KR101994775B1 - 다공성 실리카 나노복합체 약물전달체 및 그의 제조방법 - Google Patents

다공성 실리카 나노복합체 약물전달체 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기공을 갖는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어; 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 기공의 표면에 결합된 결합체를 포함하는 표면처리부; 포함하는 다공성 실리카 나노복합체를 제공한다. 본 발명의 다공성 실리카 나노복합체는 다공성 실리카 나노입자 코어의 기공 내부 및 표면을 개질시키고, 코어의 표면에 쉘을 형성함으로써, 기공 내부에 담지된 약물 분자의 관능기 및 크기에 따라 방출속도를 제어할 수 있는 효과가 있다.

Description

다공성 실리카 나노복합체 약물전달체 및 그의 제조방법{POROUS SILICA NANOCOMPOSITE DRUG DELIVERY SYSTEM AND METHOD FOR REPARING THE SAME}
본 발명은 다공성 실리카 나노복합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 약물 전달체로 사용될 수 있는 다공성 실리카 나노복합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
약물전달시스템은 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물, 예를 들어, 단백질, 핵산, 또는 기타 저분자 등을 효율적으로 전달할 수 있도록 하는 의약 기술을 의미한다. 신약개발에 필요한 비용과 시간을 절감해 주는 상기 기술은 최근 나노기술과 결합하면서 의약계에서 새로운 부가가치를 창출하는 첨단기술의 한 분야로 자리 잡고 있으며, 미국과 일본 등 기술선진국들은 지난 80년대 후반부터 제약회사 등 기업을 중심으로 신약 개발과 함께 약물전달시스템의 개발에 전력을 쏟아 왔다
치료 약물 전달에 사용되는 가장 일반적인 나노 캐리어는 리포솜, 미셀, 덴드리머, 나노 입자, 무기 물질 등이 있다. 그러나 이러한 나노 캐리어는 비효율적 인 세포 흡수, endosomal escape, target area에 도달하기 전에 발생하는 조기 분비로 인하여 많은 단점을 가지고 있었다. 최근에 나노 구조 무기 물질은 제어된 약물 전달 시스템의 설계를 위한 연구가 진행되고 있다. 이러한 물질은 금 나노 입자, 자성 나노 입자, 메조 포러스 실리카 나노 입자(MSNs)를 포함한다. 약물 운반 용기의 크기는 매크로 (1-100 mm), 마이크로 스케일 (1-100 μm), 나노 스케일 (1-100 nm)의 세 그룹으로 분류할 수 있다. 매크로 스케일 전달 요원은 일반적으로 생체 분자를 장기로 수송하는 데 사용되며 마이크로 스케일 캐리어는 조직을 대상으로 사용된다. 그러나 생의학 분야에서 나노 크기의 담체는 세포 엔도시토시스(endocytosis)를 통해 세포 수준, 세포질, 핵과 같은 세포 수준에서 치료제를 전달하기 위해 사용된다.
암세포를 선택적으로 표적화 할 수 있는 나노 캐리어 내 항암제의 캡슐화는 부작용을 감소시킬 뿐 아니라 기존의 화학 요법의 효과를 향상시킬 것으로 기대된다. 현재 알려진 전달 물질 중에서 MSN은 경제적인 제조, 비 독성 특성, 큰 표면적 및 실라놀 그룹의 높은 밀도 때문에 나노 의학 응용 분야의 실질적인 후보자로서 중요한 관심을 끌고 있다. MSN의 구조적인 특성은 기공 터널에 항암제를 로딩할 수 있다. 또한, 실라놀 함유 표면은 치료제의 약물 동력학 및 약력을 향상시킬 수 있는 다양한 기능성 리간드로 쉽게 변형된다. 특히 약물을 캡슐화하는 기공 터널은 다양한 게이트 키퍼로 봉인될 수 있으며 제어된 약물 방출을 통한 자극-반응성 약물 전달 시스템을 설계할 기회를 제공한다. MSN의 표면은 티올, 아민, 카르복실산, 알콕시 그룹 및 방향족 그룹과 같은 다양한 기능성 유기물로 합성 후 그라프팅 및/또는 공응축 졸 - 겔 방법을 통해 변형될 수 있다. 생성된 유기 - 무기 하이브리드 물질은 표적 약물 전달 및 현저한 암 치료를 위한 이상적인 발판으로 간주된다.
주로 MSN에서의 약물 방출에 영향을 미치는 세 가지 요인은 기공 벽의 전체 세공 용적, 입자 크기 및 물리 화학적 특성으로 간주된다. 200nm보다 큰 입자는 약물 전달체로서 혈류에서 짧은 반감기를 갖는다. 대형 캐리어는 포유동물 세포에 의해 삼킬 수 없기 때문에 세포 내 약물 전달에 대해 제한적이다. 게다가, ~ 100nm보다 작은 입자는 메조 구조가 불규칙하게 정렬되는 경향이 있다. 따라서, 잘 배열 된 메조 구조는 보통 100nm보다 큰 입자로부터 얻을 수 있다. 최적의 약물 보유와 조절된 방출을 보장하기 위해서는 약물 분자와 상호 작용할 수 있는 특정 리간드로 기공 표면을 기능화시켜야 하고, 그 다음에 다공성 구조에서 약물 보유력을 연장시킬 필요가 있다. 메조기공성(mesoporous) 물질의 기공 직경은 약물 방출 속도를 결정할 수 있는 중요한 요소이며 일반적으로 기공 크기의 감소가 약물의 방출을 지연시킨다. 또한, 내부 기공 벽의 적절한 기능화는 약물 분자에 대한 결합강도를 조정함으로써 방출 속도에 영향을 줄 수 있다.
지금까지 바이러스 유전자, 재조합 단백질, 리포좀(liposome), 양이온성 고분자, 그리고 다양한 형태의 나노입자와 나노물질들이 동물 세포 내로의 약물전달을 위해 이용되었다. 그러나 많은 양이온성 리포좀들과 양이온성 고분자들은 임상에 적용하기에는 세포에 독성이 강하여 부적합한 것으로 밝혀졌다. 또한, 안정적인 핵산의 세포막 투과를 위하여 핵산의 주 사슬을 화학적으로 변형시키는 방법도 시도되었다. 그러나, 이러한 방법은 비용이 비싸고 오랜 시간이 걸리며 노동 집약적인 공정이 요구되므로 임상 적용에는 적합하지 않다. 양자점, 자성 입자, 또는 금 나노입자를 포함한 다양한 형태의 나노입자를 이용한 약물전달 시스템(Drug delivery system, DDS)이 개발된 바 있다. 예를 들어, "다공성 실리콘 입자를 이용한 영상진단 약물전달체 및 그의 제조방법(대한민국 공개특허 제2010-0117433호)" 등의 관련 연구가 있었다. 그러나, 이러한 입자들은 세포에 독성을 가지며 핵산 등의 생체고분자의 도입에 용이하지 않은 구조를 가지고 있다는 문제점이 있다
제어된 약물 방출을 위한 초분자 나노 기공은 일반적으로 비공유 상호 작용을 통해 MSN 또는 이동 환형 분자의 기공 표면에 공유 결합된 고정화된 분자로 장식되어있다. MSN은 잘 정의된 구조와 고밀도의 표면 실라놀 그룹을 보유하고 있으며, 이는 다양한 작용기로 추가로 변형될 수 있다. MSN의 표면 기능은 nanopores 내부 또는 외부의 특정 기능 기와의 화학적 상호 작용을 통해 일어날 수 있는 약물 방출 제어를 위해 MSN의 표면 전하 및 기공 크기를 제어하는 데 중요하다. 이와 관련하여, MSN 시스템은 조절된 약물 방출을 위해 기공 채널을 통해 확산 분자와 상호 작용할 수 있는 내부 및 외부 작용기를 갖춘 초분자성 나노 기공을 가질 필요가 있다. 또한, 다공성 실리카 나노입자에 담지된 약물 분자의 크기에 따라 약물이 방출되는 속도를 제어할 수 있는 연구가 필요한 것으로 판단된다.
