KR101980973B1 - 로다민 하이드라자이드 유도체 및 이를 이용한 구리 및 차아염소산염 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 로다민 하이드라자이드(rhodamine hydrazide) 유도체 및 이를 이용한 구리(copper) 및 차아염소산염(hypochlorite) 검출방법에 대한 것으로, 로다민 하이드라자이드 유도체를 Cu²⁺ 및 ClO^- 이온 검출을 위한 형광 턴-온(turn-on) 탐침으로 개발하였다. Cu²⁺ 및 ClO^- 이온 존재시, 상기 탐침은 587 nm에서 무색으로부터 분홍색으로의 색 변화를 보이는 형광 턴-온 신호를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 로다민 하이드라자이드 유도체는 Cu²⁺ 및 ClO^- 이온을 동시에 쉽게 검출할 수 있어, 화학, 생물학 및 환경공학 공정에 널리 활용될 수 있다.

Description

로다민 하이드라자이드 유도체 및 이를 이용한 구리 및 차아염소산염 검출방법{Rhodamine hydrazide derivative and method for detecting copper and hypochlorite using the same}

본 발명은 로다민 하이드라자이드(rhodamine hydrazide) 유도체 및 이를 이용한 구리(copper) 및 차아염소산염(hypochlorite) 검출방법에 관한 것이다.

생물학적 및 환경학적 시스템에 있어서, 구리는 가장 풍부한 중금속 중 하나이다. 특히, 구리는 인체에 필수적인 금속으로서, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 페록시다제(ferroxidases), 퍼옥시다제(peroxidase) 및 도파민 β-모노옥시게나제(dopamine β-monooxygenase)를 포함하는 여러 산화 환원(redox) 관련 효소들에 필수적인 보조인자이며, 다양한 생물학적 산화 환원 과정에서 중요한 역할을 수행한다. 하지만, 과도한 구리는 세포 손상과 관련되어 있는데, 이는 알츠하이머병 및 윌슨병을 포함하는 여러 질환을 유발시킨다. 구리의 독성으로 인해, 환경 보호국(environmental protection agency, EPA)은 식수에서의 구리 농도를 1.3 mg/L로 제한하고 있다. 한편, 차아염소산염 이온(hypochlorite ion; ClO^-)은 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)의 하나로서, 면역시스템에서 항균 제제로서 작용한다. 하지만, 과도한 ClO^- 생성은 조직 손상, 폐 손상 동맥경화증을 포함하는 여러 면역성 관련 질환, 골관절염 및 다양한 암 질환과 연관되어 있다. 또한, EPA는 식수에서 차아염소산염 유도체인 염소산염(chlorate; ClO₃ ^-), 아염소산염(chlorite; ClO₂ ^-), 염소(chlorine; Cl₂) 및 이산화염소(chlorine dioxide; ClO₂)의 농도를 각각 0.3, 1.0, 4.0 및 0.8 mg/L로 조절하고 있다. 따라서, 생체 시료 및 식수에서 Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온을 효과적으로 검출하는 것은 인간에게 상당히 중요하다.

현재까지, 생물학적 및 환경학적 샘플에서 구리 이온을 검출하기 위하여, 원자 흡수 분광광도법(atomic adsorption spectrometry), X-ray 형광 분광광도법(X-ray fluorescence spectrometry) 및 레이저-유도 플라즈마 분광광도법(laser-induced breakdown spectroscopy)과 같은 전통적인 분석 방법이 사용되었다. 하지만, 이러한 방법들은 고비용, 운용 전문기술 및 휴대성 부족과 같은 여러 가지 문제점이 있다. 최근, Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온을 감지하기 위한 형광 저분자-기반 탐침이 개발되었으나, 단지 소량의 형광 센서만이 Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온 모두를 검출할 수 있었다. 따라서, 다른 센싱 기작에 기반하여 Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온 모두를 검출할 수 있는 형광 탐침의 개발이 필요하며, 이는 다양한 센싱 및 이미징 분야에서 널리 활용될 수 있다.

