０．０１３ｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）を添加した。得られた融解物／懸濁物をその温度で１０分間攪拌し、９５℃で３０分間、１０５℃で２．５時間、その後、９５℃でさらに１時間攪拌した。その後、反応を室温まで冷却した。０．５ＭのＨ2ＳＯ4（１００ｍＬ）を添加し、反応を室温でさらに１８時間攪拌した。生成物をＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬで２回）で抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去し、得られた油状物をＴＨＦ（１５０ｍＬ）／ヘキサン（７５ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶させて１７．９１ｇ（理論的質量の６０％）の所望の生成物を白色固体として得た。この材料をこれ以上精製せずに次の工程に進めた。
ｍＰＥＧ３０ｋ−アルデヒドの合成
ｍＰＥＧ３０ｋ−ジオール（１７．０ｇ、０．５６５ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に溶解し、室温で約３０分間攪拌した。この濁った溶液に、ＮａＩＯ4（０．１４７ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に予め溶解した溶液を一度に添加した。酸化剤添加の約４５分間後に、濁りが澄んだ。その後、反応を１８時間攪拌し、プロピレングリコール（０．０１６５ｍＬ）の添加によりクエンチした。この反応混合物をさらに１時間攪拌した。次に、水性反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬで２回）で抽出した。有機層を合わせ、ＣＨ2Ｃｌ2を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去し、得られた黄色油状物をＴＨＦ／ヘキサン（１５０ｍＬ：７５ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶して１５．０８ｇ（理論的質量の８９％）の所望の生成物を白色固体として得た。この材料をこれ以上精製せずに次の工程に進めた。
ジベンジル−αＨｍＰＰ３０ｋの合成
ｍＰＥＧ３０ｋ−アルデヒド（１４．２７ｇ、０．４７５ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．１３２ｍＬ、０．９５ｍｍｏｌ）を添加し、約３０分間攪拌させた。その後、亜リン酸ジベンジル（０．２４９ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。室温で７２時間攪拌後、溶剤を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去し、得られた油状物をＴＨＦ／ヘキサン（２００ｍＬ：１００ｍＬ）（ＴＨＦを添加し、加熱し、その後、ヘキサンを添加し、濁りが澄むまで約３０秒間ぐるぐる混ぜた）から再結晶して１４．０３ｇ（理論的質量の９７％）の所望の生成物を白色固体として得た。この材料をこれ以上精製せずに次の工程に進めた。
αＨｍＰＰ３０ｋの合成
ジベンジル−αＨｍＰＰ３０ｋ（１０．６ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を無水エタノール（１００ｍＬ）に懸濁させ、完全に溶解するまで４０℃に加熱した。１０％のＰｄ／炭素（０．４ｇ）をゆっくり添加した。その後、Ｈ2の雰囲気（バルーン圧）下４０℃で取り込みが完了するまで反応を攪拌した。Ｐｄ／炭素をセライトパッドでの濾過により除去し、濾液から溶剤を真空で（乾燥までではなく、濃い油状物になるまで）除去して９．２２ｇ（理論的質量の８８％）の所望の生成物を白色粉末として得た。
実施例６：ナノ粒子組成物（αＨｍＰＰ５ｋＳＰＩＯ）の合成
