KR101997231B1 - Cosmetic composition containing enzyme-treated honey extract - Google Patents

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이종은
최성규
선우철
박은정
이대우
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Abstract

The present invention relates to a cosmetic composition containing an enzyme-treated honey extract as an active ingredient. Provided according to the present invention is a cosmetic composition containing, based on the total weight of the cosmetic composition, 0.01 to 15 wt% of a honey extract prepared by treating a mixed enzyme of naringinase and pectinase. The enzyme-treated honey extract of the present invention not only has excellent skin exfoliation effect, skin moisturizing effect, whitening effect, wrinkle reduction and skin tone improvement effect, but also has an excellent effect of enhancing the activity of useful ingredients in skin used together in the formulation.

Description

효소반응을 이용하여 제조된 꿀 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing enzyme-treated honey extract} [0001] The present invention relates to a cosmetic composition containing an extract of a honey produced by an enzyme reaction,

본 발명은 꿀 추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것으로서, 구체적으로는 효소반응에 의한 꿀 추출물의 제조방법 및 그 추출물을 함유하여 피부 각질 제거효과, 피부 보습효과, 주름개선효과, 피부 톤 개선효과 및 피부 유용성분의 활성을 상승시키는 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a process for preparing a honey extract and using it as a cosmetic, and more particularly, to a process for producing an extract of honey by an enzyme reaction and a method for producing the honey extract, An improvement effect and an effect of raising the activity of a skin-useful component.

노화란 세월이 지나감에 따라 신체의 구조와 기능이 점진적으로 저하되고 질병과 사망에 대한 감수성이 급격히 증가하면서 쇠약해지는 과정으로 신체에 생리적 변화가 발생하여 신체 전반적으로 현저한 퇴화현상이 나타나게 되는 것을 말한다. 이 중에서 우리가 가장 쉽게 느낄 수 있는 것이 피부 노화로 이는 당뇨병, 심장병, 동맥경화, 치매, 암 등에 못지않게 중요한 것으로 인식이 되고 있으며, 개인차가 있지만 피부노화는 대개 20대 초반을 전후해서 시작되어 나이가 많아지면서 증가하는 것으로 나타난다.Aging is a process in which the structure and function of the body gradually deteriorate as the years pass, and the sensitivity to diseases and death increases rapidly, resulting in physiological changes in the body resulting in remarkable degradation throughout the body . Among them, it is recognized that skin aging is the most important thing that we can easily feel as it is as important as diabetes, heart disease, arteriosclerosis, dementia and cancer. There are individual differences but skin aging usually starts around the early 20s Of the total population.

이러한 노화 현상을 지연하기 위해 다양한 기능을 나타내는 피부개선물질들이 개발되어지고 사용하고 있다. 하지만 화장료의 경우 화장료에 포함된 생리활성 물질이 그 효능을 나타내기 위해서는 피부의 최외각층인 각질층을 통과하여만 하나, 피부장벽기능으로 인해 화장품에 포함된 피부유용성분인 피부개선물질이 각질층을 통과하기 어렵고, 따라서 그 활성을 나타내지 못하는 문제점을 가진다. 이러한 피부 개선물질이 그 기능을 나타내도록 하려면 고농도로 포함시켜야 하는데, 이 경우 제품의 가격 상승 요인이 되며 고농도에 의해 피부 자극 유발 가능성이 높아진다. 따라서 이러한 문제점을 극복하기 위해서 소량의 피부 개선물질을 안정적으로 화장료에 첨가하여 그 기능이 효과적으로 발휘될 수 있도록 하는 피부 흡수촉진용 화장료의 개발이 필요하다.In order to delay such aging process, skin-improving substances showing various functions have been developed and used. However, in the case of cosmetics, the physiologically active substance contained in cosmetics is only required to pass through the stratum corneum which is the outermost layer of the skin. However, the skin improving substance, which is a useful ingredient of skin contained in cosmetics due to the skin barrier function, And therefore, it has a problem that it can not exhibit its activity. In order for such a skin improving substance to exhibit its function, it should be contained at a high concentration. In this case, the price of the product is increased, and the possibility of inducing skin irritation by high concentration is increased. Therefore, in order to overcome such a problem, it is necessary to develop a cosmetic for accelerating skin absorption, which can stably add a small amount of skin improving substance to the cosmetic and effectively exhibit its function.

다양한 연구를 통해 활성물질의 피부 투과를 촉진하는 피부 투과 촉진제들이 보고되어 왔으며, 이들의 투과 촉진은 크게 i)세포간 지질 이중층(Intercellular lipid bilayer)에 작용, ii)세포간 결합에 관여하는 데스모좀(desmosome) 및 관련 단백질에 작용, iii)각질세포 내부 구조에 직접 작용하는 기작으로 나눌 수 있다. 이들은 피부 최외각층인 각질층의 구조를 변경시켜 생리활성 물질의 피부 투과를 촉진하게 된다. 이로 인해 대부분의 피부 투과 촉진제의 경우, 피부 세포에 대한 세포 독성이 높고 도포 시 피부 작열감 및 홍반을 유발하는 등의 피부 자극 유발 가능성이 매우 높은 특징을 가진다.Skin permeation accelerators have been reported to promote skin penetration of active substances through various studies. Their permeation enhancement is largely attributed to i) intercellular lipid bilayer, ii) desmosome involved in intercellular binding, desmosomes and related proteins, and iii) mechanisms that act directly on the keratinocyte internal structure. These alter the structure of the horny layer, which is the outermost layer of the skin, to promote the skin permeation of the physiologically active substance. As a result, most of the skin penetration enhancers have high cytotoxicity to skin cells, and are highly likely to induce skin irritation such as skin burning and erythema upon application.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 피부 개선 효과를 나타내는 피부유용성분들의 활성을 상승시킬 수 있는 방법을 연구하였으며, 그 결과 특정한 방법으로 효소 처리하여 제조된 꿀 추출물을 사용하는 경우, 피부 각질 제거효과, 피부 보습효과, 미백효과, 주름개선효과, 피부 톤 개선효과가 우수할 뿐 아니라, 피부 자극 없이 화장료 조성물 내의 피부 유용성분의 활성을 상승시키는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the inventors of the present invention have studied a method for increasing the activity of skin oil-soluble components showing skin-improving effects. As a result, when using a honey extract prepared by enzyme treatment with a specific method, The present invention has been accomplished on the basis of the fact that it is excellent in moisturizing effect, whitening effect, wrinkle improving effect and skin tone improving effect, and also has an effect of raising the activity of a skin benefit component in a cosmetic composition without skin irritation.

(001)대한민국 공개특허 제10-2016-0049812호(2016.05.10.)(001) Korean Patent Publication No. 10-2016-0049812 (May 10, 2016). (002)대한민국 공개특허 제10-2018-0063394호(2018.06.12.)(002) Korean Patent Publication No. 10-2018-0063394 (Jun.

본 발명은 효소반응을 이용하여 제조된 꿀 추출물을 함유하여 피부각질 제거효과, 피부 보습효과, 미백효과, 주름개선효과, 피부 톤 개선효과 및 피부 개선물질의 활성을 상승시키는 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention relates to a cosmetic composition containing honey extract prepared using an enzyme reaction and having an effect of enhancing skin exfoliating effect, skin moisturizing effect, whitening effect, wrinkle improving effect, skin tone improving effect, The purpose is to provide.

또한, 본 발명은 상기 꿀에 특정 효소를 처리한 후 추출물을 제조하는 꿀 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a method for producing an extract of honey from which the honey is treated with a specific enzyme to produce an extract.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)의 혼합효소를 처리하여 제조되는 꿀 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 15 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.To achieve the above object, according to the present invention, there is provided a cosmetic composition comprising 0.01 to 15 wt% of a honey extract prepared by treating a mixed enzyme of naringinase and pectinase, based on the total weight of the cosmetic composition / RTI >

상기 혼합효소는 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)가 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것이다.The mixed enzyme is composed of naringinase and pectinase in a weight ratio of 1: 3: 1 to 3: 1.