한국등록특허 제10-1011347호(2011.01.21 등록)

본 발명의 목적은 로다민 하이드라자이드(rhodamine hydrazide) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리, 차아염소산염(hypochlorite) 또는 이들의 혼합물 검출용 조성물, 검출용 형광 화학 센서 및 검출용 키트를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이용하여 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물을 검출하는 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드(rhodamine hydrazide) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리, 차아염소산염(hypochlorite) 또는 이들의 혼합물 검출용 조성물, 검출용 형광 화학 센서 및 검출용 키트를 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물이 포함된 시료를 첨가하여 반응시키는 단계 및 상기 반응시킨 반응물의 형광 파장, 형광 세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출방법을 제공한다.

본 발명은 로다민 하이드라자이드(rhodamine hydrazide) 유도체 및 이를 이용한 구리(copper) 및 차아염소산염(hypochlorite) 검출방법에 대한 것으로, 로다민 하이드라자이드 유도체를 Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온 검출을 위한 형광 턴-온(turn-on) 탐침으로 개발하였다. Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온 존재시, 상기 탐침은 587 nm에서 무색으로부터 분홍색으로의 색 변화를 보이는 형광 턴-온 신호를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 로다민 하이드라자이드 유도체는 Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온을 동시에 쉽게 검출할 수 있어, 화학, 생물학 및 환경공학 공정에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드(rhodamine hydrazide) 유도체를 이용한 Cu^{2 +} 및 ClO^- 검출 기작을 나타낸 모식도이다.
도 2(a)는 화학식 1로 표시되는 탐침의 합성 과정을 나타낸다. 도 2(b)는 30% 확률 타원체(probability ellipsoids)를 나타내는 화합물 1의 X-ray 결정 구조를 나타낸다(N, 파란색; O, 빨간색; C, 회색). H 원자들은 생략하였으며, 2가지 형태로 나타냈다.
도 3은 Na⁺, K⁺, Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Ni^{2 +}, Zn^{2 +}, Cu⁺, Cu^{2 +}, Ba^{2 +}, Cd^{2 +}, Co^{2 +}, Hg^{2 +}, Pb²⁺, Fe^{2 +} 및 Fe^{3 +}(각각 100μM) 첨가에 따른 화합물 1(10μM)의 흡광도(a) 및 형광(b)을 나타낸다. 삽입 그림은 화합물 1 용액에 Cu^{2 +} 이온 첨가에 따른 가시적 색깔 변화 및 형광 색깔 변화를 확인할 수 있는 사진이다. (c) 여러 농도의 Cu^{2 +} 이온(0-1000 equiv.)에서의 화합물 1(10μM) 형광 스펙트럼을 나타낸다. 삽입 그림은 [Cu²⁺]에 따른 587 nm에서의 형광 세기(fluorescence intensity; FI) 플롯을 나타낸다. (d) 587 nm에서의 FI 및 Cu^{2 +} 농도 사이의 선형 상관관계를 나타낸다. 모든 데이터는 HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)/CH₃CN (40:60, v/v)에서 얻었다. λ_ex = 550 nm.
도 4는 ROS(O₂ ^-, OH, t-BuO, ClO^-), 티올(GSH, Cys, Hcy, NaHS) 및 음이온(ClO₄ ^-, OAc^-, CN^-, HSO₄ ^-, HPO₄ ^-, OH^-, F^-, Cl^-, I^-)(각각 100μM) 첨가에 따른 화합물 1(10μM)의 흡광도(a) 및 형광(b)을 나타낸다. 삽입 그림은 화합물 1 용액에 ClO^- 이온 첨가에 따른 가시적 색깔 변화 및 형광 색깔 변화를 확인할 수 있는 사진이다. (c) 여러 농도의 ClO^- 이온에서의 화합물 1 형광 스펙트럼을 나타낸다. 삽입 그림은 [ClO^-]에 따른 587 nm에서의 형광 세기(fluorescence intensity; FI) 플롯을 나타낸다. (d) 587 nm에서의 FI 및 ClO^- 농도 사이의 선형 상관관계를 나타낸다. 모든 데이터는 HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)/CH₃CN (40:60, v/v)에서 얻었다. λ_ex = 550 nm.
도 5(a)는 여분의 Cu^{2 +} 이온이 존재하는 경우, 화합물 1의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 5(b)는 HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)/CH₃CN (40:60, v/v)에 녹인 화합물 1 및 Cu^{2 +} 복합체에 대한 Job's 플롯을 나타낸다. λ_ex = 550 nm. 도 5(c)는 CD₃CN에 녹인 Cu(ClO₄)₂로 화합물 1을 적정시, 이에 따른 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 별표(*)는 잔여 용매 피크를 나타낸다.
도 6은 여분의 NaClO가 존재하는 경우, 화합물 1의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 다른 경쟁적 ROS, 티올, 음이온 및 금속 이온 존재 및 부존재시, ClO^- 이온에 대한 화합물 1(10 μM)의 형광 반응을 나타낸다. 검은색 바는 여러 간섭 물질(100 μM)의 존재 및 부존재시, 587 nm에서의 형광 세기(fluorescence intensity; FI)를 나타낸다. 빨간색 바는 다른 간섭 물질을 포함하는 용액에 ClO^- 이온(100 μM)을 추가적인 첨가한 후, 587 nm에서의 FI를 나타낸다. 모든 데이터는 HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)/CH₃CN (40:60, v/v)에서 얻었다. λ_ex = 550 nm.