９．１７７ｇのαＨｍＰＰ５ｋリガンドを磁気撹拌子を含む１Ｌの三角フラスコに量り入れた。８．９５５ｍｌのＮａＯＨ溶液（０．２Ｍ）を１０４ｍｌの脱イオン水及び無水ＥｔＯＨ（２００ｍＬ）とともに添加した。フラスコを時計皿で覆い、磁気撹拌で攪拌し、無色透明溶液が得られるまで穏やかに加熱した。上記の溶液を機械式攪拌器、テフロン（登録商標）アンカー型アジテーター、熱電対、窒素入口、バブラー及び還流冷却器を備えた２Ｌのジャケット付き反応器に添加した。フラスコを無水ＥｔＯＨ（２ｘ２５ｍＬ）ですすぎ、すすいだ水を反応器に添加した。無色透明溶液を１００ｒｐｍで攪拌した。３３０．６ｍｌの酸化鉄ナノ粒子コアのベンジルアルコール溶液（６．０５ｇ Ｆｅ／ｍｌ）を反応混合物に、塩基で洗浄し、ＤＩ水ですすぎ、オーブン乾燥したメスシリンダーで粉末漏斗を通して添加した。メスシリンダーを無水ＥｔＯＨ（２５ｍＬで２回）すすぎ、すすぎ液を反応器に添加した。単相の暗赤褐色の溶液が認められた。攪拌速度を２００ｒｐｍに上昇させ、反応器を停止し、窒素下で攪拌しながら１８時間５０℃（内部温度）で加熱した。１８時間加熱した後、反応器を２５℃に冷却した。ＥｔＯＡｃ（６６０ｍＬ）及び脱イオン水（３２０ｍＬ）を反応器に添加し、バッフルを挿入して混合を向上させた。反応混合物を５００ｒｐｍで１０分間攪拌した。攪拌を停止し、相を分離させた。濁った混合物は１０分間未満で相分離し始め、約３０分間後にはっきりした相分離が認められた。２４７ｇの暗赤褐色の溶液からなる下側水性相（ＳＰＩＯ粒子を含有）を反応器から２Ｌ２４／４０の丸底フラスコに注いだ。溶液を８００ｍＬに水で希釈（理論的に約２．５ｍｇ Ｆｅ／ｍＬ）し、短時間ロータリーエバポレーターにかけて残留揮発性有機物を除去した。その後、溶液を除菌濾過（０．２２μｍ）し、５０Ｋ ＰＥＳ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０．１ｍ2メンブレンを用いてタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により精製した。生成物を２４Ｌの脱イオン水で約３時間かけて約１０ｐｓｉで保留液溜めに２．５Ｌの体積を維持しながら洗浄した。透過液を１リットル捕集するごとに透過液及び保留液サンプル（各約５ｍＬ）を取った。洗浄が完了したら、保留液を約１２０ｇ（約１６ｍｇ Ｆｅ／ｍＬ）に濃縮した。最終粒子の１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中で動的光散乱法により測定した流体力学的半径が１９．２ｎｍであった。粒子のサイズは、４０℃でインキュベートした１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中で２日間後も変化しなかった。
実施例７：ＳＰＩＯナノ粒子のコロイド懸濁液の特性評価
タンジェンシャルフロー濾過の結果として得られたコロイド懸濁液を安定性及びゼータ電位について評価した。
流体力学的半径（ＤH）を懸濁媒体として１５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液を用いて動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定した。タンジェンシャルフロー濾過からの精製ＳＰＩＯ懸濁液を１５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液に希釈し、２００ｎｍフィルターを通過させてダストを除去した後、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ社製ＺｅｔａＰＡＬＳを用いてＤＬＳ分析を行った。希釈は、ＤＬＳ測定時に最低毎秒２００００カウント得られるように行った。修飾ナノ粒子が作製された後、直ちに測定を行った。保存後のＤHの著しい増加は、ナノ粒子が凝集し、したがってそのコロイド懸濁液が安定でないことを表していた。結果を表１に示す。
実施例８：ＭＲＩによる生体内での肝臓信号強度のイメージング
動物を含むすべての手順はＧＥ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル下で完結した。酸化鉄ナノ粒子試験剤の注射前、注射後の様々な時点（例えば、１、２、５、７、２１、２８日・・・）で画像データを集めた。試験剤は、約１５０ｇの雌のＬｅｗｉｓラット（米国マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ所在Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の外側尾静脈に位置させたカテーテルを通して注射され、体重１ｋｇあたり５ｍｇ Ｆｅで投与し、例外として、ＰＥＧ３００００α−ヒドロキシホスホネート被覆剤は材料に制限があるため３ｍｇ Ｆｅ／ｋｇで投与した。カテーテルは注射後、生理食塩水で洗い流した。
イメージングは、注文製造の約６ｃｍソレノイド受信ＲＦコイルを用いて臨床用の１．５Ｔ ＧＥ Ｓｉｇｎａスキャナー上で行った。イメージングの準備のため、ラットは、３％のイソフルランを含む酸素で充填させた導入チャンバーに置くことにより麻酔された。次いで、前処理した動物をＲＦコイル内に配置し、スキャナーのボア内で位置決めし、ノーズコーンを通して２〜３％のイソフルランで維持した。