더욱 바람직하게는 상기 혼합효소의 처리는 반응 pH 4.5, 반응온도 48℃ 및 반응시간 48시간의 조건하에서 효소 반응을 진행하는 것이다.More preferably, the enzyme treatment is carried out under the conditions of a reaction pH of 4.5, a reaction temperature of 48 ° C and a reaction time of 48 hours.

상기 꿀 추출물은 화장료 조성물에 함께 포함되는 피부유용성분의 활성을 증진시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.The honey extract is characterized by exhibiting an effect of enhancing the activity of a useful component of the skin contained in the cosmetic composition.

상기 피부유용성분은 아데노신, 알부틴 및 히알루론산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이다.The skin benefit component is at least one selected from the group consisting of adenosine, arbutin and hyaluronic acid.

상기 화장료 조성물은 피부각질 제거용, 피부 보습용, 미백용, 피부 주름개선용 또는 피부 톤 개선용인 것을 특징으로 한다.The cosmetic composition is characterized in that it is used for skin exfoliation, skin moisturizing, whitening, skin wrinkle improvement or skin tone improvement.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A) 꿀을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계; (B) 여과 후 감압 농축하고 건조하여 꿀 용매추출 분말을 제조하는 단계; (C) 상기 꿀 용매추출 분말에 정제수를 가하고, 나린지나아제와 펙티나아제가 각각 1~3:1~3의 중량 비율로 혼합되어 이루어지는 혼합효소를 첨가하는 단계; (D) pH 4.5, 48℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시키는 단계; 및 (E) 살균 후 감압 농축 및 동결 건조하는 단계를 포함하는 꿀 추출물의 제조방법이 제공된다.According to the present invention, there is provided a process for producing honey, comprising the steps of (A) mixing honey with at least one solvent selected from the group consisting of water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, glycerin, ethylene glycol, propylene glycol and butylene glycol ; (B) filtration, followed by concentration under reduced pressure and drying to prepare a honey extract powder; (C) adding purified water to the honey solvent extract powder, adding a mixed enzyme comprising naringinase and pectinase in a weight ratio of 1 to 3: 1 to 3, respectively; (D) stirring the enzyme reaction at pH 4.5 and 48 ° C for 48 hours with stirring; And (E) sterilization, followed by concentration under reduced pressure and lyophilization.

효소반응을 이용하여 제조된 본 발명의 꿀 추출물은 우수한 피부 각질제거효과, 피부 보습효과, 미백효과, 주름 개선 및 피부 톤 개선 효과를 가질 뿐 아니라, 제형 내에서 함께 사용되는 피부유용성분의 활성을 증진시키는 효과가 우수하므로 피부 유용성분의 함량을 줄여도 우수한 피부개선효과를 기대할 수 있다는 장점을 가진다. 그러므로 본 발명의 효소반응을 이용하여 제조된 꿀 추출물은 항노화 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.The honey extract of the present invention produced using an enzyme reaction has excellent skin exfoliation effect, skin moisturizing effect, whitening effect, wrinkle improvement and skin tone improvement effect, So that it is possible to expect an excellent skin improving effect even if the content of the useful ingredient of the skin is reduced. Therefore, the honey extract prepared using the enzyme reaction of the present invention can be usefully used as an anti-aging cosmetic.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 꿀 추출물의 히알루론산 생성 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 꿀 추출물의 HAS mRNA 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 꿀 추출물의 피부 각질 개선 효과를 나타내는 사진도이다.
1 is a graph showing hyaluronic acid production effect of a honey extract according to an embodiment of the present invention.
2 is a graph showing the effect of promoting HAS mRNA expression of a honey extract according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a photograph showing the effect of extracting honey on the skin of the present invention. FIG.

이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

"꿀"은 꿀벌이 여러 식물의 꽃으로부터 수집한 화밀과 화분을 그들의 식량으로 전환하여 저장한 것을 지칭하는 것으로, 글루코오스(glucose)와 프락토오스(fructose), 탄수화물, 무기질, 단백질, 펩타이드, 유기산, 효소 및 효모 등을 함유하고 있다. 꿀은 오랜 기간 자양 강장, 진정, 해독, 피로회복, 위장장애, 기침, 피부 건조, 습진, 변비, 신경쇠약, 혈당 감소, 대사 균형 유지 등에 사용되어 왔다. 미용 및 건강에 유익한 효과를 가지며, 비타민 B군, 특히 B6이 풍부하게 함유되어 있는 것으로 알려져 있다."Honey" refers to the storage and conversion of honey and pollen collected from flowers of various plants into their foodstuffs. It contains glucose, fructose, carbohydrates, minerals, proteins, peptides, Enzyme and yeast. Honey has long been used for nourishing gums, soothing, detoxifying, restoring fatigue, gastrointestinal disorders, coughing, dry skin, eczema, constipation, nervous breakdown, reducing blood sugar and maintaining metabolic balance. It has a beneficial effect on beauty and health and is known to be rich in vitamin B group, especially B6.

본 발명은 효소반응을 이용하여 꿀 추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다. The present invention relates to a technique for preparing an extract of honey using an enzyme reaction and using it as a cosmetic.

본 발명에 따르면 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)의 혼합효소를 처리하여 제조되는 꿀 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 15 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 혼합효소는 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)가 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것이며, 더욱 바람직하게는 각각 1:2~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것이며, 가장 바람직하게는 1:2의 중량비율로 이루어지는 것이다.According to the present invention, there is provided a cosmetic composition comprising a honey extract prepared by treating a mixed enzyme of naringinase and pectinase in an amount of 0.01 to 15% by weight based on the total weight of the cosmetic composition. The mixed enzyme is a mixture of naringinase and pectinase at a weight ratio of 1 to 3: 1 to 3, more preferably 1: 2 to 3, And most preferably in a weight ratio of 1: 2.

더욱 바람직하게는 상기 혼합효소의 처리는 반응 pH 4.5, 반응온도 48℃ 및 반응시간 48시간의 조건하에서 효소 반응을 진행하는 것이다.More preferably, the enzyme treatment is carried out under the conditions of a reaction pH of 4.5, a reaction temperature of 48 ° C and a reaction time of 48 hours.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 효소처리 꿀 추출물은 다음과 같이 제조된다. 먼저, 꿀을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출한다. 상기 꿀 용매 추출물을 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소로 처리하고 반응시켜 꿀 추출물을 제조한다. 이때, 상기 혼합효소는 나린지나아제와 펙티나아제를 각각 1~3:1~3의 중량 비율로 혼합하여 이루어진다. 더욱 바람직하게는 상기 꿀 용매추출물에 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 가하고, 반응pH 4.5, 반응온도 48℃, 반응시간 48시간의 조건하에서 교반하면서 효소반응을 진행하는 효소 반응 단계를 통해 꿀 추출물이 제조된다.According to one embodiment of the present invention, the enzyme-treated honey extract is prepared as follows. First, honey is extracted with at least one solvent selected from the group consisting of water, lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, glycerin, ethylene glycol, propylene glycol and butylene glycol. The honey solvent extract is treated with a mixed enzyme of Naringinase and Pectinase and reacted to prepare a honey extract. At this time, the mixed enzyme is prepared by mixing Naringinase and Pectinase at a weight ratio of 1: 3: 1 to 3, respectively. More preferably, the enzymatic reaction is carried out by adding a mixed enzyme of naringinase and pectinase to the honey extract of the present invention and stirring the reaction mixture at a reaction pH of 4.5, a reaction temperature of 48 ° C, and a reaction time of 48 hours Honey extract is prepared.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 (A) 꿀을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계; (B) 여과 후 감압 농축하고 건조하여 꿀 용매추출 분말을 제조하는 단계; (C) 상기 꿀 용매추출 분말에 정제수를 가하고, 나린지나아제와 펙티나아제가 각각 1~3:1~3의 중량 비율로 혼합되어 이루어지는 혼합효소를 첨가하는 단계; (D) pH 4.5, 48℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시키는 단계; 및 (E) 살균 후 감압 농축 및 동결 건조하는 단계를 포함하는 꿀 추출물의 제조방법이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a honeycomb structure comprising (A) at least one honeycomb selected from the group consisting of water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, glycerin, ethylene glycol, propylene glycol and butylene glycol Of a solvent; (B) filtration, followed by concentration under reduced pressure and drying to prepare a honey extract powder; (C) adding purified water to the honey solvent extract powder, adding a mixed enzyme comprising naringinase and pectinase in a weight ratio of 1 to 3: 1 to 3, respectively; (D) stirring the enzyme reaction at pH 4.5 and 48 ° C for 48 hours with stirring; And (E) sterilization, followed by concentration under reduced pressure and lyophilization.