본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로, 다공성 실리카 나노입자 코어의 기공 내부 및 표면을 개질시키고, 코어의 표면에 쉘을 형성함으로써, 기공 내부에 담지된 약물 분자의 관능기 및 크기에 따라 방출속도를 제어할 수 있는 약물 전달체인 다공성 실리카 나노복합체를 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 기공을 갖는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어; 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 기공의 표면에 결합된 결합체를 포함하는 표면처리부; 포함하는 다공성 실리카 나노복합체를 제공한다.
상기 다공성 실리카 나노복합체가 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면, 상기 기공의 표면, 또는 상기 표면처리부 상에 담지되고, 약물을 포함하는 확산부; 및 상기 코어 및 표면처리부의 둘러싸고, 다공성 코팅층을 포함하는 쉘; 을 추가로 포함할 수 있다.
상기 결합체가 아래 구조식 1로 표시되는 구조로 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 기공의 표면에 결합될 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112017038869433-pat00001
상기 구조식 1에서,
X는
Figure 112017038869433-pat00002
,
Figure 112017038869433-pat00003
, 또는
Figure 112017038869433-pat00004
이고,
Y는 O 또는 S이고,
Z는
Figure 112017038869433-pat00005
,
Figure 112017038869433-pat00006
, 또는
Figure 112017038869433-pat00007
이고,
m은 1 내지 9의 정수 중 어느 하나이다.
상기 기공이 터널형 메조기공일 수 잇다.
상기 터널형 메조기공의 직경이 5 내지 15nm일 수 있다.
상기 결합체가 형광물질을 포함할 수 있다.
상기 실리카 나노입자와 상기 결합체를 서로 공유결합시키는 화합물이 아미노실란 유도체일 수 있다.
상기 아미노실란 유도체가 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS), 3-aminopropyltriethoxysilane(APTES), [3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane 및 N1-(3-trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 형광물질이 fluorescein isothiocyanate (FITC), 로다민 B 이소티오시안산염(Rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 테트라메틸로다민-5-이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate), 텍사스레드(Texas red), 아미노메틸쿠마린(Aminomethylcoumarin), 사이아닌(Cyanine) 및 메가스톡스(Megastokes) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 약물의 크기가 0.3 내지 1.2nm일 수 있다.
상기 약물이 이부프로펜(ibuprofen, Ibu), fluorescein isothiocyanate (FITC), cisplatin 및 doxorubicin 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 기공의 크기를 조절하여 상기 약물의 방출속도를 제어할 수 있다.
상기 결합체 및 다공성 코팅층 중 1종 이상이 약물의 방출 속도를 감소시키는 작용을 할 수 있다.
상기 결합체가 상기 약물의 방출 경로를 증가시킬 수 있다.
상기 결합체가 0.3 내지 0.6nm 크기의 약물의 방출속도를 제어할 수 있다.
상기 다공성 코팅층이 0.8 내지 1.2nm 크기의 약물의 방출속도를 제어할 수 있다.
상기 약물은 다공성 실리카 나노복합체가 존재하는 곳의 pH가 높을수록 상기 약물의 방출속도가 증가할 수 있다.
상기 다공성 코팅층이 폴리도파민, Chitosan, Poly(N-isopropylacrylamide) 및 Poly(Lactide-co-Glycolide) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면, (a) 기공을 갖는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어를 제조하는 단계; (b) 결합체를 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 기공의 표면에 결합시켜 상기 결합체를 포함하는 표면처리부를 형성하는 단계; (c) 약물을 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면, 상기 기공의 표면, 또는 상기 표면처리부 상에 담지시켜 상기 약물을 포함하는 확산부를 형성하는 단계; 및 (d) 다공성 코팅층 전구체를 단계 (c)의 결과물 존재 하에 반응시켜 상기 코어 및 표면처리부를 둘러싸고, 다공성 코팅층을 포함하는 쉘을 형성하는 단계; 를 포함할 수 있다.
단계 (a)의 상기 다공성 실리카 나노입자가 양이온성 계면활성제 존재하에서 실리카 전구체를 졸-겔 반응시켜 제조될 수 있다.
단계(a)가 (a-1) 양이온성 계면활성제, 실리콘 알콕사이드를 혼합하여 졸-겔 반응하여 혼합용액을 제조하는 단계; (a-2) 상기 혼합용액을 원심분리하여 생성물을 얻는 단계; 및 (a-3) 상기 생성물에서 양이온성 계면활성제를 제거하고, 건조시켜 기공을 포함하는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어를 제조하는 단계; 를 포함할 수 있다.
본 발명은 다공성 실리카 나노입자 코어의 기공 내부 및 표면을 개질시키고, 코어의 표면에 쉘을 형성함으로써, 기공의 크기 및 약물과 기공표면의 상호작용을 조절하여 내부에 담지된 약물 분자의 관능기 및 크기에 따라 방출속도를 제어할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 실시예 1 및 2의 다공성 실리카 나노복합체의 형태 및 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 실시예 1 및 2의 다공성 실리카 나노복합체의 약물 방출을 나타낸 개략도이다.
도 3은 제조예 1 다공성 실리카, 실시예 1 및 실시예 2의 다공성 실리카 나노복합체의 동적광 산란(Dynamic light scattering)을 분석 결과이다.
도 4는 제조예 1의 다공성 실리카 및 실시예 1의 다공성 실리카 나노복합체의 BJH 분석에 의한 질소 흡착 / 탈착 등온선 및 기공 크기 분포 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 CTAB 제거 전 후의 질소 흡착 / 탈착 등온선(a), MSN의 BJH 흡착으로 인한 기공 크기 분포(b)를 분석한 결과이다.
도 6은 제조예 1, 실시예 1, 시험제조예 2, 및 시험제조예 3의 SEM 및 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 제조예 1, 실시예 1 및 시험제조예 1의 FT-IR분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 제조예 1, 실시예 1 및 시험제조예 1의 발광(Photoluminescence) 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 시험제조예 3 및 시험제조예 2의 이부프로펜의 흡광과 방출시간의 상관관계를 나타낸 결과이다.
도 10은 시험제조예 3 및 시험제조예 4의 Fick의 법칙과 제곱근시간의 상관관계에 의한 방출데이터 결과(a, c)와 K-P모델과 누적시간 상관관계에 의한 방출 데이터 결과(b, d)를 나타낸 것이다.
도 11은 시험제조예 5 및 6의 FITC 흡광도 프로파일(a), FITC 방출량과 시간의 상관 관계(b), 방출량 대 제곱근 시간의 모델 적합성(c) 및 누적량 대 방출량의 모델 적합성(d) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실시예 2 및 시험제조예 7의 FITC 흡광도 프로파일(a), FITC 방출량과 시간의 상관 관계(b), 방출량 대 제곱근 시간의 모델 적합성(c) 및 누적량 대 방출량의 모델 적합성(d) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 MSN 시스템의 제어 방출에 영향을 미치는 세 가지 요소의 도식적으로 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
또한, 이하에서 사용될 제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또한, 어떤 구성요소가 다른 구성요소 상에 "형성되어" 있다거나 "적층되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소의 표면 상의 전면 또는 일면에 직접 부착되어 형성되어 있거나 적층되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 더 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명의 다공성 실리카 나노복합체에 대해 설명하도록 한다.
도 1은 다공성 실리카 나노복합체의 제조과정 및 개략도를 나타낸 것이다.
본 발명은 기공을 갖는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어; 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 기공의 표면에 결합된 결합체를 포함하는 표면처리부; 포함하는 다공성 실리카 나노복합체를 제공한다.
상기 다공성 실리카 나노복합체는 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면, 상기 기공의 표면, 또는 상기 표면처리부 상에 담지되고, 약물을 포함하는 확산부; 및 상기 코어 및 표면처리부의 둘러싸고, 다공성 코팅층을 포함하는 쉘; 을 추가로 포함할 수 있다.
상기 결합체는 아래 구조식 1로 표시되는 구조로 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 기공의 표면에 결합될 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112017038869433-pat00008
상기 구조식 1에서,
X는
Figure 112017038869433-pat00009
,
Figure 112017038869433-pat00010
, 또는
Figure 112017038869433-pat00011
이고,
Y는 O 또는 S이고,
Z는
Figure 112017038869433-pat00012
,
Figure 112017038869433-pat00013
, 또는
Figure 112017038869433-pat00014
이고,
m은 1 내지 9의 정수 중 어느 하나이다.
