KR101993391B1 - 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상온 대기압 플라즈마 처리를 통해 임플란트 재료의 표면 개질하는 방법 및 이에 의해 제조된 임플란트 재료에 관한 것이다. 구체적으로, 적정의 인가 전력, 처리시간, 및 유입가스의 유속을 조절한 상온 대기압 플라즈마 처리 하여 임플란트 재료의 표면에서 탄소 함량이 감소하고 티타늄 함량이 증가되어 친수성 및 표면 에너지가 증가함에 따라 소수성 박테리아 부착 저항성, 세포의 부착성 및 분화성이 향상된, 보다 짧은 시간에 안정되게 개질된 임플란트 재료를 얻을 수 있는 효과가 있다.

Description

표면이 개질된 치과용 임플란트 재료의 제조방법{Method for manufacturing surface-modified dental implant materials}

본 발명은 상온 대기압 플라즈마 처리를 통해 임플란트 재료의 표면 개질하는 방법 및 이에 의해 제조된 임플란트 재료에 관한 것으로, 구체적으로 임플란트 재료를 플라즈마 장치 팁과 적정의 거리를 두어 배치하고 적정의 인가 전력, 처리시간, 및 유입가스의 유속을 조절한 상온 대기압 플라즈마 처리하는 방법 및 이에 의해 제조된 임플란트 재료에 관한 것이다.

의료용 임플란트, 인공 고관절, 골지지체 등 생체 이식용 임플란트의 재료로, 티타늄, 스테인레스 스틸 합금, 코발트-크롬 합금과 같은 금속 재료, 알루미나, 지르코니아와 같은 생체 불활성 세라믹 재료 및 수산화아파타이트와 같은 생체 활성 세라믹 재료가 널리 사용되고 있다. 이러한 생체 이식용 임플란트의 재료 중에서, 생체이식용 금속 또는 합금은 세라믹스 및 고분자와 같은 다른 재료에 비해 강도, 피로저항성 및 성형가공성이 우수하여 현재까지도 골 결손 및 회손 부위의 재생 및 치료를 목적으로, 치과, 정형외과 및 성형외과에서 가장 널리 사용되고 있는 생체 재료이다.

체내에 삽입시 조직 내에서의 적합성을 향상시키기 위하여, 금속 또는 합금의 표면적을 늘리고 표면 형상(surface topography)을 변화시키거나 물리적, 화학적, 생물학적으로 표면 개질을 이루려는 시도가 이루어지고 있다.

대표적으로 거칠기 변화를 통해 표면적 또는 표면 형상을 변화시키려는 노력은 매끄러운 표면에 비해 생체 내 조직 접합성이 향상되는 것으로 알려져 있으나, 임플란트 표면에 박테리아가 부착되는 경우 임플란트를 오해사용할 수 없는 문제점이 있으며, 박테리아 부착 및 축적은 임플란트 주위염을 일으켜 골 조직 재생의 실패를 불러올 수 있다.

따라서 임플란트 표면 개질 방법 중, 친수성, 표면 에너지와 같은 표면의 화학적 조성 변화가 표면 반응성 및 생물학적 성능을 향상시키는 것으로서 그 중요성 대두되고 있다.

종래 티타늄 또는 티타늄 합금의 표면 개질 방법에 대한 연구로서, 금속비즈신터링(V. Amigo et al., J. Mater. Process. Technol., 2003, 141(1): 117-122), 블라스팅 및 산처리(J. E. Feighan et al., J. Bone Joint Surg. Am., 1995, 77(9): 1380-1395), 알칼리 침지 및 열처리(H. M. Kim et al., J. Mater. Sci. Mater. Med., 1997, 8(6): 341-347). 하이드록시아파타이트 코팅(C. Popa et al., J. Mater. Sci. Mater. Med., 2005, 16(12): 1165-1171). 양극산화법(S. H. Lee et al., J. Kor. Acad. Prosthodont., 2007, 45(1): 85-97), 이온주입법(T. R. Rautray et al., J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater., 2010, 93(2): 581-591), SLA(sandblasted, large grit, acid etched) 등이 있으나, 적정의 상온 대기압 플라즈마를 사용하여 친수성 및 표면 에너지의 증가를 통해 내균성 및 조직 접합성 향상에 대한 연구는 부족한 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 임플란트 재료를 플라즈마 장치 팁과 적정의 거리를 두어 배치하고 적정의 인가 전력, 처리시간, 및 유입가스의 유속을 조절한 상온 대기압 플라즈마 처리 결과, 임플란트 재료의 표면에서 탄소 함량이 감소하고 티타늄 함량이 증가되어 친수성 및 표면 에너지가 증가함에 따라 소수성 박테리아 부착 저항성, 세포의 부착성 및 분화성이 향상된, 보다 짧은 시간에 안정되게 개질된 임플란트 재료를 얻을 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 치과용 임플란트 재료 표면을, 0.5 내지 3.0kV의 전압 조건하에 800 내지 1200 sccm 유량의 방전용 가스가 유입되어 상온 대기압 플라즈마를 발생하는 젯에 노출하는 단계를 단계를 포함하는, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 표면 개질된 치과용 임플란트 재료의 제조방법에 의해 제조된, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료를 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 치과용 임플란트 재료 표면을, 0.5 내지 3.0kV의전압 조건하에 800 내지 1200 sccm 유량의 방전용 가스가 유입되어 상온 대기압 플라즈마를 발생하는 젯에 노출하는 단계를 단계를 포함하는, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상온 대기압 플라즈마(Non-Thermal Atmospheric Pressure Plasma)를 치과용 임플란트 재료에 처리하는 경우, 임플란트 재료의 표면에서 친수성 및 표면 에너지가 증가하는 효과를 발굴한 것에 기초한다.