상기 제조방법에 의하여 제조된 꿀 추출물은 단순 꿀 추출물이나 유산균발효 꿀 추출물, 효모발효 꿀 추출물과 비교해 볼 때, 더욱 우수한 보습효과, 주름개선 및 피부 톤 개선 효과, 각질제거 효과를 나타내는 것이 확인되었다.It was confirmed that the honey extract prepared by the above-described method exhibits superior moisturizing effect, wrinkle improvement, skin tone improvement effect and exfoliating effect in comparison with simple honey extract, lactic acid bacteria fermented honey extract and yeast fermented honey extract.

더욱이, 상기 제조방법에 의하여 제조된 꿀 추출물은 제형 내에 함께 포함되는 다른 피부유용성분의 활성을 증진시키는 효과를 나타내었다.Moreover, the honey extract prepared by the above-described method showed an effect of enhancing the activity of other useful ingredients of the skin contained in the formulation.

화장품에 사용되는 피부개선 활성성분이 피부에 작용하는 효율이 떨어지는 경우에는 원하는 피부개선효과를 얻기 위해서 많은 양을 사용할 수밖에 없으며, 이는 비용 상승과 함께 피부의 자극을 유발할 수 있다는 문제점이 있다. 상기 효소반응을 이용하여 제조되는 본 발명의 꿀 추출물은 함께 사용되는 아데노신, 알부틴, 히알루론산과 같은 피부유용성분의 피부흡수를 촉진하고 그 활성을 증진시키는 효과가 있음이 확인되었다. 이는 활성성분을 적은 양으로 사용하여도 원하는 피부개선효과를 얻을 수 있다는 것을 의미한다. When the effectiveness of the skin-improving active ingredient used in cosmetics is inferior in efficiency, it is inevitable to use a large amount of the skin-improving agent in order to obtain a desired skin improving effect, which may cause irritation of the skin along with an increase in cost. It has been found that the honey extract of the present invention produced using the enzyme reaction has an effect of promoting skin absorption and enhancing the activity of useful ingredients of skin such as adenosine, arbutin and hyaluronic acid used together. This means that even if a small amount of active ingredient is used, desired skin improving effect can be obtained.

상기 효소반응에 의해 제조된 꿀 추출물은 활성성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유된다.The honey extract prepared by the enzyme reaction is contained as an active ingredient in an amount of 0.01 to 15% by weight based on the total weight of the cosmetic composition.

본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 및 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 및 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention can be produced in the form of a general emulsified formulation and a solubilized formulation. Cosmetics of emulsified form include nutrition lotion, cream, essence, etc., and cosmetics of solubilized form have softening longevity. In addition to cosmetics, it can be prepared in the form of adjuvants which can be applied locally and systemically, which are conventionally used in the field of dermatology, by containing dermatologically acceptable mediums and bases.

또한, 본 발명에서 상기 화장료 조성물의 제형은 제한되지는 않으나 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다. The formulation of the cosmetic composition according to the present invention is not particularly limited, but may be applied to various cosmetic compositions such as a skin lotion, a skin softener, a skin toner, an astringent, a lotion, a milk lotion, a moisturizing lotion, And may be applied to any one form selected from the group consisting of a pack, a soap, a shampoo, a cleansing foam, a cleansing lotion, a cleansing cream, a body lotion, a body cleanser, a latex, a press powder, a loose powder and an eye shadow.

[실시예][Example]

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples and test examples. However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.

제조예 1: 꿀 용매 추출물의 제조Production Example 1: Preparation of Solvent Extract of Honey

아카시아 꿀 원액을 중량 대비 10배의 정제수에 넣고 교반하면서 90℃에서 2시간동안 추출하고, 냉각 후 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 50~60℃의 온도에서 농축 한 후 동결건조기로 동결 건조하여 추출분말을 제조하였다.The stock solution of acacia honey was put into purified water of 10 times by weight, extracted at 90 DEG C for 2 hours with stirring, cooled and filtered. The concentrate was concentrated at 50 ~ 60 ℃ using a vacuum concentrator and then lyophilized with a freeze dryer to prepare an extract powder.

제조예 2: 유산균 발효 꿀 추출물의 제조Production Example 2: Preparation of lactic acid bacteria fermented honey extract

상기 제조예 1에서 제조된 꿀 용매 추출물에 중량 대비 8배의 정제수를 넣고, 유산균 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 배양액을 2%(v/v)되게 접종한 다음 27℃에서 48시간 반응시켰다. 이어서 90℃에서 5분간 살균하고, 냉각 및 여과한 후 감압 농축기를 이용하여 50~60℃의 온도에서 농축하였다. 동결건조기로 동결 건조하여 유산균 발효 꿀 추출물을 제조하였다.8 times the weight of purified water was added to the honey extract prepared in Preparation Example 1, and the culture solution of Lactobacillus sakei was inoculated at 2% (v / v), followed by reaction at 27 ° C for 48 hours. Then, it was sterilized at 90 DEG C for 5 minutes, cooled and filtered, and then concentrated at a temperature of 50 to 60 DEG C using a vacuum concentrator. And lyophilized with a freeze dryer to prepare lactic acid fermented honey extract.

제조예 3: 효모 발효 꿀 추출물의 제조Production Example 3: Preparation of yeast fermented honey extract

상기 제조예 1에서 제조된 꿀 용매 추출물에 중량 대비 8배의 정제수를 가하고, 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 2%(v/v)되게 접종한 다음 35℃에서 48시간 반응시켰다. 반응물을 90℃에서 5분간 살균하고 냉각 및 여과한 후 감압 농축기를 이용하여 50~60℃의 온도에서 농축하였다. 동결건조기로 동결 건조하여 효모 발효 꿀 추출물을 제조하였다.Eight times as much water as purified water was added to the honey extract prepared in Preparation Example 1 to inoculate 2% (v / v) of yeast Saccharomyces cerevisiae, followed by reaction at 35 ° C for 48 hours . The reaction product was sterilized at 90 DEG C for 5 minutes, cooled and filtered, and then concentrated at a temperature of 50 to 60 DEG C using a vacuum condenser. And then lyophilized with a freeze dryer to prepare yeast fermented honey extract.

실시예 1~7: 효소반응 꿀 추출물의 제조Examples 1 to 7: Preparation of enzyme reaction honey extract

상기 제조예 1에서 제조된 꿀 용매 추출물에 중량 대비 8배의 정제수를 가하고, 1배의 하기 표 1의 비율별 효소액을 혼합하여 pH 4.5, 48℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시켰다. 이후, 반응물을 90℃에서 5분간 살균하고 감압 농축 및 동결 건조하여 꿀 추출물을 제조하였다.Eight times as much water as purified water was added to the honey extract prepared in Preparation Example 1, and the enzyme reaction was carried out with stirring at pH 4.5 and 48 ° C for 48 hours. Thereafter, the reaction product was sterilized at 90 캜 for 5 minutes, concentrated under reduced pressure and lyophilized to prepare a honey extract.