본 발명자들은 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드(rhodamine hydrazide) 유도체를 Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온 검출을 위한 형광 턴-온(turn-on) 탐침으로 개발하였다. Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온 존재시, 상기 탐침은 587 nm에서 무색으로부터 분홍색으로의 색 변화를 보이는 형광 턴-온 신호를 나타내는 것을 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, Cu^{2 +} 및 ClO^- 검출을 위한 화학식 1로 표시되는 탐침의 작동 원리는 로다민의 Cu^{2 +} 결합-유도 고리 열림(ring opening) 반응 및 고리-열린 로다민 B를 생산하는 차아염소산염-유도 가수분해 반응을 각각 기반으로 한다. 또한, Cu^{2 +}를 포함하는 금속 이온, 음이온 및 반응성 산화환원종과 같은 여러 간섭 물질이 함께 존재할 경우에도, 화학식 1로 표시되는 탐침은 ClO^- 이온과 쉽게 반응할 수 있으며, 형광을 증가시키고 분홍색을 나타낸다. Cu^{2 +} 및 ClO^- 에 대한 화학식 1로 표시되는 탐침의 센싱 능력 및 기작은 흡광도 및 형광 분석, ESI-Mass 및 ¹H NMR 분석을 통해 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드(rhodamine hydrazide) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리, 차아염소산염(hypochlorite) 또는 이들의 혼합물 검출용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 구리는 Cu²⁺ 이온일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출용 형광 화학 센서를 제공한다. 바람직하게는, 상기 구리는 Cu²⁺ 이온일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 구리는 Cu^{2 +} 이온일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물이 포함된 시료를 첨가하여 반응시키는 단계 및 상기 반응시킨 반응물의 형광 파장, 형광 세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 구리는 Cu^{2 +} 이온일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 지표는 UV-Vis(Ultraviolet-visible) 분광 광도계, 형광 광도계, 전자분무 이온화 질량 분광법 또는 공초점 현미경을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 시료는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출이 요구되는 시료이면 어떠한 것이든 가능하다. 보다 바람직하게는, 토양 및 수질로부터 얻어진 환경 시료 또는 생체로부터 분리된 생체 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 로다민 하이드라자이드 유도체를 유기 및 무기산을 이용해 형성할 수 있으며, 예컨대 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 질산염, 구연산염, 초산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 글루콘산염, 숙신산염, 포름산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염, 캠퍼술폰산염, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 칼슘염 및 마그네슘염 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 시약 및 소재