상기 기공은 터널형 메조기공일 수 있으며, 상기 터널형 메조기공의 직경은 5 내지 15nm, 바람직하게는 5 내지 12nm, 더욱바람직하게는 5 내지 10nm일 수 있다.
상기 결합체는 형광물질을 포함할 수 있다.
상기 결합체는 실리카 표면 또는 다공의 표면을 개질시키는 표면개질제일 수 있으며, 실리카 표면 또는 다공의 표면을 개질시켜 기공의 표면적을 증가시킬 수 있다.
상기 실리카 나노입자와 상기 결합체를 서로 공유결합시키는 화합물이 아미노실란 유도체일 수 있다.
상기 결합체는 아미노실란 유도체와 형광물질이 결합될 수 있으며, 상기 아미노실란 유도체와 형광물질은 공유결합으로 결합될 수 있다.
상기 아미노실란 유도체는 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS), 3-aminopropyltriethoxysilane(APTES), [3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane, N1-(3-trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine 등일 수 있으며, 바람직하게는 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)사용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되는 것은 아니다.
상기 형광물질은 fluorescein isothiocyanate(FITC), 로다민 B 이소티오시안산염(Rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 테트라메틸로다민-5-이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate), 텍사스레드(Texas red), 아미노메틸쿠마린(Aminomethylcoumarin), 사이아닌(Cyanine), 메가스톡스(Megastokes) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 fluorescein isothiocyanate(FITC)를 사용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되는 것은 아니다.
상기 약물의 크기가 0.3 내지 1.2nm일 수 있다.
상기 약물은 이부프로펜(ibuprofen, Ibu), cisplatin, doxorubicin 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이부프로펜을 사용할 수 있으나, 범위가 여기에 한정되는 것은 아니다
상기 기공의 크기를 조절하여 상기 약물의 방출속도를 제어할 수 있다.
상기 결합체 및 다공성 코팅층 중 1종 이상은 약물의 방출 속도를 감소시키는 작용을 할 수 있다.
결합체와 다공성 코팅층의 시너지 효과로 약물이 방출되는 입구가 막힘에 따라 약물의 방출속도를 조절할 수 있다.
상기 결합체는 상기 약물의 방출 경로를 증가시킬 수 있다.
상기 결합체는 기공 내부가 회선상의 통로가 되도록 할 수 있다. 상기 기공내부가 결합체에 의해 회선상의 통로가 형성됨에 따라, 기공 내부에 담지된 약물이 방출되는 경로가 증가할 수 있다.
상기 결합체는 0.3 내지 0.6nm크기의 약물의 방출속도를 제어할 수 있다.
상기 결합체는 다공성 실리카 코어의 표면 또는 기공의 표면 그라프트(Graft) 결합할 수 있다.
결합체에 의해 다공성 실리카의 표면과 약물 사이의 수소결합이 감소함에도 불구하고, 결합체가 앵커링 효과(anchoring effect)에 의해 작은 분자의 방출속도가 늦춰지는 효과가 있다.
상기 다공성 코팅층은 0.8 내지 1.2nm 크기의 약물의 방출속도를 제어할 수 있다.
다공성 코팅층은 약물이 방출되는 기공의 입구를 폐쇄하는 효과가 있어, 상대적으로 분자크기가 큰 약물 분자의 방출속도를 제어할 수 있다.
상기 약물은 다공성 실리카 나노복합체가 존재하는 곳의 pH가 높을수록 상기 약물의 방출속도가 증가할 수 있다.
다공성 실리카 나노복합체가 존재하는 곳의 pH가 높으면 약물 분자(이부프로펜)에 포함된 카르복실기의 negative charge가 증가하게 되며, 이는 약물과 다공성 실리카의 표면 사이의 수소결합을 감소시키게 된다.
따라서, 다공성 실리카 나노복합체는 높은 pH 환경에 있을 때, 다공성 실리카 코어 내부에 담지된 약물이 방출되는 속도가 증가한다.
상기 다공성 코팅층이 폴리도파민, Chitosan, Poly(N-isopropylacrylamide), Poly(Lactide-co-Glycolide) 등 을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리도파민을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용된 폴리도파민은 수용액에서 중합한 것으로, 실리카의 표면에 듬성듬성 씌워질 수 있다.
본 발명의 다공성 실리카 나노복합체는 다음과 같은 순서로 제조될 수 있다.
먼저, 기공을 갖는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어를 제조한다(단계 a).
상기 다공성 실리카 나노입자는 양이온성 계면활성제 존재하에서 실리카 전구체를 졸-겔 반응시켜 제조될 수 있다.
단계 a는 다음과 같이 세 단계로 나누어 수행될 수 있다.
먼저, 양이온성 계면활성제, 실리콘 알콕사이드를 혼합하여 졸-겔 반응하여 혼합용액을 제조한다(단계 a-1).
상기 양이온성 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide(CTAB)), 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride(CPC)), 세틸피리디늄 브로마이드(cetylpyridinium bromide(CPB))등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 Cetyltrimethylammonium bromide(CTAB)를 사용할 수 있으나, 본 발명의 양이온성 계면활성제의 범위가 여기에 한정되는 것은 아니다.
상기 실리콘 알콕사이드는 테트라 오쏘실리케이트(Tetraethyl orthosilicate; TEOS), 테트라 메틸 오르소 실리케이트(Tetra Methyl Ortho Silicate; TMOS), 테트라 프로필 오르소 실리케이트(Tetra Propyl Ortho Silicate; TPOS), 테트라 부틸 오르소 실리케이트(Tetra Butyl Ortho Silicate; TBOS)등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Tetraethyl orthosilicate(TEOS)를 사용할 수 있으나, 범위가 여기에 한정되는 것은 아니다.
다음으로, 상기 혼합용액을 원심분리하여 생성물을 얻는다(단계 a-2).
마지막으로, 상기 생성물에서 양이온성 계면활성제를 제거하고, 건조시켜 기공을 포함하는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어를 제조한다(단계 a-3).
생성물에 계면활성제가 남아 있으면, 기공의 표면적이 작아지므로, 계면활성제를 제거하여 기공의 표면적을 넓힐 수 있다.
단계 b 이후, 결합체를 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 기공의 표면에 결합시켜 상기 결합체를 포함하는 표면처리부를 형성한다(단계 b).
이후, 약물을 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면, 상기 기공의 표면, 또는 상기 표면처리부 상에 담지시켜 상기 약물을 포함하는 확산부를 형성한다(단계 c).
마지막으로, 다공성 코팅층 전구체를 단계 (c)의 결과물 존재 하에 반응시켜 상기 코어 및 표면처리부를 둘러싸고, 다공성 코팅층을 포함하는 쉘을 형성한다(단계 d).
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 설명하도록 한다. 그러나 이는 예시를 위한 것으로서 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
제조예 1: 다공성 실리카 나노입자(MSN) 제조
양이온성 계면활성제 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)와 tetraethyl orthosilicate (TEOS)의 졸-겔 반응을 통해 다공성 실리카 나노입자를 제조할 수 있다,
먼저, CTAB (0.15 g)과 NH4F (0.4 g)을 100mL의 물에 용해시켜 혼합용액을 제조하고, 75℃의 온도에서 가열하였다. 가열 후 용액의 색이 맑아지면, TEOS (1.5~2.5 mL)를 적가하고 75℃에서 8시간 동안 혼합하여 유백색의 졸-겔 용액을 얻었다.
이후, 수집된 백색 고체 생성물을 10,000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 졸-겔 용액으로부터 생성물을 분리하여 백색 고체 생성물을 수집하였고, 이를 물과 에탄올로 세척하고, 진공 오븐에서 60℃에서 10시간 동안 건조시켰다.
계면활성제인 CTAB를 제거하기 위해 얻어진 백색 생성물에서 염산 2.5mL(37%)를 포함하는 에탄올 150mL에 분산시켜, 75℃ 온도에서 24시간 동안 환류시키고, 이 과정을 2화 반복하여 계면활성제를 제거하였다.
원심분리하여 최종생성물을 얻고, 물로 세척하고, 진공 오븐에서 60℃에서 8시간 동안 건조시켜 다공성 실리카 나노입자(MSN)를 얻었다.