일반적으로 물질 중에서 가장 낮은 에너지 상태를 가지고 있는 고체에 열을 가하여 온도가 올라가면 액체가 되고 다시 열에너지가 가해지면 기체로 전이를 일으킨다. 계속해서 기체가 더 큰 에너지를 받으면 상태전이와는 다른 이온화된 입자들이 만들어 지게 되며 이때 양이온과 음이온의 총 전하수는 거의 같아진다. 이러한 상태가 전기적으로 중성을 띄는 "플라즈마" 상태라고 한다.

고온 플라즈마(thermal plasma)는 물질의 제3상인 기체에 고온의 에너지 인가를 통하여, 자연적으로 이온, 중성자, 양성자 및 전자들로 분해될 수 있는 현상이지만, 상온 플라즈마(atmospheric plasma)는 기체의 종류, 온도 및 압력 등과 같은 조건 변수의 조절이나 제어를 통하여 인위적으로 발생시킬 수 있다.

상온 대기압 플라즈마 처리에서는 인가 전압, 처리시간, 유입시키는 가스의 종류 및 유입가스의 유속을 처리 변수로 하여 다양하게 조절할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 치과용 임플란트 재료를 플라즈마 장치 팁과 1 내지 5 mm 거리를 두어 배치하고 적정의 인가 전력, 처리시간, 및 유입가스의 유속을 조절한 상온 대기압 플라즈마 처리 결과, 임플란트 재료의 표면에서 탄소 함량이 감소하고 티타늄 함량이 증가되어 친수성 및 표면 에너지가 증가함에 따라 소수성 박테리아 부착 저항성, 세포의 부착성 및 분화성이 향상된, 보다 짧은 시간에 안정되게 개질된 임플란트 재료를 얻을 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제조방법 있어서, “상온 대기압 플라즈마”는 일반적인 저온 대기압 대기압 플라즈마라고도 표현될 수 있다. 상온 대기압 플라즈마의 중성 입자 온도는 실내 온도 정도로서 전자의 온도보다 수십 배 낮다. 이처럼 전자와 큰 입자의 에너지가 불균형적으로 다르기 때문에 이를 비평형(non-LTE) 플라즈마라고도 분류한다. 큰 입자들의 에너지가 낮기 때문에 비평형 플라즈마는 열에 불안정한 재료의 오염처리에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서와 같이 치과용 임플란트의 재료에 처리함으로써 의료용 살균 등을 할 수 있다.

본 발명의 제조방법은 상온 대기압 플라즈마 젯 장치를 이용하여 치과용 임플란트 재료를 개질시킬 수 있다. 상기 플라즈마 젯 장치는 교류(AC) 고압 전원 발생장치와 연결되어 있으며, 방전용 가스가 유입되는 유입구와 플라즈마를 분출하는 젯으로 구성된다.

본 발명의 상온 대기압 플라즈마는 0.5kV 내지 3.0 kV의 전압으로 인가될 수 있다. 구체적으로는 0.8kV 내지 1.6kV 의 전압으로 인가될 수 있다. 0.5kV 보다 낮은 전압에서 플라즈마를 처리하는 경우, 목적하는 친수성 및 표면 에너지에 도달하기에 지나치게 오랜 시간이 소요되는 문제가 발생할 수 있으며, 3.0kV 보다 높은 전압에서 처리하는 경우, 지나치게 많은 양의 탄소가 세정될 수 있고 고른 친수성 및 표면 에너지 개질이 이루어 지지 않는 문제가 발생할 수 있다.

또한, 본 발명의 상온 대기압 플라즈마는 800 내지 1200 sccm(standard cubic cm per minute)의 유량으로 처리될 수 있다. 구체적으로 900 내지 1100 sccm의 유량으로 처리될 수 있다. 800 sccm 보다 ?F은 유량으로 플라즈마를 처리하는 경우, 목적하는 친수성 및 표면에너지에 도달하기에 지나치게 오랜 시간이 소요되는 문제가 발생할 수 있으며, 1200 sccm보다 높은 유량으로 플라즈마를 처리하는 경우, 표면에 고르게 플라즈마가 처리되지 않아 친수성 및 표면 에너지가 고르게 개질되지 않아 치과용으로 사용하기에 부적합한 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 방전용 가스는 질소, 암모니아 또는 압축된 공기일 수 있다. 구체적으로는 질소 가스일 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, “치과용 임플란트 재료”는 인체 내에서 손상된 부위를 대체 및/또는 수복하기 위해 사용되는 이식체 등을 총칭하는 임플란트 중 치과용으로 사용되는 재료를 의미한다. 필요에 따라, 예컨대, 인공심장(pacemaker)이나 인공내이(cochlear implant)와 같이, 임플란트는 내부에 전자소자를 구비할 수 있다. 또는 이식가능한 정제(implantable pills)나 약물-방출 스텐트(drug-eluting stent)의 형태를 갖는 피하 약물전달장치(subcutaneous drug delivery device)와 같이 생리활성(bioactive)일 수 있다.

치과용 임플란트의 재료는 금속 또는 합금을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로는 순수한 티타늄 금속, 티타늄 합금, 니켈-티타늄 합금, 코발트-크롬 합금, 스테인리스강(stainless steel) 또는 이들의 단순 조합을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 티타늄 합금은 알루미늄(aluminum; Al), 탄탈륨(tantalium; Ta), 니오븀(niobium; Nb), 바나듐(vanadium; Va), 지르코늄(zirconium; Zr), 주석(tin; Sn), 몰리브덴(molybdenum; Mo), 규소(silicon; Si), 금(gold; Au), 팔라듐(palladium; Pd), 구리(copper; Cu), 백금(platinum; Pt) 및 은(silver; Ag)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 금속을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는 순수한 티타늄 또는 티타늄 합금일 수 있다.