금속 이온의 염화물 염, [Cu(CH₃CN)₄]PF₆, Cu(ClO₄)₂, 음이온의 테트라부틸암모늄(tetrabutylammonium; TBA) 염, 글루타치온(glutathione; GSH), 시스테인(cysteine; Cys), 호모시스테인(homocysteine; Hcy), SH₂ 생성을 위한 소듐 하이드로설파이드, 활성산소종 생성을 위한 시약과, 합성 및 분석을 위한 다른 화합물과 같은 모든 시약은 Aldrich, TCI 및 Alfa에서 구입하였다. 모든 용매는 HPLC 시약 등급으로 사용하였고, 증류수는 분석 실험용으로 사용하였다. NMR은 Varian 400 MHz 및 Bruker 500 MHz 기기로 기록하였고, 모든 화학적 이동(chemical shifts)은 내부 대조군으로 TMS를 이용하여 ppm 수치로 작성하였다. HR-ESI-MS 데이터는 한국기초과학지원연구원의 액체 크로마토그래피 질량분석기(liquid chromatography mass spectrometer; LC/MS)를 사용하여 얻었다.

2. UV/ Vis 흡광도 및 형광 분광 분석

금속 염화물 및 과염소산염의 스톡(stock) 용액은 탈이온수에서 제조하였다. 탐침, 음이온의 TBA 염, Cu⁺ 이온을 위한 [Cu(CH₃CN)₄]PF₆의 스톡 용액은 CH₃CN에서 제조하였다. 티올(thiols)의 스톡 용액은 인산완충액(phosphate buffered saline; PBS)(10 mM, pH 7.4)에서 제조하였다. 활성산소종의 스톡 용액은 기존 문헌에 따라 제조하였다. 모든 스펙트럼은 HEPES (10 mM, pH 7.4):CH₃CN (40:60, v/v)에서 기록하였다. UV/Vis 흡광도 및 형광 스펙트럼은 UV-2600 (Shimadzu) 및 RF-6000 (Shimadzu) 분광광도계를 이용하여 각각 기록하였다. 여기(excitation)는 5 nm의 여기 및 방출(emission) 슬릿(slit) 폭으로 550 nm에서 수행하였다.

3. X-ray 결정화

X-ray 분석을 위해 적절한 화학식 1의 단일 결정은 화학식 1의 CH₃OH 용액 내로 Et₂O를 천천히 확산시켜 얻어냈다. 직접 만든 구리 플레이트 상에서 나일론 루프(Hampton Research Co.)를 이용하여 화학식 1의 단일 결정을 용액으로부터 골라내어, N₂ cryostream 내 고니오미터(goniometer) 상단에 탑재하였다. graphite-monochromated Mo Kα radiation (λ = 0.71073 Å) 장착된 Bruker SMART AXS diffractometer로 100(2) K에서 데이터를 수집하였다. CCD 데이터는 Bruker-SAINT software package를 사용하여 적용하였다. 구조는 program SHELXS-97 (Sheldrick, 2008)으로 해석하였고, SHELXL-97 (Sheldrick, 2008)를 사용하여 F2 상에서 정밀화하였다. 정밀화와 관련된 자세한 정보는 CIF 파일로 제공하였다. CCDC-1543479는 화학식 1의 추가적인 결정화 데이터도 포함하고 있다. 상기 데이터는 www.ccdc.cam.ac.uk/ data_request/cif 또는 the Cambridge Crystallographic Data Centre, 12, Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK; fax: (+44) 1223-336-033; e-mail: deposit@ccdc.cam.ac.uk.에서 무료로 얻을 수 있다.

< 실시예 1> 화합물 1의 합성 방법

화합물 2는 이전에 보고된 논문을 참고하여 합성하였으며(Sens Actuators B Chem. 2014;195:534-549), 화합물 1은 새롭게 합성하였다.