１２のエコー時間での画像収集が可能な３Ｄ高速勾配エコーパルスシーケンスを使用した。グラフィカルプレスクリプションインターフェースにより、肝臓がトランスアキシャルスラブ内で中央に位置し、かつ１スラブあたり１２の画像が取れるようにイメージングスラブを位置決めした。バルスシーケンスパラメーターは、パルスシーケンス：３Ｄ ＭＥ ｆＧＲＥ、ＴＥ：２．７〜５５．２ｍｓの範囲、間隔４．７ｍｓ、ＴＲ：１４６．８ｍｓ、フリップ角：２５°、帯域幅：１２．５ＭＨｚ、マトリクス：１９２×１６０、ＮＥＸ：１、スライス厚さ：１．１ｍｍ、スライス間の間隔：１．１ｍｍ、視野：９ｃｍであり、０．３５×０．３５×１．１のボクセルサイズをもたらした。シーケンス取得時間は約２分であった。
ＩＤＬプラットホーム（ＩＤＬ ｖ．６．３、ＩＴＴ Ｃｏｒｐ．（米国コロラド州ボールダー所在））上に構築されたカスタムソフトウェアツール（ＣｉｎｅＴｏｏｌ ｖ８．０．２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてイメージングデータセットを解析した。簡単に述べると、かかる画像解析ツールは、各系列の肝臓含有スライス上に３Ｄ対象領域（ＲＯＩ）を手動描画し、続いて描画されたＲＯＩ内のあらゆるボクセルに関する指数回帰を行ってＴ2＊時間定数を計算することを可能にした。そのように求めたＴ2＊の逆数として計算された肝臓Ｒ2＊値を様々なＰＥＧ分子量のα−ヒドロキシホスホネート−ＰＥＧ被覆酸化鉄ナノ粒子について図１及び図２にプロットする。
図１は、生きているラットに５ｍｇ Ｆｅ／ｋｇのα−ヒドロキシホスホネート−ＰＥＧ被覆酸化鉄ナノ粒子の静脈注射後、長期間ＭＲイメージングすることによって測定した肝臓中のＲ2＊緩和速度を示す。Ｒ2＊シグナルの時間とともの低下に反映した肝臓中の粒子処理速度は、被覆リガンドのＰＥＧ鎖の長さに依存することを示す。分子量５０００ＤａのＰＥＧ被覆では、肝臓シグナル減衰は、単一指数関数的かつ迅速であり、約１週間以内でベースラインに戻る。これに対して、低分子量のＰＥＧ（２０００Ｄａ以下）を被覆された粒子は、二相減衰を示し、肝臓シグナルは、何ヶ月も様々なレベル（平均±ＳＤ、ｎ・３）で高いままである。
高分子量ＰＥＧ（５０００Ｄａ以上）で被覆された粒子の肝臓中の肝臓Ｒ2＊緩和速度プロファイルを図２に示す。ｘ軸を図１から拡大して分子量５０００、１００００及び３００００ＤａのＰＥＧで被覆した３種の異なる粒子がそれぞれ、ベースラインへの迅速、単一指数関数的衰退を示す類似プロファイルをもつことを示す。リファレンスとして２０００ＤａのＰＥＧ被覆粒子も示す。
本発明のα・ヒドロキシホスホン酸−ＰＥＧ修飾ナノ粒子は優れた肝臓処理特性を有するため、修飾ナノ粒子は鉄欠乏症の処置のための補足的鉄源としても有効である。
本発明を特定の特徴だけについて例示し、説明したが、多くの変更や改変を当業者が想起することができるであろう。したがって、特許請求の範囲は本発明の要旨に入るこのようなすべての変更や改変を含むものとする。

Claims (42)

  1. α−ヒドロキシホスホネート部分が付着したナノ粒子を含む組成物であって、少なくとも１つのα−ヒドロキシホスホネート部分が次の式Ｉの構造を有する組成物。
    式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲの間の連結部であり、Ｒはポリ（エチレングリコール）であり、ＺはＰＥＧ鎖のω末端のアルコキシ又はヒドロキシ末端封鎖基であり、ＰＥＧの分子量は約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下であり、ｏ＝０又は１である。
  2. Ｓが直接結合、置換又は非置換の脂肪族又は脂環式基又はヘテロ脂肪族基である、請求項１記載の組成物。
  3. Ｓが炭素原子数１〜１０の鎖長の直鎖アルキル基である、請求項１記載の組成物。
  4. Ｌが直接結合、カルボニル基、エーテル基、アミン基、アミド基、エステル基、カルバメート基、尿素基又は第４級アミン基である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の組成物。
  5. α−ヒドロキシホスホネート部分が次の式ＩＩの構造を有する、請求項１記載の組成物。
    式中、ｎ＝１又は２であり、ｐは１１４〜６８１である。
  6. ナノ粒子が遷移金属又は遷移金属化合物を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の組成物。