본 발명의 티타늄 또는 티타늄 합금 치과용 임플란트 재료는 생체 이식용 임플란트의 재료 중에서, 다른 재료에 비해 강도, 피로저항성 및 성형가공성이 우수하고, 다른 금속재료에 비해 내식성이 우수하고 인체 조직 내에서도 안정한 특징이 있다.

또한, 상기 임플란트 재료는 생체 내에 삽입하여 손상조직을 대체하거나, 상기 조직의 재생을 촉진하기 위하여 사용할 수 있다. 또는 손상 또는 결손된 골격계 조직에 지지 또는 치료의 목적으로 사용할 수 있다. 예컨대, 치과 및 정형외과용 임플란트, 지대주, 인공 뼈, 인공 관절, 턱뼈 및 안면 부위의 소형 뼈, 충진재, 도재, 블라켓, 코어, 포스트 등 각종 경조직 재생 및 지지를 위한 지지체, 조인트, 뼈 고정용 디바이스, 척추 공정 디바이스 등에 이용할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 임플란트는 인공 치아뿌리, 인공치근, 인공 관절 또는 인공 뼈로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 임플란트는 치아와 전체 또는 부분적으로 유사한 형태, 나사, 블록, 플레이트, 필름, 필라멘트, 멤브레인, 메쉬, 직포, 부직포, 니트, 알갱이, 입자, 볼트, 너트, 못 또는 이들의 복합된 형태 예컨대, 나사와 결합된 치아의 형태를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 치과용 임플란트 재료는 플라즈마를 발생하는 젯과 1 내지 5 mm 거리를 두어 배치하여 플라즈마 처리하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는 2 내지 4 mm의 거리를 두어 배치할 수 있다. 1 mm 보다 가깝게 배치하는 경우 지나치게 국소적으로 플라즈마가 처리되어 임플란트 재료의 표면이 상할 수 있으며, 고르게 플라즈마 개질이 되지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 5 mm 보다 먼 거리에 배치하는 경우 플라즈마 처리로 인한 표면 개질 정도가 감소할 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상온 대기압 플라즈마에 노출되는 시간은 8 내지 12초일 수 있다. 구체적으로는 9 내지 11초 동안 처리되는 것일 수 있다. 8초 미만의 시간 동안 플라즈마 처리를 하는 경우, 임플란트 재료의 개질이 덜 이루어 질 수 있고, 12초 초과하는 시간 동안 플라즈마를 처리하는 경우, 임플란트 표면이 손성되거나 지나치게 탄소가 세정되는 문제점이 발생할 수 있다.

이처럼 본 발명의 제조방법은, 플라즈마 인가 전압, 처리시간, 유입시키는 가스 종류 및 유입가스의 유속, 그리고 치과용 임플란트 재료의 플라즈마 장치 팁과의 적정 거리의 조절로써, 짧은 시간 내에 안정된 치과용 임플란트의 표면을 개질하는 것에 특징이 있으므로, 상기 조절 인자 중 하나라도 상기 범위를 벗어나는 경우, 본 발명의 목적을 달성할 수 없다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 상기 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료의 제조방법에 의해 제조된, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료를 제공한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, “치과용 임플란트 재료”는 상기와 같다.

본 발명의 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료는, 상온 대기압 플라즈마의 처리 전의 치과용 임플란트 재료에 비해 표면에서 탄소 함량이 감소하고 티타늄 함량이 증가된 것일 수 있다.

치과용 임플란트의 재료의 표면에서 탄소 함량이 감소하고 티타늄 함량이 증가된 결과, 표면의 친수성 및 표면 에너지가 증가하게 되는 효과가 나타난다. 그 결과, 치과용 임플란트 표면에 소수성 박테리아 부착 저항성이 증가하게 되는 효과가 발생하여, 치과용 임플란트 재료는 내균성을 띠게 된다.

상기 박테리아는 S.상퀴니스(S. sanguinis)일 수 있다. S.상퀴니스(S. sanguinis)는 박테리아 군집의 초기 부착에 관여하는 것으로, 다른 균들은 S.상퀴니스가 있어야 부착이 가능하므로, 치과용 임플란트의 항균활성에 있어 중요한 역할을 한다.

또한, 상기 박테리아는 E.coli와 같은 그람 음성균이나 Candida albicas와 같은 진균일 수 있다.

또한, 치과용 임플란트의 재료의 표면에서 탄소 함량이 감소하고 티타늄 함량이 증가된 결과, 표면의 친수성 및 표면 에너지가 증가하게 되는 효과로 인해, 세포 부착성 및 세포 분화성이 증가되는 것일 수 있다. 상기 세포는 수용성 성질을 가지는 세포일 수 있다. 따라서 수용성 세포는 친수성이 개질된 치과용 임플란트 재료와 부착성이 증가하게 되고, 세포 분화 자극이 원활하게 이루어 질 수 있다.

상기 부착성 및 분화성이 증가되는 세포는 골수유래 중간엽 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cell)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료의 제조방법은 치과용 임플란트 재료를 플라즈마 장치 팁과 1 내지 5 mm 거리를 두어 배치하고 적정의 인가 전력, 처리시간, 및 유입가스의 유속을 조절한 상온 대기압 플라즈마 처리 하여 임플란트 재료의 표면에서 탄소 함량이 감소하고 티타늄 함량이 증가되어 친수성 및 표면 에너지가 증가함에 따라 소수성 박테리아 부착 저항성, 세포의 부착성 및 분화성이 향상된, 보다 짧은 시간에 안정되게 개질된 임플란트 재료를 얻을 수 있는 효과가 있다.