구분(중량비)Classification (weight ratio) 효소(Enzyme)Enzyme 나린지나아제(naringinase)Naringinase 펙티나아제(pectinase)Pectinase 실시예 1 Example 1 1One -- 실시예 2Example 2 -- 1One 실시예 3Example 3 1One 1One 실시예 4Example 4 1One 22 실시예 5Example 5 1One 33 실시예 6 Example 6 22 1One 실시예 7Example 7 33 1One

시험예 1: 세포독성 확인 시험Test Example 1: Test for cytotoxicity

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 피부 세포의 세포독성을 확인하였다. 사람 유래 섬유아세포 1×106 cells/well의 농도로 96 well plate에 배양하고 10% FBS를 함유하는 IMDM 배지 0.2㎖를 공급한 후 24시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 여기에 DMSO에 녹인 시료용액을 처리 한 다음 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포의 생존력을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT assay는 배양한 세포에 MTT 용액 0.1㎖을 가한 후, 4시간 동안 배양한 다음 배지는 제거하고 DMSO 0.5㎖를 넣어 형성된 포마잔을 ELISA를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율(%)은 하기 식에 의해 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.The cytotoxicity of skin cells by the samples of honey extract prepared in the above Preparation Examples and Examples was confirmed. Human-derived fibroblasts were cultured in 96-well plates at a concentration of 1 × 10 6 cells / well, and 0.2 ml of IMDM medium containing 10% FBS was added thereto, followed by culture in a CO 2 incubator for 24 hours. The sample solution dissolved in DMSO was treated and cultured for 24 hours. After that, MTT assay was performed to examine cell viability. For MTT assay, 0.1 ml of MTT solution was added to the cultured cells, followed by incubation for 4 hours. Then, the medium was removed, and 0.5 ml of DMSO was added to the formed formazan, and the absorbance was measured at 570 nm using ELISA. Cell viability (%) was measured by the following equation, and the results are shown in Table 2 below.

세포 생존율(%) = [(St-Bo)/(Bt-Bo)] ×100Cell survival rate (%) = [(St-Bo) / (Bt-Bo)] 100

Bo : 세포배양 배지만을 발색 반응한 웰의 570nm 흡광도Bo: absorbance at 570 nm of wells that had undergone chromogenic reaction in cell culture medium

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 570nm 흡광도Bt: Absorbance at 570 nm of the well that underwent chromogenic reaction without treatment of the sample

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 570nm 흡광도St: absorbance at 570 nm of the well treated and chromogenic

구분division 세포 생존율(%)Cell survival rate (%) 0.1%0.1% 0.5%0.5% 1.0%1.0% 제조예 1Production Example 1 100100 9595 8888 제조예 2Production Example 2 100100 9797 9494 제조예 3Production Example 3 100100 9898 9595 실시예 1Example 1 100100 9595 9191 실시예 2Example 2 100100 9999 9696 실시예 3Example 3 100100 9797 9292 실시예 4Example 4 100100 100100 9999 실시예 5Example 5 100100 100100 9797 실시예 6Example 6 100100 100100 9393 실시예 7Example 7 100100 100100 9191

상기 표 2에서 알 수 있듯이 상기 제조예 및 실시예 추출물을 적용한 시료 모두 높은 세포 생존률이 확인되었으며, 이는 세포 독성에 미치는 영향이 낮아 상대적으로 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 것으로 확인되었다.As can be seen from the above Table 2, high cell viability was confirmed in all of the samples to which the extracts of Preparation Example and Example were applied, and it was confirmed that the possibility of causing skin irritation was low and safe because of low influence on cytotoxicity.

시험예 2: Hyaluronic acid 생성량 측정Test Example 2: Measurement of hyaluronic acid production

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 Hyaluronic acid 생성량을 측정하였다. HaCaT 세포를 96 well plate에 1×106cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 1.0% 씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 회수한 배양액은 ELISA kit를 이용하여 hyaluronic acid(HA)의 생성량을 측정하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다. The amounts of hyaluronic acid produced by the samples of the honey extracts prepared in the above Preparation Examples and Examples were Respectively. HaCaT cells were cultured in a 96-well plate at a concentration of 1 × 10 6 cells / well, starved for 18 hours, and cultured for 24 hours. HaCaT cells were treated with 1.0% of each sample, cultured for 24 hours, and the amount of hyaluronic acid (HA) produced was measured using an ELISA kit. The results are shown in Fig.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 처리하여 반응시킨 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물에 비하여 훨씬 높은 HA 생성량을 나타내었으며, 유산균이나 효모 발효 추출물에 비해서도 우수한 효과를 나타내었다. 그 중에서도, 나린지나아제와 펙티나아제를 1:2로 혼합하여 효소 반응한 실시예 4의 시료에서 가장 우수한 히알루론산 생성 효과를 나타냈다.As can be seen from FIG. 1, the honey extract of the present invention, which was obtained by treating a mixed enzyme of naringinase and pectinase, showed a much higher amount of HA than that of the general solvent extract. In comparison with the lactic acid bacteria and yeast fermented extract And showed excellent effects. Among them, the sample of Example 4 in which Naringinase and Pectinase were mixed at a ratio of 1: 2 and subjected to an enzymatic reaction showed the best hyaluronic acid producing effect.

시험예 3: HAS mRNA 발현 증가 효과Test Example 3: Increased expression of HAS mRNA

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 HAS mRNA 발현량을 측정하였다. HaCaT 세포를 96 well plate에 1×106cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 1.0%씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 세포는 RT-PCR을 이용하여 hyaluronic acid synthase(HAS) mRNA 발현량을 조사하였다. HAS-3 발현 증가율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 도 2에 나타내었다. The amounts of HAS mRNA expressed by the honey extract samples prepared in the above Preparation Examples and Examples were Respectively. HaCaT cells were cultured in a 96-well plate at a concentration of 1 × 10 6 cells / well, starved for 18 hours, and cultured for 24 hours. HaCaT cells were treated with 1.0% of each sample and cultured for 24 hours. Then, hyaluronic acid synthase (HAS) mRNA expression was measured by RT-PCR. The HAS-3 expression increase rate was calculated by the following equation, and the results are shown in FIG.

HAS-3 발현증가율(%)=(시료 HAS-3 발현양/대조군 HAS-3 발현양)×100(%) = (Expression amount of sample HAS-3 / expression amount of control HAS-3) × 100

도 2에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 처리하여 반응시킨 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물에 비하여 훨씬 높은 HAS-3 발현증가율을 나타내었으며, 나린지나아제와 펙티나아제를 1 : 2~3으로 혼합하여 효소 반응한 실시예 4, 5의 시료에서는 유산균이나 효모 발효 추출물에 비해서도 우수한 효과를 나타내었다.As shown in FIG. 2, the honey extract of the Example of the present invention, which was obtained by treating a mixed enzyme of Naringinase and Pectinase, showed a much higher increase in the expression of HAS-3 than that of a normal solvent extract, The samples of Examples 4 and 5, in which the enzyme reaction was carried out by mixing pectinase 1: 2 to 3, showed excellent effects as compared with those of lactic acid bacteria and yeast fermentation extracts.

시험예 4: MMP-1 생성 억제 효과 시험Test Example 4: Test for inhibiting MMP-1 production

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 96-well plate에 1×106cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 제조예 및 실시예의 시료를 serum이 없는 DMEM 배지에 농도 별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 MMP-1 양은 배양액을 취하여 MMP-1 assay kit(Amersham, USA)를 사용하여 측정하고, 하기식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 adenosine을 사용하였다.Human normal fibroblasts (CCD-986sk cells) were inoculated on a 96-well plate at 1 × 10 6 cells / well and cultured for 24 hours. The samples of the above Preparation Examples and Examples were added to serum-free DMEM medium at different concentrations, and the cells were further cultured for 24 hours to obtain a cell culture medium. The amount of MMP-1 in the cell culture medium was measured using a MMP-1 assay kit (Amersham, USA) by taking the culture medium, and the inhibition rate of MMP-1 production was calculated according to the following formula. At this time, adenosine was used as a positive control for the inhibition rate of MMP-1 production.