  7. ナノ粒子が常磁性材料を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の組成物。
  8. 遷移金属又は遷移金属化合物が、鉄、マンガン、銅、コバルト、ニッケル及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項６記載の組成物。
  9. ナノ粒子が超常磁性酸化鉄を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の組成物。
  10. 前記酸化鉄が別の金属でドープされている、請求項９記載の組成物。
  11. ナノ粒子が、動的光散乱法によって１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液中で測定して、１５ｎｍ〜１００ｎｍの平均流体力学的半径（ＤH）を有する、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の組成物。
  12. ナノ粒子が、動的光散乱法によって１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液中で測定して、１５ｎｍ〜５０ｎｍの平均流体力学的半径（ＤH）を有する、請求項１１記載の組成物。
  13. ナノ粒子が、動的光散乱法によって１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液中で測定して、約２０ｎｍ〜約３０ｎｍの平均流体力学的半径（ＤH）を有する、請求項１１記載の組成物。
  14. 前記ナノ粒子が、タンジェンシャルフロー濾過して室温で１週間保存した後、動的光散乱法によって１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液中で求めた流体力学的半径（ＤH）に実質的変化のない安定な水性コロイド懸濁液を形成するのに十分に親水性である、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の組成物。
  15. 哺乳類被験体への投与に適した組成物であって、
    α−ヒドロキシホスホネート部分が付着したナノ粒子であって、α−ヒドロキシホスホネート部分が以下の式Ｉの構造を有するナノ粒子と、
    薬学的に許容されるキャリア又は賦形剤と
    を含む組成物。
    式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲの間の連結部であり、Ｒはポリ（エチレングリコール）であり、ＺはＰＥＧ鎖のω末端のアルコキシ又はヒドロキシ末端封鎖基であり、ｏ＝０又は１であり、ＰＥＧの分子量は約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下である。
  16. α−ヒドロキシホスホネート部分が式ＩＩの構造を有する、請求項１５記載の組成物。
    式中、ｎ＝１又は２であり、ｐは１１４〜６８１である。
  17. Ｓが直接結合、置換又は非置換の脂肪族又は脂環式基又はヘテロ脂肪族基又はこれらの組合せである、請求項１５又は請求項１６記載の組成物。
  18. Ｌが直接結合、カルボニル基、エーテル基、アミド基、エステル基、カルバメート基、尿素基又はこれらの組合せである、請求項１５乃至請求項１７のいずれか１項記載の組成物。
  19. ナノ粒子がＭＲＩ造影剤としての使用に適している、請求項１５乃至請求項１８のいずれか１項記載の組成物。
  20. ナノ粒子が超常磁性酸化鉄を含む、請求項１５乃至請求項１９のいずれか１項記載の組成物。
  21. ナノ粒子が、動的光散乱法によって１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液中で測定して、１５ｎｍ〜１００ｎｍの平均流体力学的半径（ＤH）を有する、請求項１５乃至請求項２０のいずれか１項記載の組成物。
  22. ナノ粒子が、動的光散乱法によって１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液中で測定して、１５ｎｍ〜５０ｎｍの平均流体力学的半径（ＤH）を有する、請求項２１記載の組成物。
  23. ナノ粒子が約２０ｎｍ〜約３０ｎｍの平均流体力学的半径（ＤH）を有する、請求項２１記載の組成物。