도 1은, 상온 대기압 플라즈마 처리 및 처리 결과를 나타낸 도면 및 그래프이다. 구체적으로, (A) NTAPPJ 처리 이미지, (B) 치과용 임플란트에 대한 S.상퀴니스(Streptococcus sanguinis) 부착의 억제에 대한 NTAPPJ 처리 및 그 표면 개질 효과에 대한 그래프, (C) 압축된 공기, 암모니아 및 질소 작동 가스의 광 방출 분광학 결과, 모든 시편에서 반응성 질소종(질소 산화물 (NO), N₂ 1st 및 2nd 양성 시스템, N₂ ⁺ 및 NI)과 활성 산소종(O²⁺ 및 OI)이 검출 및 326.2 nm에서의 암모니아 관련 방출 피크가 암모니아 NTAPPJ 표본에서만 나타났음을 나타내는 그래프, (D) 콜로니 계수와 PrestoBlue 분석을 사용하여 측정된 박테리아 수 사이의 상관 관계, (E),(F) NTAPPJ 전처리 유무에 따른 Ti 및 Ti-Ag 시편의 박테리아 부착을 나타내는 그래프이다.
도 2는, 압축된 공기, 암모니아 또는 질소를 사용하여 NTAPPJ 처리 없이 및 처리한, Ti (A, B) 및 Ti-Ag (C, D) 시편의 표면 조도(Ra 및 Sa)인 광학 거칠기 분석을 나타내는 그래프이다.
도 3은, 압축된 공기, 암모니아 또는 질소 NTAPPJ 처리 없이 및 처리한, Ti 시편의 고해상도 XPS 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. (A) C1s 스펙트럼, (B) N1s 스펙트럼, (C) Ti2p 스펙트럼 및 (D) O1s 스펙트럼.
도 4는, 압축된 공기, 암모니아 또는 질소 NTAPPJ 처리없이 및 처리한, Ti-Ag 시편의 고해상도 XPS 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. (A) C1s 스펙트럼, (B) N1s 스펙트럼, (C) Ti2p 스펙트럼, (D) O1s 스펙트럼 및 (E) Ag3d 스펙트럼.
도 5는, NTAPPJ 처리된 (A) Ti 및 (B) Ti-Ag 시편의 원자 조성 백분율(at %)을 나타내며, (C) 탄소에 대한 2 시간 배양 후 박테리아 부착물의 플롯 및 (D) Ti 및 Ti-Ag 표면상의 티타늄 원자 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 6은, (A) 증류수와 (B) 20 ℃에서 에틸렌글리콜을 사용하여 질소 NTAPPJ로 처리된 Ti 및 Ti-Ag 시편의 접촉각을 나타내는 그래프 및 (C) Owens-Wendt 방법을 사용하여 계산된 표면 에너지, (D) 표본에서 BHI 배지로 방출된 이온을 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)을 사용하여 측정한 그래프, (E) S.상퀴니스는 각각 TiCl₄ 및 AgNO₃로부터의 Ti (50 ppb) 또는 Ag (20 ppb) 이온과 함께 Ti 또는 Ti-Ag 시편에 부착되는 정도를 나타내는 그래프이다.
도 7은, 압축된 공기, 암모니아 또는 질소 가스의 (A, C, E) NTAPPJ 처리되지 않은, (B, D, F) NTAPPJ 처리된 Ti 시편에 부착된 S.상퀴니스의 살아있는(녹색) 및 죽은(적색) 상태를 나타내는 염색의 공초점 레이저 현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 8은, 압축된 공기, 암모니아 또는 질소 가스의 (A, C, E) NTAPPJ 처리되지 않은, (B, D, F) NTAPPJ 처리된 Ti-Ag 시편에 부착된 S.상퀴니스의 살아있는(녹색) 및 죽은(적색) 상태를 나타내는 염색의 공초점 레이저 현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 9는, (A) NTAPPJ 처리 없이 및 처리한 Ti 및 Ti-Ag 시편에 세포 부착 정도를 나타내는 그래프, (B - E) 테트라졸 아민 검정을 통한, 질소 NTAPPJ 기능화된 Ti 및 Ti-Ag 시편에서 액틴 세포골격(녹색) 및 빈쿨린 편재화(흰색 화살표)를 나타내는 도면, (F) 배양 14일에서 측정한 시편의 ALP 활성 정도를 나타내는 그래프이다.
도 10은 그람 음성균인 E.coli와 진균인 Candida albicas를 대상으로 박테리아 부착성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 방전용 가스를 달리하여 NTAPPJ 처리된 Ti-Ag 시편의 골형성 보충배지에 배양시 알칼리성 인산가수 분해효소(ALP) 활성의 증가 여부를 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 상온 대기압 플라즈마 처리를 통한 Ti 및 Ti 합금의 개질

상온 대기압 플라즈마 제트(Non-Thermal Atmospheric Pressure Plasma Jet; NTAPPJ)는 PlasmaBioscience Research Center (광운대학교)에서 설계 및 제공 한 것으로, 1.2 mm 깊이와 0.2 mm 두께의 텅스텐 내부 전극과 3.2 mm 두께의 석영 유전체를 포함하도록 NTAPPJ 장비는 조절하였다. 전극 외부의 스테인레스 강 내 구멍은 2 mm 높이 및 0.7 mm 직경의 다공성 알루미나이며, 다공성 알루미나는 기공크기가 150-200 μm이고 공극율이 35%이다. 전력을 입력 또는 제어하기 위해 고전압 전원과 Neon Trans (PNP-1000, 최대 출력 전압 15 kV, 방전 전압 1.2kV, 전류 20 mA, 60 Hz의 AC 전원, 2.0W의 평균 전력)를 부착하고 가스 유형 및 유량을 변경하기 위해 질량 유량 컨트롤러(AFC600, Astrovac, Korea)를 설치하였다.