실시예 1: 표면개질된 다공성 실리카 나노입자(MSNs@APTMS-FITC)
FITC (2.5mg)의 역가를 무수 에탄올 (3mL)에 용해시키고, 혼합물을 3- 아미노 프로필트리메톡시 실란 (APTMS; 100㎕)에 첨가하였다. 상기 용액을 어두운 곳에서 6시간 동안 교반하면서 반응시켜 APTMS-FITC 복합체를 얻었다. MSN 합성을 위해 70℃에서 교반하면서 CTAB (0.15g)과 NH4F (0.4g)를 물 100mL에 연속 용해시켰다. 용액이 하얗게 된 후, TEOS (2.5 mL)를 적가하고, APTMS-FITC 용액을 졸 - 겔 용액에 서서히 첨가하였다. 이 절차는 70℃에서 일정하게 교반하면서 어두운 곳에서 수행되었다. 24시간 후, 황색 용액을 원심 분리하고 물과 에탄올로 여러 번 세척 하였다. 고체 생성물을 물에 분산시키고, 염산을 첨가하여 CTAB를 제거하였다. 황색 고체 (MSNs APTMS-FITC)를 원심 분리하여 60℃의 진공 오븐에서 6시간 동안 건조시켜 표면개질된 다공성 실리카 나노입자(MSNs@APTMS-FITC)를 얻었다. 이후 이를 암실에 보관 하였다.
실시예 2: 이부프로펜 함유 다공성 실리카 나노복합체
(단계 1: 약물 로딩)
이부프로펜을 담지하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조된 MSNs@APTMS-FITC(30mg)을 에탄올 (10mL)에 첨가하고, 입자를 교반 및 초음파 처리에 의해 분산시켰다. 에탄올 (10 mL) 중 다양한 농도의 이부프로펜을 800 rpm에서 지속적으로 교반하면서 바이알에 넣었다.
혼합된 용액을 추가로 24시간 동안 교반하여 최대량의 이부프로펜을 MSN에 적재하였다. 이어서, 백색 용액을 원심 분리하고 물로 세척하여 MSNs @ APTMS-FITC의 표면으로부터 잔류 이부프로펜을 제거하였다. 이부프로펜이 로딩된 MSNs@APTMS-FITC (MSNs-Ibu@APTMS-FITC)를 40℃의 진공 오븐에서 건조시켰다.
이부프로펜을 MSNs@APTMS-FITC에 로딩하는 반응은 실온에서 어두운 곳에서 수행되었다.
(단계 2: 고분자 코팅)
중성 pH에서 도파민의 산화 자기 중합을 통해 얇은 PDA 층으로 코팅될 수 있다. 이 과정은 먼저 단계 1에서 얻은 약물을 함유하는 표면개질된 다공성 실리카 나노입자(MSNs-Ibu@APTMS-FITC)(30mg)를 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-HCl(Tris-HCl) 완충액 (10 mL, pH 8.5)에 분산시키고, 도파민(10 mg)을 나중에 첨가하였다. 흑색 용액을 어두운 곳에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다. PDA로 코팅된 MSNs-Ibu (MSNs-Ibu@APTMS-FITC)를 원심 분리에 의해 수집하고 물로 여러 번 세척하여 중합되지 않은 도파민을 제거하여 흑색의 실시예 2(MSNs-Ibu@APTMS-FITC@PDA)를 최종으로 얻었다. 얻어진 흑색 생성물을 60℃의 진공 오븐에서 4시간 동안 건조시키고 추가의 특성화를 받을 때까지 암실에 보관하였다.
(약물 방출)
단계 2에서 제조된 MSNs-Ibu@APTMS-FITC@PDA을 600 rpm으로 일정하게 교반하면서 인산 완충 식염수 (PBS; 15 mL)에 첨가하고 37 ± 0.5 ℃ (즉, 생리학 체온)로 유지시켰다. 입자가 PBS 용액에 첨가된 직후, 약물의 방출 과정이 시작되었다. 약물이 방출되는 과정을 나타낸 개략도를 도 2에 나타내었다.
[시험예]
시험예 1: 입자크기 분석
시험제조예 1: MSNs@APTMS-FITC@PDA
실시예 1에 따라 제조된 표면개질된 실리카 다공성 나노입자(MSNs@APTMS-FITC)를 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-HCl(Tris-HCl) 완충액 (10mL, pH 8.5)에 분산시키고 도파민(10 mg)을 나중에 첨가하였다. 흑색 용액을 어두운 곳에서 실온에서 3시간 동안 교반 하였다. PDA로 코팅된 MSNs@ APTMS-FITC를 원심 분리에 의해 수집하고 물로 여러 번 세척하여 중합되지 않은 도파민을 제거하여 PDA 고분자 쉘을 포함하고 표면개질된 다공성 실리카 나노복합체인 MSNs@ APTMS-FITC@PDA를 제조하였다. 흑색 생성물을 60℃의 진공 오븐에서 4 시간 동안 건조시키고 추가의 특성화를 받을 때까지 암실에 보관 하였다.
입자크기 측정을 위한 동적광 산란(DLS) 및 제타전위 측정 분석
도 3은 제조예 1(MSN), 실시예 1(MSNs@APTMS-FITC), 시험제조예 1(MSNs@APTMS-FITC@PDA)를 동적광 산란(DLS) 분석을 통해 입자크기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
MSN의 평균 입자 크기는 93nm였으며, MSNs@APTMS-FITC는 입자크기가 97nm로 표면개질 후 입자크기가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 표면에 고분자 쉘이 형성된 MSNs@APTMS-FITC@PDA는 99nm인 것을 확인할 수 있었다.
또한, 표면전하는 제타 전위 측정기로 측정하였다. MSN의 제타 포센셜은 -19.06 mV 였고, APTMS-FITC 접합체로 이식한 후에는 -3.25 mV로 증가하였고, PDA 층으로 코팅한 후에는 +28.02 mV로 증가하였다.
시험예 2: 질소 탈착/흡착 등온선 분석
도 4는 MSN 및 실시예 1(MSNs@APTMS-FITC)의 질소 탈착/흡착 등온선 분석 결과 및 BJH 분석에 의한 기공 크기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4를 참조하면, 흡착 / 탈착 등온선은 II 형 등온선과 유사한 것을 확인할 수 있다. 흡착 등온선의 초기 부분에서, 흡착 능력은 급격하게 증가하는데, 이것은 풍부한 나노기공이 존재하는 것을 의미한다. MSN의 기공 표면에 APTMS-FITC 접합체를 그라프트시킨 실시예 1(MSNs@APTMS-FITC)의 BET 표면적은 293m2/g에서 1156m2/g으로 5배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 기공 용적이 0.70cm3/g에서 1.67 cm3/g으로 증가하였으나, 평균 기공 크기는 10.3 nm 에서 5.6 nm로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 그라프트된 APTMS-FITC 접합체는 형광 특성을 제공하고, 음으로 하전된 약물의 부착 및 내재화를 촉진시키는 MSN에 양성 표면 전하를 부여하는 것으로 판단된다.
또한, 도 5는 CTAB의 제거 전과 후의 다공성 실리카 나노입자의 질소 탈착/흡착 등온선 분석 결과 및 BJH 분석에 의한 기공 크기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5를 참고하면, CTAB이 제거된 후, MSN의 BET 표면적은 145m2/g에서 293m2 /g로 증가했다. 유사한 증가가 0.46 cm3/g에서 0.70 cm3/g 사이의 기공 부피에서 관찰되었고, MSN의 평균 기공 크기는 12.8 nm에서 10.3 nm로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
시험예 2: 표면이미지 분석
제조시험예 2: MSNs@PDA
표면개질된 실리카 다공성 나노입자(MSNs@APTMS-FITC) 대신에 제조예 1에 따라 제조된 MSNs을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 단계 2와 동일한 방법으로 PDA 고분자 쉘을 코팅하여 시험제조예 2(MSNs@PDA)을 제조하였다.