Figure 112019008181811-pat00001
Figure 112019008181811-pat00001

시료
농도
(%)
sample
density
(%)
MMP-1 생성 억제율(%)Inhibition rate of MMP-1 production (%)
제조예Manufacturing example 실시예Example AdenosineAdenosine 1One 22 33 1One 22 33 44 55 66 77 0.10.1 12.112.1 18.918.9 19.419.4 26.526.5 45.745.7 40.740.7 47.747.7 46.846.8 44.144.1 32.332.3 46.846.8 0.50.5 23.823.8 35.735.7 40.440.4 44.144.1 61.861.8 60.060.0 68.968.9 64.564.5 58.658.6 44.444.4 64.264.2 1.01.0 35.935.9 44.044.0 53.853.8 60.660.6 80.280.2 78.978.9 85.785.7 83.583.5 80.880.8 67.867.8 83.383.3

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제 2종의 효소를 혼합하여 처리한 실시예의 시료에서 전반적으로 우수한 MMP-1 발현 억제 효과를 나타내었다.As shown in Table 3 above, the samples of the examples treated with the two enzymes of naringinase and pectinase exhibited excellent overall MMP-1 expression inhibitory effect.

시험예 5: 콜라겐 생합성 촉진 효과 시험Test Example 5: Test for promoting collagen biosynthesis

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 96-well plate에 1×106cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 serum이 없는 DMEM 배지에 농도별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 양은 procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio, Japan)을 사용하여 정량하였다. 측정된 콜라겐 양은 Lowry assay로 구한 총 단백질 양으로 보정하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 대조군으로는 아데노신(Adenosine)을 사용하였다.Human normal fibroblasts (CCD-986sk cells) were inoculated on a 96-well plate at 1 × 10 6 cells / well and cultured for 24 hours. The extracts of the above Preparation Examples and Examples were added to serum-free DMEM medium at different concentrations, and the cells were further cultured for 24 hours to obtain a cell culture medium. The amount of collagen in the cell culture was quantitated using procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio, Japan). The amount of collagen measured was corrected to the total amount of protein determined by the Lowry assay. The results are shown in Table 4 below. As a control group, adenosine was used.

시료
농도
(%)
sample
density
(%)
procollagen 발현율(%)procollagen expression rate (%)
제조예Manufacturing example 실시예Example AdenosineAdenosine 1One 22 33 1One 22 33 44 55 66 77 00 2.62.6 2.62.6 2.62.6 2.62.6 2.62.6 2.62.6 2.62.6 2.62.6 2.62.6 2.62.6 2.62.6 0.10.1 8.78.7 9.99.9 11.311.3 18.418.4 22.922.9 13.813.8 24.724.7 23.123.1 22.322.3 20.820.8 27.427.4 0.50.5 18.418.4 17.717.7 25.225.2 33.133.1 38.038.0 28.428.4 42.942.9 41.041.0 36.736.7 31.531.5 43.943.9 1.01.0 28.828.8 34.934.9 48.248.2 47.847.8 50.450.4 44.744.7 58.358.3 54.854.8 48.448.4 41.041.0 59.759.7

상기 표 4에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제 2종의 효소를 혼합하여 처리한 실시예의 시료에서 전반적으로 우수한 콜라겐 생성 촉진 효과를 나타내었으며, 그 중에서도 나린지나아제와 펙티나아제 효소를 1:2로 혼합하여 처리한 실시예 4의 시료에서 가장 우수한 콜라겐 생성 촉진 효과를 나타냈다.As shown in Table 4, the samples of the examples in which the enzymes of two kinds of naringinase and pectinase were mixed, showed excellent collagen production promoting effect overall. Among them, naringinase and pectinase enzyme Were mixed at a ratio of 1: 2, the sample of Example 4 exhibited the best promoting effect of collagen production.

시험예 6: 피부 세포 재생 효과Test Example 6: Skin cell regeneration effect

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물의 피부 재생 효과를 확인하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성세포(HACAT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1×106 cell/well로 조절한 후, 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 6 웰 플레이트(well plate)에 가득 자란 세포에 스크래치를 내어 세포의 일부분을 플레이트 바닥에서 떨어지게 한 다음, 실시예 및 제조예 각각의 시료를 0.5(w/v%)씩 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 세포가 재생된 정도를 확인하였고, 세포재생율을 하기 수학식에 의하여 산출하였다.A wound healing assay was performed to confirm the skin regeneration effect of the honey extracts prepared in the above Preparation Examples and Examples. The keratinocyte (HACAT) was adjusted to 1 × 10 6 cells / well using DMEM supplemented with 10% FBS, and then inoculated in a 6-well plate and cultured for 18 hours. The cells grown in a 6-well plate were scratched to allow a portion of the cells to fall off the bottom of the plate, and the samples of each of the examples and the preparations were treated with 0.5 (w / v%) for 48 hours . The degree of cell regeneration was confirmed, and the cell regeneration rate was calculated by the following equation.

세포재생율(%) = (시료 세포 재생율/대조군 세포 재생율) × 100Cell regeneration rate (%) = (sample cell regeneration / control cell regeneration) x 100

산출된 세포재생율을 하기 표 5에 나타내었다. 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다.The calculated cell regeneration rates are shown in Table 5 below. Dexamethasone was used as a control.

구분division 처리농도(w/v%)Treatment concentration (w / v%) 세포재생율(%) Cell Regeneration (%) 제조예 1Production Example 1 1.01.0 57.957.9 제조예 2Production Example 2 1.01.0 60.660.6 제조예 3Production Example 3 1.01.0 66.366.3 실시예 1Example 1 1.01.0 69.769.7 실시예 2Example 2 1.01.0 79.979.9 실시예 3Example 3 1.01.0 71.471.4 실시예 4Example 4 1.01.0 82.582.5 실시예 5Example 5 1.01.0 80.180.1 실시예 6Example 6 1.01.0 79.579.5 실시예 7Example 7 1.01.0 77.877.8 덱사메타손(Dexamethason)Dexamethason 1.01.0 83.283.2

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 처리하여 반응시킨 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물에 비하여 훨씬 우수한 세포 재생효과를 나타내었으며, 유산균이나 효모 발효 추출물에 비해서도 우수한 효과를 나타내었다.As shown in Table 5, the honey extract of the example of the present invention, which was obtained by treating the mixed enzyme of naringinase and pectinase, exhibited remarkably superior cell regeneration effect than the general solvent extract, and the lactic acid bacteria, yeast fermented extract Which is superior to the conventional method.