플라즈마는 분당 1000 표준 입방 센티미터(sccm)의 질소 (99.9 %) 또는 압축 공기를 플라즈마-분사 장치를 통과시킴으로써 생성하였다. 또한 암모니아 플라즈마를 생성하기 위해, 100 sccm의 질소를 900 sccm의 질소와 함께 28% 수산화 암모늄 용액(SigmaAldrich, USA)에 통과시킴으로써 기화된 암모니아 가스를 발생시켰다. 총 1000 sccm의 질소-함유 암모니아 가스를 플라스마-분사 장치를 통과시켜 주성분이 암모니아인 플라즈마를 생성하였다. 기판에 균일한 NTAPPJ 기능화를 위해, 디스크 시편을 처리시간(5초/사이클) 동안 수평으로 수동으로 이동시켰다.

생성된 라디칼의 처리방법 및 특성은 도 1의 A 내지 C에 도시하였다. 질소 및 암모니아-NTAPPJ에서는 500-600 nm에서 여기된 산소 이온(O₂ ⁺) 지배적인 방출선을 보여 주었지만 공기-NTAPPJ는 777 nm에서 원자 산소(OⅠ)를 생성했다(도 1의C). 또한 모든 NTAPPJ 그룹에서 300-390 nm 및 610-710 nm의 스펙트럼 영역에서 각각 질소 및 여기된 질소 분자와 관련된 반응성 종을 검출하였으며, 390-480 nm 범위에서 이온화된 질소 분자(N₂ ⁺)를 검출했다. 원자 질소 (NⅠ)는 또한 747, 822 및 868 nm에서 발견되었다. 흥미롭게도, 암모니아-NTAPPJ에서 암모니아 관련 방출 피크 (326.2 nm)가 분명했다.

한편, Ti 및 Ti 합금 치과용 임플란트에 대한 NTAPPJ 기능화 효과를 평가하기 위해 Ti 및 Ti-Ag 디스크 (직경 12 mm, 두께 1 mm)를 치과용 임플란트 시편으로 사용하였다. Ti에 2% Ag가 함유된 Ti-Ag 합금은 다양한 Ti-Ag 합금 중에서 높은 내부식성과 기계적 특성을 가진다. 거친 표면을 생성하기 위해, 시편을 200 grit SiC 사포로 연마하였다. 표면 거칠기(Sa) 값이 0.5 ± 0.05㎛의 범위 내에 있음을 확인하였다. 이후 시편을 해독 및 살균하였다. 간단히 말하자면, 시편을 일련의 아세톤, 에탄올 및 증류수를 사용하여 각각 10 분 동안 초음파 세정하고, 25 ℃에서 1일 동안 진공 건조시킨 후, 산화 에틸렌 가스를 사용하여 시편을 멸균하고, 48 시간 동안 공기에 노출시켜 남아있는 산화 에틸렌 가스를 제거하였다.

준비된 거친 Ti(Sa = 0.5±0.05 μm) 및 Ti-Ag 디스크 시편(직경 12 mm, 두께 1 mm)을 NTAPPJ 팁과 3 mm 거리를 두어 배치하고 10초 동안, 질소, 공기 및 암모니아 플라즈마 처리하였다. 대조군 샘플은 NTAPPJ에 노출시키지 않았다. 또한 NTAPPJ 처리 후 기능화가 감소하는 시효 효과를 피하기 위해, NTAPPJ 처리된 기재는 즉시 추가 연구에 사용하였다.

실험예 1: 플라즈마 처리한 개질된 시편의 표면 분석

실험방법 1-1: 시편의 표면 분석 방법

광학 표면 프로필로메트리, X선 광전자 분광법(XPS) 및 접촉각 분석을 사용하여 NTAPPJ 기능화 전후에 표면 분석을 수행하였다. NTAPPJ 기능화 전후의 거칠기 차이를 시각화하기 위해 광학 표면 프로필로미터(Contour GT-X3 base, Bruker, 독일)를 사용하여 거칠기 분석을 수행하였다. 거칠기 데이터(Ra, Sa)는 2D 및 3D 조도 매개 변수로 각각 얻어졌다. 광학 프로필로미터는 표면 높이를 광학적으로 측정하여 그레이 스케일로 표현하였다. 즉, 광학 프로필로미터는 기능화 전후의 동일한 위치에서 표면 거칠기의 차이를 평가하는데 도움을 주었다. 표준 카메라의 대물 배율 및 줌 배율은 각각 ×10 및 ×2.0이고, 육안으로 관찰한 면적은 0.23 × 0.31 mm²였다. 각 분석의 스캔 길이와 백스캔은 30μm였다. 평균(n = 5)과 표준편차(SD)가 나타내었다.

접촉각 분석은 Phoenix 300을 이용하였다. 5 마이크로 리터의 증류수와 에틸렌 글리콜 (Sigma Aldrich)을 NTAPPJ 처리 및 비처리 표본의 중앙에 분주했다. 5초 후, 정적 접촉각을 측정하고, 우측 및 좌측 값의 평균을 기록하였다. 각 그룹으로부터 5개의 샘플을 측정하였다. 표면 에너지를 비극성(분산) 및 극성 성분을 사용하는 Owens-Wendt 방법에 따라 계산하였다. 방의 온도는 20℃로 설정하였다. 시험 용액의 비극성(인장 및 분산) 및 극성 변수를 갖는 표면 에너지는 다음과 같다: 표면장력, 분산력 및 극성은 각각 72.8, 21.8, 51.0 mJ/m² (물의 경우) 및 48.3 29.3, 19.0 mJ /m² (에틸렌 글리콜의 경우)이다.