도 6은 제조에 1(MSN), 실시예 1(MSNs@APTMS-FITC), 시험제조예 2(MSNs@PDA) 및 시험제조예 1(MSNs@APTMS-FITC@PDA)의 SEM 및 TEM 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6을 참조하면, MSN의 SEM 이미지는 균일한 크기 분포를 갖는 구형을 보여 주었다(a). MSN과 비교하여, APTMS-FITC 접합체(MSNs @ APTMS-FITC) 또는 PDA 코팅 (MSNs @ PDA)을 가진 MSN은 더 거친 표면 형태를 보였다(b 및 c). PDA 층으로 코팅 된 MSNs에 APTMS-FITC 접합체를 접목시킨 결과, MSNs @ APTMS-FITC @ PDA는 구형 및 입자 크기의 불균일성이 증가한 것으로 나타났다(d). 고해상도 TEM 이미지를 살펴보면, MSN의 2차원 기공 배열이 명확하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(a 및 b). 또한, MSN의 주변부에서 PDA 코팅층 (~ 3 nm)의 존재하는 것을 확인할 수 있었다(c 및 d).
구분 BET 표면적
(m2/g)		 Pore volume
BJH method
(cm3/g)		 평균 기공크기*
(nm)		 SEM
입자크기
(nm)		 DLS
입자크기
(nm)
제조예 1(MSNs) 293 0.70 10.3 92 ± 3 93 ±4
실시예 1
(MSNs@APTMS-FITC)		 1156 1.67 5.6 95 ± 3 97 ± 3
시험제조예 1
(MSNs@APTMS-FITC@PDA)		 - - - 98 ± 4 99 ± 3
* 평균 기공 크기는 BJH 에 의해 측정되었다.
시험예 3: FTIR 분석
도 7은 제조예 1(MSN), 실시예 1(MSNs@APTMS-FITC) 및 시험제조예 1(MSNs@APTMS-FITC@PDA)의 구조를 분석하기 위해 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 (a)는 약 3685cm-1 및 995cm-1의 넓은 밴드가 실라놀 그룹의 O-H 인장 진동(stretching vibrations) 및 흡수된 물에 기인한 MS의 FT-IR 스펙트럼 피크가 나타났다. 또한, 1064cm-1 및 797cm-1의 피크는 각각 Si-O-Si 결합의 비대칭 및 대칭 인장 진동에 기인한다. MSN-APTMS-FITC는 C-S 및 CO 진동에 기인한 642cm-1 및 1681 cm-1범위의 새로운 밴드가 나타난 것을 확인할 수 있었다. 또한, 2395cm-1 및 3413cm-1의 피크는 APTMS-FITC 접합체의 C-N-C 및 NH기인 것으로 판단되며, 이러한 결과는APTMS-FITC 결합체가 MSN에 표면개질된 것을 의미한다(도 4의 b). 추가로 폴리도파민(PDA) 층으로 코팅할 때, PDA의 OH 및 NH기는 약 3673cm-1에 피크가 나타난 것을 확인할 수 있었다. PDA의 CH2 단위의 C-H 비대칭 진동에 기인한 약 2950 cm-1에서도 새로운 이중 피크가 나타난 것을 확인할 수 있었다. 1212, 1370 및 1543 cm-1의 추가 피크는 벤젠 고리의 C-C, C-N 및 C = C 그룹에 해당되는 것으로 분석된다(도 4의 c). 이러한 결과에 따라, MSN@APTMS-FITC상에 PDA층이 형성되었음을 확인할 수 있었다.
시험예 4: PL 분석
도 8은 발광파장에서 제조예 1(MSN), 실시예 1(MSNs@APTMS-FITC) 및 시험제조예 1(MSNs@APTMS-FITC@PDA)의 발광(Photoluminescence) 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8을 참조하면, 방출 피크는 MSNs@APTMS-FITC는 513nm에서 관찰되었지만 MSN은 해당 파장에서 방출 피크를 보이지 않았다. 따라서, PL 스펙트럼은 MSN의 기공 표면에 형광결합체가 성공적으로 표면개질된 것을 확인할 수 있었다.
시험예 5: 정전기적 상호작용이 운동방출(kinetic release)에 미치는 영향 분석
시험제조예 3: MSNs - Ibu
이부프로펜을 혼합하기 위해, 제조예 1에 따라 제조된 MSNs(30mg)을 에탄올 (10mL)에 첨가하고, 입자를 교반 및 초음파 처리에 의해 분산시켰다. 에탄올 (10 mL) 중 다양한 농도의 이부프로펜을 800 rpm에서 지속적으로 교반하면서 바이알에 넣었다.
혼합된 용액을 추가로 24시간 동안 교반하여 최대량의 이부프로펜을 MSN에 적재하였다. 이어서, 백색 용액을 원심 분리하고 물로 세척하여 MSNs의 표면으로부터 잔류 이부프로펜을 제거하였다. 이부프로펜이 로딩된 MSNs(MSNs-Ibu)를 40℃의 진공 오븐에서 건조시켰다.
이부프로펜을 MSNs에 로딩하는 반응은 실온에서 어두운 곳에서 수행되었다.
시험제조예 4: MSNs-Ibu@PDA
표면개질된 실리카 다공성 나노입자(MSNs@APTMS-FITC) 대신에 시험제조예 3에 따라 제조된 이부프로펜이 로딩된 MSNs(MSNs-Ibu)을 사용한 것을 제외하고는 시험제조예 1과 동일한 방법으로 MSNs-Ibu@PDA를 제조하였다.
고분자 쉘 유무에 따른 이부프로펜(약물) 흡수 및 방출시간 분석
도 9는 37℃의 PBS 용액에서 시험제조예 3(MSNs-Ibu)(pH 7.4) 및 시험제조예 4(MSNs-Ibu@PDA)(pH 5.0 및 pH 7.4)의 이부프로펜 흡수도 및 방출시간을 분석하여 나타낸 것이고, 도 10은 (a), (c)는 37℃에서 PBS의 pH5.0 및 pH7.4의 MSNs-Ibu 및 MSNs-Ibu @ PDA의 Fick 법칙에 의해 나타난 결과이고, (b), (d) 37℃에서 PBS 중의 pH5.0 및 pH7.4에서 MSNs-Ibu 및 MSNs-Ibu@PDA의 누적 시간 대 K-P 모델에 의해 나타난 방출 데이터 분석 결과를 나타낸 것이다.
이부프로펜의 방출속도는 하기 식 1로 표시되는 Fick's 법칙에 의해 분석되었다.
[식 1]
Figure 112017038869433-pat00015
상기 식 1에서, Qt와 Q∞는 시간 t에서 구형의 다공성 매트릭스에서 약물의 양이고, t=∞에서의 평형량이며, kF는 약물 농도와는 독립적인 확산 속도 상수이다. 기판에 대한 용매의 접근성과 다공성 채널을 통한 확산 계수, a는 구형 MSN의 반경이다. 단순화를 위해 데이터의 피팅시 A의 값은 단일이라고 가정하였다.
또한, 방출 프로파일은 이완 과정에 의해 야기된 비-피치(Fickian) 확산을 예측하기 위해 보통 사용된 Korsmeyer-Peppas(K-P) 모델에 기초한 하기 식 2로 표시되는 거듭제곱 법칙에 의해 적합화되었다.
[식 2]
Figure 112017038869433-pat00016
Qt / Q∞는 시간 t에서 방출된 약물의 분율이고, kR은 이완 속도 상수이고, n은 방출 지수이다. K-P 모델에서, n의 값은 해제 메커니즘을 나타낸다. 원통형 정제의 경우, n = 0.5는 Fickian 확산에 해당하고, 0.5 <n <1이 아닌 Fickian 수송에 해당하며, n = 1 ~ Case II (relaxational) 수송에 해당된다.
MSNs- Ibu 과 MSNs-Ibu@PDA의 방출 동력은 Fick의 법칙을 따르지 않는다.
하기 표 2에서 알 수 있듯이, Fick의 모델 적합성은 MSNs-Ibu, MSNs-Ibu @ PDA (pH5) 및 MSNs-Ibu@PDA(pH 7)에 각각 해당하는 0.37, 0.27 및 0.29의 kF 값을 나타냈다. 그러나, KP 모델은 샘플의 방출 동력에 적합하다. 먼저, pH 7.4에서 MSN-Ibu에 대해 kR = 41.7, 두 번째로 pH 5.0에서 MSN-Ibu @ PDA에 대해 kR = 37.9, 세 번째로, pH 7.4에서 MSN-Ibu @ PDA에 대해 kR = 39.0. MSN-Ibu의 이완 속도 상수 kR은 pH 5.0 및 7.4에서 MSN-Ibu-PDA의 이완 속도 상수보다 높았다.