시험예 7: 티로시나아제 활성 억제 효과 시험Test Example 7: Test for inhibiting tyrosinase activity

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 티로시나아제 저해 활성을 측정하였다. B16F10 세포에 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)와 상기 제조예 및 실시예의 시료를 처리하여 72시간 배양하였다. 배양 후, 인산 완충액(pH 7.4)으로 세척한 후 원심분리하여 세포 침전물을 얻어 1%(w/v) triton X-100을 함유한 10 mM phosphate buffer(pH 6.8)를 100 μL를 가하고 5분간 shaking 한 후 세포와 용액을 모두 eppendorf tube로 이전시키고 원심분리하여 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 이용하였다. 시료 처리 후 얻은 상층액은 96-well plate에 40 μL를 분주하고, 0.1M sodium phosphate buffer(pH 7.2)에 녹인 10 mM L-DOPA 40 μL를 가하여 37℃에서 30분 동안 배양하였다. Tyrosinase에 의해 생성된 DOPA chrome은 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정결과를 양성대조군인 아스코빅애씨드(Ascorbic acid)를 처리한 대조군(con)의 티로시나아제 저해 활성 대비 각 추출물의 저해활성을 확인하여 표 6에 나타내었다.The tyrosinase inhibitory activity of the honey extract prepared in the above Preparation Examples and Examples was evaluated by Respectively. B16F10 cells were treated with α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) and the samples of the above-mentioned preparation examples and the examples and cultured for 72 hours. After culturing, the cells were washed with phosphate buffered saline (pH 7.4), centrifuged to obtain a cell suspension, 100 μL of 10 mM phosphate buffer (pH 6.8) containing 1% (w / v) triton X-100 was added and shaking After the cells and solution were transferred to an eppendorf tube, the supernatant was used for tyrosinase activity measurement. The supernatant obtained after the sample treatment was dispensed in a 96-well plate and 40 μL of 10 mM L-DOPA dissolved in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.2) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The absorbance of DOPA chrome produced by tyrosinase was measured at 475 nm. The inhibitory activity of each extract against the inhibitory activity of tyrosinase of the control (con) treated with Ascorbic acid, which is a positive control group, was confirmed and the results are shown in Table 6.

시료
농도
(%)
sample
density
(%)
Inhibition ratio(%)Inhibition ratio (%)
제조예Manufacturing example 실시예Example Ascorbic acidAscorbic acid 1One 22 33 1One 22 33 44 55 66 77 0.10.1 13.713.7 19.919.9 18.418.4 28.428.4 32.932.9 21.321.3 35.235.2 33.233.2 23.923.9 20.120.1 48.748.7 0.50.5 18.818.8 27.727.7 24.524.5 36.136.1 48.048.0 33.833.8 53.453.4 50.050.0 43.643.6 31.531.5 59.459.4 1.01.0 32.832.8 32.932.9 40.440.4 56.356.3 58.258.2 44.444.4 61.861.8 59.759.7 49.949.9 47.047.0 70.170.1

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 처리하여 반응시킨 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물이나 유산균, 효모 발효 추출물에 비하여 우수한 티로시나아제 저해활성을 나타내었다.As can be seen in Table 6, the honey extract of the present invention, which was obtained by treating a mixed enzyme of naringinase and pectinase, reacted to exhibit excellent tyrosinase inhibitory activity as compared with general solvent extract, lactic acid bacterium, and yeast fermented extract .

시험예 8: 멜라닌 생성 억제 효과 시험Test Example 8: Test for inhibiting melanin formation

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 멜라닌 생성량을 측정하였다. 멜라닌 생성량 측정을 위해 melanoma cell B16F10을 각각의 시료와 positive control인 ascorbic acid를 농도별로 처리하여 미백 활성을 측정하였다. Melanoma cell B16F10을 96-well plate에 1.0×106 cells/well 농도로 접종한 후 시료를 3일간 처리하였다. 3일 후에 각 well의 배지를 제거한 후에 PBS로 세척하고, 각 well 당 1 mL의 1 N NaOH를 가한 다음 교반시켜 멜라닌 성분이 용출되도록 하였다. 용출된 멜라닌의 함량을 측정하기 위하여 microplate reader를 이용하여 400 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.The amounts of melanin produced by the samples of the honey extracts prepared in the above Preparation Examples and Examples were measured. Melanoma cell B16F10 was treated with ascorbic acid, a positive control, to determine the amount of melanin production. Melanoma cell B16F10 was inoculated on a 96-well plate at a concentration of 1.0 × 10 6 cells / well and treated for 3 days. After 3 days, the medium of each well was removed, washed with PBS, 1 mL of 1 N NaOH was added to each well, and the mixture was stirred to dissolve the melanin component. The absorbance was measured at 400 nm using a microplate reader to measure the content of dissolved melanin. The results are shown in Table 7.

시료
농도
(%)
sample
density
(%)
Melanin production(%)Melanin production (%)
제조예Manufacturing example 실시예Example Ascorbic acidAscorbic acid 1One 22 33 1One 22 33 44 55 66 77 0.10.1 99.699.6 96.296.2 94.494.4 94.394.3 90.390.3 92.392.3 88.388.3 90.090.0 93.993.9 92.092.0 88.788.7 0.50.5 91.391.3 89.989.9 89.789.7 83.183.1 79.479.4 88.588.5 73.673.6 78.878.8 85.285.2 84.784.7 74.174.1 1.01.0 79.879.8 74.474.4 76.576.5 68.768.7 62.162.1 73.973.9 59.759.7 63.463.4 70.670.6 69.469.4 60.360.3

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물이나 유산균, 효모 발효 추출물에 비하여 우수한 미백활성을 나타내었으며, 실시예 4에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.As shown in Table 7, the honey extract of the present invention showed excellent whitening activity as compared with general solvent extract, lactic acid bacteria and yeast fermented extract, and showed the most excellent effect in Example 4.

실시예 8: 효소전환 꿀 추출물을 함유하는 크림 제조Example 8: Preparation of a cream containing an enzyme-converted honey extract

상기 실시예 4의 추출물을 포함한 크림을 하기 표 8의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.The cream containing the extract of Example 4 was prepared according to a conventional method with the composition and content shown in Table 8 below.

성 분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 대조예 1Control Example 1 실시예 8Example 8 꿀 추출물(실시예 4)Honey extract (Example 4) -- 2.02.0 친유형 모노스테아린산글리세린Pro-type glycerin monostearate 2.02.0 2.02.0 스테아릴알콜Stearyl alcohol 2.22.2 2.22.2 스테아린산Stearic acid 1.51.5 1.51.5 밀납Wax 1.01.0 1.01.0 폴리솔베이트 60Polysorbate 60 1.51.5 1.51.5 솔비탄스테아레이트Sorbitan stearate 0.60.6 0.60.6 정화식물유Purified vegetable oil 1.01.0 1.01.0 스쿠알란Squalane 3.03.0 3.03.0 광물유Mineral oil 5.05.0 5.05.0 트리옥타노인Trioctanoin 5.05.0 5.05.0 디메치콘Dimethicone 1.01.0 1.01.0 소듐마그네슘실리케이트Sodium magnesium silicate 0.10.1 0.10.1 글리세린glycerin 5.05.0 5.05.0 베타인Betaine 3.03.0 3.03.0 트리에탄올아민Triethanolamine 1.01.0 1.01.0 소듐히아루로네이트Sodium hyaruronate 4.04.0 4.04.0 방부제, 향, 색소Preservative, fragrance, pigment 미량a very small amount 미량a very small amount 정제수Purified water 잔량Balance 잔량Balance 합계Sum 100100 100100

시험예 9: 피부 각질 개선 효과 확인Test Example 9: Confirmation of skin horny improving effect

피부 각질 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예 8과 대조예 1의 제형을 이용하여 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 각질의 개선 정도를 영상 분석을 통해 평가하였다.In order to confirm the effect of improving the skin's exfoliation, each of 10 persons was applied for 4 weeks twice a day (morning and evening) using the formulations of Example 8 and Control 1. After 4 weeks, the degree of improvement of the keratin was evaluated by image analysis.

실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 안면부의 각질을 측정한 후 4주간 도포(2회/일) 한 후, 피부의 각질 개선도를 영상분석을 통해 각질의 명암 분석으로 각질 상태를 측정하였다. 영상분석에 의한 피부 각질 상태의 측정 결과를 도 3에 도시하였다. Before the start of the experiment, the horny part of the facial part to be measured was measured, and after applying for 4 weeks (twice / day), the horny state of the skin was measured by the horny light and darkness analysis through image analysis. The measurement results of the skin horny condition by image analysis are shown in Fig.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소 전환 꿀 추출물을 함유한 실시예 8의 크림에서 우수한 각질 개선 효과를 나타내었다.As shown in FIG. 3, the cream of Example 8 containing the enzyme-converted honey extract of the present invention exhibited excellent exfoliation improving effect.