또한, 284.8 eV의 단색화된 Al K-alpha.C1s을 기준으로 사용하고 Ti, C, O, N 및 Ag는 세부적으로 감지하여 X-선 광전자 스펙트럼(XPS, K-alpha, Thermo Sci-entific, UK)을 얻었다. 표면 분석은 독립적으로 3회 수행되었고, 대표 데이터를 나타내었다.

실험결과

광학 표면 프로필로메트리 측정 결과, 표면 거칠기(Ra 및 Sa) 또는 지형도에는 유의할만한 차이가 없었다(도 2).

또한 XPS 분석은 NTAPPJ 기능화에 따른 화학 조성의 변화를 특성화하기 위해 수행되었으며, 원래의 표면은 NTAPPJ 기능화 후에도 여전히 뚜렷한 접지 표시와 홈을 나타냈다. 그리고 기능화되지 않은 샘플과 비교하여, 탄소 관련 피크(C-H 및 C=O) 및 탄소 함량은 기능화된 Ti 및 Ti-Ag 표면에서 감소한 것으로 나타났다(도 3의 A, 4의 A, 5의A 및 B). 또한, NTAPPJ 기능화는 기능화가 없는 것과 비교하여 N-C 피크가 감소하게 하였다(도 3의 B 및 4의 B). 암모니아-NTAPPJ 기능화된 시편은 407.3 eV에서 암모니아 유도체 피크를 보였다(도 3의 B 및 4의 B). TiO₂ 피크는 Ti 함량이 증가함에 따라 NTAPPJ 기능화 후에 증가했다(도 3의 C, 4의 C, 5의 A 및 B). Ti-O와 같은, 산소 결합은 NTAPPJ로 기능화된 시편에서 증가했다(도 3의 D 및 4의 D). 그러나 Ag 관련 피크에는 유의미한 차이가 없었다(도 4의 E). 세 가지 가스 중 질소 NTAPPJ 기능화 군은 Ti 함량이 가장 많이 증가하고 탄소 함량이 가장 많이 감소했다 (도 5의 A 및 B).

표면 화학의 변화는 친수성뿐만 아니라 박테리아 부착과 관련된 표면 에너지를 변화시킨다. 2 개의 액체(증류수 (DW) 및 에틸렌 글리콜 (EG))로 정적 접촉각 측정을 사용하여 표면 에너지 분석을 수행하였다. Ti 및 Ti-Ag 시편의 NTAPPJ 기능화 후의 DW 및 EG 표면 접촉각의 중요한 변화는 비-기능화 대조군 시편과 비교하여 세 가스 모두에서 명백했다(도 6의 A 및 B). 일 예로써, Ti 수접촉각에서 플라즈마를 처리하지 않은 대조군은 80도를 나타내었으나 압축된 공기를 처리한 경우 7.5도, 암모니아를 처리한 경우 8도 및 질소를 처리한 경우는 5도 정도가 나타나, 친수성이 증가됨을 알 수 있었다.

오웬스-웬트(Owens-Wendt) 방법에 의해 측정된 NTAPPJ-기능화된 시편의 표면 에너지는 증가된 극성 및 분산력 때문에 비-관능화된 시편에 비해 4배 이상 증가한 것을 나타났다. 즉, Ti 및 Ti-Ag 시편의 질소 NTAPPJ 기능화는 DW 및 EG 접촉각의 최대 감소로 인한 표면 에너지의 최대 증가를 초래함을 알 수 있었다(도. 6의 C).

실험예 2: 박테리아 부착 저항성 확인

실험방법 2-1: 박테리아 부착성 분석

S.상퀴니스(S. sanguinis, ATCC 10556, USA)는 선구 박테리아로서 치과용 임플란트의 생물막 정보의 초기 단계를 담당하기 때문에 이를 선택하였으며, S. sanguinis는 5% 탈섬유소 면양 혈액(KisanBio)이 첨가된 트립티케이스 소이배지 (KisanBio)에서 배양하였다. 아가 플레이트에서 하나의 콜로니를 채취한 후, 이를 현탁시키고 원심분리하였다. 이후 펠릿을 신선한 BHI 용액에 5 × 10⁷ CFU/ml로 재현탁하였다. 박테리아 현탁액(1 ml)을 디스크 시편이 있는 12-웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하였다. 각 시편을 세균 현탁액에 완전히 잠기게 하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다(n = 5). 이후, 세균 부착에 대한 이온의 영향을 평가하기 위해 50 ppb의 TiCl₄ 또는 20 ppb의 AgNO₃를 함께 또는 따로 첨가하였으며, 각 디스크를 PBS(Gibco, USA)로 2회 세척하고 깨끗한 12-웰 배양접시로 옮겼다.

또한, 시편으로부터 방출되는 Ti 또는 Ag이온이 박테리아 부착에 영향을 줄 수 있으므로 이온의 영향을 미미하게 하기 위해, 50 ppb의 TiCl₄ 또는 20 ppb의 AgNO₃를 현탁액에 첨가했다.

PrestoBlue (Molecular probes, Eugene, OR, USA)를 100 μl씩 넣은 순수한(fresh) BHI 용액 1 ml를 첨가한 후 배양접시를 1시간 동안 항온 배양하여 부착된 박테리아 수를 조사하였다. 또한, 상기 액체(100 μl)를 96-웰 플레이트에 옮기고 마이크로 플레이트 판독기 (Epoch, BioTek, USA)를 사용하여 570 및 600 nm에서 흡광도를 판독하여 부착된 박테리아를 계수하였다. PrestoBlue 분석법으로 얻은 정규화된 흡광도와 박테리아 수 사이의 상관관계를 확인하기 위해 연속 집락형성단위(colony-forming unit; CFU) 방법을 사용했다. 즉, BHI를 사용하여 연속 희석액을 만들고 각 희석액의 0.1 ml 분액을 BHI 아가 플레이트(Bacto Agar, BD)에 도말하고 37 ℃에서 24시간 동안 배양했다. PrestoBlue 어세이를 사용하여 박테리아를 계수하기 위해 10 μl의 화학물질을 각 희석 된 박테리아 현탁액에 가하고 검량선을 만들었다. 분석법은 독립적으로 3회 수행되었고, 평균과 표준편차를 기록하였다.