화합물 2((0.5 g, 1.1 mmol) 및 메틸 옥살일 클로라이드(methyl oxalyl chloride)(0.152 ml, 1.65 mmol)는 디클로로메탄(dichloromethane; DCM)(20 ml)에 용해시켰다. 혼합물에 트리에틸아민(Triethylamine; TEA)(0.3 ml, 2.2 mmol)을 추가한 후, 질소 조건 하에서 5시간 동안 환류시켰다. 반응 용매는 증발시켰고, 생성물은 DCM에 용해하였고, 물로 2번 씻어냈다. 유기층을 수집하였고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰으며, 여과하였다. 유기 용매를 증발시킨 후, 용출제(eluent)로 에틸 아세테이트/핵산(2:1, v/v)을 사용하여, 실리카 컬럼 크로마토그래피로 생성물을 정제하여, 갈색 고체의 화합물 1을 얻어냈다(0.40 g, 67%). ESI-MS m/z [M+H]⁺ calc. 543.25, obs. 543.10. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 1.20 (t, J = 5.1 Hz, 12H); 3.43-3.19 (m, 8H); 3.79 (s, 3H); 6.42-6.18 (m, 4H); 6.68 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.09 (d, J = 7.0 Hz, 1H); 7.56-7.39 (m, 2H); 7.95 (m, J = 7.1 Hz, 2H); 8.21 (s, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 164.5, 159.7, 153.9, 153.5, 152.0, 149.0, 133.4, 129.0, 128.3, 128.1, 124.0, 123.5, 108.1, 103.5, 97.6, 77.4, 77.1, 76.8, 66.2, 53.5, 44.3, 12.6.

화학식 1로 표시되는 탐침은 도 2a에 나타낸 바와 같이 합성되었다. 전구체 2는 이전 보고에 따라 적용하였다. 염기로서 TEA를 첨가하고, DCM에 녹인 화합물 2 및 메틸 옥살일 클로라이드의 축합 반응으로, 67%의 수율로 화합물 1을 얻어냈다. 합성물의 화학 구조는 1H, 13C NMR 및 ESI-MS를 통해 명확하게 확인하였다. 또한, 화합물 1의 단일 결정은 X-ray 결정학을 통해 분석하였고, 이는 도 2b에 나타냈는데, 화합물 1은 스파이로락탐 고리-닫힘 형태(spirolactam ring-closed form)로 존재하는 것을 확인하였다.