시험예 10: 피부 보습 개선 효과 확인Test Example 10: Confirmation of skin moisturizing effect

피부 보습에 대한 임상시험으로 피부 수분 측정기(Corneometer, Courage+Khazaka, GmbH, Germany)를 이용하여 피부전도도를 측정함으로써 피부 보습력을 평가하였다. 피부 수분 측정은 실내온도 20 내지 25℃, 상대습도 40 내지 55%로 유지시킨 항온항습 조건 하에서 실시예 8과 대조예 1의 크림을 10명의 피검자 얼굴을 반으로 나누어 한쪽에는 실시예의 제품을 다른 한쪽에는 대조예의 제품을 2회/1일 도포하면서 사용 전 및 2주 후의 수분 함유량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.Skin moisturization was evaluated by measuring the skin conductivity using a skin moisture meter (Corneometer, Courage + Khazaka, GmbH, Germany) as a clinical test for skin moisturization. The skin moisture was measured by subjecting the cream of Example 8 and the cream of Comparative Example 1 to half of the subject's face in half under constant temperature and humidity conditions maintained at a room temperature of 20 to 25 캜 and a relative humidity of 40 to 55% , The water content of the control sample was measured before and two weeks after the application of the control sample twice / once a day. The results are shown in Table 9 below.

구분division 초기(D0) 평균 The initial (D0) average 2주(D14) 평균2 weeks (D14) Average 수분 증가량(%)Moisture Increase (%) 대조예 1Control Example 1 3232 3636 1313 실시예 8Example 8 3333 4444 3333

상기 표 9에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물을 함유한 실시예 8에서 높은 보습효과를 나타내었다.As can be seen in Table 9, high moisturizing effect was shown in Example 8 containing the enzyme-converted honey extract of the present invention.

시험예 11: 피부 주름 개선 효과 확인Test Example 11: Confirmation of the effect of improving skin wrinkles

피부 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예 8과 대조예 1의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 주름의 개선 정도를 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.In order to confirm the effect of improving the wrinkles of the skin, the formulations of Example 8 and Comparative Example 1 were applied to the face portion for 2 weeks (morning and evening) for 4 weeks for each 10 persons. After 4 weeks, the improvement of wrinkles was evaluated by image analysis of wrinkles.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 10에 나타내었다.The evaluation of the wrinkles by the image analysis was performed by taking replica under the eyes before the start of the experiment and collecting the replica immediately after the end of the experiment from the same area under the eyes and by analyzing the image by two dimensional analysis of the wrinkles, Were measured. The results of the measurement of the wrinkle density by image analysis are shown in Table 10 below as a reduction rate relative to the wrinkle density before use.

구분division 주름 밀도 감소율 (%)Wrinkle density reduction rate (%) 대조예 1Control Example 1 44 실시예 8Example 8 2121

상기 표 10에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물을 함유한 실시예 8에서 높은 주름개선 효과를 나타내었다.As shown in Table 10, the wrinkle-improving effect was shown in Example 8 containing the enzyme-converted honey extract of the present invention.

시험예 12: 피부 톤 개선 효과 확인Test Example 12: Confirmation of skin tone improvement effect

피부 톤 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예8, 대조예 1의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 피부의 톤 을 측정한 후 4주간 도포(2회/일) 한 후, 피부의 톤 개선도를 색차계를 사용하여 측정하였다. 색을 표시하는 데에는 L*, a*, b* 표색계를 쓰며 본 실험에서는 주로 L*값(명도)을 지표로 하였다. L*값은 검정색(L*=0)으로부터 흰색(L*=100) 까지를 나타내며 4주 후의 ΔL*를 구하여, 그 결과를 하기 표 11에 정리하였다.In order to confirm the effect of improving the skin tone, the formulations of Example 8 and Control Example 1 were applied to each of 10 persons for 4 weeks twice a day (morning and evening) on the face. Before the start of the experiment, the skin tone to be measured was measured, and after applying for 4 weeks (twice / day), the tone improvement degree of the skin was measured using a colorimeter. L *, a *, and b * color systems are used to represent color, and L * value (brightness) is used as an index in this experiment. L * values are from black (L * = 0) to white (L * = 100), and ΔL * after 4 weeks is calculated. The results are summarized in Table 11 below.

구분division ΔL* DELTA L * 대조예 1Control Example 1 0.430.43 실시예 8Example 8 7.977.97

상기 표 11에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물을 함유한 실시예 8에서 높은 피부 톤 개선 효과를 나타내었다.As shown in Table 11, the skin tone improvement effect was high in Example 8 containing the enzyme-converted honey extract of the present invention.

실시예 9~11: 효소 전환 꿀 추출물과 피부유용성분을 함유하는 크림 제조Examples 9 to 11: Production of a cream containing an enzyme-converted honey extract and a skin-active ingredient

상기 실시예 4의 추출물과 피부유용성분인 기능성 원료를 포함한 크림을 하기 표 12의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.The extract of Example 4 and the cream containing the functional ingredient, which is a useful ingredient for the skin, were prepared according to the conventional methods with the composition and contents shown in Table 12 below.

성 분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 비교예Comparative Example 실시예Example 1One 22 33 99 1010 1111 꿀 추출물(실시예 4)Honey extract (Example 4) -- -- -- 1.01.0 1.01.0 1.01.0 히알루론산Hyaluronic acid 2.52.5 -- -- 1.51.5 -- -- 아데노신Adenosine -- 1.51.5 -- -- 0.50.5 -- 알부틴Arbutin -- -- 2.52.5 -- -- 1.51.5 친유형 모노스테아린산글리세린Pro-type glycerin monostearate 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 스테아릴알콜Stearyl alcohol 2.22.2 2.22.2 2.22.2 2.22.2 2.22.2 2.22.2 스테아린산Stearic acid 1.51.5 1.51.5 1.51.5 1.51.5 1.51.5 1.51.5 밀납Wax 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 폴리솔베이트 60Polysorbate 60 1.51.5 1.51.5 1.51.5 1.51.5 1.51.5 1.51.5 솔비탄스테아레이트Sorbitan stearate 0.60.6 0.60.6 0.60.6 0.60.6 0.60.6 0.60.6 정화식물유Purified vegetable oil 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 스쿠알란Squalane 3.03.0 3.03.0 3.03.0 3.03.0 3.03.0 3.03.0 광물유Mineral oil 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 트리옥타노인Trioctanoin 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 디메치콘Dimethicone 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 소듐마그네슘실리케이트Sodium magnesium silicate 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 글리세린glycerin 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 베타인Betaine 3.03.0 3.03.0 3.03.0 3.03.0 3.03.0 3.03.0 트리에탄올아민Triethanolamine 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 소듐히아루로네이트Sodium hyaruronate 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 방부제, 향, 색소Preservative, fragrance, pigment 미량a very small amount 미량a very small amount 미량a very small amount 미량a very small amount 미량a very small amount 미량a very small amount 정제수Purified water 잔량Balance 잔량Balance 잔량Balance 잔량Balance 잔량Balance 잔량Balance

시험예 13: 피부 보습 개선활성 증진 효과 Test Example 13: Effect of improving skin moisturizing activity

피부 보습에 대한 임상시험으로 피부수분측정기(Corneometer, Courage+Khazaka, GmbH, Germany)를 이용하여 피부전도도를 측정함으로써 피부 보습력을 평가하였다. 피부 수분 측정은 실내온도 20 내지 25 ℃, 상대습도 40 내지 55%로 유지시킨 항온항습 조건 하에서 실시예 9와 비교예 1의 화장료를 10명의 피검자 얼굴을 반으로 나누어 한쪽에는 실시예의 제품을 다른 한쪽에는 비교예의 제품을 도포(2회/1일)하면서 사용 전 및 2주후의 수분 함유량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.Skin moisturization was evaluated by measuring the skin conductivity using a skin moisture meter (Corneometer, Courage + Khazaka, GmbH, Germany) as a clinical test for skin moisturization. The skin moisture was measured by subjecting the cosmetic compositions of Example 9 and Comparative Example 1 to half of the subject's face in half under constant temperature and humidity conditions maintained at a room temperature of 20 to 25 캜 and a relative humidity of 40 to 55% , The moisture content before and after 2 weeks was measured while applying the product of the comparative example (twice / day). The results are shown in Table 13 below.