실험방법 2-2: 공초점 레이저 현미경을 통한 박테리아 분석

Live-dead 염색법은 SYTO^®9와 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 40× 배율(4x 대물 렌즈 X 10x 접안렌즈)의 공초점 레이저 현미경(LSM700, 칼자이스, Thornwood, 뉴욕, 미국)을 통해 박테리아를 관찰을 위해 각 웰에 상기 염색액을 추가하였다. 강렬한 녹색 형광(ex/em = 480/500)이 살아있는 세포에서 관찰되었고, 밝은 적색 형광(ex/em = 490/635)이 죽은 세포에서 관찰되었다.

실험방법 2-3: ICP-MS 측정

이온 농도(Ti 및 Ag)를 결정하기 위해 유도결합 플라즈마 질량 분석법(Inductively coupled plasma mass spectrometry; ICP-MS, ELAN6100, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하였다. 이어서 BHI 1ml를 37℃에서 2시간 동안 12- 웰 플레이트에서 NTAPPJ 처리 또는 비처리 된 시편과 함께 항온배양한 후, 컨디셔닝된 용액을 측정에 사용하였다.

실험결과

도 1D에 PrestoBlue 분석을 사용하여 콜로니 계수와 박테리아 수 사이의 상관관계(r²=0.997)를 나타내었다. 그리고 PrestoBlue 분석을 사용하여 Ti 및 Ti-Ag 합금에 대한 초기 박테리아 부착에 대한 상온 대기압 플라즈마의 억제 효과를 평가했다. Ti와 Ti-Ag 시편의 기능화를 위한 모든 작동 가스는 상당한 박테리아 부착 저항 효과를 나타내었고, 박테리아 부착 저항성 효능은 Ti 시편의 세 가지 작동 가스간에 유의미한 차이를 보였다 (도 1의 E 및 F). 구체적으로 플라즈마 처리하지 않은 대조군에 비해 압축된 공기의 경우 약 30%, 암모니아는 40%, 질소는 60%에 달하는 박테리아 부착성이 낮게 나타났다. 즉, Ti 시편에 대한 S.상퀴니스 부착은 공기 및 암모니아 NTAPPJ 기능화보다 질소 NTAPPJ 기능화에 더 민감하였다.

PrestoBlue 분석 결과는 형광색소 calcein AM 및 ethidium homodimer-1 염색에 따른 박테리아의 live-dead 염색에 의해 확인되었다(도 7 및 8). NTAPPJ가 기능화되기 전에 많은 수의 살아있는 박테리아(녹색)가 Ti 및 Ti-Ag 표본에 확인되었으나, NTAPPJ가 기능화 한 후에, 표본에 붙어있는 박테리아는 더 적었고, N₂ NTAPPJ 기능화는 표본에 붙어있는 박테리아의 수를 최대로 줄였다.

이러한 결과로부터 표면 화학 결과와 NTAPPJ-기능화된 또는 비-기능화된 Ti 및 Ti-Ag 시편에 대한 박테리아 부착 사이의 관계를 평가하면, 탄소 함량과 Ti 함량 및 세균 부착간에 강한 양의 상관 관계가 관찰되었다(도. 5의 C 및 D). 즉, 플라즈마 개질로 인해 시편의 Ti 함량이 증가하고 탄소 함량이 감소하여 친수성 및 표면 에너지의 증가하게 되고, 이로써 박테리아 부착 저항성을 증가시키는 것을 알 수 있었다.

실험예 3: 초기 세포 부착성 및 알칼리성 인산가수 분해효소(ALP) 활성 확인

실험방법 3-1: 초기 세포 부착성 시험

래트 골수 유래 중간엽 줄기세포(Rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells; rBMM-SC)를 5주령 수컷 Sprague-Dawley 래트의 대퇴골 및 경골에서 채취하여 α-MEM(Welgene)에 위치시키고 5% CO₂, 37℃ 환경에서 0.5% 항생제/항진균제 및 10% 소태아혈청을 함유하는 α-MEM에서 배양하였다. 배양 5일 후, 비-부착성 세포를 제거하였다. 2번째와 5번째 사이의 rBMMSC를 실험에 사용하였으며, 모든 동물 실험은 단국대학교 기관심사위원회 (DKU-11-028)의 표준 및 규정에 따라 수행되었다.

초기 세포 부착 분석을 위해 1 × 10⁵ 세포/100μl를 시편에 시딩하고 37℃에서 5 % CO₂ 가습 배양기에서 4시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 또한 수용성 테트라졸륨(WST)염 검정을 사용하여 부착된 세포의 수를 계수하여 부착 세포의 세포 생존도를 간접적으로 측정되었다. 세포 수와 WST 용액의 450 nm에서의 흡광도 사이의 검정 곡선을 나타내었고, 상관계수는 0.995로 계산되어 세포 수와 450 nm에서의 흡광도 사이의 강한 선형 반응이 있음을 나타내었다.

또한, 시편에 1 × 10⁵ 세포/100 μl를 4시간 동안 시딩하고, 액틴 세포뼈대와 초점 접착 염색 키트(Millipore, Bedford, MA)로 염색한 후, 공초점 현미경 검사를 200x 배율(20x 대물렌즈 × 10x 접안렌즈)에서 빈쿨린과 액틴 필라멘트를 검출하기 위해 시행하였다.