< 실시예 2> 화합물 1의 광학 특성

화합물 1의 센싱 능력을 확인하기 위해서, 금속 이온, 음이온 및 활성산소종과 같은 다양한 분석 물질(analytes)의 첨가에 따른 화합물 1의 흡광도 및 형광 변화를 관측하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)/CH₃CN (40:60, v/v)에 녹인 Na⁺, K⁺, Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Ni^{2 +}, Zn^{2 +}, Cu⁺, Cu^{2 +}, Ba^{2 +}, Cd^{2 +}, Co^{2 +}, Hg²⁺, Pb^{2 +}, Fe^{2 +} 및 Fe^{3 +}과 같은 여러 금속 이온에 대해 화학식 1로 표시되는 탐침을 시험하였다. 초반에, 화합물 1 용액은 가시 영역에서 아무런 흡광도 및 방출 밴드를 나타내지 않았다(도 3a 및 도 3b). 하지만, 화합물 1 용액에 Cu^{2 +} 이온을 추가하면, 550 nm에서 흡광도 밴드 및 587 nm에서 방출 밴드를 명확하게 나타냈다. 또한, 색깔 변화도 무색에서 분홍색으로 변하는 것으로 확인되었다. 반면, 다른 금속 이온의 경우에는 이러한 변화를 보이지 않았다. 또한, Cu^{2 +} 이온에 대한 화합물 1의 형광 반응은 시간에 의존하는 것으로 나타났다. Cu^{2 +} 이온 존재하에서, 화합물 1의 587 nm에서 형광 세기는 95분까지는 점차적으로 증가하였고, 정체기에 도달하였다. Cu²⁺ 이온의 농도 증가에 따라, 화합물 1은 형광 세기가 점차적으로 증가하는 것으로 나타났고, 800 equiv.의 Cu^{2 +} 이온에서 포화되었다(도 3c). 또한, 587 nm에서의 형광 세기(fluorescence intensity; FI) 및 0 내지 400 equiv. 범위의 [Cu2⁺] 사이에 우수한 선형 상관관계를 나타냈다(R² = 0.99347)(도 3d). 또한, Cu^{2 +}에 대한 화합물 1의 검출 한계는 0.95 μM로 측정되었으며, 이는 EPA에 의해 제한되는 식수에서의 Cu^{2 +} 수준보다 낮은 수치이다. 상기 결과는 화합물 1이 수상 용액에서 Cu^{2 +} 이온을 선택적으로 검출할 수 있는 형광 탐침으로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 1의 흡광도 및 형광 변화는 HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)/CH₃CN (40:60, v/v)에 녹인 음이온(e.g., ClO₄ ^-, OAc^-, CN^-, HSO₄ ^-, HPO₄ ^-, OH^-, F^-, Cl^-, I^-)과, ROS(e.g., O₂ ^-, OH, t-BuO, ClO^-) 및 티올(e.g., GSH, Cys, Hcy, NaHS)과 같은 산화환원종의 첨가에서도 확인되었다. ClO^- 이온 존재하에서, 화학식 1로 표시되는 탐침은 587 nm에서의 방출 밴드와 함께, 550 nm에서 확실한 흡광도 밴드를 나타냈다(도 4a 및 4b). 또한, 색깔 변화도 무색에서 분홍색으로 변하는 것으로 확인되었다. 이러한 광학적 변화는 Cu^{2 +} 이온 존재하에서 관측되는 화합물 1의 결과와 유사했다(도 3). 시간-의존적 형광 변화가 관찰되었다. 화합물 1 용액에 ClO^-를 첨가함에 따라, 30분 동안 587 nm에서 점차적인 형광 증가가 관찰되었다. 화학식 1로 표시되는 탐침을 ClO^- 이온으로 적정하면, 형광 세기는 ClO^-의 농도가 증가함에 따라 점차적으로 증가하였고, 이는 20 equiv. ClO^- 이온에서 포화되었다(도 4c). 또한, 형광 증가 및 ClO^- 농도(0-70 μM)의 선형 상관관계는 도 4d에 나타냈다. 또한, ClO^-에 대한 화합물 1의 검출 한계는 0.028 μM로 측정되었으며, 이는 EPA에 의해 제한되는 식수에서의 차아염소산염 유도체 농도보다 낮은 수치이다. 결과적으로, 본 발명자들은 환경 조건에서 존재하는 Cu^{2 +} 또는 ClO^- 이온에 대하여 화합물 1이 분명한 색깔 변화와 함께 강력한 형광 증가를 보여줄 수 있다는 것을 밝혀냈다. 흥미롭게도, 화합물 1은 Cu^{2 +} 이온 보다 ClO^- 이온에서 더 높은 민감성 및 더 빠른 검출 시간을 나타냈다. 이에, 본 발명자들은 화합물 1이 다양한 분석 샘플에서 Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온을 검출 및 이미지화할 수 있는 형광 및 발색 탐침으로 사용될 수 있다고 확신하였다.