이러한 결과는 이부프로펜의 방출 속도가 PDA 코팅층에 의해 약간 영향을 받는다는 것을 나타내며, 즉 PDA 코팅층은 이부프로펜의 MSN 방출 속도를 약간 감소시켰다. 또한, 이부프로펜의 pH 7.4에서의 이완 속도 상수는 pH 5에서의 이완 속도 상수보다 약간 높았으며, 이는 이부프로펜보다 높은 pH에서보다 빨리 방출된다는 것을 확인할 수 있었다.
이와 같이 상이한 pH 값에서의 방출 속도의 약간의 차이는 수소 결합 상호 작용의 차별적인 변화에 기인한다. 이부프로펜의 -COOH 그룹의 음전하가 높은 pH에서 증가하여 결과적으로 이부프로펜과 MSN의 기공 벽 사이의 수소 결합 상호 작용이 감소하게 되었다. 따라서, 이부프로펜은 음전하를 갖는 세공 채널로부터 쉽게 방출되는 경향이 있는 것으로 나타났다.
또한, 도 10을 참조하면, 도 7의 (a) 및 (c) 나타난 바와 같이 MSNs-Ibu 및 MSNs-Ibu @ PDA의 방출 속도는 Fick의 법칙을 따르지 않는다. 하기 표 2에서 볼 수 있듯이, Fick의 모델 적합성은 MSNs-Ibu, MSNs-Ibu @ PDA (pH5) 및 MSNs-Ibu @ PDA (pH7)에 각각 해당하는 0.37, 0.27 및 0.29의 kF 값을 나타냈다. 그러나, KP 모델은 샘플의 방출 동력에 적합했다. 먼저, pH 7.4에서 MSN-Ibu에 대해 kR = 41.7, pH 5.0에서 MSN-Ibu @ PDA에 대해 kR = 37.9, 및 pH 7.4에서 MSN-Ibu @ PDA에 대해 kR = 39.0. MSN-Ibu의 이완 속도 상수 kR은 pH 5.0 및 7.4에서 MSN-Ibu-PDA의 이완 속도 상수보다 높았다.
이러한 결과는 이부프로펜의 방출 속도가 PDA 코팅층에 의해 약간 영향을 받는다는 것을 나타내며, 즉 PDA 코팅층은 이부프로펜의 MSN 방출 속도를 약간 감소시켰다. 또한, 이부프로펜의 pH 7.4에서의 이완 속도 상수는 pH 5에서의 이완 속도 상수보다 약간 높았으며, 이는 이부프로펜이 높은 pH에서 빨리 방출된다는 것을 나타낸다.
상이한 pH 값에서의 방출 속도의 약간의 차이는 수소 결합 상호 작용의 차별적인 변화에 기인하는 것으로 판단된다. 이부프로펜의 -COOH 그룹의 음전하가 높은 pH에서 증가하여 결과적으로 이부프로펜과 MSN의 기공 벽 사이의 수소 결합 상호 작용이 감소하게 되기 때문에, 이부프로펜은 음전하를 갖는 세공 채널로부터 더욱 쉽게 방출되는 것으로 판단된다.
하기 표 2는 실시예 2와 시험제조예 3 내지 7에 따라 제조된 샘플의 확산 모델에 따른 파라미터를 계산한 결과를 정리하여 나타낸 것이다.
구분 확산 모델 식 파라미터
시험제조예 3
(MSNs-Ibu)		 Fick's law Qt/Q8=1-A.e-kt kF = 0.36, A = 1
K-P model Qt/Q8=k.tn kR = 41.4, n = 0.192
시험제조예 4
(MSNs-Ibu@PDA) (pH5.0)		 Fick's law Qt/Q8=1-A.e-kt kF = 0.27 , A = 1
K-P model Qt/Q8=k.tn kR = 38.9, n = 0.183
시험제조예 4
(MSNs-Ibu@PDA) (pH7.4)		 Fick's law Qt/Q8=1-A.e-kt kF = 0.29, A = 1
K-P model Qt/Q8=k.tn kR = 38.2, n = 0.195
시험제조예 5
(MSNs-FITC)		 K-P model Qt/Q8=k.tn kR = 76.62, n= 0.062
Fick's law Qt/Q8=1-A.e-kt kF = 1.05, A = 1
시험제조예 6
(MSNs-FITC@PDA)		 K-P model Qt/Q8=k.tn kR = 10.07, n = 0.474
Higuchi model Qt=k.t1/2 kH =18.03
시험제조예 7
(MSNs-Ibu@APTMS-FITC)		 K-P model Qt/Q8=k.tn kR = 65.94, n = 0.09
Fick's law Qt/Q8=1-A.e-kt kF = 0.73, A = 1
실시예 2
(MSNs-Ibu@APTMS-FITC@PDA)		 K-P model Qt/Q8=k.tn kR = 6.1, n = 0.60
Higuchi model Qt=k.t1/2 kH = 18.67
시험예 6: PDA층(고분자 쉘)이 운동 방출에 미치는 영향 분석
시험제조예 5: MSNs - FITC
아세톤 (5 mL)에 제조예 1에 따라 제조된 MSNs(20mg)를 일정한 교반 및 초음파 처리에 의해 분산시켜 MSN 혼합용액을 제조하였다. FITC (15mg)를 포함하는 아세톤(5 mL)에 MSN의 혼합 용액에 24시간 동안 첨가하여 혼합용액을 제조하였다. 제조된 혼합용액을 원심 분리시켜 FITC-로딩된 MSNs(MSNs-FITC) 수집하고 40℃에서 진공 오븐에서 건조시켰다.
시험제조예 6: MSNs-FITC@PDA
표면개질된 실리카 다공성 나노입자(MSNs@APTMS-FITC) 대신에 시험제조예 5에 따라 제조된 MSNs-FITC을 사용한 것을 제외하고는 시험제조예 1과 동일한 방법으로 MSNs-FITC@PDA을 제조하였다.
분자 크기에 따라 고분자 쉘이 방출에 미치는 영향 분석
도 11은 37℃의 PBS에서 시험제조예 5(MSNs-FITC)와 시험제조예 6(MSNs-FITC @PDA)의 FITC 흡광도 분석 결과(a), FITC 방출량과 시간의 상관관계(b), 방출량 대 제곱근 시간의 모델 (c) 및 누적량 대 방출량의 모델(d)을 나타낸 것이다.
도 11을 참조하면, MSN과 MSN에서 나온 FITC의 방출 동력을 시간의 함수로 조사한 것으로, (a)와 (b)에서 볼 수 있듯이 MSNs-FITC는 MSN에서 FITC를 신속하게 공개했지만 MSNs-FITC@PDA는 7일 동안 최종 값에 대해 느리고 점근적으로 접근했습니다. MSN-FITC의 경우 처음 5시간 이내에 80% FITC의 초기 파열이 발생했으며 20 시간 후에 FITC의 방출량이 95%까지 증가했습니다. MSNs-FITC의 빠른 방출 동작은 Fick의 법칙에 의해 잘 예측되었다. (c)에서 MSNs-Ibu의 방출 속도는 Fick의 k = 1.05 확산 공식에 잘 부합했다. 반면, MSNs-FITC@PDA의 방출 동역학은 140 시간 동안 FITC의 서방성을 보여 주었고, 방출량과 제곱근의 근사 도와의 선형성을 보여 주었다.
MSN-FITC@PDA의 방출 속도는 Higuchi 모델에 의해 분석될 수 있다. 방출 동역학은 아래 식 3으로 표시되는 히구치 모델(Higuchi model)을 기초로 하여 설명될 수 있다.
[식 3]
Figure 112017038869433-pat00017
여기서, Qt는 시간 t에서 방출된 약물의 양이고, D는 확산 계수이고, S는 용해 매질에서 약물의 용해도이고, ε은 다공성이며, A는 입자 1 입방 센티미터 당 약물 함량이고, kH는 히구치 모델의 제곱근 근사 시간에 대한 방출속도 상수이다.