  24. ナノ粒子が、タンジェンシャルフロー濾過して室温で１週間保存した後、動的光散乱法によって１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液中で求めた流体力学的半径（ＤH）に実質的変化のない安定な水性コロイド懸濁液を形成するのに十分に親水性である、請求項１５乃至請求項２３のいずれか１項記載の組成物。
  25. キャリアが等張性水媒体である、請求項１５乃至請求項２４のいずれか１項記載の組成物。
  26. キャリアが生理的ｐＨにある、請求項１５乃至請求項２５のいずれか１項記載の組成物。
  27. ＰＥＧ置換α−ヒドロキシホスホネート被覆ナノ粒子を用いて画像診断する方法であって、
    以下の式Ｉの構造を有するα−ヒドロキシホスホネート部分が付着した酸化鉄ナノ粒子を含むナノ粒子組成物が予め投与されている個体をイメージングに付す工程
    を含む方法。
    式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲの間の連結部であり、Ｒはポリ（エチレングリコール）であり、ＺはＰＥＧ鎖のω末端のアルコキシ又はヒドロキシ末端封鎖基であり、ｏ＝０又は１であり、ＰＥＧの分子量は約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下である。
  28. α−ヒドロキシホスホネート部分が式ＩＩの構造を有する、請求項２７記載の方法。
    式中、ｎ＝１又は２及びｐは１１４〜６８１である。
  29. 被験体に予め投与されているナノ粒子組成物が造影剤として作用する、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
  30. 前記ナノ粒子が吸入又は経口摂取によって投与される、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
  31. 前記ナノ粒子が非経口的に投与される、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
  32. 前記ナノ粒子が注射又は注入によって投与される、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
  33. 前記ナノ粒子が被験体に埋め込まれる、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
  34. イメージングが磁気共鳴（ＭＲ）によるものである、請求項２７乃至請求項３３のいずれか１項記載の方法。
  35. ＰＥＧ置換α−ヒドロキシホスホネート被覆ナノ粒子を用いて鉄欠乏症を処置する方法であって、
    以下の式Ｉの構造を有するα−ヒドロキシホスホネート部分が付着した酸化鉄コアを有するナノ粒子を含むナノ粒子組成物を個体に投与する工程
    を含む方法。
    式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲの間の連結部であり、Ｒはポリ（エチレングリコール）であり、ＺはＰＥＧ鎖のω末端のアルコキシ又はヒドロキシ末端封鎖基であり、ｏ＝０又は１であり、ＰＥＧの分子量は約５０００Ｄａ超〜約３００００Ｄａ以下である）の構造を有する。
  36. α−ヒドロキシホスホネート部分が式ＩＩの構造を有する、請求項３５記載の方法。
    式中、ｎ＝１又は２及びｐは１１４〜６８１である。
  37. 被験体に予め投与されているナノ粒子組成物が生体利用可能な鉄源として作用する、請求項３５又は請求項３６記載の方法。
  38. 前記ナノ粒子が非経口的に投与される、請求項３５乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
  39. 前記ナノ粒子が注射によって投与される、請求項３５乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
  40. 前記ナノ粒子が注入によって投与される、請求項３５乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
  41. 前記ナノ粒子が被験体に埋め込まれる、請求項３５乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
  42. 前記ナノ粒子が経口摂取によって投与される、請求項３５乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
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