< 실시예 3> Cu ^{2 +} 및 ClO ^- 이온에 대한 화합물 1의 센싱 기작

Cu^{2 +} 이온에 대한 화합물 1의 센싱 기작을 조사하기 위해서, HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)/CH₃CN (40:60, v/v)에 녹인 화합물 1 및 여분의 Cu^{2 +} 이온 혼합물을 ESI-MS 분광광도계로 분석하였다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 각각 m/z 543.10 및 606.10 에서 [1+H]⁺ 및 [1+Cu+H]⁺에 대한 2개의 명백한 질량 피크를 확인하였다. 또한, 화합물 1 및 여분의 Cu^{2 +} 이온 혼합물에 여분의 EDTA를 첨가한 경우, [1+H]⁺에 대한 상대 피크 세기가 증가한 반면, 화합물 1 및 Cu^{2 +} 복합체에 대한 피크 세기는 낮아졌다. 또한, 붉은색에서 무색으로 색깔 변화도 관측되었다. 이는 Cu^{2 +} 이온에 대한 EDTA의 강한 결합 능력 때문이다. 화합물 1 및 Cu^{2 +} 복합체의 화학량론(stoichiometry)을 측정하기 위해서, Job's 플롯 실험을 수행하였다. 도 5b에서 나타낸 바와 같이, 형광 변화(F-F0) 최고점은 몰분율([1]/[1+Cu2⁺])이 0.5인 것으로 나타났는데, 이는 Cu^{2 +} 이온에 화합물 1이 결합하는 화학량론이 1:1인 것을 나타낸다. 또한, Cu^{2 +} 이온에 대한 화합물 1의 결합 상수(K _a)는 1.45 × 10³ M^-1인 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터, 본 발명자들은 형광 증가 및 색깔 변화를 유도하는 화학식 1로 표시되는 탐침이 Cu^{2 +} 이온에 선택적으로 결합한다는 것을 밝혀냈다.

화합물 1 및 Cu^{2 +} 이온의 결합 모드를 확인하기 위해서, CD₃CN에 녹인 여러 농도의 Cu(ClO₄)₂에서 ¹H NMR 분석을 수행하였다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, Cu(ClO₄)₂의 농도가 증가할수록 방향족 부분과 관련된 양성자 피크(H_a-H_g)가 낮은 필드로 이동하였고, H_h 및 H_i에 대한 피크가 2개의 그룹으로 나눠졌다. 또한, NH의 양성자도 적정 과정 중에 낮은 필드로 이동하였다. 상기 변화는 1.0 equiv.의 Cu(ClO₄)₂에서 포화되었다. 상기 결과는 Cu^{2 +} 결합에 의해 유도되는 화합물 1의 로다민 스파이로락탐 고리 열림에 의해 설명된다. 또한, 상기 결과는 도 5a 및 도 5b에서 나타낸, 화합물 1이 Cu^{2 +}에 1:1의 화학량론으로 결합한다는 것을 뒷받침하고 있다.

한편, ClO^- 이온에 대한 화합물 1의 센싱 기작은 ESI-MS를 통해 확인하였고, 그 결과는 도 6에 나타냈다. 화합물 1에 ClO^- 이온을 첨가함에 따라, 로다민 B에 대한 m/z 443.53 피크가 관찰된 반면, 화합물 1에 대한 피크는 사라졌다. 본 발명자들은 형광 증가 및 색깔 변화를 가져오는 고리-열린 로다민 B를 생산하기 위해, 화학식 1로 표시되는 탐침이 차아염소산염-매개 산화 및 추가적인 가수분해를 겪을 것으로 추정하였다. 결과적으로, ClO^- 이온을 검출하기 위한 화합물 1의 작동 원리는 도 5a에서 나타낸 Cu^{2 +} 이온에 대한 비가역적 화학 반응을 기반으로 하고 있다.

< 실시예 4> 다른 간섭 물질 존재시 ClO ^- 에 대한 화합물 1의 선택적 반응

HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)/CH₃CN (40:60, v/v)에 녹인 Na⁺, K⁺, Cu⁺, Mg²⁺, Ca^{2 +}, Ni^{2 +}, Zn^{2 +}, Ba^{2 +}, Cd^{2 +}, Co^{2 +}, Hg^{2 +}, Pb^{2 +}, Fe^{2 +} 및 Fe^{3 +}를 포함하는 다른 경쟁 금속 이온이 동시에 존재하는 경우, Cu^{2 +} 이온에 대한 화합물 1의 형광 반응을 시험하였다. 화합물 1 용액은 여러 금속 이온의 존재하에서는 분명한 형광 신호를 나타내지 않았는데, 화합물 1 용액에 Cu^{2 +} 이온을 첨가함에 따라 587 nm에서 강한 형광을 나타냈다. 이는 화학식 1로 표시되는 탐침이 Cu^{2 +}에 선택적으로 결합하고, 다른 금속 이온들로부터의 어떠한 간섭 없이 증가된 형광을 제공한다는 것을 나타낸다.