Higuchi 모델에 의해 MSN-FITC@PDA의 방출 속도를 분석한 결과, 평형 루트 시간에 대한 FITC의 방출량의 선형 의존성이 명확하게 나타났다. kH 값은 18.03이었다. FITC의 방출 동역학은 또한 MSN-FITC 및 MSN-FITC@PDA에 대해 각각 0.062 및 0.474의 적합한 방출 지수를 생성하는 K-P 모델에 의해 분석되었다. 방출 지수의 뚜렷한 차이는 MSN과 MSN에서 FITC의 각기 다른 확산 메커니즘의 작동을 명확하게 나타내었다.
MSN의 FITC 방출 속도는 FITC 분자 간의 추가적인 상호 작용으로 인해 MSNs @PDA의 방출 속도보다 훨씬 빠르다. 예를 들어, 자기조립된 FITC 분자는 부주의하게 FITC 분자의 크기를 증가시켰으며, 따라서 감소된 기공크기를 갖는 PDA 코팅층을 통해 방출되는 것이 더 어려웠다. 한편, 관련 FITC 분자는 기공 표면상의 OH 기와 상호 작용할 수 있는 기능기가 감소하였다. 실제로, MSNs-FITC@PDA의 방출 시간은 PDA 코팅층의 존재로 인해 140시간 이상이 소요되는 반면, MSNs-FITC의 방출은 24시간 이내에 완료되었는데, 이는 FITC 분자와 MSN의 기공 표면 간의 약해진 상호작용 때문인 것으로 판단된다.
따라서, MSN-FITC의 빠른 방출 속도는 Fick의 법칙에 의해 측정될 수 있었으며, MSN-FITC @ PDA의 느린 방출 속도는 Higuchi 및 / 또는 K-P 모델에 의해 잘 예측되었다.
따라서, PDA 코팅층은 큰 FITC 분자의 방출 속도를 조절하는데 매우 효과적이었지만, 비교적 작은 이부프로펜의 방출 속도를 조절하는 데는 그리 효과적이지 못한 것으로 확인되었다.
시험예 7: APTMS-FITC 결합체(conjugates)의 고정 효과(Anchoring effect)
시험제조예 7: MSNs-Ibu@APTMS-FITC
실시예 2의 단계 1까지 수행하여 MSNs-Ibu@APTMS-FITC을 제조하였다.
고분자 쉘과 형광결합체( APTMS - FITC )의 상호작용이 작은 분자 방출(이부프로펜)에 미치는 영향
도 12는 (a) 37℃에서 시험제조예 7(MSNs-Ibu@APTMS-FITC)과 실시예 2(MSNs-Ibu@APTMS-FITC@PDA)로부터 이부프로펜 흡광도 프로파일, (b) 이부프로펜 양과 방출 시간 사이의 상관관계, c) 방출량 대 제곱근 시간, (d) 방출량 대 누적 시간의 모형 적합도를 나타낸 것이다.
MSNs-Ibu@APTMS-FITC의 방출 동역학은 시간 함수로서 분석되었다. (a) 및 (b)는 초기 급속 방출과 140시간 이상의 서방 방출을 갖는 이부프로펜의 2단계 방출을 나타낸다. 처음 3시간 이내의 초기 방출은 이부프로펜의 방출의 85%를 차지했으며, 20시간 후에 점차적으로 90%까지 증가하였고, 방출은 140시간 후에 완결되었다. 도 12의 (c)에서 MSN-Ibu@APTMS-FIT의 방출 동력은 방출의 최종 단계에서 Fick의 법칙을 약간 벗어난 pseudo-Fickian 확산을 따르는 것으로 보인다. 상기 표 2를 참조하면, Fick의 모델에 따라 MSNs-Ibu@APTMS-FITC의 kF 값은 0.73으로 MSNs-Ibu의 0.37보다 큰 값을 갖는 것으로 나타났다. 이 결과는 MSN에서의 이부프로펜 방출이 APTMS-FITC가 MSN보다 빠르다는 것을 의미한다. 이것은 APTMS-FITC 접합이 기공 표면의 히드록실기의 수를 현저히 감소시켜 확산이 있는 이부프로펜과 MSN의 기공 벽 사이의 수소 결합 상호 작용을 감소시키기 때문인 것으로 판단된다.
또한, MSN-Ibu@APTMS-FITC @ PDA의 방출 동력은 Higuchi와 K-P 모델에 따른다. (c)에서 알 수 있듯이 MSNs@APTMS-FITC @ PDA의 작은 이부프로펜 방출 속도는 누적량과 제곱근 시간의 선형 플롯에 따라 히구치 모델을 따른다. MSNs-Ibu @ APTMS-FITC @ PDA의 방출 속도 상수 kH는 MSNs-FITC @ PDA에서와 거의 동일한 값인 18.68로 맞추어졌다. 이러한 결과는 APTMS-FITC 접합체가 PDA 코팅층과 결합 된 우리의 MSN 시스템에서 작은 이부프로펜의 놀라운 지속 방출을 제공함을 분명히 나타냈다. 또한, (d)에서, MSN-Ibu@APTMS-FITC@PDA의 방출 동력학 K-P 모델에 의해 적합화된 것을 알 수 있었다. MSNs-Ibu@APTMS-FITC@PDA의 방출지수 n은 0.6이었고 이는 MSNs-Ibu@APTMS-FITC보다 훨씬 컸다. 지수 값의 뚜렷한 차이는 MSNs@APTMS-FITC의 이부프로펜 방출 메커니즘이 MSN@APTMS-FITC@PDA의 방출 메커니즘과 크게 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, MSNs-Ibu@APTMS-FITC의 이완 속도상수 kR은 65.9이었으며, 이는 MSNs-Ibu@APTMS-FITC@PDA (kR = 6.1)보다 훨씬 큰 값이다. 따라서 PDA 코팅층을 갖는 APTMS-FITC 접합체는 MSN으로부터의 작은 이부프로펜의 지속 방출에 현저한 효과를 갖는다.
또한, COOH, OH 및 -NH-CS-NH-와 같은 APTMS-FITC 접합체의 작용기는 정전기 및/또는 수소결합을 통해 PDA 코팅층의 극성기(NH2 및 OH)와 상호 작용할 수 있으며, 기공 입구에 국한된 극성 그룹의 극성 밀도는 확산 분자에 대해보다 효과적인 기공 폐쇄를 가져온 것을 알 수 있었다.
또한, PDA 코팅층과 결합된 APTMS-FITC 접합체는 시너지 효과가 있는 핀치 효과 (pinch-effect)를 생성하여 MSN의 구멍에서 작은 분자를 포획 및 / 또는 차단할 수 있는 것으로 판단된다.
우수한 약물 전달체 플랫폼으로서, APTMS-FITC 접합체는 기공 반경, 앵커 밀도, 및 PDA 코팅층의 최적 조정을 통해 메조포러스 실리카 매트릭스로부터 작은 이부프로펜의 매우 지속적인 방출에 기여하는 탁월한 고정 효과가 나타나는 것을 알 수 있었다.
시험예 8: MSN 시스템의 제어 방출에 영향을 미치는 세 가지 요소분석
도 13은 MSN 시스템의 제어 방출에 영향을 미치는 세 가지 요소의 도식적 나타낸 것으로, MSN-Ibu 및 MSN-Ibu@PDA의 제어 방출에 대한 수소 결합 효과(A), MSN-FITC 및 MSN-FITC@PDA의 통제된 방출에 대한 크기 효과(B), MSNs-Ibu @ APTMS-FITC 및 MSNs-Ibu@APTMS-FITC @ PDA의 통제 된 방출에 대한 정박효과(C)를 나타낸 것이다.
도 13을 참조하면, 방출 동력학은 정전기 상호 작용(용액 pH), 약물 분자의 크기 (PDA 코팅) 및 APTMS-FITC 접합체의 고정 효과의 3가지 요소와 관련이 있는 것을 확인하였다.