구분division 초기(D0) 평균 The initial (D0) average 2주(D14) 평균2 weeks (D14) Average 수분 증가량(%)Moisture Increase (%) 비교예 1Comparative Example 1 3232 4444 3737 실시예 9Example 9 3131 4747 5252

상기 표 13에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물과 히알루론산을 함께 함유한 실시예 9는 히알루론산만을 함유한 비교예 1에 비하여 수분증가량이 높게 나타나, 본 발명의 꿀 추출물은 제형 내에서 함께 사용되는 보습성분인 히알루론산의 활성을 크게 상승시키는 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다. As can be seen from the above Table 13, in Example 9 containing the enzyme-converted honey extract of the present invention and hyaluronic acid together, the moisture increase was higher than that of Comparative Example 1 containing only hyaluronic acid. Which is a moisturizing ingredient used together with the hyaluronic acid.

시험예 14: 피부 주름 개선활성 증진 효과Test Example 14: Effect of enhancing skin wrinkle improving activity

피부 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예 10과 비교예 2의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 주름의 개선 정도를 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.In order to confirm the effect of improving the wrinkles of the skin, the formulations of Example 10 and Comparative Example 2 were applied for 10 weeks to each face for 2 weeks (morning and evening) for 4 weeks. After 4 weeks, the improvement of wrinkles was evaluated by image analysis of wrinkles.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 14에 나타내었다.The evaluation of the wrinkles by the image analysis was performed by taking replica under the eyes before the start of the experiment and collecting the replica immediately after the end of the experiment from the same area under the eyes and by analyzing the image by two dimensional analysis of the wrinkles, Were measured. The measurement results of the wrinkle density by the image analysis are shown in Table 14 below as a reduction rate relative to the wrinkle density before use.

구분division 주름 밀도 감소율 (%)Wrinkle density reduction rate (%) 비교예 2Comparative Example 2 1717 실시예 10Example 10 2929

상기 표 14에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물과 아데노신을 함께 함유한 실시예 10은 아데노신만을 함유한 비교예 2에 비하여 주름 밀도 감소율이 높게 나타났다. 본 발명의 꿀 추출물을 주름개선활성성분인 아데노신과 함께 사용하는 경우, 피부유용성분인 아데노신을 더 적게 함유하여도 더 우수한 주름개선효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.As shown in Table 14, Example 10 containing the enzyme-converted honey extract of the present invention and adenosine together exhibited a higher wrinkle density reduction ratio than Comparative Example 2 containing only adenosine. When the honey extract of the present invention is used together with adenosine, which is an active ingredient for improving wrinkles, it can be seen that even with less adenosine, a useful component of the skin, it exhibits a more excellent wrinkle-reducing effect.

시험예 15: 피부 톤 개선에 대한 상승 효과Test Example 15: Synergistic effect on skin tone improvement

피부 톤 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예 11과 비교예 3의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 피부의 톤 을 측정하였다. 4주간 도포(2회/일) 한 후, 피부의 톤 개선도를 색차계를 사용하여 측정하였다. 색을 표시하는 데에는 L*, a*, b*표색계를 쓰며 본 실험에서는 L*값(명도)을 지표로 하였다. L*값은 검정색(L*=0)으로부터 흰색(L*=100) 까지를 나타내며 4주 후의 ΔL*를 구하여, 그 결과를 하기 표 15에 정리하였다.In order to confirm the effect of improving the skin tone, the formulations of Example 11 and Comparative Example 3 were applied to the facial area twice a day (morning and evening) for 10 weeks, respectively, for 10 weeks. Prior to the start of the experiment, the tones of the skin to be measured were measured. After 4 weeks of application (twice / day), the tone improvement of the skin was measured using a colorimeter. L *, a *, b * colorimetric system is used to display color, and L * value (brightness) is used as an index in this experiment. The L * values are from black (L * = 0) to white (L * = 100), and ΔL * after 4 weeks is obtained. The results are summarized in Table 15 below.

구분division ΔL* DELTA L * 비교예 3Comparative Example 3 8.428.42 실시예 11Example 11 10.7010.70

상기 표 15에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물과 알부틴을 함께 함유한 실시예 11에서 더 우수한 피부 톤 개선효과를 나타내는 것을 확인하였다.As shown in Table 15, it was confirmed that Example 11 containing the enzyme-converted honey extract of the present invention and arbutin together showed a better skin tone improving effect.

Claims (7)

나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)의 혼합효소를 처리하여 제조되는 꿀 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 15 중량% 함유하는 화장료 조성물.A cosmetic composition comprising a honey extract prepared by treating a mixed enzyme of naringinase and pectinase in an amount of 0.01 to 15% by weight based on the total weight of the cosmetic composition. 제1항에 있어서, 상기 혼합효소는 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)가 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.The cosmetic composition according to claim 1, wherein the mixed enzyme comprises naringinase and pectinase in a weight ratio of 1: 3: 1 to 3, respectively. 제1항에 있어서, 상기 혼합효소의 처리는 반응 pH 4.5, 반응온도 48℃ 및 반응시간 48시간의 조건하에서 효소 반응을 진행하는 것으로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.The cosmetic composition according to claim 1, wherein the enzyme treatment is carried out under the conditions of a reaction pH of 4.5, a reaction temperature of 48 ° C, and a reaction time of 48 hours. 제1항에 있어서, 상기 꿀 추출물은 화장료 조성물에 함께 포함되는 피부유용성분의 활성을 증진시키는 효과를 나타내는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.[Claim 2] The cosmetic composition according to claim 1, wherein the honey extract exhibits an effect of enhancing the activity of a skin benefit component contained in the cosmetic composition. 제4항에 있어서, 상기 피부유용성분은 아데노신, 알부틴 및 히알루론산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.The cosmetic composition according to claim 4, wherein the skin benefit component is at least one selected from the group consisting of adenosine, arbutin and hyaluronic acid. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부각질 제거용, 피부 보습용, 미백용 또는 피부 주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물. [Claim 7] The cosmetic composition according to claim 1, wherein the cosmetic composition is used for skin exfoliation, skin moisturizing, whitening or skin wrinkle improvement. (A)꿀을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계;
(B)여과 후 감압 농축하고 건조하여 꿀 용매추출 분말을 제조하는 단계;
(C)상기 꿀 용매추출 분말에 정제수를 가하고, 나린지나아제와 펙티나아제가 각각 1~3:1~3의 중량 비율로 혼합되어 이루어지는 혼합효소를 첨가하는 단계;
(D)pH 4.5, 48℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시키는 단계; 및
(E)살균 후 감압 농축 및 동결 건조하는 단계를 포함하는 꿀 추출물의 제조방법.





(A) extracting honey with at least one solvent selected from the group consisting of water, lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, glycerin, ethylene glycol, propylene glycol and butylene glycol;
(B) filtration, followed by concentration under reduced pressure and drying to prepare a honey extract powder;
(C) adding purified water to the honey solvent extract powder, adding a mixed enzyme comprising naringinase and pectinase in a weight ratio of 1 to 3: 1 to 3, respectively;
(D) stirring the enzyme reaction at pH 4.5 and 48 ° C for 48 hours with stirring; And
(E) sterilization, followed by concentration under reduced pressure and lyophilization.





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