또한, HEPES 완충액 (10 mM, pH 7.4)/CH₃CN (40:60, v/v)에 녹인 산화환원종, 음이온 및 금속 이온을 포함하는 여러 간섭 물질의 존재시, ClO^- 이온에 대한 화합물 1의 선택적 가수분해를 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, O₂ ^-, OH, t-BuO, GSH, Cys, Hcy, NaHS와 같은 여러 산화환원종, OAc^-, CN^-, HSO₄ ^-, HPO₄ ^-, OH^-, F^-, Cl^-, I^-과 같은 음이온 및 Na⁺, K⁺, Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Ni^{2 +}, Zn^{2 +}, Cu⁺, Ba^{2 +}, Cd^{2 +}, Co^{2 +}, Hg²⁺, Pb^{2 +}, Fe^{2 +} 및 Fe^{3 +}를 포함하는 금속 이온의 존재시, 화학식 1로 표시되는 탐침은 587 nm에서 거의 형광 세기를 나타내지 않았다(검은색 바). 하지만, Cu^{2 +} 이온을 포함하는 여러 간섭 물질의 존재시에도, 용액에 ClO^-를 추가적으로 첨가하면 587 nm에서 상당한 형광 증가를 나타냈다(빨간색 바). Cu^{2 +} 이온의 존재시 ClO^- 이온에 의한 화합물 1의 가수분해는 ESI-MS 분석을 통해 확인하였다. GSH, Cys, Hcy, NaHS를 포함하는 티올과, Cu⁺ 및 Co^{2 +} 이온과 같은 금속의 경우, 다른 간섭 물질의 존재시에 비교하여 형광 세기가 조금 증가한 것으로 나타났다. 이는 산화제로 작용하는 ClO^-에 대한 높은 환원력 때문인 것으로 보인다. 결과적으로, 본 발명자들은 화학식 1로 표시되는 탐침이 로다민 부분의 Cu^{2 +} 결합-유도 고리 열림 및 차아염소산염-유도 가수분해 각각에 기반하여, Cu^{2 +} 및 ClO^- 이온 모두를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 또한, 여러 산화환원종, 음이온 및 Cu^{2 +} 이온을 포함한 금속 이온의 존재시에도, 화합물 1은 ClO^- 이온과 선택적으로 반응하여, 확실한 형광 증가 및 색깔 변화를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드(rhodamine hydrazide) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
   [화학식 1]
   

   
2. 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리, 차아염소산염(hypochlorite) 또는 이들의 혼합물 검출용 조성물.
   [화학식 1]
   

   
3. 제2항에 있어서, 상기 구리는 Cu^{2 +} 이온인 것을 특징으로 하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출용 조성물.
4. 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출용 형광 화학 센서.
   [화학식 1]
   

   
5. 제4항에 있어서, 상기 구리는 Cu^{2 +} 이온인 것을 특징으로 하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출용 형광 화학 센서.
6. 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출용 키트.
   [화학식 1]
   

   
7. 제6항에 있어서, 상기 구리는 Cu^{2 +} 이온인 것을 특징으로 하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출용 키트.
8. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 로다민 하이드라자이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물이 포함된 시료를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
   상기 반응시킨 반응물의 형광 파장, 형광 세기 및 광학적 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지표를 측정하는 단계를 포함하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 구리는 Cu^{2 +} 이온인 것을 특징으로 하는 구리, 차아염소산염 또는 이들의 혼합물 검출방법.

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