첫째, MSN의 이부프로펜 방출 속도는 약물 분자와 MSN의 기공 벽 사이의 수소 결합 상호 작용에 영향을 받는다. 용액 pH (7.4에서 5로)의 감소는 이부프로펜과 MSN의 기공 벽 사이의 수소 결합 상호 작용을 약간 감소시켰다. 결과적으로, 이부프로펜 분자는 낮은 pH (예: pH 5)에서 MSN로부터 약간 더 빠른 방출을 보였다. 기공 표면상의 OH 기가 APTMS-FITC 접합체로 이식함으로써 수소결합이 가능한 OH기가 감소되어, MSNs-Ibu@APTMS-FITC는 이부프로펜과 IMT의 상호 작용이 약화 되었기 때문에 MSNs-Ibu에 비해 이부프로펜의 방출이 빠른 것으로 판단된다.
두 번째로, 확산 약물 (이부프로펜 (Ibuprofen)과 FITC)의 방출 동력은 MSN의 기공 크기에 비례하여 약물 분자의 크기에 영향을 받았다. 예를 들어, FITC 분자는 자가조립에 의해 분자의 크기가 커지는 경향이 있어 FITC 분자는 PDA 코팅층에 의해 작아진 기공에 의해 방출이 방해 및/또는 차단되기 쉽다. 결과적으로, PDA 코팅층이 기공의 입구를 감소시키기 때문에 MSN-FITC@PDA는 MSN-FITC 보다 느린 방출 동역학을 나타냈다. 그러나 작은 ibuprofen의 경우, MSNs-Ibu@PDA는 작은 이부프로펜에서 PDA 코팅층의 차단 효과가 미미하여 MSNs-Ibu 보다 약간 느린 방출 동역학을 보였다.
세 번째로, FITC-APTMS 접합체는 MSN으로부터의 작은 이부프로펜의 지속적인 방출에 대한 탁월한 고정 효과를 입증하였다. FITC-APTMS 접합체는 기공 표면상의 OH 기의 수를 현저하게 감소시켰고 결과적으로 약물 분자와 MSN의 기공 벽 사이의 수소 결합 상호 작용을 감소시켰다. 그럼에도 불구하고 MSNs@APTMS-FITC@PDA는 PDA 층으로 코팅된 MSN으로부터의 이부프로펜의 체외 방출에 APTMS-FITC 접합체의 현저한 고정 효과를 나타냈다. 앵커된 접합체가 브러시와 같은 장벽으로 작용하여 이부프로펜이 방출 경로가 복잡해지므로 이부프로펜의 방출속도가 감소하는 하게 된다. 더욱이, 기공은 APTMS-FITC 접합체 및 PDA로부터 유래된 다양한 작용기 (-COOH, -OH, -NH-CS-NH-, -NH2 및 -OH)의 많은 정전기 및/또는 수소 결합 상호 작용으로 속도가 감소하게 된다. 구멍 입구에서의 집중적인 상호 작용은 분자의 확산을 효과적 감소시켜 다공성 채널을 통해 작은 이부프로펜의 지속적인 방출을 하도록 한다. 막힌 모공에 의한 시너지 효과의 핀치 효과는 기공 입구에서 약물 분자를 포획(또는 차단)하는데 매우 두드러지기 때문에 MSN 시스템은 크기와 기능이 다른 약물 분자를 동력 학적으로 제어 방출할 수 있는 효율적인 약물 전달체 플랫폼이 될 수 있는 것으로 판단된다.
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (21)

  1. 기공을 갖는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어;
    상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 다공성 실리카 나노입자의 상기 기공과 접하는 표면에 결합된 결합체를 포함하는 표면처리부;
    상기 다공성 실리카 나노입자의 표면, 상기 다공성 실리카 나노입자의 상기 기공과 접하는 표면, 또는 상기 표면처리부 상에 담지되고, 약물을 포함하는 확산부; 및
    상기 코어 및 표면처리부를 둘러싸고, 다공성 코팅층을 포함하는 쉘;을 포함하고,
    상기 결합체가 아래 구조식 1로 표시되는 구조로 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 다공성 실리카 나노입자의 상기 기공과 접하는 표면에 결합되고,
    상기 결합체가 형광물질을 포함하고,
    상기 형광물질이 fluorescein isothiocyanate (FITC), 로다민 B 이소티오시안산염(Rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine isothiocyanate) 및 테트라메틸로다민-5-이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 약물이 이부프로펜(ibuprofen, Ibu) 및 fluorescein isothiocyanate (FITC) 중에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 다공성 코팅층이 폴리도파민을 포함하는 것인, 다공성 실리카 나노복합체.
    [구조식 1]
    Figure 112019051953074-pat00038

    상기 구조식 1에서,
    X는
    Figure 112019051953074-pat00039
    이고,
    Y는 S이고,
    Z는
    Figure 112019051953074-pat00040
    이고,
    m은 1 내지 9의 정수 중 어느 하나이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 기공이 터널형 메조기공인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 터널형 메조기공의 직경이 5 내지 15nm인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 실리카 나노입자와 상기 결합체를 서로 공유결합시키는 화합물이 아미노실란 유도체이고,
    상기 아미노실란 유도체가 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) 및 3-aminopropyltriethoxysilane(APTES) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 약물의 크기가 0.3 내지 1.2nm인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    상기 기공의 크기를 조절하여 상기 약물의 방출속도를 제어하는 것을 특징으로 다공성 실리카 나노복합체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 결합체 및 다공성 코팅층 중 1종 이상이 약물의 방출 속도를 감소시키는 작용을 하는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 결합체가 상기 약물의 방출 경로를 증가시키는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 결합체가 0.3 내지 0.6nm 크기의 약물의 방출속도를 제어하는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 코팅층이 0.8 내지 1.2nm 크기의 약물의 방출속도를 제어하는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 약물은 다공성 실리카 나노복합체가 존재하는 곳의 pH가 높을수록 상기 약물의 방출속도가 증가하는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체.
  18. 삭제
  19. (a) 기공을 갖는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어를 제조하는 단계;
    (b) 결합체를 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 다공성 실리카 나노입자의 상기 기공과 접하는 표면에 결합시켜 상기 결합체를 포함하는 표면처리부를 형성하는 단계;
    (c) 약물을 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면, 상기 다공성 실리카 나노입자의 상기 기공과 접하는 표면, 또는 상기 표면처리부 상에 담지시켜 상기 약물을 포함하는 확산부를 형성하는 단계; 및
    (d) 다공성 코팅층 전구체를 단계 (c)의 결과물 존재 하에 반응시켜 상기 코어 및 표면처리부를 둘러싸고, 다공성 코팅층을 포함하는 쉘을 형성하는 단계; 를 포함하고,
    상기 결합체가 아래 구조식 1로 표시되는 구조로 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면 또는 상기 다공성 실리카 나노입자의 상기 기공과 접하는 표면에 결합되고,
    상기 결합체가 형광물질을 포함하고,
    상기 형광물질이 fluorescein isothiocyanate (FITC), 로다민 B 이소티오시안산염(Rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine isothiocyanate) 및 테트라메틸로다민-5-이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 약물이 이부프로펜(ibuprofen, Ibu) 및 fluorescein isothiocyanate (FITC) 중에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 다공성 코팅층 전구체가 도파민을 포함하고,
    상기 다공성 코팅층이 폴리도파민을 포함하는 것인, 다공성 실리카 나노복합체의 제조방법.
    [구조식 1]
    Figure 112019051953074-pat00041

    상기 구조식 1에서,
    X는
    Figure 112019051953074-pat00042
    이고,
    Y는 S이고,
    Z는
    Figure 112019051953074-pat00043
    이고,
    m은 1 내지 9의 정수 중 어느 하나이다.
  20. 제19항에 있어서,
    단계 (a)의 상기 다공성 실리카 나노입자가 양이온성 계면활성제 존재하에서 실리카 전구체를 졸-겔 반응시켜 제조되고,
    상기 양이온성 계면활성제가 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide(CTAB))를 포함하고,
    상기 실리카 전구체가 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate(TEOS))를 포함하는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체 제조방법.
  21. 제20항에 있어서,
    단계(a)가,
    (a-1) 양이온성 계면활성제, 실리콘 알콕사이드를 혼합하여 졸-겔 반응하여 혼합용액을 제조하는 단계;
    (a-2) 상기 혼합용액을 원심분리하여 생성물을 얻는 단계; 및
    (a-3) 상기 생성물에서 양이온성 계면활성제를 제거하고, 건조시켜 기공을 포함하는 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 코어를 제조하는 단계; 를
    포함하는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 나노복합체 제조방법.


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