실험방법 3-2: 알칼리성 인산가수 분해효소의 활성 시험

1x10⁵ 세포/100 μl의 rBMMSC를 4시간 동안 시편에 시딩하고 PBS로 세척한 후, 50 μg/ml의 L-아스코르브산 및 10 mM의 β-글리세로포스페이트를 12-웰 플레이트에 함유하는 골형성 보충배지(osteogenic supplementmedium; OS)가 있거나 없는, 5% CO₂ 및 37℃ 상태의 가습 배양기에서 14일간 배양하였다. 세포에서 단백질과 DNA를 추출하기 위해 3 회의 동결-해동 사이클 및 원심분리를 실시하였다. 수득된 상등액을 사용하여, 2-아미노메틸-1-프로판올(pH 10.3) 및 MgCl₂에서 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 알칼리성 인산가수 분해효소(ALP)의 활성을 측정하였다.

흡광도는 마이크로 플레이트 판독기(SpectraMax M2e)를 사용하여 405 nm의 파장에서 측정하였고, 이를는 Quant-iTPicoGreen Kit(Invitrogen)을 사용하여 PicoGreen 검정으로 측정한 dsDNA 양으로 표준화하였다.

실험방법 3-3: 통계 분석

모든 데이터는 최소 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시하였다. NTAPPJ 기능 화 전후의 표면 거칠기 값을 paired t-test를 사용하여 분석 하였다. 다른 통계 분석은 Tukey 's 방법을 이용한 단방향 ANOVA를 post hoc test로 사용하여 수행되었다. 유의성은 p <0.05로 설정 하였다. 단순 선형 회귀 및 피어슨의 상관계수 계산을 수행하였으며, 유의 수준은 p <0.05로 설정하였다. 통계분석을 위해 IBM SPSS Statistics 22 소프트웨어 (Armonk, NY, USA)를 사용했다.

실험결과

질소 NTAPPJ 개질된 표면상의 부착성 rBMMSCs를 평가하였고, 그 결과를 도. 9에 도시하였다. 질소 NTAPPJ-기능화된 Ti 및 Ti-Ag 시편에서는 플라즈마 미처리 시편과 비교하여 세포 부착성에 있어서 유의미한 증가가 있었다. 질소 NTAPPJ 기능화가 없는 시편과 비교하여 질소 NTAPPJ 기능화된 Ti 및 Ti-Ag 시편에서 액틴 세포골격 및 빈쿨린 편재화(흰색 화살표)가 증가된 것으로 나타났다(도 9의 C 및 E). 구체적으로, 질소 NTAPPJ 기능화된 시편은 플라즈마 처리도지 않은 대저군에 비해 4시간 배양에서는 10%, 24시간 배양에서는 무려 30%정도의 세포 부착성이 증가하였다.

또한 ALP 활성도는 질소 NTAPPJ로 기능화된 시편에서 비처리된 시편보다 유의하게 높게 나타났다(도. 9의 F). 구체적으로 OS배지 및 플라즈마 처리하지 않은 대조군에 비해 OS배지가 있는 경우 ALP 활성도가 4배 증가하였으며, OS배지 및 질소 NTAPPJ 기능화된 시편은 약 9배가 증가하였다.

이러한 결과로부터 NTAPPJ로 기능화한 시편은 세포 부착 및 세포 분화에 도움이 된다는 것을 알 수 있었다.

실험예 4: 그람 음성균 및 진균의 부착성 평가

실험예 2-1에 기재한 박테리아 부착성 분석을 그람 음성균인 E. coli와 진균인 Candida albicas를 대상으로 수행하였다.

그 결과, 공기를 처리한 쪽에서 E. coli와 candida albicas가 더 유의하게 부착 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 10).

실험예 5: 알칼리성 인산가수 분해효소(ALP) 활성 확인

실험예 3-2에서 기재한 알칼리성 인산가수 분해효소 활성확인 실험을 질소뿐만 아니라 공기 및 암모니아 기체를 방전용 가스로 사용한 결과를 확인하였다(도 11)

그 결과, 사용하는 가스에 관계없이 모두 동일하게 좋은 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

1. 치과용 임플란트 재료 표면을, 0.5kV 내지 3.0kV의 전압 조건하에 800 내지 1200 sccm 유량의 방전용 가스가 유입되어 상온 대기압 플라즈마를 발생하는 젯에 노출하는 단계를 포함하는, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 방전용 가스는 질소, 암모니아 또는 압축된 공기인 것인, 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 치과용 임플란트 재료는 티타늄(Ti) 또는 티타늄 합금(Ti-alloy)인 것인, 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 치과용 임플란트 재료는 상기 젯과 1 내지 5 mm 거리를 두어 배치하는 것인, 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 노출시간은 8 내지 12초인 것인, 제조방법.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료.
   
7. 제6항에 있어서, 상온 대기압 플라즈마의 처리 전의 치과용 임플란트 재료에 비해 표면에서 탄소 함량이 감소하고 티타늄 함량이 증가된 것인, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 상온 대기압 플라즈마 처리 전의 치과용 임플란트 재료에 비해 표면에서 박테리아 부착 저항성이 증가된 것인, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 박테리아는 S.상퀴니스(S. sanguinis), 그람 음성균, 또는 진균인 것인, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료.
   
10. 제6항에 있어서, 상기 상온 대기압 플라즈마 처리 전의 치과용 임플란트 재료에 비해 표면에서 친수성 및 표면 에너지가 증가하여 세포 부착성 및 세포 분화성이 증가된 것인, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 세포는 골수유래 중간엽 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cell)인 것인, 표면이 개질된 치과용 임플란트 재료.

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